KR100689249B1 - Hiv 백신 - Google Patents

Abstract

신규한 HIV백신을 제공한다. 특히, 상기 백신은 무독성이고 비세포용해성인 재조합 HIV을 포함하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질의 천연 신호서열은 비세포용해성 신호서열로 치환되어 있고 바이러스의 nef유전자가 결실되어 있어 바이러스가 무독성이 된다.

Description

ＨＩＶ 백신{HIV VACCINE}

본발명은 AIDS 치료를 위한 신규한 백신 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 대량으로 생산될 수 있고 비세포용해성(non-cytolytic) 및 무독성(non-virulent) 백신에 관한 것이다.

최근에 항바이러스 치료의 발전에도 불구하고, AIDS 또는 HIV 감염에 대한 완전한 치료방법이 없다. 약물치료가 효과적인 치료를 제공한다는 점에서는 연구 유망성을 제시하나, 그 부작용, 승낙, 및 비용때문에 빨리 발전하고 있지 않다. 이러한 어려움에 더하여, 2000년까지 HIV감염의 90%가 발생할 것으로 추정되는 몇몇 개발도상국에 대해서, 상기 약물의 이용가능성이 제한되어 있다는 사실이다.

천연두 및 소아마비에 대해 가장 주목할 만한 성과, 즉 감염성 질환에 대한 백신의 성공으로, AIDS 에 대한 효과적인 백신에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있고, 다양한 연구가 시도되고 있다. 정말로, 대부분의 HIV-1백신의 개발은 서브유니트 백신에 집중되어 있다. 서브 유니트 백신 연구의 어려움은 최적의 면역성을 생산하는 능력이다. 현재, 자연적인 감염으로부터 보호에 HIV항원(들) 및 면역 체계의 성분이 필수적인 지 여부가 정확히 알려져 있지 않다.

초기 백신연구는 HIV-1 외피 단백질인 gp120과 같은 면역원에 기초를 둔 재 조합 서브유니트 단백질에 촛점이 맞추어져 있었다. 이들 시도의 결과에 의하면, 몇몇 개체에서 외피 특이적 CD8+CTL 및 HIV-1외피에 대한 무력화 항원 모두를 자극하는, 살아있는 재조합 바이러스 및 서브 유니트 단백질 모두를 이용하는 면역요법이 실망스러움을 알 수 있다(Cooney EL, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 1882-86; McElrath MJ, et al. J Infect Dis. 169:41-47 (1994); Graham BS, et al., J Infect Dis 166: 244-52(1992); and Graham BS, et al., J Infect Dis 167:533-37 (1993)).

HIV의 외피 당단백질의 연구로 부터 백신개발의 가능성에 대한 해답을 얻을 수 없었다. 예컨대, HIV-1 gp120과 관련하여 HIV-1 외피 당단백질 gp120의 신호서열은 HIV-1 천연 신호서열에 대한 NSS(Natural signal sequence)로 알려져 있으며, 이는 gp 120의 분비정도와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 점에서, 멜리틴 또는 IL-3 신호서열로 NSS를 치환함으로써 gp 120이 높은 수준으로 생산되고 효과적으로 분비됨을 나타낸다(Li, Y., et al., Virology 204:266-278 (1994); and Li, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:9606-9611 (1996)). 그러나, HIV-1 gp 120의 신호서열이 바이러스의 병원성에 기여하는 지 여부는 알려져 있지 않다.

바람직한 경로는, 전체, 불활성화된 바이러스 백신 예컨대 불활성화된 폴리오 바이러스 백신, 또는 약독화 생 바이러스 백신 예컨대 경구 폴리오백신의 전체 사용이다. 불행하게도, 부적합하게 불활성화된 폴리오 백신으로 인해 실제 임상 소아마비를 야기하는 "커터 사고(Cutter incident)"와 같은 문제가 생길 수 있어, AIDS 바이러스 백신 연구에서 이러한 접근은 너무 위험하다. 이전의 접근법은 야생 형 HIV-1의 사용에 관한 것이나, HIV-1에 감염된 T-세포주의 수율이 매우 낮기 때문에 사멸된 완전한 바이러스를 적합한 양으로 생산하는 것은 불가능하다(Coffin et al., Retroviruses, CSH Press, 1989). 수율을 증가시킬 수 있다고 가정한다면, 많은 부피의 감염성 HIV-1의 성장에 관한 잠재적인 문제 또한 중요하다.

HIV 백신과 관련하여, HIV nef 유전자를 결실시켜 바이러스를 약독화하는 것이 알려져 있다. 데스로지에르 와 그의 동료들은 nef-결실된 SIV로 짧은 꼬리 원숭이를 백신화함으로써 야생형 SIV 자극으로부터 보호된다는 것을 설명하였고(Daniels, M.D. et al., Science 258:1938 (1992); Desrosiers, R.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6353 (1989)), 다른 사람들은 nef유전자가 SIV 및 HIV의 복제에 필수적임을 설명하였다(Daniels. M.D. et al., Science 258:1938 (1992); Gibbs, J.S., et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 10:343 (1994); Igarashi, T., et al., J. Gen. Virol. 78:985 (1997); Kestler III, H.W., et al., Cell 65:651 (1991)). 더욱이, nef 유전자를 결실시킴으로써 정상적으로 감수성 있는 숙주에서 바이러스가 비병원성을 갖도록 한다(Daniels, M.D. et al., Science 258:1938 (1992)). 이러한 유전자 결실로는 대량 생산가능한 바이러스 형태를 제공하지 못한다. 또한, 이런 형태의 바이러스는 백신생산을 위한 안정성을 나타내지도 못했다.

따라서, 야생형 HIV-1을 사용하는 문제점 및 이전의 문제점이 없으면서도 대량으로 생산가능할 뿐만 아니라 무독성인 백신이 필요하다.

발명의 요약

본발명에 의하면, 사람의 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1)의 외피 당단백질 gp 120에 대한 천연신호서열(Natural Signal Sequence, NSS)이 바이러스에 감염된 세포의 일반적인 괴사 뿐만 아니라 세포사멸의 원인으로 밝혀졌다. 또한 본 발명자들은 더욱 효율적인 신호서열, 예컨대 멜리틴 또는 IL-3 신호서열로 NSS를 치환시킴으로써 gp 120을 매우 효율적으로 복제하고 분비할 수 있는 비세포용해성 HIV-1을 생산할 수 있음을 알았다. 결과적으로, 본발명은 높은 효율성으로 바이러스를 복제할 수 있어 레트로바이러스 백신을 제조하는데 유용한, 비세포용해성 레트로바이러스에 관한 것이다. 최대로 넓은 발명의 범위내에서, 본발명은 바이러스 외피 당단백질의 천연 신호서열이 변형되어 본질적으로 비세포용해성이 되거나 본질적으로 비세포용해성 신호서열로 치환된, 본질적으로 비세포용해성인 레트라바이러스를 제공한다.

