KR100736262B1 - 통증감퇴 ａｃ５ 녹아웃 마우스 및 이를 이용한 통증억제용 화합물의 스크리닝 방법 - Google Patents

통증감퇴 ａｃ５ 녹아웃 마우스 및 이를 이용한 통증억제용 화합물의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 통각감퇴 AC5 녹아웃 마우스 및 이를 이용한 통증 억제용 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 AC5 유전자의 결손이 상동 염색체 1쌍에서 모두 일어난 AC5-/-의 유전형질을 가지는 동형접합체(homozygote)로서, 통각감퇴의 표현형을 나타내는 AC5 녹아웃 마우스 및 이를 이용한 통증 억제용 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 AC5 녹아웃 마우스는 AC5 유전자의 결실로 인해 통각감퇴의 표현형을 나타내므로 통증관련 기작을 규명하고 통증을 억제하는 화합물의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
통각감퇴, AC5, 녹아웃, 통증

Description

통증감퇴 ＡＣ５ 녹아웃 마우스 및 이를 이용한 통증 억제용 화합물의 스크리닝 방법{AC5 knock-out mouse with hypoalgesia and screening method of compound for inhibiting pain}
도 1은 AC5 녹아웃 마우스의 기계적 또는 열적 자극에 대한 통증 반응을 측정한 결과이다(*: P<0.05에서 유의적인 차이가 있음).
A: 마우스 발바닥에 기계적 자극을 가한 경우의 회피역치를 나타낸 그래프
B: 마우스 꼬리에 기계적 자극을 가한 경우의 회피역치를 나타낸 그래프
C: 마우스 발바닥에 열 자극을 가한 경우의 회피잠복기를 나타낸 그래프
D: 마우스 꼬리에 온열 자극을 가한 경우의 회피잠복기를 나타낸 그래프
E: 마우스 발바닥에 냉 자극을 가한 경우의 회피빈도를 나타낸 그래프
도 2는 AC5 녹아웃 마우스의 포르말린에 의해 유발된 염증성 통증 반응을 측정한 결과이다(*: P<0.05에서 유의적인 차이가 있음, **: P<0.01에서 유의적인 차이가 있음).
도 3은 AC5 녹아웃 마우스의 MgSO4(A) 또는 아세트산(B)에 의해 유발된 염증성 내장 통증 반응을 측정한 결과이다(*: P<0.05에서 유의적인 차이가 있음, **: P<0.01에서 유의적인 차이가 있음).
도 4는 AC5 녹아웃 마우스의 L5 척수신경 결찰 수술에 의해 유발된 신경병성 통증 반응을 측정한 결과이다(*: P<0.05에서 유의적인 차이가 있음).
A: 마우스 발바닥에 기계적 자극을 가한 경우의 회피역치를 나타낸 그래프
B: 마우스 발바닥에 기계적 자극을 가한 경우의 감소된 회피역치의 감소율을 나타낸 그래프
C: 마우스 발바닥에 냉 자극을 가한 경우의 회피빈도를 나타낸 그래프
D: 마우스 발바닥에 냉 자극을 가한 경우의 회피빈도 증가율을 나타낸 그래프
E: 마우스 발바닥에 열 자극을 가한 경우의 회피잠복기를 나타낸 그래프
F: 마우스 발바닥에 열 자극을 가한 경우의 회피잠복기의 감소율을 나타낸 그래프
G 및 H: 마우스 발바닥의 자발통에 대한 회피시간을 나타낸 그래프
도 5는 AC5 녹아웃 마우스 꼬리신경을 손상에 의해 유발된 신경병성 통증 반응을 측정한 결과이다(*: P<0.05에서 유의적인 차이가 있음).
A: 마우스 꼬리에 기계적 자극을 가한 경우의 회피역치를 나타낸 그래프
B: 마우스 꼬리에 기계적 자극을 가한 경우의 회피역치 감소율을 나타낸 그래프
C: 마우스 꼬리에 열 자극을 가한 경우의 회피잠복기를 나타낸 그래프
D: 마우스 꼬리에 열 자극을 가한 경우의 회피잠복기의 감소율을 나타낸 그 래프
도 6은 AC5 녹아웃 마우스 및 야생형 마우스의 모르핀 투여에 따른 진통효과를 측정한 결과이다(*:P<0.05에서 유의적인 차이가 있음, **:P<0.01에서 유의적인 차이가 있음).
A: 마우스의 모르핀 투여에 따른 열 자극에 대한 회피잠복기를 나타낸 그래프
B: 마우스의 모르핀 투여에 따른 열 자극에 대한 %MPE를 나타낸 그래프
본 발명은 통각감퇴 AC5 녹아웃 마우스 및 이를 이용한 통증 억제용 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 AC5 유전자의 결손이 상동 염색체 1쌍에서 모두 일어난 AC5-/-의 유전형질을 가지는 동형접합체(homozygote)로서, 통각감퇴의 표현형을 나타내는 AC5 녹아웃 마우스 및 이를 이용한 통증 억제용 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
조직 상해나 손상은 환자에게 지속적인 통증을 유발한다. 일반적으로 통증은 피부나 내부 조직에 존재하는 통각 수용기로 구성된 자유 신경 말단이 기계적, 열적 및 화학적 자극을 받는 경우에 경험된다. 보다 구체적으로 통증의 원인으로는 염증, 손상, 질병, 근육 경련 및 신경병성 신드롬의 발병을 포함한다. 이렇게 유발된 통증은 실제 조직의 손상 또는 조직 손상이 임박한 피검체에 정보를 제공하고 방어 반응을 유도한다.
