KR100689779B1 - 나프틸아미드 고정상, 이를 충진한 액체크로마토그래피컬럼, 이 컬럼을 이용한 폴리클로로비페닐 및 다이옥신의분석방법 - Google Patents
나프틸아미드 고정상, 이를 충진한 액체크로마토그래피컬럼, 이 컬럼을 이용한 폴리클로로비페닐 및 다이옥신의분석방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, PCB 및 다이옥신의 분석에 사용되는 나프틸아미드 고정상, 이를 충진한 LC 컬럼, 이 컬럼을 이용한 PCB 및 다이옥신의 분석방법에 관한 것이다.
나프틸아미드, 고정상, PCB, 다이옥신
Description
본 발명은 잔류성유기오염물질(POPs)로 알려진 일련의 비극성 유기오염물질 폴리클로로비페닐 (이하, 종종 'PCB' 로 언급함) 및 다이옥신을 분석하기 위한 정제과정에 사용되는 새로운 액체크로마토그래피용 고정상, 상기 고정상의 제조 방법, 상기 고정상으로 충진된 컬럼, 및 이들을 이용한 PCB 및 다이옥신 분석 방법에 관한 것이다.
잔류성유기오염물질(POPs)은 생태계 교란의 원인물질 및 생체의 내분비계장애물질(EDCs)로써 물리·화학적으로 안정하고 난분해성이므로 발생원으로부터 대기, 수질, 토양 등을 매개로 전세계로 확산된다. 잔류성유기오염물질인 PCB 및 다이옥신은 하기와 같은 구조식으로 나타내어지며, 다양한 임의의 위치에서 다양한 수의 염소원자로 치환된 물리·화학적 성질이 유사한 수많은 동질체(congener) 형태가 존재하며, 인간과 환경에 대한 위해성과 잔류성 때문에 이들 PCB 및 다이옥신 의 잔류농도에 대한 정확한 정보가 요구된다.
따라서, 각기 상이한 독성을 나타내는 PCB 및 다이옥신의 개별 동질체 농도에 대한 정확한 분석이 요구되며, 정제과정에서 최종 기기분석에 방해요인으로 작용하는 각종 불순물을 제거하고, 이들 PCB 및 다이옥신 동질체 상호간의 방해를 방지할 수 있는 분리과정이 필수적이다.
일반적으로 PCB 및 다이옥신 분석의 정제에서 극성 불순물을 제거하기 위하여 실리카겔 컬럼 방법이 사용되고 있으며, 고정상과 상호작용의 세기차이에 따라 PCB 및 다이옥신 동질체들의 일부를 각각 분리할 수 있는 알루미나, 활성탄, 실리카겔을 함유한 활성탄, 파이렌기(pyrenyl group)가 결합된 실리카겔 등을 고정상으로 충진한 액체크로마토그래피(LC) 방법이 사용되고 있다.
현재 상업적으로 개발되어 판매되는 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 컬럼으로 실리카겔을 함유한 활성탄으로 충진된 Hypercarb 컬럼과 실리카겔에 파이렌기(pyrenyl group)를 도입한 PYE 컬럼이 있으며, 이들은 PCB 및 다이옥신의 π-전자와 HPLC 고정상의 π-전자 사이에 작용하는 비결합성 π-π 상호작용(π-π interaction)의 차이에 기초하여, 개별 동질체의 HPLC 머무름 시간은 π-π 상호작용의 세기에 비례한다는 사실에 착안한 분리 메커니즘을 이용한다. 그러나 활성탄 컬럼은 강한 π-π 상호작용에 의해 PCB 및 다이옥신의 분리를 위하여 이동상으로 비극성 용매인 노르말 헥산과 유기염소계 용매인 디클로로메탄의 혼합용매를 이동상으로 사용하며 다이옥신의 용출을 위하여 톨루엔을 이동상으로 사용하여 역방향으로 용출시켜야하는 단점이 있다. 파이렌 컬럼의 경우에도 강한 π-π 상호작용에 의한 머무름시간을 감소시키기 위하여 노르말헥산과 유기염소계 용매인 디클로로메탄의 혼합용매를 이동상으로 사용하는 단점이 있다.