본발명의 일예에 따라, 레트로바이러스 외피 당단백질의 천연 신호서열을 변형함으로써 바이러스, 바람직하게는 HIV를 더욱 효율적으로 복제할 수 있게 한다. 따라서, 본발명은 1개 이하 및 바람직하게는 0개의 양성 전하를 띤 아미노산을 얻도록, 양성 전하를 띤 아미노산을 제거, 바람직하게는 제거 또는 변형에 의해서 바이러스에 의한 세포 손상을 방지하기에 충분하도록 바이러스의 외피 당단백질의 천연 신호서열을 변형시키고, 매우 효율적으로 복제가능한, 본질적으로 비세포용해성인 재조합 HIV-1을 제공한다.

또다른 일례에서, 천연 신호서열을 치환함으로써 HIV가 더욱 효율적으로 복제된다. 따라서, 본발명은 바이러스 외피 당단백질의 천연 신호서열이 본질적으로 비세포용해성이고 더욱 효율적인 신호서열, 바람직하게는 1개 이하 더욱 바람직하게는 0개의 양성 전하를 띤 아미노산을 포함하며, 더욱 바람직하게는 멜리틴 신호서열(MSS) 또는 IL-3 신호서열(ILSS)을 포함하는 신호서열로 치환하여, 매우 효율적으로 복제가능한, 본질적으로 비세포용해성인 재조합 HIV-1을 제공한다.

또다른 일례에 따르면, 본질적으로 비세포용해성 바이러스는 무세포독성이다. 따라서, 본발명은 바이러스를 무독성으로 만드는 핵산서열의 첨가 또는 결실로 이루어지는, 무세포독성이고 본질적으로 비세포용해성인 레트로바이러스를 제공하며, 여기서 본질적으로 비세포용해성인 신호서열을 제공하도록 상기 바이러스 외피 당단백질의 천연 신호서열은 변형되거나 치환되어있다.

바람직한 일례에서, 비병원성으로 만들기에 충분하도록 nef유전자를 결실시키는 것을 포함하는, 무세포독성이고 본질적으로 비세포용해성 레트로바이러스를 제공하고, 여기서 더욱 효율적인 신호서열을 제공하기 위해서 바이러스 외피 당단백질 gp120의 NSS는 변형되거나 치환되어 있다.

본발명의 구체예에 따르면, 정상적으로 민감한 숙주에서 비병원성인 바이러스를 제조하기에 충분한 nef유전자 결실을 갖는, 무세포독성, 본질적으로 비세포용해성이고 매우 효율적으로 복제가능한 HIV-1을 제공하며, 여기서 바이러스 외피 당단백질 gp120의 NSS는 더욱 효율적인 신호서열, 바람직하게는 MSS 또는 ILSS로 치환되어 있다.

또다른 일면에서, 본발명은 본질적으로 비세포용해성인 재조합 레트로바이러스를 포함하는 레트로바이러스의 감염에 대한 백신을 제공하며, 여기서 본질적으로 비세포용해성 NSS을 제공하기 위해서 바이러스 외피 당단백질의 NSS가 변형되거나 본질적으로 비세포용해성 NSS로 치환되어 있다. 상기 재조합 레트로바이러스는 유전적 병이가 재조합 레트로바이러스에 포함되었음에도 보호 면역을 생성하는 데 필수적인 형태적 에피토페를 포함할 것이기 때문에 야생형 레트로바이러스에 대한 보호를 제공할 수 있다. 바람직하게는, 상기 레트로바이러스는 HIV, 더욱 바람직하게는 모든 다른 부류의 HIV-1이다.

또한, 본발명은 필요한 동물에게 충분한 양의 NSS에 대한 길항근(antagonist), 바람직하게는 항체 또는 안티센스 분자를 투여하는 것으로 이루어지는, 레트로바이러스 감염에 의해 유도되는 세포사멸을 방지하는 방법을 포함한다.

또한, 본발명은 필요한 동물에게 본질적으로 비세포용해성인 재조합 레트로바이러스를 투여하는 것으로 이루어지는, 레트로바이러스의 예방 또는 치료를 위한 방법을 포함하며, 여기서 본질적으로 비세포용해성인 NSS를 제공하기 위해서 바이러스 외피 당단백질의 NSS를 변형하거나 본질적으로 비세포용해성인 NSS로 치환한다.

본발명은 필요한 동물에게 HIV-1의 NSS를 포함하도록 가공한, 표적세포에 특이적인 재조합 바이러스를 투여하는 것으로 이루어지는, 본명세서에서 "표적"세포로 언급한 세포, 바람직하게는 암세포를 파괴하는 방법을 추가로 포함한다.

본발명은 본발명의 재조합 레트로바이러스에 의해 형질감염된 세포를 추가로 포함한다.

본발명의 다른 특징 및 잇점은 다음 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나 본 발명 요지 및 범위내에서 다양한 변화 및 변형은 다음 발명의 상세한 설명으로부터 본기술분야의 전문가에게 명백해질 것이기 때문에, 본발명의 바람직한 구체예를 나타내기 위한 발명의 상세한 설명 및 구체적인 예들은 단지 예시로서 제시된 것으로 이해되어야 한다.

재조합 레트로바이러스

상기한 바와 같이, 본발명은 본질적으로 비세포용해성인 레트로바이러스에 관한 것이며, 여기서 HIV-1 외피 당단백질 gp120(NSS)의 천연 신호서열이 변형되어 본질적으로 비-세포용해성이 되거나, 또는 본질적으로 비세포용해성인 신호서열로 치환된 것이다. 용어 "본질적 비-세포용해성"이란 본명세서에서 사용되는 바와 같이, 레트로바이러스가 감염된 세포를 상당히 손상시키거나 죽이지 않는 것을 의미한다.

일례에서, 본 발명은 매우 효율적인 복제능을 갖는, 본질적으로 비세포용해성인 재조합 HIV-1를 제공하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질의 NSS는 충분히 변형되어 상기 바이러스에 의한 세포손상이 방지되거나, 바람직하게는 양성 전하를 띠는 아미노산을 제거함으로써, 더욱 바람직하게는 그러한 제거 또는 변형의 결과 1개 이하 및 더욱 바람직하게는 0 개의 양성 전하를 띠는 아미노산으로 변형된다. 변형 또는 치환될 수 있는 상기 양성 전하를 띠는 아미노산은 라이신 및 알기닌을 포함한다.