그러나 손상된 조직이 치유된 이후에도 계속 나타나는 통증, 부정확한 정보를 제공하는 통증 또는 통증과 관련된 조직의 손상이 없는데도 불구하고 나타나는 통증의 경우에는 적절한 처치를 통해 완화시켜야 한다.
이러한 통증으로는 만성 염증성 통증과 신경병성 통증이 있다. 상기 염증성 통증은 조직이 손상된 경우 수술 또는 다양한 물리적, 화학적 및 열 자극 또는 생물제제에 의한 감염의 결과로 유발된다. 신경병성 통증은 신경 시스템, 말초 신경, 후근절(dorsal root ganglion) 또는 중심 신경 시스템의 손상 결과 유발되는 지속통 증후군이다. 이는 유해 자극에 대해 감수성이 증가되어 유발되는 통증(과통증), 무해 자극에 의해 유발되는 통증(이질통) 및 자극 없이 자발적으로 나타나는 통증(자발통)을 포함한다. 신경의 손상으로 인한 통증은 매우 견디기 힘들며 아편제를 비롯한 통상적인 진통제를 사용하더라도 자주 재발되며 부작용으로 인해 치료하기가 어렵다. 따라서 만성 통증 치료에 적합한 기본 메카니즘 및 치료적 전략을 긴급하게 확립할 필요가 있다.
아데닐릴 싸이클라아제(adenylyl cyclase, AC)는 아데노신 트리포스페이트 (ATP)로부터 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cyclic adenosine monophosphate) 또는 사이클릭 AMP(cyclic AMP, cAMP)를 합성하는 효소이다. 상기 cAMP는 세포외 신호를 세포내 효과기, 특히 단백질 키나제 A로 보내는 2차 전달자(second messenger)이다. 현재 AC는 분자 클로닝 및 일련의 연구를 통해 10 종류의 이성질체가 규명되어 있다.
이 중에서 타입 5 아데닐릴 싸이클라아제(AC5)는 상술한 바와 같이 Ca2+에 의해 억제되는 Ca2+-억제성 아데닐릴 싸이클라아제로서 뇌의 선조체에서 집중적으로 발현되며(Galtt and Snyder, Nature, 361, 536-538, 1993) 전두엽의 피질에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 상기 뇌 영역들은 통각과 보상 반응에 영향을 주지만, AC5가 직접적으로 통증 반응에 관련이 있다는 사실은 규명된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 AC5가 결실된 AC5 녹아웃 마우스를 제조한 후 다양한 자극에 대한 상기 마우스의 통증 반응을 조사함으로써 AC5 유전자의 결실로 인해 통각감퇴 표현형이 나타남을 처음으로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 통각감퇴 AC5 녹아웃 마우스, 그 제조방법 및 이를 이용한 통증 억제용 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 통각감퇴 AC5 녹아웃 마우스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 통각감퇴 AC5 녹아웃 마우스의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 통각감퇴 AC5 녹아웃 마우스를 이용한 통증 억제용 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 AC5 유전자를 포함하는 DNA 컨스트럭트를 이용한 통증 억제용 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 AC5 유전자가 결실된 마우스의 경우 야생형 마우스에 비해 통각이 현저하게 감퇴됨을 실험을 통해 확인함으로써 AC5 유전자가 통증의 주요 매개자임을 처음으로 규명하였다는 데에 특징이 있다.
본 발명의 통각감퇴 AC5 녹아웃(knock-out) 마우스는 AC5 유전자의 결손이 상동 염색체 1쌍에서 모두 일어난 것으로 AC5-/-의 유전형질을 가지는 동형접합체(homozygote)이며, 통각감퇴의 표현형을 나타내는 특징이 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "통각감퇴(hypalgia 또는 hypoalgesia)"는 감각의 민감성이 낮아지고, 통증 자극에 대한 역치가 증가된 상태를 말한다. 상기에서 "역치(threshold)"는 자극이 주어졌을 때 반응을 일으킬 수 있는 최소자극의 세기를 말한다. 본 발명에서 상기 통증 자극은 물리적 자극, 염증 및 신경 손상이 포함된다.
본 발명의 일 실시예에서는 AC5 녹아웃 마우스와 야생형 마우스의 물리적 자극에 대한 통증 반응(실시예 2 참조), 염증성 통증에 대한 반응(실시예 3 참조) 및 신경병성 통증에 대한 반응(실시예 4 참조)을 각각 비교 조사하였다. 그 결과, AC5 녹아웃 마우스의 경우 야생형에 비해 기계적 자극 및 열 자극과 같은 물리적 자극(도 1 참조), 포르말린에 의해 유발된 염증 및 아세트산 또는 황산마그네슘에 의해 유발된 내장 염증과 같은 염증성 통증(도 2 참조), 신경병성 통증(도 3 및 도 4 참조)과 같은 다양한 자극에 대한 통각이 감퇴되었음을 확인 할 수 있었다. 이로부터 본 발명자들은 AC5가 통증 반응에 있어서 주요한 매개자임을 알 수 있다.