본 발명에서는 이러한 단점을 극복하기 위하여 실리카겔에 π-π 상호작용이 가능한 나프틸아미드기가 결합된 분자구조를 가지는 신규 HPLC 고정상을 개발하였으며 노르말헥산 단일용매를 이동상으로 사용하여 PCB 및 다이옥신 동질체를 분리하고자 시도하였다. 기존의 고정상에 비하여 π-π 상호작용의 세기가 조절된 나프틸아미드 고정상을 사용한 방법은 분리과정에서 환경위해성의 원인이 되는 톨루엔, 디클로로메탄 등의 유기용매를 이동상으로 사용하지 않고, 비극성 노르말헥산 단일 용매를 이동상으로 사용하여 PCB 및 다이옥신 동질체를 선택적이고 안정적으로 신속하게 분리할 수 있으며, 사용되는 이동상의 용매량 또한 약 30㎖ 정도로 분석이 가능하므로 분석과정에서 발생하는 환경오염을 최소화할 수 있다.
PCB 및 다이옥신은 상기와 같이 분자구조와 물리·화학적 성질이 유사한 수백종의 동질체가 존재할 수 있으며, 이러한 특성 때문에 기체크로마토그래피/질량분석기(GC/MS)를 사용한 최종 기기분석에서 분석용 GC 모세관 컬럼에서 머무름시간이 비슷한 동질체에 의한 상호방해가 발생하여 시료 중 극미량 존재하는 각각의 동 질체 농도 분석에서 오차원인이 되고 있다. 여기서 기인하는 분석의 오차를 줄이고 정확도, 정밀도를 향상시키기 위하여 GC/MS에 의한 최종기기분석에 앞서 HPLC 컬럼을 통하여 PCB 및 다이옥신 동질체를 사전에 분리하여 각각의 분획을 GC/MS로 분석하는 방법이 사용되고 있다.
HPLC 컬럼을 사용한 PCB 및 다이옥신 동질체 분리는 HPLC 컬럼에 충진된 고정상과 각각의 동질체 사이에서 일어나는 분자수준의 상호작용의 차이에 따라 결정되며, 비편재화된 π-전자를 가지고 있고 염소원자의 치환에 따라 전자적, 입체적 특성이 달라지는 PCB 및 다이옥신 동질체를 효과적으로 분리하기 위하여, 분자간 π-π 상호작용과 입체효과(steric effect)를 고려한 고정상의 개발이 요구된다.
본 발명에서는 고정상의 분자설계 단계에서 PCB 및 다이옥신 동질체와 분자간 π-π 상호작용을 위하여 비편재화된 π-전자를 가진 나프틸기(naphthyl group)를 도입하였고, π-π 상호작용을 조절하기 위하여 나프틸기 π-전자 시스템에 전자적, 입체적 영향을 줄 수 있는 아미드기(amide group)를 도입하여 2종의 나프틸아미드 고정상을 합성하였다. 또한 나프틸아미드 고정상을 충진한 HPLC 컬럼을 사용하여 PCB 및 다이옥신 동질체를 분리하였으며 각각의 분획을 GC/MS로 확인한 결과, 분리과정에 비극성 용매인 노르말헥산을 단일 이동상으로 사용하여 신속하고 안정적으로 각 동질체의 전자적, 입체적 특성에 따른 분리가 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PCB 및 다이옥신 등 잔류성유기오염물질의 분석을 위해 HPLC 에 적용할 수 있는 새로운 고정상을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기한 고성상의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기한 새로운 고정상을 포함하는 HPLC 컬럼을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 새로운 고정상을 포함하는 HPLC 컬럼을 이용한 PCB 및 다이옥신 등 잔류성유기오염물질의 새로운 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PCB 및 다이옥신 등 잔류성유기오염물질의 분석을 위해 HPLC 에 적용할 수 있는 고정상으로서, 나프틸아미드 고정상을 사용함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 나프틸아미드 고정상은, PCB 및 다이옥신과 π-π 상호작용이 가능하며, GC 분석을 위한 전처리 과정으로서 이를 이용한 HPLC 분리법에 의해 GC분석에서 머무름 시간이 유사한 동질체들을 HPLC 컬럼에서 사전에 분획하는 방법은 수많은 동질체에 의해 발생하는 극미량 분석의 오차를 감소시키고, 동질체 간의 상호 방해 없이 개별적으로 분리시킬 수 있다.