또다른 예에서, 천연 신호서열을 치환함으로써 HIV가 더욱 효과적으로 복제 한다. 따라서, 본발명은 매우 효율적인 복제능을 갖는, 본질적으로 비세포용해성인 HIV-1를 제공하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질의 NSS가 본질적으로 비-세포용해성이고 더욱 효율적인 신호서열로 치환된다. 바람직한 일례에서, 멜리틴 또는 IL-3 신호서열로 HIV-1의 외피 당단백질의 NSS를 치환함으로써 레트로바이러스의 세포독성을 감소시켰다. 이와 같이, 본발명은 레트로바이러스를 본질적으로 비세포용해성으로 만드는 어떠한 신호서열에 의한 NSS의 치환도 본 발명의 범위내이다. 또한, 본발명자들은 멜리틴 또는 IL-3 신호서열로 NSS를 치환함으로써 세포독성의 감소뿐만 아니라 gp120의 생산 및 분비 수준이 증가함을 밝혔다. 또한 본발명자들은 NSS의 치환으로 υpu 유전자가 부분적으로 결실되었음을 밝혔다. 연구에 의하면, 바이러스 복제능에 어떠한 측정가능한 영향을 주지 않고 υ유전자를 완전히 결실시킬 수 있다(James, et al., AIDS Res. Human Retrovirus 10:343-350, 1994).

또다른 일례에서, 레트로바이러스에 무독성을 제공한다. 바람직한 예에서, nef 유전자를 제거함으로써 바이러스를 무독성으로 만든다. 따라서, 본발명은 무독성이고, 본질적으로 비-세포용해성인 레트로바이러스를 제공하며, 여기서 상기 바이러스는 바이러스를 비병원성으로 만들기에 충분한 nef 유전자 결실을 포함하며, 상기 바이러스의 외피 당단백질 gp120 의 코딩 서열은 더욱 효율적인 신호서열로 치환되어 있다. 본명세서에서 사용되는 바와 같이, "충분한 결실"이란 전사를 방지함으로써 nef 단백질 산물의 생산을 방지하기 위한, 서열의 충분한 결실을 의미한다.

추가의 일례에서, 레트로바이러스는 무독성이고 본질적으로 비세포용해성이며, 바이러스를 비병원성으로 만들도록 nef 유전자 및 υpu유전자의 충분한 결실을 포함한다.

본발명의 재조합 레트로바이러스는 HIV-1, HIV-2, SIV, HTLV-1을 포함하는 어떠한 레트로바이러스일 수 있다. 바람직하게는, 상기 레트로바이러스는 HIV-1 및 HIV-2중에서 선택된 사람 면역결핍 바이러스이고, 더욱 바람직하게는 HIV-1이다.

본 기술분야의 알려진 기술을 이용하여 본발명의 재조합 레트로바이러스를 제조할 수 있다. 일례에서, 숙주에서 레트로바이러스의 복제 및 발현에 적합한 조건하에 숙주세포로 레트로바이러스를 도입할 수 있다. 따라서, 또한 본발명은 재조합 레트로바이러스에 의해 형질감염된 세포를 제공하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질 gp120의 천연 신호서열이 변형되어 본질적으로 비세포용해성을 제공하거나, 본질적으로 비세포용해성인 신호서열로 치환된다. 상기 세포는 바람직하게는 T-림프구, 더욱 바람직하게는 형질전화된 세포주에서 유래되지 않은 T-세포이다.

본발명의 레트로바이러스는 숙주에 비병원성이 형태로 대량으로 생산되기 때문에, 본발명의 본질적으로 비세포용해성이고 무독성인 레트로바이러스는 레트로바이러스 감염을 예방 및 치료하는데 매우 유용할 것이며, 바람직하게는 본발명의 바이러스는 HIV감염의 예방 및 치료를 위한 HIV/AIDS 백신의 개발을 위해 유용할 것이다. 따라서, 또한 본발명은 필요한 동물에게 본발명의 본질적으로 비세포용해성이고 무독성인 재조합 레트로바이러스를 사멸하여 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 레트로바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 용어 "유효량"이라 함은 본명세서에서 사용되는 바와 같이 원하는 결과를 달성하기에 필요한 시간동안 유효한 투여량을 말한다. 용어 "동물"이란 본명세서에서 사용되는 바와 같이 포유동물, 바람직하게는 사람을 포함하는 모든 동물계의 일원을 포함한다.

바람직한 예에서, 본발명은 사멸된 재조합체로서 본질적으로 비세포용해성이고 무독성인 레트로바이러스를 이를 필요로 하는 동물에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 레트로바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질, 바람직하게는 gp120이 변형되어 본질적으로 비세포용해성이 되거나, 바람직하게는 nef유전자를 결실시킴으로써 상기 바이러스를 무독성으로 한다. 바람직한 일예에 따라서, 비세포용해성 NSS을 제공하는 변형의 결과, NSS서열에는 1개 이하의 양성 전하를 띤 아미노산, 더욱 바람직하게는 0개의 양성전하를 띤 아미노산이 있다. 가장 바람직하게는, 상기 동물은 사람이며, 레트로 바이러스는 HIV-1이다.

추가의 바람직한 예에서, 본발명은 사멸된 재조합체로서 본질적으로 비세포용해성이고 무독성인 레트로바이러스를 이를 필요로 하는 동물에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 레트로바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질, 바람직하게는 gp 120의 천연 신호서열이 본질적으로 비세포용해성인 신호서열로 치환되거나, 바람직하게는 상기 바이러스는 nef유전자의 결실로 무독성이 된다. 가장 바람직하게는 상기 동물은 사람이며, 레트로바이러스는 HIV-1이다.

NSS가 치환된 상기 방법의 바람직한 예에 따르면, 비세포용해성인 신호서열은 멜리틴 서열 및 IL-3 신호서열로 이루어진 군에서 선택된다.

백신

추가로 본발명은 무독성이고 본질적으로 비세포용해성인 레트로바이러스를 유효량으로 포함하는 백신을 포함하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질, 바람직하게는 gp120의 천연 신호서열이 본질적으로 비세포용해성 신호서열에 의해서 치환되며, 바이러스는 nef 유전자의 충분한 결실로 무독성이다. 상기 레트로바이러스는 또한 NSS 치환의 결과로 결실된 υpu 유전자의 일부분을 가질 수 있다. 바람직하게는 본질적으로 비세포용해성 신호서열이 멜리틴 서열 및 IL-3신호서열중에서 선택된다.

일예에 따르면, 레트로바이러스의 외피 당단백질의 천연 신호서열의 변형으로 바이러스, 바람직하게는 HIV가 더욱 효율적으로 복제하게 된다. 따라서, 본발명은 매우 효율적인 복제능을 갖는, 비세포용해성 재조합 HIV-1을 제공하며, 여기서 바이러스의 외피 당단백질의 NSS가 바이러스에 의한 세포손상을 방지하기에 충분히 변형되고, 바람직하게는 양성 전하를 띤 아미노산을 제거함으로써, 더욱 바람직하게는 그러한 제거 또는 변형의 결과 1개 이하의 양성 전하를 띤 아미노산, 더욱 바람직하게는 0개의 양성 전하를 띤 아미노산을 얻는다.

또다른 예에서, 비세포용해성 신호서열을 치환한 결과, HIV복제가 더욱 효율적이게 된다. 따라서, 본발명은 매우 효율적인 복제능을 갖는 비세포용해성 재조합 HIV-1을 포함하는 백신을 제공하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질의 NSS 가 비세포용해성이고 더욱 효율적인 신호서열, 바람직하게는 1개 이하의 양성 전하를 띤 아미노산를 포함하며, 바람직하게는 멜리틴 신호서열(MSS) 또는 IL-3신호서열(ILSS)로 치환된다.