따라서 본 발명의 AC5 녹아웃 마우스는 통증과 관련된 기작을 규명하고 통증을 억제하는 화합물을 스크리닝하기 위한 질환 모델로서 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 AC5 유전자가 결실 또는 변이되어 발현되지 않으며 통각이 감퇴된 AC5 녹아웃 마우스는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
(a) AC5 유전자를 포함하는 AC5 게놈 DNA 클론을 얻는 단계;
(b) 상기 AC5 게놈 DNA 클론으로부터 AC5 녹아웃 카세트를 제조하는 단계;
(c) 상기 녹아웃 카세트를 배아간세포에 형질감염시키는 단계;
(d) 상기 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하는 단계;
(e) 상기 배아간세포가 주입된 포배강을 대리모의 자궁에 이식하여 키메라 마우스를 얻는 단계;
(f) 상기 키메라 마우스를 교배시켜 AC5+/- 유전형질을 갖는 이형접합체 F1 형질전환 마우스를 얻는 단계; 및
(g) 상기 F1 형질전환 마우스를 교배시켜 AC5-/- 유전형질을 갖는 동형접합체 F2 형질전환 마우스를 얻는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 AC5 게놈 DNA 클론은 화학적인 합성법, PCR 증폭법, 목적으로 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 진핵세포 또는 플라스미드, 파지미드, YACs, 코스미드, 박테리오파지와 같은 타겟 클로닝 벡터로부터의 정제하는 방법 등과 같은 당업계에 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 마우스의 AC5 유전자를 특이적으로 인식하는 프라이머로 PCR 증폭함으로써 AC5 유전자 단편을 수득하고 이를 프로브로 사용하여 129SVJ 마우스 게놈 DNA 라이브러리로부터 AC5 게놈 DNA 클론을 수득하였다.
상기 (b) 단계에서 AC5 유전자의 녹아웃은 AC5 게놈 DNA 클론을 특정 제한 효소로 절단하여 얻어진 일부 엑손들의 단편들 사이에 마커(marker) 유전자를 코딩하는 DNA 서열을 삽입시키든지 또는 엑손을 포함하는 유전자의 일부분을 마커 유전자로 대체시킴으로써 생성될 수 있다. 삽입 위치는 원형(native) 유전자의 발현을 방해할 수 있는 부위로서 서열 중 절단가능한 제한부위(restriction site)와 마커 유전자의 적당한 위치에 따라 결정되며, 마커 유전자는 검출가능한 어떤 핵산 서열도 가능하나, 바람직하게는 neo(네오마이신 내성 유전자) 또는 β-gal(베타-갈락토시다제)을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 AC5 게놈 DNA 클론을 제한효소로 처리하여 엑손 2의 앞쪽 일부분을 포함하는 절편과 엑손 2의 뒷부분을 포함하는 절편을 neo 유전자를 포함하는 벡터의 양쪽 말단에 서브클로닝함으로써 제조하였다. 상기 에서 제조한 AC5 녹아웃 카세트를 배아간세포에 도입함으로써 동형 재조합에 의해 AC5 유전자의 결실을 유도할 수 있다.
상기 (c) 단계의 배아상태의 간세포(embryonic stem cell, ES cell)는 일반적으로 시험관내에서 배양한 착상 전 초기배아(pre-implantation embryos)로부터 수득될 수 있다(Evans et al., Nature, 292:154-156, 1981; Bradley, et al., Nature, 309:225-258, 1984; Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 83:9065-9069, 1986). 상기 ES 세포는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 배양될 수 있다(Robertson, "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, a Practical Approach", IRL Press, Washington D. C., 1987; Bradley et al., Current Topics in Devel. Biol. 20:357-371, 1986; Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo":A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986).
상기 AC5 녹아웃 카세트의 배아간세포로의 도입은 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 전핵주입법(pronuclear microinjection), 레트로바이러스 매개 유전자 트랜스퍼(retrovirus mediated gene transfer), 유전자 적중(gene targeting), 전기충격(electroporation), 정액 매개 유전자 트랜스퍼, 칼슘 포스페이트/DNA 공-침전법 및 미세주입법(microinjection) 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 AC5 녹아웃 카세트를 전기충격법에 의해 배아간세포로 도입하였다.
배아간세포를 형질감염시킨 후 특정 항생물질을 포함하는 선택 배지에서 배양하여 내성을 나타내는 배아간세포 클론을 선별함으로써 동형재조합이 이루어진 세포만을 선별한다.
상기 (d) 단계에서는 상기 (c) 단계의 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하고 상기 (e) 단계에서 상기 배아간세포가 주입된 포배아를 대리모의 자궁에 이식하여 키메라 마우스를 수득한다.
상기 (f) 단계에서는 상기 키메라 마우스로부터 AC5+/- 유전형질을 갖는 이형접합체 F1 형질전환 마우스를 유도하고 (g) 단계에서 이를 상호교배시켜 AC5-/- 유전형질을 갖는 동형접합체 AC5 녹아웃 마우스를 수득한다.
또한, 본 발명의 통각감퇴 AC5 녹아웃 마우스는 통증을 억제하는 화합물을 스크리닝하기 위한 생체내(in vivo) 분석방법에 사용될 수 있다. 상기 화합물은 개체 내에서 AC5의 기능을 억제하거나 AC5의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 보 다 구체적으로 본 발명의 분석방법은 (a) AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 마우스의 통증 자극에 대한 반응 정도를 측정하는 단계;
(b) 상기 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 마우스에 시험제제를 투여하고, 통증 자극에 대한 반응 정도를 측정하는 단계; 및
(d) 상기 시험제제를 투여하기 전과 투여한 후의 통증 자극에 대한 반응 정도를 비교하여 AC5-/- 형질전환 마우스에서의 통증 자극에 대한 반응 감소율에 비해 AC5+/+ 야생형 마우스에서의 통증 자극에 대한 반응 감소율을 증가시키는 제제를 선별하는 단계를 포함한다.