나프틸 고정상은 π-전자 밀도가 높아 π-염기성 선택자로서 사용할 수 있으며, 이러한 특성은 각각의 PCB 및 다이옥신 동질체와 고정상의 π-π 상호작용의 차이로 인해 머무름 시간 차이가 발생하여, PCB 및 다이옥신 동질체를 선택적으로 분리할 수 있는 것으로 여겨진다.
따라서, 본 발명에 따른 나프틸아미드 고정상은, PCB 및 다이옥신과 π-π 상호작용이 가능하다면 그 형태가 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 1-나프토익산 또는 2-나프토익산 등을, 예를 들어 아미노프로필 실리카겔에 커플링시킨 1-나프틸아미드 고정상 또는 2-나프틸아미드 고정상 등일 수 있다.
본 발명에 따르면, 나프틸기 자체는 π-전자 밀도가 높아 π-염기성 선택자로서 사용할 수 있기 때문에, 나프틸기가 고정되는 고정상은 나프틸기의 π-전자 밀도에 영향을 주지 않는다면 특별히 한정되지는 않고, 예를 들어 아미노프로필 실리카겔, 아미노부틸 실리카겔, 아미노펜틸 실리카겔 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는 아미노프로필 실리카겔이 사용된다.
한편, 본 발명에 따른 나프틸아미드 고정상은 하기에서 보는 바와 같이, 나프토익산(naphthoic acid)을 디클로로메탄 용매하에서 고정상, 예를 들어 아미노프로필 실리카겔과 반응시켜 제조한다. 이때, 커플링 시약으로는 예를 들어 EEDQ(2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린)를 사용하고, 실리카겔 표면의 잔류 실라놀기는 예를 들어 염화부티릴(butyryl chloride)로 말단처리(end-capping)한다.
일반적으로, 아미노프로필 실리카 겔과 나프토익산의 반응 몰량은 나프토익산 대 아미노프로필실 실리카겔의 당량 비율이 1 : 1 내지 2.0, 바람직하게는 1 : 1.5 내지 2.0 인 것이 바람직하다.
고정상을 제조하기 위해 사용되는 용매로는 상기한 커플링 반응, 즉 친핵성 첨가 제거 반응을 효율적으로 수행시킬 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 디클로로메탄 이외에, 클로로포름, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 등 이 사용될 수 있다.
한편, 상기에서 커플링제로는 일반적으로 아미드 커플링제, 예를 들어 EEDQ(2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린), EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), 에틸클로로포르메이트(Ethylchloroformate) 등이 사용될 수 있고, 커플링제의 사용량은 나프토익산에 존재하는 카르복실산 1 당량을 기준으로 1 내지 1.5 당량의 범위에서 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
한편, 본 발명에 따르면, 실리카겔 표면의 잔류 실라놀기는 말단처리제 (end-capping agent)에 의해서 아미노기를 극성이 낮은 작용기로 치환하는 말단처리함으로써, 고정상을 제조하기 위한 커플링 반응에서 반응물질과 반응하지 않은 극성이 큰 아미노기가 그대로 실리카겔 표면에 존재하게 되어 이후의 PCB 및 다이옥신의 분리 과정에서 분자설계시 고려한 고정상의 분리효과 이외에 다른 극성 상호작용의 가능성을 제거하는 것이 바람직하다.
이러한 말단 처리제로는 하기 화학식을 갖는 화합물을 사용할 수 있다:
[식중, R 은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸 등의 알킬이다].
바람직하게는, 염화부티릴을 말단처리제로서 사용할 수 있다.
상기 고정상을 제조하기 위한 커플링 반응은 실온, 예를 들어 18 ~ 25℃에서 수행할 수 있다.
