KR100688443B1 - Serum-free cryopreservation liquid composition and method of cryopreservation for long-term preservation of cellular artificial tissue - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포성 인공조직의 반영구적인 보관을 통하여 품질과 제고관리를 가능케 하고, 대량생산을 위한 안전하고 효율적인 세포성 인공조직의 장기보관이 가능하여 세포성 인공조직을 동결 및 해동하는 과정에서 동반되는 손상을 최소화하여 해동 후 세포성조직 내 세포의 생존율을 높이고 사멸 정도를 최소화하며, 인공조직 내 생물학적 기능을 반영구적으로 보관, 유지하는데 적당한 세포성 인공조직의 장기보관이 가능한 무혈청성 동결보존액 및 이를 이용한 세포성 인공조직의 동결보존방법을 제공하기 위한 것으로서, 본 발명의 세포성 인공조직의 장기보관을 위한 동결보존액은 5~20%범위의 디메틸설폭사이드(DMSO) 동결방지제와, 상기 동결방지제를 인공조직과 세포로 전달하기 위한 80~95% 범위의 UW(University of Wisconsin)용액으로 이루어진 것을 특징으로 한다.The present invention enables quality and upkeep management through semi-permanent storage of cellular artificial tissues, and enables long-term storage of safe and efficient cellular artificial tissues for mass production, accompanied in the process of freezing and thawing cellular artificial tissues. Serum-free cryopreservation solution capable of long-term storage of cellular artificial tissues suitable for semi-permanent storage and maintenance of biological function in artificial tissues by minimizing damage, enhancing cell survival after thawing, minimizing the degree of death, and As to provide a cryopreservation method of the cellular artificial tissues used, cryopreservation solution for long-term storage of cellular artificial tissues of the present invention is a 5-20% range of dimethyl sulfoxide (DMSO) cryoprotectant and the cryoprotectant 80% to 95% of UW (University of Wisconsin) solution for delivery to artificial tissues and cells And a gong.
UW용액, 디메틸설폭사이드, 인공조직, 생존율 UW solution, dimethyl sulfoxide, artificial tissue, survival rate
Description
도 1a는 동결보존액으로서 DMEM/F-12(10 FBS)를 사용한 경우의 세포성 인공조직의 조직학적 검사에 따른 세포의 사멸, 세포내부의 팽창 및 공포로 인한 세포의 변성여부를 투과전자현미경으로 촬영한 화면Figure 1a is a transmission electron microscope to determine whether the cell death due to the histological examination of cellular artificial tissue using the DMEM / F-12 (10 FBS) as cryopreservation, denaturation of cells due to expansion and fear within the cells Screen shot
도 1b는 동결보존액으로서 HTS+10% DMSO를 사용한 경우의 세포성 인공조직의 조직학적 검사에 따른 세포의 사멸, 세포내부의 팽창 및 공포로 인한 세포의 변성여부를 투과전자현미경으로 촬영한 화면 FIG. 1B is a transmission electron microscope image showing whether cell death due to histological examination of cellular artificial tissue, intracellular expansion, and fear due to histological examination using HTS + 10% DMSO as a cryopreservative.
도 1c는 본 발명의 실시 예에 따른 동결보존액으로서 UW용액+10% DMS)를 사용한 경우의 세포성 인공조직의 조직학적 검사에 따른 세포의 사멸, 세포내부의 팽창 및 공포로 인한 세포의 변성여부를 투과전자현미경으로 촬영한 화면Figure 1c shows the degeneration of cells due to apoptosis, expansion and fear of cells according to histological examination of cellular artificial tissue when UW solution + 10% DMS) as a cryopreservation solution according to an embodiment of the present invention Screen shot with transmission electron microscope
도 2는 본 발명의 실시 예에 다른 동결 보존된 투과전자 현미경상의 섬유세포를 나타낸 도면FIG. 2 is a view showing fibrous cells on a cryopreserved transmission electron microscope according to an embodiment of the present invention. FIG.
본 발명은 조직공학적 기법으로 배양하여 제조된 세포성 인공조직의 기능과 생명력을 반영구적으로 보관하기 위한 동결보존액의 조성과 그 동결보존방법에 관한 것으로서, 세포성 인공조직을 장기간 동결보관한 후 인공조직 내 섬유모세포의 생존을 유지하고 사멸을 억제하여 인공조직의 기능을 반영구적으로 보존 유지하는데 적당한 세포성 인공조직의 장기보관을 위한 무혈청성 동결보존액 및 이를 이용한 세포성 인공조직의 동결보존방법에 관한 것이다.The present invention relates to the composition of cryopreservation liquid and its cryopreservation method for semi-permanent storage of the function and vitality of cellular artificial tissue prepared by histological engineering, artificial tissue after cryopreserving cellular artificial tissue for a long time The present invention relates to a serum-free cryopreservation solution for long-term storage of cellular artificial tissue suitable for maintaining the survival of intracellular fibroblasts and inhibiting death by permanently preserving the function of artificial tissue, and a cryopreservation method of cellular artificial tissue using the same. .
일반적으로, 사고나 질병에 의해 결손 혹은 손상된 조직은 인체조직 및 동물 조직의 이식으로 치료가 가능하다. 하지만, 이러한 경우 조직의 공급부족, 면역거부반응, 감염 등의 조직이식에 있어서 한계가 있다. 따라서 인체 및 동물 조직을 대체할 수 있는 인공조직의 개발이 필요하다.In general, tissues that are missing or damaged by accidents or diseases can be treated by transplantation of human tissues and animal tissues. However, in this case, there is a limit in tissue transplantation such as lack of tissue supply, immune rejection reaction, infection. Therefore, there is a need for the development of artificial tissue that can replace human and animal tissue.