상기에서 "시험제제(test agent)"는 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
상기에서 통증 자극은 물리적 자극, 염증 및 신경손상에 의해 유발된 자극일 수 있으며 상기 자극에 대한 반응은 당업계에 공지된 방법에 따라 측정할 수 있다.
예를 들어, 기계적 자극에 대한 통증 반응은 공지된 방법을 이용하여 회피역치(withdrawal threshold)를 측정함으로써 마우스의 발과 꼬리의 기계적 민감성을 평가할 수 있다(Chaplan et al., J NeurosciMethods 53, 55-63, 1994).
온열 자극에 대한 통증반응은 마우스의 꼬리를 온수에 침지시키고 회피 잠복기(latency)를 측정하는 방법, 마우스의 발바닥의 적외선 열 민감성을 발바닥 테스트 장치(7371 plantar test, Ugo Basile, Italy)를 이용하여 측정하는 방법(Hargreaves et al., Pain, 32, 77-88, 1998) 및 핫-플레이트에서 마우스가 통증 반응을 나타내는데 소요되는 시간을 측정하는 방법을 사용할 수 있다.
염증에 의해 유발된 통증 반응은 여러 가지 염증 유발 물질을 실험동물의 피하에 주입하여 통증을 유발시킨 후 통각행동을 지속적으로 관찰함으로써 측정할 수 있다. 상기 염증 유발 물질로는 포르말린, 카라기난, FCA(Freund's complete adjuvant) 등이 있다.
신경손상에 의해 유발된 통증 반응은 당업계에 공지된 방법에 따라 신경이 손상된 다양한 신경병성 통증 동물 모델을 제조하고 이의 물리적 자극에 대한 통증반응을 측정함으로써 평가할 수 있다. 신경병성 통증 모델로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 신경절단모델(Wall et al., Pain, 7, 103-111, 1979), 신경결찰모델(Bennett & Xie, Pain, 33, 87-107, 1998; Seltzer et al., Pain, 43, 205-218, 1990; Kim & Chung, Pain, 50, 355-363, 1992), 냉동손상모델(DeLeo et al., 1994), 압궤손상모델(Devor et al., Pain, 56, 9-16, 1979; Decostered et al., Pain, 100, 155-162, 2002) 및 종양침입모델(Shimoyama et al., Pain, 99, 167-174, 2002) 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 신경결찰모델을 사용하였다.
한편, 본 발명의 일 실시예에서 AC5 녹아웃 마우스와 야생형 마우스에 오포 오이드 약제의 일종인 모르핀을 투여하고 진통작용을 비교 조사한 결과(실시예 5 참조), 야생형 마우스에서의 모르핀의 진통작용에 비해 AC5 녹아웃 마우스에서의 모르핀의 진통작용이 감소함을 확인하였다(도 6 참조). 이는 AC가 오포오이드 약제가 결합하는 수용체에 대한 주요 효과기 중 하나로서 본 발명의 AC5 녹아웃 마우스의 경우 AC5 유전자의 결실로 인해 상기 오포오이드 수용체의 활성화가 억제됨으로써 오포오이드 약제의 효능이 감소된 것이라 사료되었다.
또한, 본 발명은 통증을 억제하는 화합물을 스크리닝하기 위한 시험관내(in vitro) 분석방법을 제공한다. 상기 화합물은 개체 내에서 AC5의 기능을 억제하거나 AC5의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 분석방법은 (a) 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 AC5 유전자 또는 AC5 유전자의 프로모터를 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 컨스트럭트를 제조하는 단계;
(b) 상기 DNA 컨스트럭트를 시험제제와 접촉시키는 단계; 및
(c) 리포터 유전자의 발현정도를 측정하여 리포터 유전자의 발현을 억제하는 제제를 선별하는 단계를 포함한다.
상기에서 시험제제의 존재로 인해 리포터 유전자의 발현이 감소되는 것은 후보물질이 AC5의 발현을 억제하여 통증을 치료하는데 유용할 수 있음을 의미한다.
상기에서 "리포터 유전자"는 목적으로 하는 유전자의 발현을 고감도로 용이하게 관찰하는데 사용되는 유전자를 말한다. 보다 구체적으로 리포터 유전자는 목적 유전자의 발현 정도에 따라 그 발현이나 생산 정도가 조절되어 목적 유전자의 발현을 직접적으로 검출하는 것을 대신하여 사용되며, 직접적으로 또는 간접적으로 표준방법에 의해 용이하게 이의 활성 또는 생산 정도를 검출할 수 있는 특징이 있다. 이러한 유전자는 당업계에 공지되어 있으며 이에 한정되지는 않으나, 예를 들면, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT), β-갈락토시다아제 및 루시퍼라아제 등이 있다. 또한 이들의 활성 또는 생산정도를 측정하는 방법도 당업계에 공지되어 있다.
상기에서 "DNA 컨스트럭트"는 타겟 조직, 세포주 또는 동물에 형질전환될 수 있도록 인공적으로 조립된 DNA 단편을 말한다. 바람직하게는, 상기 DNA 컨스트럭트는 목적 유전자 서열, 조절 서열 및 리포터 유전자 서열을 포함한다.