한편, 최종적으로 제조된 나프틸아미드 고정상의 표면 농도는 실리카겔에 결 합된 반응물질의 양을 나타내며, 표면적은 생산되는 실리카겔의 종류에 따라 다르지만, 일반적으로 표면적이 클수록 반응물질이 많이 결합하며, 이후의 PCB 및 다이옥신의 분리 효과에 있어서 유리하므로 표면적은 큰 것이 바람직할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 나프틸아미드 고정상을 이용한 HPLC 컬럼 방법에 있어서, 용출액으로서는 비극성용매, 예컨대 n-헥산, n-펜탄, n-헵탄 등이 사용될 수 있지만, 이에 한정되지 않고, 나프틸아미드 고정상에 흡착되어 있는 분자들을 적당한 분리능으로 용출시킬 수 있는 분자라면 용출액으로 사용될 수 있다. 이러한 용출액의 선택은 당업자에게 자명할 것이다. 그러나, 본 발명에 따르면, 비극성용매를 단일 용매로 사용하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 나프틸아미드 고정상을 이용한 HPLC 분리를 수행하는 조건에 관해서는 당업자에게 자명할 것이다.
한편, 본 발명에 따른 나프틸아미드 고정상은 상대적으로 π-염기성으로, π-산성을 나타내는 PCB 동질체와 π-π 상호작용이 가능하다. 나프틸아미드 고정상과 PCB 동질체의 π-π 상호작용 차이는 분자구조와 형태에서 유래하며 HPLC 분리에서 머무름시간의 차이로 나타난다. 본 발명에 따르면, PYE 고정상, 1-나프틸아미드 고정상, 2-나프틸아미드 고정상, C18 고정상에서 PCB 동질체의 분획을 비교한 결과, 각 고정상의 PCB 동질체와 π-π 상호작용은 PYE > 2-나프틸아미드 > 1-나프틸아미드 > C18 순서였으며, C18 고정상은 PCB 동질체와 선택적인 상호작용이 없었다. 2-나프틸아미드 고정상은 제조가 용이하고, PCB 동질체를 선택적으로 분리할 수 있으며, 이동상으로 예를 들어 n-헥산을 소량 사용하여 짧은 시간내에 분획할 수 있는 장점을 가지고 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 나프틸아미드 고정상에 대한 다이옥신 동질체의 분획실험 결과를 살펴보면 고리형태로 고정된 평면구조를 가지는 다이옥신은 전체적으로 PCB보다 머무름 시간이 증가하는 경향을 나타냈으며, PCB와 마찬가지로 염소원자의 치환에 비례하여 머무름 시간이 증가하였다. 나프틸아미드 고정상에서 다이옥신의 머무름 시간도 PCB와 동일하게 1-나프틸아미드 고정상보다 2-나프틸아미드 고정상에서 증가하였다.
따라서, PCB 보다 다이옥신이 HPLC 컬럼에서 머무름 시간이 더욱 길다는 사실은, HPLC 컬럼에서 PCB 분획과 다이옥신의 분획이 개별적으로 분리될 수 있고, 이후 GC 컬럼을 통해서 개별적으로 분석될 수 있다는 것을 의미하므로, PCB 및 다이옥신을 모두 포함하고 있는 환경 시료를 매우 효율적으로 사전분획하여, GC 컬럼을 통해 분석될 수 있도록 할 수 있다.
한편, 환경시료의 HPLC 분획 및 GC 분석에 앞서서, PCB 및 다이옥신을 추출하고 정제하는 전처리 방법 및 절차에 관해서는 당업계에 충분히 공지되어 있으며, 본 발명의 나프틸아미드 고정상을 이용한 환경시료의 분석에 있어서도 이러한 당업계에 공지된 전처리를 수행한다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명이 이에 의해서 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1 : 나프틸아미드 고정상의 합성
1) 1-나프틸아미드 고정상의 합성 및 이를 충진한 컬럼의 제조
300 ㎖ 둥근바닥플라스크에 1-나프토익산(naphthoic acid) 0.8g(4.67mmol) 을 디클로로메탄 100㎖에 녹인 후 EEDQ 2.0g(8.09mmol)을 가해주고 1시간동안 교반하였다. 300㎖ 둥근바닥 플라스크에 HPLC 컬럼용 아미노프로필 실리카겔(Kromasil 5㎛, 100Å) 4.0g과 디클로로메탄 100㎖를 넣고 천천히 교반하면서 위에서 준비한 1-나프토익산과 EEDQ 반응 혼합물을 1시간동안 적가 해주고 상온에서 24시간 동안 천천히 교반시킨다. 반응 혼합물은 감압여과하여 실리카겔을 회수하고 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디클로로메탄, 톨루엔, n-헥산의 순서로 세척한 후 진공펌프로 충분히 건조시킨다. 소량의 실리카겔은 원소분석하여 실리카겔 표면에 공유결합된 선택자의 양을 결정하였다. 원소분석 결과에 의하면 탄소를 기준으로 1.59μmol/㎡ 의 선택자가 실리카겔에 고정된 것으로 확인되었다.