심제성 궤양 치료에 있어서 비세포성 인공조직 혹은 인체피부의 경우 상처 주위 조직에서 혈관 및 세포가 인공조직 내로 성장하여 인체조직과 융합하여야만 이식편이 생착되어 상처가 치유된다. 그러나 당뇨병 혹은 혈관 부전성 환자의 경우는 상처수복능력이 떨어져 이식조직과 주위조직 사이의 세포 성장이 부족하여 이식 후 조직이 박리되는 문제가 자주 발생한다. 이로 인해 혈관구조의 손상이 광범위하고 혈관재생능력이 떨어진 환자에서의 조직결손은 인공조직의 초기 생착률을 높이기 위하여 살아있는 세포와 그 세포에서 생성한 세포외기질로 구성된 세포성 인공조직의 이식을 통한 치료가 시도되었고, 치료효과 즉 상처 회복률이 우수하여 당뇨병성 피부궤양 환자를 대상으로 임상적으로 사용되고 있다.In the treatment of cardiac ulcers, in the case of noncellular artificial tissue or human skin, blood vessels and cells grow in artificial tissues from the surrounding tissues and fuse with human tissues so that the grafts engraft and heal. However, in the case of diabetic or vascular insufficiency, the wound repair ability is poor, and there is a problem in that tissue is detached after transplantation due to insufficient cell growth between the transplanted tissue and the surrounding tissue. As a result, tissue defects in patients with extensive vascular damage and poor vascular regeneration are treated by transplantation of cellular artificial tissue composed of living cells and extracellular matrix produced by the cells to increase the initial engraftment rate. Has been tried and is used clinically in diabetic skin ulcer patients because of its excellent therapeutic effect, that is, wound recovery rate.
이러한 세포성 인공조직의 실용화를 위해서는 적절한 품질관리와 제고관리가 필수적이다. 인체에서 피부조직을 분리하고 확대 배양하는데 필요한 시간은 최소 2주에서 3주이고, 확대 배양한 세포를 이용하여 세포성 인공조직 혹은 세포성 인공피부를 제조하는데 소요되는 시간은 약 1주에서 2주가 요구된다. 따라서 세포성 인공조직을 공급에 필요한 시간적 한계로 인하여 수요요청에 따라 원하는 기간 내에 원하는 세포성 인공조직을 생성하여 공급하는 것은 비현실적이며, 또한 균일한 품질과 생물학적 유효성과 안정성을 유지하기란 어렵다. 이러한 문제를 타계하기 위하여 생물학적 안전성, 기능성과 품질관리를 위한 반영구적인 세포성 인공조직의 보존을 위한 방법이 요구되었다.Appropriate quality control and improvement management are essential for the practical application of these cellular artificial tissues. The time required to separate and expand the skin tissue from the human body is at least 2 to 3 weeks, and the time required to produce cellular artificial tissue or cellular artificial skin using the expanded cultured cells is about 1 to 2 weeks. Required. Therefore, it is unrealistic to produce and supply the desired cellular artificial tissue within the desired period according to the demand request due to the time limit necessary for supplying the cellular artificial tissue, and it is difficult to maintain uniform quality, biological effectiveness and stability. To overcome these problems, a method for preserving semi-permanent cellular artificial tissues for biological safety, functionality and quality control has been required.
살아있는 즉, 생명력과 기능성을 유지하면서 인체조직 혹은 세포성 인공조직을 보존하기 위한 방법으로는 크게 냉장보존과 냉동보존이 있다. 냉장보존은 저온에서 보관하여 조직 혹은 장기의 보존기간을 증가시키는 방법으로 그 대표적인 예가 미국특허 제4,798,824호 및 4,879,283호에 개시되어 있으며, 췌장, 간장, 신장, 피부 등과 같은 장기 및 조직의 단기간(24~72시간)의 운송과 보관을 위한 목적으로 개발되었다.The method for preserving human tissues or cellular artificial tissues while maintaining life, ie, vitality and functionality, is largely refrigerated and cryopreserved. Refrigerated preservation is a method of increasing the shelf life of tissues or organs by storing at a low temperature, and representative examples thereof are disclosed in US Pat. Nos. 4,798,824 and 4,879,283. Developed for the purpose of transportation and storage.
하지만, 이러한 냉장보존은 저온(4℃)상태에서 1주일 이내 혹은 대사반응이 활발한 조직 및 장기인 경우 1~3일 동안의 단기간 보존만 가능하여 환자의 수요에 따른 장기간 보존의 한계가 있었다.However, such cold preservation is limited to long-term preservation according to the patient's demand because only a short term preservation is possible within one week or in the case of tissues and organs with active metabolism at low temperature (4 ° C.) for one to three days.
이에 반하여, 냉동보존은 세포, 조직 및 장기를 -80~-196℃의 초저온 상태에서 보관하여 세포, 조직 그리고 장기 내 모든 대사반응을 정지시켜 원하는 세포, 조직 그리고 장기를 반영구적으로 보관하는 방법이다. 이 방법은 연구 및 치료목적으로 세포 및 조직을 반영구적으로 보관하기 위한 가장 이상적인 방법이며, 비영리 혹은 상업적 목적의 모든 세포 및 조직은행에서 세포 및 조직을 보관하기 위하여 사용하는 방법이다. On the contrary, cryopreservation is a method of semi-permanently storing cells, tissues and organs by storing cells, tissues and organs at cryogenic conditions of -80 ~ -196 ° C. to stop all metabolism in cells, tissues and organs. This method is ideal for semi-permanent storage of cells and tissues for research and treatment purposes, and is used for the storage of cells and tissues in all cells and tissue banks for non-profit or commercial purposes.
그러나, 동결과 해동과정에서 필연적으로 동반되는 얼음결정의 형성과 이온 및 삼투압의 불균형에 따른 세포 및 조직의 손상을 피할 수가 없으며, 장기 및 조직과 같은 치밀하고 복잡한 경우에서는 동결과 해동과정으로 인한 손상이 증대된다. 이러한 손상을 최소화하고 냉동 및 해동 후 생존율과 기능성을 극대화하기 위하여 해당 세포, 조직 그리고 장기의 생화학적, 물리적 특성에 따라 냉동 및 해동과정에서 동반되는 손상을 최소화하기 위한 냉동보존액의 개발과 냉동방법의 개발은 매우 중요하다.However, damage to cells and tissues due to the formation of ice crystals and the imbalance of ions and osmotic pressures, which are inevitably accompanied by freezing and thawing, cannot be avoided. Is increased. Development of cryopreservation solution and freezing method to minimize the damages involved in the freezing and thawing process according to the biochemical and physical characteristics of the cells, tissues and organs in order to minimize such damage and maximize the survival rate and functionality after freezing and thawing. Development is very important.