상기에서 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 핵산이 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된다는 것을 의미한다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
AC5 녹아웃 마우스의 제조
AC5 녹아웃 마우스는 본 발명자들이 이전에 공지한 방법(대한민국특허 제406484호)에 따라 AC5 녹아웃 카세트를 제조하고 이를 이용한 동형재조합(homologous recombination) 방법에 의해 AC5가 결실된 형질전환 마우스를 제조하였다.
먼저, AC5 녹아웃 카세트를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. AC5 유전자의 특이서열을 인식하는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 마우스의 AC5 유전자의 N 말단에 존재하는 369bp DNA 단편을 수득하였고 이를 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다. 상기 AC5 유전자 단편을 이용하여 129SVJ 마우스 게놈 라이브러리(mouse 129SVJ genomic DNA library, Stratagene)로부터 AC5 게놈 DNA 클론을 선별하였다. 그 결과, 마우스 AC5 유전자의 전반부 대부분을 포함하는 1.3kb ApaI 단편을 포함하고 있는 DNA 클론을 수득하고 이 단편을 엑손 2(exon 2)로 명명하였다. AC5 녹아웃 카세트를 제조하기 위해 상기 AC5 게놈 DNA 클론으로부터 제한효소 처리를 하여 수득한 BamHI 제한효소 부위로부터 엑손 2의 앞쪽 일부분을 포함하는 2.2Kb 절편과 엑손 2의 뒷부분에 존재하는 제한효소 부위 ApaI과 XhoI 사이를 포함하는 5.3Kb 절편을 벡터 pGK-neo의 양쪽 말단에 서브클로닝하여 AC5 녹아웃 카세트를 제조하고 이를 pAC5-neo-TK라 명명하였다.
상기 AC5 녹아웃 카세트 pAC5-neo-TK를 129SVJae 배아 유래의 배아 줄기세포에 전기충격(electroporation) 방법으로 형질감염(transfection)시키고 2 내지 3일간 배양한 후 다시 G418 및 갱싸이클로버(gancyclovor) 배지에서 배양함으로써 동형재조합에 의하여 게놈 내 AC5 유전자가 녹아웃 카세트 pAC5-neo-TK에 의하여 정 확하게 치환된 배아 줄기세포 클론을 선별하고 유지하였다. 선별된 배아 줄기세포 클론을 C57BL/6J 마우스(미국 잭슨 연구실로부터 구입) 유래의 포배기의 포배강에 주입하고 이들을 다시 ICR(미국 잭슨 연구실로부터 구입) 대리모의 수란관에 이식하여 배아 줄기세포 클론(129SVJae)과 C57BL/6J 마우스의 포배로부터 생성된 이형세포 교배종의 일종인 키메라 마우스 7종을 확보하였다. 상기 키메라 마우스로부터 유전적으로 안정화된 동형접합체 돌연변이 F1 형질전환 마우스를 확보하였다. 상기 F1 마우스를 교배하여 동형접합체, 이형접합체 및 야생형 자손인 F2 잡종 270마리를 확보하였다. 상기 270마리의 자손 중 동형접합체(AC5-/-), 이형접합체(AC5-/+) 및 야생형(AC5+/+)은 각각 58마리(21.5%), 146마리(54.1%) 및 66마리(24.4%)였으며 이로부터 본 발명의 AC5-/- 형질전환 마우스가 멘델의 법칙에 따라 생산됨을 알 수 있었다.
<실시예 2>
AC5 녹아웃 마우스의 물리적 자극에 대한 통증 반응
상기 실시예 1에서 제조한 AC5 녹아웃 마우스(AC5-/-)의 기계적 및 열 자극과 같은 물리적 자극에 대한 통증 반응을 야생형(AC5+/+)과 비교하여 조사하였다.
기계적 자극에 대한 통증 반응은 회피역치(withdrawal threshold)를 측정함 으로써 마우스의 발과 꼬리의 기계적 민감성을 평가하였다(Chaplan et al., J NeurosciMethods 53, 55-63, 1994). 50% 회피역치는 본 프레이 필라멘트(von Frey filaments)(0.02, 0.07, 0.16, 0.4, 1, 2, 4, 6g, Stoelting, Wood Dale, IL, USA)를 이용하여 결정하였다. 본 프레이 필라멘트에 대하여 발을 들거나 꼬리를 튀기는(flick) 반응을 회피 반응으로 간주하였다. 첫 번째 자극으로는 0.4g 필라멘트를 사용하고 회피 반응이 일어났을 때 다음의 보다 더 약한 필라멘트를 사용하였다. 반응이 일어나지 않은 경우에는 보다 더 강한 필라멘트를 사용하였다. 50% 역치값은 딕손 방법에 의해 계산하였다(Dixon, Annu Rev Pharmacol Toxicol, 20, 441-462, 1980)
온열 자극에 대한 통증반응은 마우스의 꼬리를 온수(38℃)에 침지시킨 후 15초의 컷-오프 시간 내의 회피 잠복기를 측정함으로써 평가하였다(Back et al., Neurosci Lett, 322, 153-156, 2002). 상기 꼬리 침지 테스트는 각 동물 당 5분 간격으로 5회를 반복하여 꼬리 회피 잠복기(latency)의 평균값을 얻었다.