250 ㎖ 둥근바닥 플라스크에 위에서 얻은 실리카겔 4.0g(1.243mmol/g : N)을 넣고 디클로로메탄 100㎖를 가해주고 슬러리를 만든 다음 Et3N 2.1㎖( 1.24mmol) 첨가하여 0℃로 냉각시킨다. 염화부티릴(butyryl chloride) 1.6㎖(1.243mmol)를 천천히 적가한 후 상온에서 10시간동안 교반시킨다. 반응 후 실리카겔을 감압여과하고 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, n-헥산, 에테르 순으로 세척한 뒤 진공펌프로 충분히 건조시켰다. 건조된 실리카겔은 HPLC용 스테인레스 컬럼(250mm×4.6mm i.d.)에 일반적인 슬러리 충진법으로 충진하였다.
1-나프틸아미드 고정상을 갖는 실리카겔의 원소분석결과는 하기 표 1에서 보는 바와 같다.
또한, 사용된 1-나프틸아미드는 다음과 같은 특성을 가졌다:
또한, 실리카겔 (Kromasil)의 표면적은 340 ㎡/g 이었으며, 하기 식에 의해서 계산된 실리카 겔의 표면농도는 1.16 μmol/㎡ 이었다.
[식중, %C : 원소분석 결과 얻은 탄소의 %(w/w); Nc : 고정상에 존재하는 탄소의 수; S : 실리카겔의 표면적; 및 M : 실리카겔에 결합된 선택자의 분자량].
2) 2-나프틸아미드 고정상의 합성 및 이를 충진한 컬럼의 제조
2-나프토익산(naphthoic acid) 0.8g(4.67mmol)을 사용하여 1-나프틸아미드 고정상과 동일한 방법으로 합성하였으며 원소분석 결과 1.59 μmol/㎡ (탄소 원자를 기준으로 함)의 선택자가 실리카겔에 고정된 것으로 확인되었다.
1-나프틸아미드 고정상을 갖는 실리카 겔의 원소분석결과는 하기 표 1에서 보는 바와 같다.
또한, 사용된 2-나프틸아미드는 다음과 같은 특성을 가졌다:
또한, 실리카 겔 (Kromasil)의 표면적은 340 ㎡/g 이었으며, 하기 식에 의해서 계산된 실리카 겔의 표면농도는 1.59 μmol/㎡ 이었다.
[식중, %C : 원소분석 결과 얻은 탄소의 %(w/w); Nc : 고정상에 존재하는 탄소의 수; S : 실리카겔의 표면적; 및 M : 실리카겔에 결합된 선택자의 분자량].
실시예 2: PCB의 분석
1) HPLC 분획실험
PCB의 분획실험에는 하기 표 3에 기재된 총 4종의 HPLC 컬럼, 즉 본 발명의 1-나프틸아미드 고정상 또는 2-나프틸아미드 고정상으로 충진된 컬럼, PYE 컬럼, 및 C18 컬럼을 사용하였다.
분석할 표준물질로는 하기에 나타낸 개별 동질체의 농도가 각각 2.0 ㎍/㎖ 인 하기 표 4 에 나타낸 62종 PCB (Wellington BPMS) 를 20 ㎕ (40ng) 의 총량으로 HPLC에 주입하여 분획하였다.