이하에서는 냉동 및 해동과정에서 동반되는 손상을 최소화하기 위한 종래의 동결보존액의 조성과 동결보존방법을 설명하기로 한다.Hereinafter will be described the composition and cryopreservation method of the conventional cryopreservation solution to minimize the damage accompanying the freezing and thawing process.
세포, 조직 및 장기를 포함한 모든 생명체는 수분의 존재하에 이루어지는 대사반응에 의하여 생명과 그 기능이 유지된다. 동결과정을 통하여 조직 및 장기를 구성하는 세포 내 모든 수분이 얼음결정체로 전환됨에 따라 세포, 조직 및 장기의 모든 대사반응이 중단된다. 즉, 생명력을 지닌 모든 세포성 생물학적 제재는 -80~-196℃ 범위의 초저온 상태에서 세포 내 수분을 결정화시킴으로써 세포내의 모든 대사작용을 멈추게 하여 세포를 살아있는 상태로 영구적으로 보관할 수 있다.All living things, including cells, tissues and organs, are sustained by life and their functions by metabolic reactions in the presence of water. As the freezing process converts all the water in the cells that make up tissues and organs into ice crystals, all metabolic reactions of cells, tissues and organs are stopped. In other words, all cellular biological agents with vitality can be permanently stored in the living state by stopping all metabolism in the cell by crystallizing the intracellular moisture in the cryogenic state in the range of -80 ~ -196 ℃.
이러한 영구적인 동결보존의 일차적 목적은 세포 내 모든 수분을 얼음 결정 체로 치환함으로써 세포 내 모든 대사반응을 중지시키고, 동결과 해동과정에서 발생하는 손상을 최소화함으로써 생명력을 유지한 채로 생명체의 영구적인 보관에 있다. 그러나 이러한 초저온 냉동보존방법의 단점은 액체상에서부터 고체상으로의 전이되는 동결과정에서 물 분자의 질서정연한 배열에 따라 얼음결정(ice crystal)이 형성되고, 얼음결정에 의하여 세포막은 광범위한 손상을 받아 세포는 생명력을 소실하게 된다는 것이다. 또한, 동결과정에 있어 세포 내부의 체적이 증가(Cellular volume excursions)하여 세포 내외의 이온 및 삼투압의 불균형과 생명체의 탈수에 따라 세포 및 조직의 손상을 초래한다는 것이다. 따라서 동결보존방법은 세포 및 조직 내의 얼음결정형성, 체적변화, 이온 및 삼투압 불균형으로 인한 손상을 최소화하는 동결방법의 개발이 주된 사안이다. 즉, 동결하고자 하는 조직과 세포의 조직학적 미세구조의 특성에 따라 동결보존액의 조성은 달라지며, 조직과 세포의 특성에 맞는 동결보존액 조성의 선택과 그 동결보존액에 따른 냉동방법은 성공적인 동결보존에 있어 핵심 사안이다.The primary purpose of this permanent cryopreservation is to stop all metabolic reactions in the cells by replacing all the moisture in the cells with ice crystals, and to maintain the vitality by maintaining the vitality by minimizing the damage that occurs during freezing and thawing. have. However, the disadvantage of the cryogenic cryopreservation method is that ice crystals are formed according to the orderly arrangement of water molecules during the freezing process of transition from liquid phase to solid phase. Will be lost. In addition, during the freezing process, cell volume excursions increase, resulting in cell and tissue damage due to imbalance between ions and osmotic pressure inside and outside the cell and dehydration of living organisms. Therefore, the cryopreservation method is the development of a freezing method that minimizes damage due to ice crystal formation, volume change, ionic and osmotic pressure imbalance in cells and tissues. That is, the composition of cryopreservation liquid varies according to the characteristics of the histological microstructure of the tissue and cells to be frozen, and the selection of cryopreservation liquid composition and the freezing method according to the cryopreservation liquid are suitable for successful cryopreservation. It's a key issue.
이러한 동결보존액은 동결보존제(cryoprotective agents)와 동결보존제를 조직과 세포로 전달하는 운반용액(vehicle solution)으로 구성된다. 동물세포의 동결보존시 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)와 그리세롤(glycerol)이 가장 널리 사용되는 세포막 투과성(permeating-type) 동결보존제이며, 이는 얼음결정의 형성을 효과적으로 감소시킨다. 미국특허 제3,842,831호에서는 시체 피부 절편의 동결 보존을 위한 방법이 제시된다. 이 방법은 피부를 느슨한 면포 또는 안감에 부착하고 피부 절편과 면포를 동결전에 함께 마는 것에 관련된다. 이때 글리세린 또 는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 동결보존제로 이용하였고, 운반용액으로는 세포배양액인 "Dulbecco's Modified Eagel Medium(DMEM)" 혹은 RPMI를 이용하였다. Such cryopreservatives consist of cryoprotective agents and vehicle solutions that deliver cryopreservatives to tissues and cells. In cryopreservation of animal cells, dimethylsulfoxide (DMSO) and glycerol are the most widely used cell membrane permeating-type cryopreservatives, which effectively reduce the formation of ice crystals. US Patent No. 3,842,831 discloses a method for cryopreservation of body skin sections. This method involves attaching the skin to a loose scrim or lining and drying the skin sections and scrim together before freezing. At this time, glycerin or dimethyl sulfoxide (DMSO) was used as a cryopreservative, and as a carrier solution, cell culture medium "Dulbecco's Modified Eagel Medium (DMEM)" or RPMI was used.
그러나 상기와 같은 조성의 동결보존액에 따르면, 디메틸설폭사이드(DMSO)가 동결과 해동 과정에서 얼음결정의 형성을 최소화하지만 동결과 해동과정에서 발생하는 이온과 삼투압 불균형(ionic and osmotic imbalance)과 활성산소유리기(free radical)의 생성으로 인한 세포 손상은 피할 수 없다는 문제점이 있었다. 특히 세포 부유액(Cell suspension)보다 복잡한 조직 및 기관과 같은 복합체 단위의 구조를 동결하는 경우는 이온과 삼투압 불균형으로 인한 조직과 세포의 손상은 더욱 커지게 된다.However, according to the cryopreservation solution of the above composition, dimethyl sulfoxide (DMSO) minimizes the formation of ice crystals during freezing and thawing, but ionic and osmotic imbalance and free radicals generated during freezing and thawing. Cell damage due to the production of free radicals has been a problem that can not be avoided. In particular, in the case of freezing the structure of complex units such as tissues and organs more complex than the cell suspension, tissue and cell damage due to ionic and osmotic pressure imbalance becomes more severe.