또한, 마우스의 발바닥의 적외선 열 민감성을 발바닥 테스트 장치(7371 plantar test, Ugo Basile, Italy)를 이용하여 공지된 방법으로 측정하였다(Hargreaves et al., Pain, 32, 77-88, 1998). 이동성 발광-열원을 유리 바닥 밑에 놓고 마우스의 발바닥에 초점을 맞췄다. 발 회피 잠복기를 10초의 컷-오프 시간을 이용하여 측정하였다. 적외선 50nm(IR50)에서 발광-열 자극을 10분 간격으로 3회 반복하여 발 회피 잠복기의 평균값을 얻었다.
냉 자극에 대한 통증반응은 마우스의 발바닥(hindpaw)에 냉수(15℃)를 떨어 뜨려 회피반응을 측정하였다(Tal et al., Onset of ectopic firing in the Chung model of neuropathic pain coincides with the onset of tactile allodynia, Proceedings of the 11th World Congress on Pain). 냉수는 시린지에 연결된 폴리에틸렌 튜브를 이용하여 마우스의 오른쪽 발바닥에 5분 간격으로 5회 떨어뜨렸다. 발 회피 빈도를 총 시험 수로 나누어 백분율로 나타내었다.
두 그룹간의 비교는 Mann-Whitney U-검정법을 이용하여 수행하였으며, 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 유의적인 차이는 5% 수준에서 검정하였다.
실험 결과, 기계적 자극에 대한 AC5+/+ 및 AC5-/- 마우스의 50% 회피역치 값이 발 자극에 대해 각각 0.4±0.1g 및 1.1±0.2g이였고, 꼬리 자극에 대하여는 각각 1.1±0.2g 및 2.8±0.5g이였다(도 1의 A 및 B). 상기 실험결과로부터 AC5-/- 마우스의 경우 야생형에 비해 기계적 자극에 대한 감도가 감소했음을 알 수 있었다.
마우스의 발에 온열 자극을 가한 경우 AC5+/+ 및 AC5-/- 마우스의 회피 잠복기는 각각 3.7±0.3초 및 4.8±0.3초였다(도 1의 C). 반면, 온수(38℃) 자극을 꼬리에 가하거나 냉수 자극을 발바닥에 가한 경우의 회피 잠복기는 상기 두 유전형 타입간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다(도 1의 D 및 E).
상기 실험결과로부터 AC5가 기계적 및 열 감각의 정상적인 프로세싱에 필요하며 AC5 null 돌연변이는 급성 기계적 자극 및 열 자극에 대해 통각감퇴 반응을 유도함을 알 수 있었다.
<실시예 3>
AC5 녹아웃 마우스의 염증성 통증에 대한 반응
<3-1> 포르말린 피하주사 시험
공지된 방법에 따라 포르말린(2%, 10㎕)을 상기 실시예 <1-1>의 AC5 녹아웃 마우스(AC5-/-) 및 야생형 마우스(AC5+/+)의 오른쪽 발바닥의 뒷면에 피하주사하고 관찰용 챔버(16×14cm)에 두었다(Kim et al., Mol Cell Neurosci, 18, 235-245, 2001). 관찰용 챔버의 후방에 위치한 거울을 통해 발바닥을 관찰하였다. 포르말린을 주사한 후 주사한 발을 핥고 무는데 소요되는 시간을 60분간 기록하였다. 포르말린을 주사한 후 처음 10분간을 단계 1로 하였고 그 다음의 50분을 단계 2로 하였다(Dubuission & Dennis, Pain 4, 161-174, 1997; Haley et al., Eur J Pahrmacol 191, 437-446, 1990). 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 두 그룹간의 비교는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
실험 결과, AC+/+ 마우스의 포르말린 주사에 의한 첫 번째 급성 통증 반응(단계 I)은 10분 내에 일어났고, 2번째 만성 통증 반응은 조직 손상 및 염증(단계 II)과 병행하여 50분에 일어났다. 반면, 상기 두 단계는 AC5-/- 마우스의 경우 상기 두 단계의 통증 반응 시간은 AC5+/+ 마우스에 비해 현저하게 짧게 나타났다(도 2). 이러한 결과로부터 AC5가 급성 생리적 통증과 만성 염증성 동통의 주요 조절자임을 알 수 있었다.
<3-2> 내장 통증 시험
아세트산(염수에 용해된 0.6%) 또는 황산마그네슘(12mg/ml) 용액을 상기 실시예 1의 AC5 녹아웃 마우스(AC5-/-) 또는 야생형 마우스(AC5+/+)의 복강(i.p.)에 5mg/kg 또는 10ml/kg의 양으로 천천히 주사하였다. 주사 후 마우스를 투명한 실린더(직경 30cm×높이 33cm)에 넣고 비디오 카메라를 이용하여 통증 반응을 기록하였다. 아세트산은 염증을 생성하고 장기간 동안 염증성 통각을 유도하는 반면 황산마그네슘은 급성 비염증성 반응을 유도한다(Kim et al., Science, 302, 117-119, 2003; Mogil et al., Pain 80, 67-82, 1999). 아세트산을 주사한 후 처음 20분 또는 황산마그네슘을 주사한 후 처음 10분간 복부의 수축 또는 몸부림 수를 계수하였다. 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었고 두 그룹간의 비교는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
실험 결과, 황산마그네슘의 투여에 따른 복부 수축 및 몸부림 수는 AC5-/- 마우스가 AC5+/+ 마우스에 비해 유의적으로 작은 것으로 나타났다(도 3의 A).