이동상으로 HPLC용 n-헥산을 0.5㎖/min의 유속으로 흘려주었으며 시료의 주입과 동시에 2㎖ 바이알에 0.5㎖(1분)씩 모은 후 질소(99.999%)로 50 ㎕까지 농축 하였다. 각각의 분획은 다음과 같다.
Fr.1(3∼3.5㎖), Fr.2(3.5∼4㎖), Fr.3(4∼4.5㎖), Fr.4(4.5∼5㎖), Fr.5(5∼5.5㎖), Fr.6(5.5∼6㎖), Fr.7(6∼6.5㎖), Fr.8(6.5∼7㎖), Fr.9(7∼7.5㎖), Fr.10(7.5∼13㎖).
HPLC 분획에는 Waters 996 PDA(photodiode array detector)가 장착된 Waters 2690 Alliance System HPLC 가 사용되었다. PCB의 분획은 시료가 주입됨과 동시에 2㎖ 바이알에 1분 간격으로 0.5㎖씩 받았으며, Waters 996 PDA로 210∼400nm 범위에서 흡광도를 측정하였다.
2) PCB의 HRGC/LRMS 분석
위의 분획실험에서 농축한 각각의 분획에는 HRGC/LRMS분석의 내부표준물질로 240ng/㎖ 농도의 13C-PCB 28(13C-2,4,4'-TriCB) 50 ㎕ (12ng)를 가해주었다. 분획시료의 분석조건은 하기 표 5에서 보는 바와 같다:
각 동질체별로 SIM 분석에 사용한 이온은 상기 표 4에서 보는 바와 같다.
각 분획의 HRGC/LRMS와 HRGC/HRMS 분석에서 얻어지는 PCB의 GC 머루름 시간은 하기 표 6에서 보는 바와 같다.
3) 결과
PYE 컬럼을 이용한 분획시험 결과를 하기 표 7에, 1-나프틸아미드 고정상을 이용한 분획시험 결과를 하기 표 8에, 2-나프틸아미드 고정상을 이용한 분획시험 결과를 하기 표 9에 나타내었고, C18 컬럼 고정상을 이용한 분획시험 결과는 Fr.1 분획에 모두 용출되었다. 각 분획에서 용리된 PCB는 치환된 염소원자의 수에 따라 동질체별로 구분하였으며, IUPAC 번호로 표시하였다. 1개 이상의 분획으로 나누어진 동질체는 과량이 용리된 분획의 IUPAC 번호에 이탤릭체로 표시하였다.
1) Fr.1(3∼3.5㎖), Fr.2(3.5∼4㎖), Fr.3(4∼4.5㎖), Fr.4(4.5∼5㎖), Fr.5(5∼5.5㎖), Fr.6(5.5∼6㎖), Fr.7(6∼6.5㎖), Fr.8(6.5∼7㎖), Fr.9(7∼7.5㎖), Fr.10(7.5∼13㎖)
2) 이탤릭체 : 주요 분획
1) Fr.1(3∼3.5㎖), Fr.2(3.5∼4㎖), Fr.3(4∼4.5㎖), Fr.4(4.5∼5㎖), Fr.5(5∼5.5㎖)
2) 이탤릭체 : 주요 분획
1) Fr.1(3∼3.5㎖), Fr.2(3.5∼4㎖), Fr.3(4∼4.5㎖), Fr.4(4.5∼5㎖), Fr.5(5∼5.5㎖), Fr.6(5.5∼6㎖)
2) 이탤릭체 : 주요 분획
상기 표의 결과에서 보는 바와 같이, 상업화된 2종의 컬럼과 자체 제작한 2종의 컬럼에 대한 PCB 동질체 62종의 분획 결과를 보면, C18 컬럼은 Fr.1 분획에서 실험에 사용한 62종이 모두 용리 되었고, PYE 컬럼은 Fr.1 ∼ Fr.10 범위에서, 1-나프틸아미드 컬럼은 Fr.1 ∼ Fr.5 범위에서, 2-나프틸아미드 컬럼은 Fr.1 ∼ Fr.6 범위에서 각각 62종의 동질체가 모두 용리되었다. 각 컬럼에서 PCB가 용리되는 일반적인 특징을 살펴보면 PYE 컬럼에서 가장 광범위한 머무름 시간의 유형을 나타냈고 1-나프틸아미드 컬럼과 2-나프틸아미드 컬럼 사이에는 큰 차이는 없었다.