한편, 신장, 간, 그리고 피부조직의 원거리 운반기간 동안에 조직 및 장기의 생명력과 기능을 단기간 동안 냉장보관하기 위한 목적으로 우로콜린(EuroCollins)용액, University of Wisconsin용액(이하, "UW용액"이라 함), 그리고 하이포서모졸(HypoThermosol®) 용액 등이 각각 개발된바 있다. Meanwhile, EuroCollins solution, University of Wisconsin solution (hereinafter referred to as "UW solution") for the purpose of refrigeration of tissues and organs for short periods of time during renal transport of kidney, liver and skin tissues. ), And HypoThermosol ® Solutions have been developed, respectively.
상기한 용액의 특성은 300 달톤(daltons) 이상의 분자크기를 가지는 물질인 락토비오네이트(lactobionate), 라피노스(raffinose), 하이드록실에칠 스타취(hydroxylethy starch), 다당류를 다량 함유하고 있어 세포막에 투과하지 못하는 냉장보존액으로 조직과 장기의 운송과 보관시 이온 및 삼투압의 균형을 유지하고, 또한 저산소증(hypoxia)에 대사반응 장애를 최소화하여 저온에서 조직과 장기의 손상을 방어하는 역할을 한다. 조직 및 장기의 냉장보존은 빙점이상 온도인 0~4℃에 서 시행하고 저온에서 보관함에 따라 산소소비량과 대사활동을 감소시켜 조직 및 장기의 단기간 동안 보존할 수 있는 장점이 있다. 대부분의 조직 및 세포은행에서 저온보존을 위하여 세포배양액을 이용하고 있으나, 이러한 세포배양액은 생리적인 체온인 37℃에서 세포 및 조직의 기능을 유지하기 위하여 개발되었다. 즉, 저온으로 인한 세포 및 조직의 생화학적 그리고 생리적인 특성이 변화하게 되며, 세포배양액은 이러한 변화된 환경에서 세포 및 조직의 생명력과 기능을 적절히 유지하지 못한다.The characteristics of the above solution include lactobionate, raffinose, hydroxylethy starch, and polysaccharides, which have a molecular size of 300 Daltons or more, and permeate the cell membrane. It is a refrigerated preservative that does not maintain balance of ions and osmotic pressures during transportation and storage of tissues and organs, and also protects tissue and organ damages at low temperatures by minimizing metabolic disorders in hypoxia. Refrigeration preservation of tissues and organs is carried out at the freezing point of 0 ~ 4 ℃ and stored at low temperature has the advantage that can be preserved for a short period of time by reducing oxygen consumption and metabolic activity. Most tissues and cell banks use cell cultures for cryopreservation, but these cell cultures have been developed to maintain the function of cells and tissues at physiological body temperature of 37 ° C. That is, the biochemical and physiological characteristics of cells and tissues are changed due to the low temperature, and the cell culture fluid does not properly maintain the vitality and function of the cells and tissues in this changed environment.
동결과정에서 디메틸설폭사이드(DMSO)와 같은 동결보존제의 독성과 저산소증으로 인한 세포 및 조직 손상을 최소화하기 위하여 0~4℃에서 동결보존액을 첨가하고 냉동과정을 시작한다. 즉, 0~4℃에서 세포와 조직과 동결보존액 사이에 물질교환이 이루어지고, 동결보존액은 평행상태를 유지한다. 다시 말해서, 효율적인 생명체의 냉동보관을 위해서는 적절한 냉장보관이 선행되어야 한다는 점이다. 이러한 기반에서 냉동보존제의 운반용액으로 널리 사용되는 세포배양액보다는 냉장보존액으로 개발된 용액들이 보다 적합하다고 판단된다. 즉, 디메틸설폭사이드(DMSO) 혹은 글리세롤(glycerol)을 운반하는 운반용액은 저온과 동결과정에서 세포와 세포간질 사이에서 삼투압과 이온의 균형을 유지할 수 있어야 된다.In the freezing process, the cryopreservation solution is added at 0-4 ° C and the freezing process is started to minimize cell and tissue damage due to the toxicity and hypoxia of cryopreservatives such as dimethyl sulfoxide (DMSO). In other words, the material exchange between the cells and tissues and cryopreservation solution at 0 ~ 4 ℃, the cryopreservation solution is kept in parallel. In other words, proper refrigeration should be preceded for efficient cryopreservation of life. On this basis, it is judged that solutions developed as refrigerated preservatives are more suitable than cell culture fluids widely used as carrier solutions for cryopreservatives. That is, the carrier solution carrying dimethyl sulfoxide (DMSO) or glycerol should be able to maintain osmotic pressure and ion balance between cells and cytoplasm during low temperature and freezing.
대부분의 세포 및 조직의 동결보존액의 조성은 5~15% 디메틸설폭사이드(DMSO) 혹은 글리세롤과 같은 동결보존제와 10~30%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 그리고 55~85% RPMI 혹은 DMEM과 같은 세포배양액으로 구성되어 있다. 그러나 FBS를 사용함으로써 동물에서부터 전파되는 전염원의 위험으로부터 노 출되고 FBS의 제품간의 차이(lot to lot variation)로 인한 품질관리에 문제를 야기할 수 있다.Cryopreservation of most cells and tissues consists of cryopreservatives such as 5-15% dimethylsulfoxide (DMSO) or glycerol, 10-30% fetal bovine serum (FBS), and 55-85% RPMI. Or cell culture fluid such as DMEM. However, the use of FBS can pose problems for quality control due to exposure to the source of infectious agents from animals and lot to lot variation in FBS.
본 발명은 조직공학적 기법으로 배양하여 제조한 세포성 인공조직의 반영구적인 보관을 통하여 품질과 제고관리를 가능케 하고, 대량생산을 위한 안전하고 효율적인 세포성 인공조직의 장기보관이 가능한 무혈청성 동결보존액 및 이를 이용한 세포성 인공조직의 동결보존방법을 제공하는데 그 목적이 있다.The present invention enables the quality and upkeep management through semi-permanent storage of cellular artificial tissues cultured by histological techniques, and serum-free cryopreservatives capable of long-term storage of safe and efficient cellular artificial tissues for mass production. The purpose is to provide a cryopreservation method of cellular artificial tissue using the same.