또다른 일례에 따르면, 또한 본질적으로 비세포용해성인 레트로바이러스는 바람직하게는 nef유전자의 결실을 통해 비세포독성이 된다. 따라서, 본발명은 바이러스를 무독성으로 만드는 핵산 결실 또는 첨가를 포함하는 무독성이고 본질적으로 비세포용해성인 레트로 바이러스를 포함하는 백신을 제공하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질의 천연 신호서열이 변형되거나 치환되어 본질적으로 비세포용해성인 신호서열을 제공한다.

혹은, 상기 백신은 유효량의 무독성이고 비세포용해성인 레트로바이러스를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질 gp120의 천연신호서열이 변형되어 1개 이하의 양성 전하를 띤 아미노산, 바람직하게는 0개의 양성 전하를 띤 아미노산을 갖도록 양성 아미노산 수를 감소시키며, 상기 바이러스는 nef유전자의 충분한 부분의 결실로 무독성을 만든다.

따라서, 본발명은 또한 필요한 동물에게 본발명의 백신을 투여하는 것을 포함하는, 레트로바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 포함한다. 본명세서에서 사용되는 바와 같이, "백신"이란 모든 예방적 및 치료적 백신을 포함한다. 일예에 따르면, 백신은 무독성이고 본질적으로 비세포용해성인 재조합 레트로바이러스를 포함하며, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질의 NSS는 변형되어 본질적으로 비세포용해성인 NSS를 제공하거나, 본질적으로 비세포용해성인 NSS로 치환되며, 상 기 바이러스는 nef유전자의 충분한 부분의 결실로 무독성이 된다.

본발명의 백신 조성물은 생체내 생물학적으로 양립가능한 형태로 대상에 투여하기에 적합한다. 표현 "생체내로 투여하기에 적합한 생물학적으로 양립가능한 형태"라 함은 본명세서에서 사용되는 바와 같이 치료효과가 어떠한 독성효과보다 높은 형태로 투여되는 물질의 형태를 말한다. 상기 물질을 어떠한 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다.

본발명의 백신은 추가적으로 적합한 희석제, 부형제 및/또는 담체를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 상기 백신은 생체내에서 백신의 면역원성을 향상시킬 수 있는 부형제를 포함한다. 상기 부형제는 그램 음성 박테리아의 엔도톡신중 리피드-A 부분, 마이코박테리아의 트레할로스 디마이콜레이트, 포스포리피드 라이소레시틴, 디메틸딕타데실 암모늄 브로마이드(DDA), 어떤 직쇄 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌(POP-POE) 블록 폴리머, 알루미늄 히드록시드 및 리포좀을 포함하는 본기술분야의 알려진 부형제들중에서 선택될 수 있다. 또한 상기 백신은 GM-CSF, IL-2, IL-12, TNF 및 IFNγ을 포함하는 면역반응을 향상시키는 것으로 알려진 사이토킨을 포함할 수도 있다.

백신의 투여량은 환자의 질병상태, 나이, 성 및 체중 및 환자에게 원하는 반응을 유도하기 위한 항체능과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 최적 치료반응을 제공하기 위해서 투여량 요법을 조절할 수 있다. 예컨대, 수개의 나누어진 투여량으로 매일 투여하거나 치료 상황의 긴급성에 의해 나타나는 대로 투여량을 비례적으로 감소시킬 수 있다. 백신의 투여량은 또한 상황에 다른 최적 예방 투여량 반응 을 제공하기 위해서 다양하게 할 수 있다.

상기 백신을 주사(피하, 정맥내, 근육내, 기타등등)로, 경구투여로, 흡입으로, 경피 투여(국소크림 또는 연고, 기타등등), 또는 좌약과 같이 통상의 방법으로 투여될 수 있다.

세포사멸의 예방

또한, 본발명은 레트로바이러스의 NSS가 세포사멸을 일으키는 것을 방지하는 방법을 포함하며, 상기 세포사멸은 레트로바이러스 감염에 의해서 유도된다. 따라서, 본발명은 필요한 동물에게 NSS에 대한 길항근을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 세포사멸을 방지 또는 저해하는 방법을 제공한다. 상기 길항근은 NSS유전자, 또는 여기서 "NSS 단백질"로 언급한 이의 단백질 생산을 저해할 수 있는 물질일 수 있으며, 바람직하게는 상기 길항근은 항체 또는 안티센스 분자이다.

일례에서, 상기 길항근은 NSS 단백질 특이적 항체와 같은 NSS단백질을 저해하는 물질이다. Kohler 및 Milstein, Nature 256, 495 (1975) 및 미국특허 제 RE 32,011, 4,902,614호, 4,543,49호 및 4,411,993호에 기재된 방법과 같은 본 기술분야에 알려진 기술을 이용하여 NSS단백질에 대한 항체를 제조할 수 있다. (참조, 단클론 항체, 하이브리도마: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol(eds.), 1980 및 항체:A Laboratory manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, 이들 문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 본 발명의 문맥내에서, 항체는 단클론항체, 다클론 항체, 항체 단편(예, Fab 및 F(ab')2) 및 재조합적으로 생산된 결합 파트너 를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본발명은 NSS단백질을 저해하는 항체를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 레트로바이러스의 NSS의 효과를 저해하는 방법을 제공한다.

항체에 추가하여, NSS단백질에 결합하고 그 기능을 저해하는 다른 길항근 또는 리간드도 또한 사용가능하다. NSS 단백질에 결합하는 펩타이드에 대한 시료를 분석함으로써 NSS단백질 리간드를 확인할 수 있다. 공동-면역침전법, 교차결합 및 을 포함하여 단백질-단백질 상호작용을 탐지할 수 있는 어떠한 시스템 또는 테스트 방법도 사용가능하며, 농도구배를 통한 공동-정제 또는 크로마토그래피 칼럼도 사용가능하다. NSS 단백질-결합 펩타이드에 대해 생물적 시료 및 상업적으로 이용가능한 라이브러리를 테스트할 수 있다. 예컨대, 표지된 NSS단백질 또는 수용성 NSS단백질을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 탐지할 수 있다. 또한, NSS단백질에 결합하는 항체를 사용하여 NSS단백질에 결합하는 친화성으로 다른 펩타이드를 분리할 수 있다. 예컨대, 표지된 항체를 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리 또는 생물시료를 탐지할 수 있다. 추가로, NSS단백질을 코딩하는 핵산 서열을 사용하여 NSS 단백질에 결합하는 단백질를 코딩하는 핵산 또는 리간드에 대한 생물시표 또는 라이브러리를 탐지할 수도 있다.

또다른 예에서, NSS길항근은 NSS단백질의 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. NSS단백질을 저해하는 본발명의 방법에 NSS단백질 유전자의 핵산서열에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.