또한, PYE 컬럼에서는 Fr.2∼Fr.6 분획에서 대부분의 동질체가 용리되었으며 1-나프틸아미드 컬럼에서는 Fr.2와 Fr.3 분획에서, 2-나프틸아미드 컬럼에서는 Fr.2∼Fr.4 분획에서 대부분의 동질체가 용리되었다.
C18 컬럼은 옥타데실기가 치환되어 있는 고정상으로 본 실험에 사용한 4종류의 컬럼 가운데 각 동질체의 머무름 시간이 가장 짧고 전부 Fr.1 분획에 용리되었다. 이러한 결과에서 C18 컬럼의 옥타데실기는 PCB 동질체와 선택적인 상호작용이 거의 없다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 실험에 사용된 컬럼 고정상의 π-염기성의 세기는 PYE>나프틸아미드>C18의 순서이며 PCB 126과 169의 머루름 시간이 C18<나프틸아미드<PYE의 순서로 증가하는 결과와 일치한다. π-π상호작용이 가능한 고정상과 분석대상물질의 분리에서 머무름시간의 증가는 π-π상호작용의 세기에 비례하며 동일한 분석대상물질에 대한 각 컬럼의 머무름시간 차이는 컬럼 고정상의 π-π상호작용 세기를 반영하는 것으로 생각된다.
실시예 3: 다이옥신의 분석
1) 다이옥신의 HPLC 분획실험
다이옥신의 분획실험에는 자체 제조한 1-나프틸아미드 고정상과 2-나프틸아미드 고정상으로 충진된 컬럼(250mm×4.6mm i.d., 5㎛)을 사용하였으며 표준물질로 표 10 에 나타낸 각각의 개별 동질체의 농도가 100pg/㎕ (OCDD는 200 pg/㎕)인 15종 13C-다이옥신(CIL EDF8999)을 20 ㎕ (2ng, OCDD는 4ng)로 HPLC에 주입하여 분획하였다. 이동상으로 HPLC용 n-헥산을 0.5㎖/분의 유속으로 흘려주었으며 시료의 주입과 동시에 2㎖ 바이알에 0.5㎖(1분)씩 모은 후 질소(99.999%)로 50 ㎕까지 농축하였다. 시료의 분획조건은 PCB 분획시험의 것과 유사하였다.
다이옥신의 분획은 시료가 주입됨과 동시에 2㎖ 바이알에 2분 간격으로 1㎖씩 2회를 받고, 이후에는 1분 간격으로 0.5㎖ 씩 받았다.
Fr.1(0∼2.0㎖), Fr.2(2.0∼4.0㎖), Fr.3(4.0∼4.5㎖), Fr.4(4.5∼5.0㎖), Fr.5(5.0∼5.5㎖), Fr.6(5.5∼6.0㎖), Fr.7(6.0∼6.5㎖), Fr.8(6.5∼7.0㎖), Fr.9(7.0∼7.5㎖), Fr.10(7.5∼8.5㎖), Fr.11(8.5∼9.5㎖), Fr.12(9.5∼10.5㎖), Fr.13(10.5∼11.5㎖), Fr.14(11.5∼12.5㎖), Fr.15(12.5∼13.5㎖), Fr.16(13.5∼14.5㎖), Fr.17(14.5∼19.5㎖), Fr.18(19.5∼24.5㎖).
2) 다이옥신의 HRGC/HRMS 분석
위의 분획실험에서 농축한 각각의 분획에는 HRGC/HRMS분석의 내부표준물질로 50ng/㎖ 농도의 13C-1,2,3,4-TCDD, 13C-1,2,3,7,8,9-HxCDD으로 구성된 13C-다이옥신(CIL ED 2521) 표준물질 50 ㎕ (2.5ng)를 가해주었다. 분획시료의 분석조건은 하기 표 11에서 보는 바와 같다. 각 동질체별로 SIM분석에 사용한 이온은 상기 표 10 에 나타낸 바와 같다.