본 발명의 다른 목적은 구조가 복잡한 세포성 인공조직을 동결 및 해동하는 과정에서 동반되는 손상을 최소화하여 해동 후 세포성조직 내 세포의 생존율을 높이고 사멸 정도를 최소화하며, 인공조직 내 생물학적 기능을 반영구적으로 보관, 유지하는데 적당한 세포성 인공조직의 장기보관이 가능한 무혈청성 동결보존액 및 이를 이용한 세포성 인공조직의 동결보존방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to minimize the damages involved in the process of freezing and thawing complex cellular artificial tissue structure to increase the survival rate of cells in the cellular tissue after thawing and to minimize the degree of death, semi-permanent biological function in the artificial tissue The present invention provides a serum-free cryopreservation solution capable of long-term storage of cellular artificial tissues suitable for storage and maintenance, and a cryopreservation method of cellular artificial tissues using the same.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 세포성 인공조직의 장기보관을 위한 동결보존액은 5~20%범위의 디메틸설폭사이드(DMSO) 동결방지제와, 상기 동결방지제를 인공조직과 세포로 전달하기 위한 80~95% 범위의 UW(University of Wisconsin)용액의 혼합물로 이루어진 것을 특징으로 한다.Cryopreservative for long-term storage of cellular artificial tissue of the present invention for achieving the above object is a 5-20% range of dimethyl sulfoxide (DMSO) cryoprotectant, and to deliver the cryoprotectant to artificial tissues and cells It is characterized by consisting of a mixture of UW (University of Wisconsin) solution in the range of 80 ~ 95%.
여기서, 상기 동결방지제는 디메틸설폭사이드(DMSO)이고, 상기 운반용액은 UW(University of Wisconsin)용액이 바람직하며, 이때, 상기 디메틸설폭사이드(DMSO)는 10%이고, 상기 UW(University of Wisconsin)용액은 90%인 것이 바람직하다.Here, the cryoprotectant is dimethyl sulfoxide (DMSO), the transport solution is preferably a University of Wisconsin (UW) solution, wherein the dimethyl sulfoxide (DMSO) is 10%, the University of Wisconsin (UW) Preferably the solution is 90%.
한편, 본 발명의 실시 예에 따른 세포성 인공조직의 장기보관이 가능한 무혈청성 동결보존액을 이용한 세포성 인공조직의 동결보존방법은 세포성 인공조직을 상기 제1항의 동결보존액에 현탁하는 단계와, 상기 세포성 인공조직을 -1℃/분 씩 내려가는 cryo-탱크(냉동 탱크)에 옮긴 후 순차적으로 냉동고와 초저온 냉동고에서 냉각하는 단계와, 상기 냉각된 세포성 인공조직을 -196℃의 액체질소탱크에서 보존하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 냉동고에서는 1시간, 초저온 냉동고에서는 2시간 동안 냉동시키는 것이 바람직하다.On the other hand, cryopreservation of cellular artificial tissue using a serum-free cryopreservation solution capable of long-term storage of cellular artificial tissue according to an embodiment of the present invention comprises the steps of suspending the cellular artificial tissue in the cryopreservation solution of claim 1, The cellular artificial tissue was transferred to a cryo-tank (freezing tank) descending by -1 ° C / min, followed by cooling in a freezer and a cryogenic freezer, and the cooled cellular artificial tissue at -196 ° C liquid nitrogen tank. Characterized in that it comprises a step of preserving in. Here, it is preferable to freeze for 1 hour in the freezer, 2 hours in the cryogenic freezer.
그리고 상기 세포성 인공조직을 배양하기 위해 사용되는 세포는 포유동물 유래의 섬유 모세포로 구성된 조직인 것을 특징으로 한다.And the cells used to culture the cellular artificial tissue is characterized in that the tissue consisting of fibroblasts derived from mammals.
[실시 예][Example]
이하, 본 발명의 실시 예에 따른 세포성 인공조직의 장기보관이 가능한 무혈청성 동결보존액 및 이를 이용한 세포성 인공조직의 동결보존방법을 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, a serum-free cryopreservation solution capable of long-term storage of cellular artificial tissue and a cryopreservation method of cellular artificial tissue using the same will be described below.
먼저, 본 발명의 실시 예에 따른 세포성 인공조직은 포유동물, 보다 구체적으로는 인체의 진피조직과 유사한 구성으로 체외에서 조직공학적 기법으로 인공적으로 제조한 것을 말하며, 상기의 인체 진피조직에는 콜라겐, 글리코사미노글리겐(glycosaminoglycans) 등으로 구성된 세포외기질과 이러한 세포외기질을 합성하여 분비하는 섬유모세포로 구성된다.First, the cellular artificial tissue according to an embodiment of the present invention refers to artificially manufactured by tissue engineering techniques in vitro in a configuration similar to mammalian, more specifically, the dermal tissue of the human body, the human dermal tissue is collagen, It consists of extracellular matrix consisting of glycosaminoglycans and fibroblasts that synthesize and secrete such extracellular matrix.
상기한 세포성 인공조직을 제조하기 위해서는 포유동물, 보다 구체적으로는 인체조직에서 유래한 세포와 생체에 적합한 3차원 다공성 스폰지, 그리고 이를 체외에서 배양하는 시스템이 요구되며, 이러한 세포성 인공조직은 3차원 다공성 스폰지에 포유동물 유래의 세포를 조합하여 제작한 포유동물의 인공조직과 동등한 기능을 유지하는 구성물을 의미한다. 따라서, 본 발명의 실시 예에 따른 세포성 인공조직은 포유류 특히 인체조직에서 기원한 세포인 섬유모세포를 다공성 스폰지에 파종하여 체외에서 배양하여 제조한 인공조직을 의미한다.In order to prepare the cellular artificial tissues, a mammal, more specifically, a three-dimensional porous sponge suitable for living cells and cells derived from human tissues, and a system for culturing them in vitro are required. Means a component that maintains the same function as the mammalian artificial tissue produced by combining the mammal-derived cells in the dimensional porous sponge. Therefore, the cellular artificial tissue according to the embodiment of the present invention refers to an artificial tissue prepared by culturing in vitro by fibroblasts, which are cells derived from mammals, particularly human tissues, in a porous sponge.