결론적으로, 본발명은 NSS단백질 유전자에서 얻은 핵산서열에 상보적인 안티 센스 올리고뉴클레오타이드 유효량을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는, 레트로바이러스의 NSS효과를 저해하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 레트로바이러스는 HIV-1이다.

용어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 본명세서에서 사용되는 바와 같이 그의 표적에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

용어, "올리고뉴클레오타이드"란 자연에 존재하는 염기, 당 및 당간(골격) 결합으로 이루어지는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 올리고머 또는 폴리머를 말한다. 또한 상기 용어는 자연에 존재하지 않는 모노머 또는 이와 유사하게 기능하는 이들 일부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 올리고머를 포함한다. 그러한 치환된 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드는 좋은 세포흡수 및 뉴클레아제의 존재시에 안정성이 높기 때문에 자연에 존재하는 형태보다 더 바람직할 수 있다. 또한 상기 용어는 2이상의 화학적으로 구별되는 영역을 포함하는 키메릭 올리고뉴클레오타이드도 포함한다. 예컨대, 상기 키메릭 뉴클레오타이드는 유리한 특성(예, 뉴클레아제에 대한 저항성 증가, 세포 흡수의 증가)을 부여하는 변형된 뉴클레타이드의 적어도 일부 영역을 포함하거나, 본발명의 2 이상의 올리고뉴클레오타이드가 공동으로 키메릭 올리고뉴클레오타이드를 형성할 수도 있다.

본발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보핵산 또는 데옥시리보핵산일 수 있고, 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 및 우라실을 포함하는 자연에 존재하는 염기를 포함할 수도 있다. 또한 상기 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같은 변형된 염기를 포함할 수도 있다:잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌, 5-할로 우라실, 5-할로 사이토신, 6-아자 우라실, 6-아자 사이토신 및 6-아자 티민, 슈도 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티올알킬 아데닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티올알킬 구아닌, 8-히드록실 구아닌 및 다른 6-치환된 구아닌, 다른 아자 및 데아자 우라실, 티미딘, 사이토신, 아데닌 또는 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 사이토신.

본발명의 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 인(phosphorous), 인골격중 산소 헤테로원자, 짧은 사슬 알킬 또는 시클로알킬 당간 결합 또는 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 당간 결합을 포함할 수도 있다. 예컨대, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트 및 포스포로디티오에이트를 포함할 수도 있다. 본발명의 일예에서, 4 내지 6 3-말단 염기사이의 포스포로티오에이트 결합이 있다. 또다른 예에서, 포스포로티오에이트 결합은 모든 뉴클레오타이드를 연결한다.

또한, 본발명의 안티센스 올리고뉴클레오타드는 치료제 또는 실험제로 더욱 적합할 수 있는 뉴클레오타이드 동족체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 동족체의 예는 펩타이드 핵산(PNA)이며, 여기서 이는 DNA (또는 RNA)상 상기 데옥시리보스(또는 리보스) 인산골격를 펩타이드에서 발결되는 것과 유사한 폴리아미드 골격으로 치환한 것이다(P.E. Nielsen, et al., Science 1991, 254, 1497). PNA 동족체는 효소에 의한 분해에 저항성이 있으며 생체내 및 시험관에서 살아있는 기간이 연장된 것으로 밝혀졌다. PNA사슬과 DNA사슬간의 전하반발이 약하기 때문에 또 한 PNA는 상보적인 DNA서열에 더 강하게 결합한다. 다른 올리고뉴클레오타이드는 폴리머골격, 고리형 골격 또는 비고리형 골격을 포함하는 뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다. 예컨대, 뉴클레오타이드는 몰폴리로 골격 구조를 가질 수도 있다(미국특허 제 5,034,506호). 또한 올리고뉴클레오타이드는 리포터 그룹, 올리고뉴클레오타이드의 약동역학적 특성을 향상시키는 그룹, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 약동역학적 특성을 향상시키는 그룹과 같은 그룹을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드도 또한 당 모양을 가질 수 있다.

본 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 화학적 합성 및 효소적 리게이션 반응을 사용하여 안티센스 핵산분자를 제조할 수 있다. 본발명의 안티센스 핵산 분자 또는 이의 단편은 천연 뉴클레오타이드, 또는 포스포로티오에이트 유도체와 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드와 같이 mRNA 또는 천연 유전자로 형성된 이중사슬의 물리적 안정성을 향상시키기나 분자의 생물학적 안정성을 향상시키기 위해서 고안된 다양한 변형된 뉴클레오타이드를 시용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 높은 효율성 조절영역의 조절하에서 안티센스 서열이 제조되는 재조합 플라즈미드, 파지미드 또는 약독화된 바이러스의 형태로 발현벡터를 세포에 도입하여 생물학적으로 안티센스 서열을 생산할 수 있으며, 그 활성은 벡터가 도입되는 세포유형에 따라 결정된다.

더욱이, 본발명은 또한 NSS를 포함하는 레트로바이러스와 테스트 물질을 NSS가 저해되는 조건하에서 반응시키고, 레트로바이러스가 세포사명을 유도하는 능력을 측정하고, 이를 테스트 물질이 없는 경우에 얻어지는 세포사멸능과 비교하는 것 으로 이루어지는, 레트로바이러스의 NSS의 활성을 저해하는 물징을 분석하는 방법을 제공한다.

종양세포의 사멸

추가로 본발명은 바람직하게는 HIV-1의 NSS을 포함하는 표적세포에 특이적인, 재조합 바이러스 바람직하게는 VSV, 또는 어떠한 다른 담체 RNA 바이러스를 유효량으로 이를 필요로 하는 동물, 가장 바람직하게는 사람에게 투여하는 것으로 이루어지는, 표적세포, 바람직하게는 종양세포을 사멸 또는 파괴하는 방법을 포함한다. 감염되었거나 종양성 세포는 HIV-1의 NSS가 포함된 적합한 벡터에 포함될 수 있는 상보적인 인식자리에 대한 세포 특이적 마커를 발현한다. 이러한 접근은, CD4 및 CXCR4 유전자를 포함하도록 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 가공함으로써 변형된 VSV를 HIV-1에 감염된 세포로 표적화하는데 사용되었다(Schnell, M.J. et al., Cell 90:849-857 (1997)). 따라서, 본발명은 표적세포에 특이적인 인식자리 및 NSS를 포함하는 재조합 바이러스를 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는, 표적세포 예컨대 종양세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 구체예에서, HIV-1의 NSS를 변형된 VSV-유사 벡터에 도입하고, 특별한 종양세포 표면 항원에 기초한 특이한 종양세포 유형에 이 벡터를 표적화함으로써, 표적화 종양세포의 사멸을 유도할 수 있는 능력을 갖는 VSV를 제공한다.

다음의 비제한적인 실시예는 본 발명을 예시하는 것이다 .