각 분획의 HRGC/LRMS와 HRGC/HRMS 분석에서 얻어지는 다이옥신 동질체의 GC 머루름 시간은, DB-5MS 모세관 컬럼을 이용한 분석 결과로서 하기 표 12에서 보는 바와 같다.
3) 결과
1-나프틸아미드 고정상 및 2-나프틸아미드 고정상에서 탄소의 동위원소 13C으로 라벨된 2,3,7,8-다이옥신 표준물질 15종의 HPLC 분획 결과를, 각각 하기 표 13 및 14 에 나타낸다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 나프틸아미드 고정상은, PCB 및 다이옥신과 π-π 상호작용이 가능하여, GC 분석을 위한 전처리 과정으로서 이를 이용한 HPLC 분리법에 의해 GC분석에서 머무름 시간이 유사한 동질체들을 HPLC 컬 럼에서 사전에 분획하는 방법은 수많은 동질체에 의해 발생하는 극미량 분석의 오차를 감소시키고, 동질체 간의 상호 방해 없이 개별적으로 분리시킬 수 있다.
Claims (10)
- PCB 및 다이옥신의 GC 분석을 위한 전처리 과정으로서 HPLC 분리법에 의해 PCB 및 다이옥신 동질체들을 HPLC 컬럼을 이용하여 사전에 분획하는데 사용되는 HPLC 컬럼용 고정상에 있어서, 상기 HPLC 컬럼용 고정상이 나프틸아미드 고정상임을 특징으로 하는 HPLC 컬럼용 고정상.
- 제 1 항에 있어서, 상기 나프틸아미드 고정상이 1-나프틸아미드 고정상 또는 2-나프틸아미드 고정상임을 특징으로 하는 HPLC 컬럼용 고정상.
- 제 1 항에 있어서, 상기 나프틸아미드 고정상이 아미노프로필 실리카겔과 1-나프토익산 또는 2-나프토익산의 커플링 결합에 의해서 제조된 것임을 특징으로 하는 HPLC 컬럼용 고정상.
- 커플링제의 존재 하에, 나프토익산을 아미노프로필 실리카겔, 아미노부틸 실리카겔 및 아미노펜틸 실리카겔로 이루어진 군으로부터 선택된 실리카겔과 커플링시키는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 따른 HPLC 컬럼용 고정상의 제조 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 커플링 반응이 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된 용매 중에서 수행됨을 특징 으로 하는 HPLC 컬럼용 고정상의 제조 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 커플링제가 EEDQ, EDC 및 에틸클로로포르메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미드 커플링제임을 특징으로 하는 HPLC 컬럼용 고정상의 제조 방법.
- 제 4 항에 있어서, 제조된 실리카겔 고정상에 존재하는 잔류 실라놀기를 말단처리제 (end-capping agent)의 존재하에 말단처리하는 것을 더 포함함을 특징으로 하는 HPLC 컬럼용 고정상의 제조 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 말단처리제가 하기 화학식을 갖는 화합물임을 특징으로 하는 HPLC 컬럼용 고정상의 제조 방법:
[식중, R 은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 펜틸로 이루어진 군으로부터 선택된 알킬이다]. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 HPLC 컬럼용 고정상 또는 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조된 HPLC 컬럼용 고정상을 충진한 것임을 특징으로 하는 HPLC 컬럼.
- PCB 및 다이옥신의 GC 분석을 위한 전처리 과정으로서 HPLC 분리법에 의해 PCB 및 다이옥신 동질체들을 HPLC 컬럼을 이용하여 분리한 후, 이를 GC분석으로 PCB 및 다이옥신을 분석하는 방법에 있어서, PCB 및 다이옥신를 포함하는 환경 시료를 사전에 분획하는데 사용되는 HPLC 컬럼으로서 제 9 항에 따른 HPLC 컬럼을 이용함을 특징으로 하는 PCB 및 다이옥신의 분석 방법.
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| KR1020040030544A KR100689779B1 (ko) | 2004-04-30 | 2004-04-30 | 나프틸아미드 고정상, 이를 충진한 액체크로마토그래피컬럼, 이 컬럼을 이용한 폴리클로로비페닐 및 다이옥신의분석방법 |
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