이러한 인공조직은 인체조직에서 분리 배양한 세포를 3차원 다공성 스폰지에 파종하여 체외에서 배양과정을 통해 세포가 증식, 분화되고, 세포에서 합성 분비된 세포외기질이 다공성 스폰지 내로 침착하여 인체 진피조직과 유사해진 조직을 말하며, 상기의 세포성 인공조직을 이용하여 화상, 궤양, 욕창, 피부 채취 등과 같은 피부 결손 부위를 치유할 수 있다.These artificial tissues are seeded with three-dimensional porous sponge cells cultured in human tissues, cells are proliferated and differentiated through in vitro culture, and the extracellular matrix synthesized from the cells is deposited into the porous sponge and It refers to a tissue similar to the above, and the above cellular artificial tissue can be used to heal skin defects such as burns, ulcers, bedsores, and skin extracts.
상기한 다공성 스폰지는 세포성 인공조직을 환자에게 적용함에 있어서, 면역 및 염증 반응이 없고 생체적합성이 우수한 생분해성 특성이 있는 재질을 이용하는 것이 바람직하며, 이러한 생체 유래의 재료로서는 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 피브린, 콘드로이친, 하이알론산 등이 있고, 생분해성 합성 고분자 재료로는 폴리글리콜산, 폴리락트산 및 이들의 혼합물 등을 이용할 수 있다. 이러한 재료에 의해 만들어지는 담체는 세포가 담체 내에서 성장할 수 있도록 다공성이 높아야 되며, 구멍 사이가 연결되어 있어 영양분 및 가스 교환이 원활히 이루어질 수 있어야 한다. 본 발명의 실시 예에서는 생체적합성이 뛰어난 콜라겐 스폰지를 사용하지만 콜라겐 스폰지 외에도 기타 천연 혹은 합성 고분자에서 제조한 다공성 스폰지를 사용할 수 있다. In applying the cellular artificial tissue to the patient, the porous sponge is preferably made of a material having no biodegradation properties and excellent biocompatibility, without immune and inflammatory reactions. Such bio-derived materials include collagen, gelatin, chitin, Chitosan, fibrin, chondroitin, hyaluronic acid, and the like. As the biodegradable synthetic polymer material, polyglycolic acid, polylactic acid, a mixture thereof, and the like can be used. Carriers made from these materials must be highly porous to allow cells to grow in the carrier, and the pores must be connected to facilitate nutrient and gas exchange. In the embodiment of the present invention, but using a collagen sponge excellent in biocompatibility, it is possible to use a porous sponge made from other natural or synthetic polymers in addition to the collagen sponge.
상기 세포성 인공조직을 제조하기 위하여 포유동물 유래의 세포, 보다 구체적으로는 인체조직에서 분리 배양한 섬유모세포를 비롯하여 지방세포, 혈관내피세포 등에서 한 가지 종류 혹은 두 가지 이상의 세포를 사용할 수 있으나, 본 발명의 실시 예에서는 섬유모세포를 이용하여 인공조직을 제조한다. 이러한 세포는 상처에서 증식하여 재생하는 역할과 동시에, 창상 치유를 촉진하는 사이토카인, 주변의 세포가 이동하는 조직을 재구축할 때의 발판이 되는 세포외기질 등을 합성, 분비하는 역할을 한다.In order to manufacture the cellular artificial tissue, one or two or more kinds of cells derived from mammals, more specifically, fibroblasts cultured from human tissues, fat cells, and vascular endothelial cells, may be used. In an embodiment of the present invention, artificial tissue is prepared using fibroblasts. These cells proliferate and regenerate in the wound, and simultaneously play a role in synthesizing and secreting cytokines that promote wound healing, and extracellular matrix, which is a scaffold for reconstructing tissues in which surrounding cells move.
상기 세포성 인공조직을 보관하는 방법에는 단기간 동안의 냉장보관과 반영구적인 냉동보관이 있으며, 보관 기간 동안에 세포성 인공조직 내의 구성인자인 세포와 세포외기질 그리고 창상치유를 촉진하는 사이토카인을 포함한 성장인자를 포함하여 생명력과 그 기능을 유지하여야만 한다. The method for storing cellular artificial tissues includes short-term refrigeration and semi-permanent cryopreservation, and growth including cytokines that promote cellular healing, extracellular matrix, and wound healing, which are constituents within cellular artificial tissues. Vitality and its function must be maintained, including the Son of Man.
상기 세포성 인공조직의 냉장보관은 0~4℃ 저온에서 보관하여 세포의 대사작용을 부분적으로 억제함으로써 단기간 동안, 구체적으로 1주일 정도로 그 생명력과 기능을 유지할 수밖에 없다는 한계가 있다. 이에 본 발명의 실시 예에서는 세포성 인공조직을 영하 130도 이하에서 세포성 인공조직 내 모든 수분을 동결화하여 대사작용을 완전히 정지시켜 반영구적으로 보관할 수 있는 방법을 제공한다.The cold storage of the artificial artificial tissue is stored at a low temperature of 0 ~ 4 ℃ by partially inhibiting the metabolism of the cells for a short time, specifically for a week there is a limit that can only maintain its vitality and function. Thus, the embodiment of the present invention provides a method of semi-permanently storing the cellular artificial tissue by completely freezing all the moisture in the cellular artificial tissue below 130 degrees below zero to completely stop metabolism.
상기의 인공조직을 동결하는 과정에서 발생하는 얼음 결정체는 수분의 용적이 증가함에 따라 세포막과 세포소기간 막의 광범위한 손상을 야기시켜 세포성 인공조직을 구성하는 세포의 비가역적인 죽음을 야기하며, 동결에 따른 세포 내외의 수분의 이온 및 삼투압의 증가를 야기하여 급격한 이온 및 삼투압 불균형에 따른 세포의 손상을 야기하여 세포를 죽음에 이르게 한다. 따라서, 성공적인 세포성 인공조직의 영구적인 보관을 위해서는 동결과정에 발생하는 얼음 결정체 형성을 억제하고 이온 및 삼투압 불균형을 제어할 수 있는 동결보존제가 요구되며, 동결시키고자 하는 인공조직과 동결보존제의 특성에 따라 동결온도 및 과정을 선택하여야 한다.The ice crystals generated in the process of freezing the artificial tissues cause extensive damage of the cell membrane and the small-term membrane as the volume of water increases, causing irreversible death of the cells constituting the cellular artificial tissue, This results in an increase in the ions and osmotic pressure of the water inside and outside the cell, causing damage to the cells due to rapid ionic and osmotic imbalance, leading to cell death. Therefore, for the permanent storage of successful cellular artificial tissues, cryopreservatives that can suppress the formation of ice crystals and control ionic and osmotic pressure imbalances are required.The characteristics of artificial tissues and cryopreservatives to be frozen The freezing temperature and process should be selected accordingly.