아세트산 주사에 의해 유도된 내장 염증성 통증의 경우, 주사 후 10분에 AC5+/+ 마우스는 일반적인 복부 스트레칭과 수축 행태를 보인 다음 급격하게 감소하였으나 AC5-/- 마우스는 통증 반응이 AC5+/+ 마우스에 비해 완화되고 지연됨을 확인할 수 있었다(도 3의 B).
<실시예 4>
AC5 녹아웃 마우스의 신경병성 통증에 대한 반응
신경병성 통증에서 AC5의 작용을 이해하기 위하여, 본 발명자들은 AC5-/- 및 AC5+/+ 마우스의 통증 작용을 2 종류의 말초 신경병증 모델(L5 SNL 모델 및 TNI 모델)을 이용하여 비교하였다.
<4-1> L5 척수신경 결찰 모델
실시예 1의 AC5 녹아웃 마우스(AC5-/-) 및 야생형 마우스(AC5+/+)의 L5 척수신경 결찰(L5 spinal nerve ligation, L5 SNL)을 공지된 방법에 따라 수행하였다(Kim and Chung, Pain, 50, 355-363, 1992). 엔플루란(enflurane) 마취 하에서 L4 내지 S2의 등 쪽 척주(dorsal vertebral column)를 노출시키고 해부현미경 하에서 L6 가로돌기를 제거한 다음 L5 척수신경을 6-0 실크사로 단단히 결찰하였다.
신경을 손상시킨 후 1, 4, 7 및 14일째에 각 마우스의 신경병성 통증에 대한 행동평가를 수행하여 행동 반응을 신경 손상 1일전과 비교하였다. 행동평가는 기계적 자극 테스트, 꼬리-온열 감수성 테스트, 발바닥-냉 자극 테스트 및 발광-열 자극 테스트를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다. 신경이 손상된 후 발생되는 자발통(spantaneous pain)은 공지된 방법을 이용하여 측정하였다(Dubuisson and Dennis, Pain, 4, 161-174, 1997). 20분간 적응시킨 후 3분간 실온(20-22℃)의 바닥에서 마우스가 발바닥을 들어올리는 것을 관찰하여 누적 시간을 측정하였다. 이때 보행운동 또는 몸의 위치를 전환하기 위해 발바닥을 들어올리는 것은 제외하였다. 실험을 2회 실시한 후 평균 점수를 계산하였다. 실험결과의 통계처리는 실시예 2와 동일하게 수행하였다.
실험 결과, SNL 수술에 의해 신경이 손상된 AC5+/+ 마우스의 경우 기계적 자극에 대한 발 회피역치가 수술 전 값에 비해 급격하게 감소하는 경향을 나타냈다. 이로부터 신경이 손상된 마우스가 정상 마우스에 비해 보다 더 낮은 수준의 기계적 자극에 반응함을 알 수 있었다. 한편, SNL 수술에 의해 신경이 손상된 AC5-/- 마우스의 발 회피역치는 수술 전 값에 비해 약하게 감소되었으며 AC5+/+ 마우스에 비해 지속적으로 높게 나타났다(도 4의 A 및 B).
또한, SNL-수술한 AC5+/+ 마우스는 냉 자극 및 적외선 열 자극에 대해 강하고 지속적인 이질통을 나타냈다. 반면, AC5-/- 마우스는 냉 자극 및 열 자극에 대한 이질통을 약하게 나타냈다(도 4의 C, D, E 및 F).
AC5+/+ 및 AC5-/- 마우스는 모두 손상된 발을 들어올리는 것과 같은 신경손상 후 발생되는 자발통의 행태를 나타냈다. 한편, AC5+/+ 마우스와는 달리 AC5-/- 마우스의 자발통은 1일째에만 검출되었고 점차적으로 진정되었다(도 4의 G 및 H).
<4-2> 꼬리 신경 손상 모델
꼬리 신경 손상 모델(Tail nerve injury model, TNI)을 공지된 방법에 따라 제조하였다(Back et al., Neurosci Lett, 322, 153-156, 2002). 엔플루란 마취 하에서, 왼쪽 상부 및 하부의 꼬리쪽 신경을 노출시키고 S1 및 S2 척수 신경 사이를 절개하였다. 제공된 신경의 중앙 및 말단부의 재결합 가능성을 방지하기 위하여, 중앙부의 말단으로부터 신경 조각(1mm 길이)을 제거하였다. 상기 수술은 꼬리에 분포된 S1 척수 신경에 손상을 준다.
신경을 손상시킨 후 1, 4, 7 및 14일째에 각 마우스의 신경병성 통증에 대한 행동평가를 수행하여 행동 반응을 신경 손상 1일전과 비교하였다. 행동평가는 꼬리의 기계적 자극 테스트 및 꼬리-온열 감수성 테스트를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
실험 결과, TNI 수술에 의해 신경이 손상된 AC5+/+ 및 AC5-/- 마우스는 모두 수술 전에 비해 기계적 자극에 대해 더 민감해진 것으로 나타났다. 한편, AC5-/- 마우스는 AC5+/+ 마우스에 비해 기계적 이질통이 느린 속도로 나타났으며, 기계적 자극에 대한 회피역치가 AC5+/+에 비해 높게 나타났다(도 5의 A 및 B).
열 자극에 대해서는 TNI 수술에 의해 신경이 손상된 AC5+/+ 마우스의 경우 꼬리 회피 잠복기가 급격하게 감소된 반면, AC5-/- 마우스의 경우에는 수술 전과 비교해 볼 때 수술 후 14일까지 변화를 나타내지 않았다(도 5의 C 및 D).