도 1은 재조합 베큘로 바이러스(AcNPV)가 감염된 SF2/곤충세포를 현미경으로 조사한 사진이다.

도 2는 HIV-1 env 신호서열이 세포사멸에 미치는 영향을 설명하는 그래프이다.

도 3은 다른 신호서열을 갖는 gp120을 발현하는 재조합 AcNPV로 감염된 SF21세포의 DNA단편 분석을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 결과이다.

도 4는 HIV-1 env 천연 신호서열의 존재유무에 따른 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G(VSV-G)을 발현하는 재조합 베큘러바이러스로 감염된 SF21의 DNA단편분석을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 결과이다.

도 5는 신호서열이 없는 VSV-G단백질의 재조합 플라스미드 구조를 나타낸다.

도 6는 NSS을 포함하는 HIV-1 gp120의 구조를 나타내다.

도 7은 HIV-1 env의 천연 신호서열을 갖는 VSV-G 단백질 유전자를 포함하는 플라스미ㄷ pBSK VSV-G-NSS의 예시이다.

도 8은 EcoR1-Bam H1은 p블루스크립트 SK 벡터에서 pNL4-3의 서브클로닝된 단편을 포함하며, 재조합 플라스미드 구조를 예시하고 있다.

도 9는 Pst I + Bam H 1 자리로 클로닝된 2245bp 단편을 포함하는 재조합 플라스미드 구조의 예시이다.

도 10은 EcoR1 및 Pst-I으로 분해한 PCT산물(445bp 단편)을 포함하는 재조합 플라스미드 구조의 예시이다.

도 11은 멜리틴 신호서열 또는 인터루킨-3 신호서열중 어느 하나를 코팅하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 플라스미드 구조의 예시이다.

도 12는 벡터의 Bam HI-Xho I자리에서 nef 유전자를 코팅하는 서열으로부터 분리된 421bp 단편을 포함하는 재조합 플라스미드 구조의 예시이다.

실시예 1

재조합 배큘로바이러스의 제조

HIV-1 gp120-NSS, gp120-MSS, 및 gp120-△S을 발현하는 재조합 베큘로바이러스의 제조는 Li등의 저서에 상세히 기재되어 있다(Li et al., Virology 204:266-278, 1994).

VSV_Ind 당단백질(G)을 발현하는 재조합 베큘로바이러스의 제조는 Bailey등의 Virology 169:323-331, 1989에 기재되어 있다.

HIV-1 env 신호서열을 갖는 VSV_Ind G 단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스의 제조:

VSV-G단백질의 신호서열을 치환하기 위해서, 본발명자들은 먼저 두가지 프라이머을 사용하는 PCR로 VSV단백질(VSV-G-NSS)를 제조하였다.

프라이머 #1:(5' 프라이머) (서열 번호 1)

프라이머 #2: (3' 프라이머) (서열 번호 2)

플라스미드 pwK1(이는 미국 버지니아 대학교의 로버트 알, 와그너 박사가 제공한 VSV_Ind 완전한 길이의 G 유전자를 포함)를 주형으로 하여, 각 프라이머 1.0 M 와 주형으로 pwK1 20 ng으로 Perkin-Elmer Cetus Thermocycler(한 주기는 94℃, 1분; 45℃ 2분; 72℃ 3분)의 PCT 30주기로 GENE amp 키트로 증폭하였다.

모든 프라이머는 5'말단 BamH1 부위을 가지고 있어 증폭된 VS-G-△S DNA 단편을 플라스미드 pBluescript SK VECTOR(Stratagene)의 BamH1자리에 삽입할 수 있다. T7 프로모터쪽 VSV-G-△S의 5'말단을 갖는 클론을 선택하여 Sph1과 Xho1 제한효소로 분해하였다. 상기 벡터를 도 5에 나타냈다.

HIV-1 신호서열의 증폭

다음의 두가지 프라이머를 사용하는 PCR로 pBluescript-gp120-NSS로부터 env 유전자의 HIV-1 신호서열을 증폭하였다.

프라미어 #1: (T7 프라이머) (서열 번호 3)

5'-AAT ACG ACT CAC TAT-3'

프라이머 #2: (HIV-1신호서열 유전자의 C-말단에 상보적) (서열 번호 4)

이를 도 6에 예시하였다. HIV-1 신호서열을 포함하는 증폭된 DNA단편을 Xho I 및 Sph I 제한효소로 절단하고 Xho I 및 Sph I으로 절단된 벡터, pBluescript VSV-G-△S 에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 pBSK VSV-G-NSS로 지명하고, 추가로 DNA 서열분석을 통해 상기 플라스미드의 구조를 확인하였다. 이를 도 7에 나타 냈다.

VSV-G-NSS의 BamH1 단편을 베큘로바이러스 pAcYM1의 BamH1 자리에 도입하고(Li등의 virology 204:266-278), 표준 형질감염 방법에 의해서 VSV-G-NSS를 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 생성하였다(Li et al., Virology 204:266-278).

실시예 2

재조합 베큘로바이러스로 감염된 세포에 대한 현미경 조사

재조합 AcNPV 5 pfu/세포 moi로 SF21세포를 감염시키고 27℃에서 48시간동안 배양하였다. 위상차 현미경으로 상기 감염된 세포를 조사하였다. 얻어진 결과를 도 1에 나타냈다. (A) 야생형 AcNPV-감염된 세포; (B) vAcgp 120-NS-감염된 세포(HIV-1 천연신호서열을 갖는 rgp120은 세포용햇을 나타냄); (C) vAcgp 120-△S -감염된 세포; (신호서열이 없는 rgp120은 완전한 세포를 나타냄); (D) vAc8gp120-MS-감염된 세포 (멜리틴 신호서열을 갖는 rgp 120는 완전한 세포를 나타냄); (E) vAcVSV-G-감염된 세포(VSV G단백질은 완전한 세포를 나타냄); (F) vAcVSV-G-NS-감염된 세포 (HIV-1 env 천연 신호서열을 갖는 VSV G단백질은 세포용해을 나타냄).

상기 결과에 의하면, HIV-1 env 신호서열은 세포를 빠르게 사멸시킴을 알 수 있다.

실시예 3

HIV-1 env 신호서열의 세포 사멸에 미치는 영향

트립판 블루 분석:

재조합 AcNPV 5 pfu/세포 moi로 SF21세포를 1시간동안 감염시키고, 상기 접종원을 제거하고 10% 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 완전한 TNM-FH배지로 배양하였다. 감염후 24, 48, 및 72시간에, 세포를 트립판 블루(GIBCO, BRL)로 5분간 앱식하고, 현미경하에서 상기 세포를 세었다. 사멸된 세포 퍼센트를 다음 공식에 의해서 결정하였다:

락테이트 데하이드로게나제 방출분석(LDRA):

제조자의 지시대로(Boehringer Mannheim Cytotoxicity Detection Kit) 상기 LDRA를 수행하였다.