이에, 본 발명의 실시 예에 따른 세포성 인공조직의 장기보관이 가능한 무혈청성 동결보존액은 동결과정에 발생하는 얼음 결정체 형성을 억제하는 동결방지제와 이를 운반하는 용액으로 구성된다. 이때, 상기 동결방지제로서는 디메틸설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜등과 같은 투과성(permeating) 동결보존액 중 어느 한 가지 혹은 이들을 조합하여 사용할 수 있으나, 특히 디메틸설폭사이드(DMSO)는 세포 혹은 조직 내로 투과가 용이하며 또한 점도가 낮아 세포성 인공조직과 같은 치밀한 구조의 조직인 경우 동결방지제의 조직 내 침투가 용이하다.Thus, the serum-free cryopreservation solution capable of long-term storage of cellular artificial tissue according to an embodiment of the present invention is composed of a cryoprotectant that inhibits the formation of ice crystals occurring during the freezing process and a solution carrying the same. In this case, as the cryoprotectant, any one or a combination of permeating cryopreservatives such as dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, propylene glycol, and ethylene glycol, or a combination thereof may be used, in particular, dimethyl sulfoxide (DMSO) may be a cell. Alternatively, in the case of a dense structure such as cellular artificial tissue, the permeation of the cryoprotectant is easy to penetrate into the tissue.
그러나 동결방지제로 사용되는 디메틸설폭사이드(DMSO)는 동결과정에서 발생하는 이온 및 삼투압의 불균형을 초래하고 유리산소기를 발생시켜 세포 및 조직을 손상시킬 수도 있기 때문에 상기 디메틸설폭사이드(DMSO)와 같은 동결방지제를 운반하는 용액의 조성으로는 10~30% 우태아혈청을 포함한 세포배양액이 가장 널리 사용된다.However, dimethyl sulfoxide (DMSO), which is used as a cryoprotectant, causes an imbalance of ions and osmotic pressures generated during the freezing process, and may cause free oxygen groups to damage cells and tissues, thus freezing such as dimethyl sulfoxide (DMSO). Cell culture fluids containing 10-30% fetal bovine serum are most widely used as the composition of the solution carrying the inhibitor.
그러나, 우태아혈청을 포함한 세포배양액은 디메틸설폭사이드(DMSO)의 운반용액으로 그 역할을 담당하나 디메틸설폭사이드(DMSO)의 단점을 보완할 수는 없다. 따라서, 조직 및 장기의 단기간 냉장보관의 목적으로 개발된 우로콜린(EuroCollins) 용액, UW용액, 그리고 하이포서모졸(HypoThermosol) 용액은 성분 내 이온 및 삼투압의 급격한 변화를 완충할 수 있는 락토비오네이트(lactobionate), 서크로스(sucrose), 만니톨(mannitol), 덱스트란(dextran)을 함유하고 있고, 이러한 성분들은 세포 내로 침투하지 못하고 세포외장액(세포 밖에서)에 존재하면서 동결과정에서 발생하는 이온 및 삼투압의 변화를 완충하고 유리산소기를 흡수하는 특성을 지니고 있어 동결과정에서 발생하는 이온 및 삼투압의 불균형과 유리산소기로 인한 세포 및 조직의 손상을 방지할 수 있다. However, cell culture fluid containing fetal calf serum plays a role as a carrier solution of dimethyl sulfoxide (DMSO), but cannot compensate for the disadvantages of dimethyl sulfoxide (DMSO). Therefore, EuroCollins solution, UW solution, and HypoThermosol solution, developed for the purpose of short-term refrigeration of tissues and organs, are lactobionates that can buffer rapid changes in ions and osmotic pressures in components. It contains lactobionate, sucrose, mannitol, and dextran, and these components do not penetrate into cells and are present in extracellular fluid (extracellular), resulting in freezing and ion osmotic pressure It has a characteristic of buffering the change of and absorbing free oxygen groups, thereby preventing the imbalance of ions and osmotic pressures generated during the freezing process and damage to cells and tissues due to free oxygen groups.
이에, 본 발명의 실시 예에서는 동결방지제로써 5~20% 범위의 디메틸설폭사이드(DMSO)와 이를 운반하는 용액으로서 80~95% 범위의 UW용액으로 구성된 동결보존액을 세포성 인공조직의 영구적인 냉동보관을 위하여 사용하는 것을 특징으로 한다. 이러한 동결보존액 조성은 인공조직 내로 디메틸설폭사이드(DMSO)를 균일하게 침투시켜 얼음 결정의 형성을 최소화하고 이온 및 삼투압의 급격한 변화와 유리산 소기의 발생을 억제하여 해동 후 세포성 인공조직의 생존율을 극대화 할 수 있다. 또한 UW용액을 동결보존을 위한 운반용액으로 사용한 경우 디메틸설폭사이드(DMSO)의 농도를 낮출 수 있어 동결과 해동으로 인한 세포와 조직의 손상을 최소화할 수 있다. Thus, in the embodiment of the present invention, the cryopreservation solution consisting of 5-20% dimethyl sulfoxide (DMSO) as a cryoprotectant and a UW solution of 80-95% range as a solution for transporting it permanently freezing cellular artificial tissue It is used for storage. The cryopreservation composition infiltrates dimethylsulfoxide (DMSO) uniformly into artificial tissues to minimize the formation of ice crystals and to suppress the rapid change in ionic and osmotic pressures and the generation of free acid scavenging to improve the survival rate of cellular artificial tissues after thawing. Can be maximized. In addition, when UW solution is used as a carrier solution for cryopreservation, the concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO) can be lowered, thereby minimizing damage to cells and tissues due to freezing and thawing.