상기 실험 결과로부터 AC5-/- 마우스의 경우 신경병성 통증 모델에서 기계적 및 열적 이질통이 강하게 억제됨을 알 수 있었다.
<실시예 5>
AC5 녹아웃 마우스에서 모르핀의 진통효과 시험
AC5+/+ 마우스 및 AC5-/- 마우스에서 모르핀의 진통효과를 핫-플레이트 시험을 통해 조사하였다. 진통효과는 모르핀을 각각 4, 10, 30mg/kg을 주사한 후 30분에 조사하였다. 모르핀을 주사하거나 주사하지 않은 각 마우스를 52℃ 또는 55℃로 조절된 플레이트위에 올려놓고, 발을 핥거나 점프하는 것과 같은 통증 반응을 나타내는데 소요되는 시간(반응잠복기, latency)을 기록하였다. 이때 컷오프 시간은 60분으로 하였다. 또한, % MPE(percent maximum possible effect)를 하기식에 따라 계산하였다.
% MPE=시험군의 반응 잠복기-베이스라인의 반응 잠복기/(컷오프의 반응 잠복기-베이스라인의 반응 잠복기)×100
실험결과는 다음과 같은 방법으로 통계처리하였다. 두 그룹 간의 비교는 스튜던트 T 테스트를 이용하여 비교하였고 다군간의 비교는 원-웨이 ANOVA 테스트 방법으로 비교하였다. 모든 실험결과는 평균±표준오차로 표시하였고 5% 수준에서 유의적인 차이를 인정하였다.
실험 결과, 핫-플레이트에서 모르핀을 주사하지 않은 AC5+/+ 및 AC5-/- 마우스가 통증 반응을 보이는데 소요되는 시간은 52℃에서는 각각 19.3초 및 18.4초였고 55℃에서는 각각 14.3초 및 15.4초였다(도 6의 A).
한편, 모르핀을 10mg/kg으로 주사한 AC5+/+ 및 AC5-/- 마우스가 통증 반응을 나타내는데 소요되는 시간은 증가되어 52℃에서 각각 38.0초 및 23.5초였고, 55℃에서는 27.8초 및 17.7초로 나타났다(도 6의 A). 또한, AC5+/+ 및 AC5-/- 마우스의 모르핀에 의해 유도된 진통의 최대 가능한 효과 백분율(%MPE)은 52℃에서 각각 38% 및 11%이고, 55℃에서는 30% 및 6%였다(도 6의 B).
따라서 모르핀은 두 그룹의 마우스에서 진통작용을 나타내지만, AC5-/- 마우스에서의 진통 반응이 AC5+/+ 마우스에 비해 더 약하게 나타남을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 AC5 녹아웃 마우스는 AC5 유전자의 결실로 인해 통각감퇴의 표현형을 나타내므로 통증관련 기작을 규명하고 통증을 억제하는 화합물의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. AC5 유전자(type 5 adenylyl cyclase)가 결실된 AC5-/- 형질전환 마우스에 있어서, 상기 형질전환 마우스가 통각감퇴 마우스임을 특징으로 하는 AC5-/- 형질전환 마우스.
  2. 제1항에 있어서, 통증에 대한 역치가 증가된 것임을 특징으로 하는 마우스.
  3. 제2항에 있어서, 상기 통증이 물리적 자극에 의한 통증, 염증성 통증 및 신경병성 통증으로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 마우스.
  4. (a) AC5 유전자를 포함하는 AC5 게놈 DNA 클론을 얻는 단계;
    (b) 상기 AC5 게놈 DNA 클론으로부터 AC5 녹아웃 카세트를 제조하는 단계;
    (c) 상기 녹아웃 카세트를 배아간세포에 형질감염시키는 단계;
    (d) 상기 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하는 단계;
    (e) 상기 배아간세포가 주입된 포배강을 대리모의 자궁에 이식하여 키메라 마우스를 얻는 단계;
    (f) 상기 F1 형질전환 마우스를 교배시켜 AC5+/- 유전형질을 갖는 이형접합체 F1 형질전환 마우스를 얻는 단계; 및
    (g) 상기 이형접합체 F1 형질전환 마우스를 교배시켜 AC5-/- 유전형질을 갖는 동형접합체 F2 형질전환 마우스를 얻는 단계를 포함하는 AC5 유전자가 결실된 형질전환 마우스의 제조방법에 있어서, 상기 형질전환 마우스가 통각감퇴 마우스임을 특징으로 하는 제조방법.
  5. (a) AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 마우스의 통증 자극에 대한 반응 정도를 측정하는 단계;
    (b) 상기 AC5-/- 형질전환 마우스와 AC5+/+ 야생형 마우스에 시험제제를 투여하고, 통증 자극에 대한 반응 정도를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 시험제제를 투여하기 전과 투여한 후의 통증 자극에 대한 반응 정도를 비교하여 AC5-/- 형질전환 마우스에서의 통증 자극에 대한 반응 감소율에 비해 AC5+/+ 야생형 마우스에서의 통증 자극에 대한 반응 감소율을 증가시키는 제제를 선별하는 단계를 포함하는 통증을 억제하는 화합물의 스크리닝 방법.
  6. (a) 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 AC5 유전자 또는 AC5 유전자의 프로모터 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 DNA 컨스트럭트와 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
    (c) 리포터 유전자의 발현정도를 측정하고 대조군과 비교하여 리포터 유전자의 발현을 감소시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 통증을 억제하는 화합물의 스크리닝 방법.
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