재조합 AcNPV 5 PFU/세포 moi로 SF21세포를 1시간동안 감염시키고, 접종원을 제거하고 완전한 배지에서 27℃에서 배양하였다. 상기 배양배지를 12시간의 규칙적인 간격으로 수집하여 1분간 12,000rpm으로 원심분리하였다. 배양액 상등액을 10배로 희석하여 100㎕ 상등액을 100㎕의 반응 혼합물(세포독성 탐지 키트)과 실온에서 30분간 반응시켰다. 마이크로판 (ELISA) 탐독기(Bio-Rad 550)을 사용하여 형성된 포마젠 염료를 정량화함으로써 490 nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다.

트립판 블루 및 락테이트 데하이드로게나제 방출 분석의 결과를 도 2A 및 2B에 각각 나타냈다. 도 2A: 다른 신소서열을 갖는 rgp 120 또는 VSV-G 단백질을 발현한 후에 트립판 블루(사멸세포)가 투과된 세포의 퍼센트. 도 2B:락테이트 데하이드게나제 (LDH) 방출 분석(Boehringer Mannheim's Cytotoxicity Detection Kit).

다른 신호서열을 갖는 rgp 120 또는 VSV-G을 발현하는 재조합 바이러스로 감염된 SF21세포에서 방출되는 LDH의 양을 490nm에서 읽은 ELISA판에서 형성된 포마잔을 정량화함으로써 측정하였다.

결론적으로, HIV-1 env 천연 신호서열을 갖는 rgp 120 및 VSV-G는 세포를 더 빨리 사멸시킨다. HIV-1 env 천연 신호서열 또는 멜리틴 신호서열을 갖지 않는 경우에는 세포가 더 오래 생존한다. HIV-1 env 천연신호서열은 빠른 세포사멸의 원인이다.

실시예 4

세포사멸의 조사:

전체 DNA 추출방법

재조합 AcNPV 5 pfu/세포 moi로 SF21 세포(3 x 10⁶)를 1시간동안 감염시켰다. 접종원을 제거하고 완전한 배지에서 27℃에서 1시간동안 배양하였다. 10분간 2500rpm에서 세포를 응집하고 TSE(10 mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA, 1% SDS에 최종농도가 10 ㎕/ml가 되도록 프로테아제 K를 추가함)로 추출하였다. 그런후에, 샘플을 37℃에서 2시간동안 배양하고, 배양 말기에 NaCl을 최종 농도 1M이 되게 첨가하고, 샘플을 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 마지막으로, 에탄올(100%)을 첨가하여 DNA을 침전시키고(15분간 80℃), 상기 DNA침전물을 15분간 12,000rpm으로 마이크로-원심분리를 하여 펠렛을 형성하였다. 상기 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 1회 세척하고 RNase A(50 /ml)를 포함하는 TE(10 mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁하고, 1.2% 아가로스 겔상에서 전기영동하고, 에티듐 브로마이드로 염색하였다(N, Chejanovsky and E. Gershburg, Virology 209: 519-525, 1995). 얻어진 결과를 도 3에 나타냈다. 전체 세포 DNA (A), 또는 저분자 DNA (B)를 감염후 48시간에 추출하고, 에티올륨 브로마이드의 존재하에 1.2% 아가로스겔상 전기영동으로 분석하였다. 레인 M, DNA 마커; 레인 WT, 야생형 AcNPV-감염된 세포; 레인 △S -감염된 세포 (신호서열이 없는 rgp120); 레인 NSS, vAcgp120-NS-감염된세포(HIV-1 env 천연신호서열)을 갖는 rgp120);레인 MSS, vAcgp120-MS-감염된 세포(멜리틴 신호서열을 갖는 rgp120). 상기 결과에 의하면, HIV-1 env 천연 신호서열을 세포사멸을 포함한다.

단편화된 DNA의 추출

5 pfu/세포 moi로 vAcVSVG(VSV-G) 또는 vAcVSV-G-NSS(VSV-G-NSS)로서 SF21세포를 감염하고 27℃에서 48시간동안 배양하였다. 감염후 48시간이 경과한 후에, SF21 세포(3 x 10⁶)를 2500 rpm에서 5분간 펠렛을 제조하고, 10mM Tris HCl(pH 8.0), 10mM EDTA, 0.5% 트리온 X-100을 포함하는 용액에서 용혈시키고, 엔펜도르프 마이크로 원심분리를 25분간 12,000rpm에서 수행하여 염색체 DNA를 펠렛으로 제조하였다. 상등액을 1 ml당 0.1 mg의 RNase A로 37℃에서 1시간동안 분해시키고, 1% SDS의 존재하에서 50℃, 1 ml당 1 mg 프로테아제 K로 2시간동안 분해하고, 페놀과 클로로포름으로 추출하고, 찬 에탄올로 침전시켰다. 상기 침전물을 TE에서 재현탁하고, 1 ml당 5㎍ 의 에티듐 브로마이드을 함유하는 11.5% 아가로스 겔상에서 전기영동을 수행하였다. UV조사로 DNA을 보이게 하였다(Rosario Leopardi and Bernard Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9583-9587, 1996).

얻어진 결과를 도 3, 패널 B 및 도 4의 패널 B에 나타냈다.

실시예 5

부분적인 υpu 및 nef 결실 그리고 NSS치환을 포함하는 재조합 HIV-1의 제조

1. NSS치환(MSS, IL-3 또는 다른 신호서열을 포함)과 υpu결실을 포함하는 플라스미드 pNL4-3의 제조

감염성 HIV-1 프로바이러스 DNA 단독, pNL4-3(국립보건원의 NIADI, AIDS부서, AIDS연구 및 참조시약 프로그램을 통해 말콤 마틴박사가 제공함, Adachi et al., J. Virol. 59:284-291, 1986)은 두개의 독특한 제한효소자리를 포함한다:EcoRi(5744위치) 및 BamH1 (위치 8466). 상기 env유전자를 코팅하는 영역은 6221 위치에서 8785위치이다. HIV-1 env의 천연신호서열을 멜리틴, IL-3 또는 다른 분비 단백질의 신호서열로 치환하기 위해서는, pNL4-3의 EcoR1-BamH1 단편을 아가로스 겔로부터 분리하고, 도 8에 예시된 바와 같이 pBluescript SK 벡터의 EcoR1-BamH1자리로 서브클로닝한다. 이 산물로부터, 다음과 같은 4가지 프라이머가 지정된다:

프라이머 # 1(정방향) (서열 번호 5)

프라이머 # 2(역방향) (서열 번호 6)

프라이머 # 3 (정방향) (서열 번호 7)

프라이머 # 4(역방향) (서열 번호 8)

주형 pBSK-env와 프라이머 #1, #2을 사용하여 PCR을 수행하여 env 영역의 왼쪽 부분, 477bp 단편을 증폭한다. 이와 유사하게, env 의 오른쪽 영역, 2245bp을 증폭하기 위해서는 프라이머 #3, #4를 사용한다. EcoR1-Pst 1 PCR 산물(477bp 단편)을 EcoR1 + Pst 1으로 분해하고, Pst1-BamH1 PCR 산물(2245 bp 단편)을 Pst1 + BamH1으로 절단한다. 그런 후에, 도 9에 도시된 바와 같이 Pst1-BamH1으로 절단된 2245bp 단편을 pBSK벡터의 Pst1 + BamH1 자리로 클로닝하였다.

그런후에, pBSK-2245 을 EcoR + Pst 1으로 절단하고 EcoR1 + Pst 1으로 절단한 PCR산물과 라이게이션하여, 도 1에 나타낸 플라스미 pBSK-env-△S를 얻었다.

상기 플라스미드 pBSK-env-△S를 Pst1 + Nco 1으로 분해한 후에, MSS, IL-3 신호서열 또는 어떠한 다른 원하는 신호서열을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오타이드와 라이게이션시켰다. 이러한 합성 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에 Pst 1을 포함하고, 3'말단에 Nco1을 포함한다. 벡터로 접합시키기 전에, 이들 이중 사슬 올리고뉴클레오타이드를 먼저 Pst1 + Nco1으로 절단하였다.

A. 멜리틴 신호서열을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오타이드 ((+)서열만을 나타냄, 서열 번호 9):

인터루킨-3 신호서열을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오타이드:((+)서열만을 나타냄, 서열 번호 10):

얻어진 재조합 플라스미드는 도 11에 나타냈다.

바르게 변형되었는지를 확인하기 위한 서열분석을 한 후에, 플라스미드를 EcoR1 + BamH1으로 분해하여 EcoR1-BamH1단편을 분리하고, pNL4-3 DNA 벡터의 EcoR1-BamH1 자리에 다시 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 pHIV-1-MSS (또는 pHIV-1-IL-3SS)로 명명하였다.

추가로, 상기 제조동안에 NSS를 MSS 또는 IL-3 신호서열로 치환하고, 또한 부분적인 vpu 서열을 결실시켰다. 상기 vpu은 82aa 및 이의 3'말단은 HIV-1 env유전자의 신호서열과 약 28aa가 중첩된다. 그러나, 이것은 다른 리딩 프레임을 갖는다(-1 리딩 프레임). 연구에 의하면, vpu 또는 nef유전자의 결실로 침팬지 PBMCs, 사람 PBMCs, 또는 B/T 하이브리드 세포주 CEM x 174상에서 바이러스의 복제를 변화시키지 않는다(James et al., AIDS Res. Human Retrovirus 10:343-350, 1994). 따 라서, 프라이머 #1, #2를 사용하여 env 의 왼쪽 부분 455bp 단편을 PCR 증폭하는 동안에, 두가지 종료 코돈을 env유전자의 개시코돈앞에 첨가함으로써 vpu의 28aa를 결실시킨다(프라이머 #2를 참조).

2. nef결실을 포함하는 플라스미드 제조

nef 유전자 코딩서열은 pNL4-3 프로바이러스의 DNA클론에서 8787위치에서 시작하고 9407에서 종료한다. 또한 두가지 독특한 제한효소부위를 갖는다:env 유전자의 8466자리에 Bam H1, nef유전자의 8887bp자리에서 Xho1. nef유전자를 결실시키기 위해서, 플라스미드 HIV-1 MSS (또는 IL-3SS)을 BamH1과 Xho1으로 절단하였다. 얻어진 421bp짜리 BamH1-Xho! 단편을 분리하고, 도 12에 나타낸대로 pBSK벡터의 BamH1-Xho1자리에 서브클로닝하였다. 두가지 프라이머를 고안하였다:

프라이머 #5(정방향):(서열 번호 11)

프라이머 #6 (서열 번호 12)

본 본발명에 따르면 nef유전자는 260aa을 코딩한다. 두 종료코돈을 Xho1자리에 삽입함으로써 33aa만을 코팅하는 nef가 얻어진다. PCT증폭 및 BamH1 + Xho1분해후에, 이 421bp짜리 PCR DNA 단편을 BamH1-Xho1 pHIV-1-MSS (또는 IL-3SS)벡터로 다시 클로닝하였다. 얻어진 재조합 플라스미드는 NSS치환, 백신 테스트에 사용되는 부분적인 vpu 및 nef결실을 포함한다.

상기 바람직한 실시예를 참고로 한여 본발명을 설명하였으나, 본발명을 상기 기재된 실시예에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 반대로, 본발명은 다양한 변화 및 동등한 배합이 첨부된 청구범위의 본질 및 보호범위에 포함하는 의도이다.

여기서 언급한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 구체적으로 각각 참고문헌으로 병합한다고 나타낸 바와 같이 그 전체로서 참고문헌으로 병합한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (31)

1. 사람 면역 결핍 바이러스-1(HIV-1)의 외피 당단백질의 천연 신호서열(natural signal sequence, NSS)이 멜리틴 신호서열(MSS) 또는 IL-3 신호서열(ILSS)로 치환되고, HIV-1은 nef 유전자의 결실로 무독성이 된 것인 비세포용해성 재조합 HIV-1.
2. 제 1 항에 있어서, 멜리틴 신호서열은 서열 번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것인 비세포용해성 재조합 HIV-1.
3. 제 1 항에 있어서, IL-3 신호서열은 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것인 비세포용해성 재조합 HIV-1.
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9. HIV-1의 외피 당단백질의 NSS가 멜리틴 신호서열 또는 IL-3 신호서열로 치환되고, nef 유전자의 결실로 무독성이 된 비세포용해성 재조합 HIV-1을 유효량으로 이를 필요로 하는 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, HIV-1 감염의 예방 또는 치료 방법.
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15. HIV-1의 외피 당단백질의 NSS가 멜리틴 신호서열 또는 IL-3 신호서열로 치환되고, HIV-1은 nef 유전자의 결실로 무독성이 된 것인 비세포용해성 재조합 HIV-1을 포함하는 백신.
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21. 제 15 항에 있어서, 부형제를 추가로 포함하는 백신.
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24. HIV-1의 외피 당단백질의 NSS 및 표적세포에 특이적인 인식자리를 함유하는 재조합 바이러스 VSV를 유효량으로 인간을 제외한 동물의 표적세포에 투여하는 것을 포함하는, 표적세포의 사멸 방법.
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26. 항체, 안티센스 분자 및 단백질 리간드로 이루어진 군에서 선택되는, HIV-1의 외피 당단백질의 NSS에 대한 길항근을 유효량으로 이를 필요로 하는 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, HIV-1의 외피 당단백질의 NSS에 의해 유도되는 세포사멸의 예방 방법.
27. 삭제
28. 제 26 항에 있어서, 길항근은 HIV-1의 외피 당단백질의 NSS에 대한 항체인 것인 방법.
29. HIV-1의 외피 당단백질의 NSS 유전자에 대한 핵산서열에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유효량으로 이를 필요로 하는 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, HIV-1의 외피 당단백질의 NSS 효과의 저해 방법.
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