체외에서 제조한 세포성 인공조직을 본 발명의 실시 예에 따른 동결보존제가 조직 내로 충분히 침투시켜 조직 내외로 동결방지제가 평행을 도달시키기 위하여 4℃의 동결보존액을 인공조직에 첨가하여 세이커(shaker)를 이용하여 분산시켰다. A cryopreservative at 4 ° C. was added to the artificial tissue in order to sufficiently infiltrate the cryopreservative according to an embodiment of the present invention into the tissue so that the cryoprotectant reached parallel to the tissue. ) Is dispersed.
동결과정은 단계별 동결법과 유리화 (vitrification) 동결법이 있다. 급속 동결법이란 동결보존액을 첨가한 용액을 이용해 초저온 냉동고 등에서 조직 및 세포를 빙점 이하로 급속히 냉각 동결시키는 방법이고, 유리화 동결법이란 고농도의 동결보존제를 첨가한 용액에 세포를 부유시킨 후에 액체 질소에 투입하여 빙정핵이 존재하지 않는 유리화 상태가 되도록 하는 동결 방법이다.The freezing process consists of stepwise freezing and vitrification freezing. Rapid freezing is a method of rapidly freezing tissues and cells below freezing point in a cryogenic freezer using a solution containing a cryopreservative solution. Vitrification freezing is a method in which a cell is suspended in a solution to which a high concentration of cryopreservative is added and then added to liquid nitrogen. It is a freezing method in which a vitrified state in which ice crystal cores do not exist is present.
본 발명의 실시 예에서는 단계별(step-cooling) 동결법을 이용하였다. 여기서, '단계별 동결법'이란 동결 보존액을 첨가한 용액을 이용해 인공적으로 세포 외에서 형성시킨 빙정을 완만하고 적당한 냉각 속도로 냉각함으로써 세포 내를 탈수 및 농축하여, 그 후의 급격한 냉각에 의한 세포 내 동결을 방지해 보존함으로써 융해 후 높은 생존율을 얻는 방법이다. 냉각 속도는 4℃ 상태의 세포성 인공조직을 -1℃/분 씩 내려가는 cryo-tank(냉동 탱크)에 옮긴 후 냉동고(-20℃)에 30분, 초저온 냉동고(deep freezer, -80℃)에서 4시간 동안 냉각한다. 이 후 -196℃ 액체질소탱크(liquid nitrogen tank)에서 반영구적으로 보존한다. In an embodiment of the present invention, a step-cooling freezing method was used. Here, the 'step-by-step freezing method' refers to the freezing of artificially formed ice crystals using a solution containing a cryopreservative solution at a moderate cooling rate, thereby dehydrating and concentrating the cells to prevent intracellular freezing by rapid cooling. By preserving the sea, a high survival rate after melting is obtained. Cooling rate was transferred to cryo-tank (freezing tank) at -1 ° C / min by 4 ° C, then 30 minutes in freezer (-20 ° C), deep freezer (-80 ° C) Cool for 4 hours. It is then stored semi-permanently in -196 ℃ liquid nitrogen tank.
이러한 단계별 동결보존 방법은, 일정한 온도 강하를 조절하기 위하여 정밀하고 고가인 프로그램 프리저 등의 동결 장치를 필요로 하지 않으므로 적은 비용으로 손쉽게 수행할 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 실시 예에서는 세포성 인공조직의 동결 보존 온도를 장시간 생물 활성을 높게 유지하기 위해서 -80℃~-196℃의 범위로 유지한다. 단기간 보존하는 경우에는 -20℃로 충분하지만, 장기간 보존하는 경우에는 -20℃보다 저온에서 저장하는 것이 필요하며, -80℃에서는 1~2년의 보존이 가능하고, -120℃~-196℃에서는 반영구적으로 보존할 수 있다.This step-by-step cryopreservation method does not require a freezing device, such as a precise and expensive program freezer, in order to control a constant temperature drop, which has the advantage of being easily performed at low cost. In an embodiment of the present invention, the cryopreservation temperature of cellular artificial tissue is maintained in the range of -80 ° C to -196 ° C in order to maintain high biological activity for a long time. In the case of short-term storage, -20 ° C is sufficient, but in the case of long-term storage, it is necessary to store at a lower temperature than -20 ° C. At -80 ° C, one to two years can be stored, and -120 ° C to -196 ° C. Can be preserved semi-permanently.
이와 같은 본 발명의 실시 예에 따른 세포성 인공조직의 장기보관을 위한 무혈청성 동결보존액을 이용하는 경우 세포성 인공조직의 생존율을 살펴보면 아래와 같다.When using the serum-free cryopreservation solution for long-term storage of cellular artificial tissue according to an embodiment of the present invention as described above look at the survival rate of cellular artificial tissue.
사람으로부터 채취한 피부를 75%의 아이소프로페놀(isopropanol)에 살균한 후, 무균작업대로 옮겨 표피 및 진피층을 제외한 피하지방층을 모두 제거한다. 이 피부를 200 U/㎖ 페니실린(penicillin), 200 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 20 ㎍/㎖ 사이플로플록사신(ciprofloxacin)으로 구성된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 또는 Hank's balanced salt solution(HBSS) 용액으로 수세 후, 멸균된 면도칼을 이용하여 1~2㎣ 이하의 크기로 잘게 자른다. 이러한 조직 절편을 원심분리하여, 10% 피틀 보바인 시어럼(fetal bovine serum(FBS, 우태아혈청)), 1 unit/㎖ 헤파린(heparin), 50㎍/㎖ MVI, 항생제(100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin, 10 ㎍/㎖ ciprofloxacin)가 함유된 알파-엠이엠(α-MEM) 용액에 배양한다. Skin from humans is sterilized in 75% isopropanol, and then transferred to a sterile workbench to remove all subcutaneous fat layers except the epidermal and dermal layers. The skin was treated with Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) or Hank's balanced salt solution (HBSS) consisting of 200 U / ml penicillin, 200 μg / ml streptomycin, 20 μg / ml ciprofloxacin. After washing with water, use a sterile razor to chop into 1 ~ 2㎣ or less. These tissue sections were centrifuged to give 10% pet bovine serum (FBS, Fetal Bovine Serum), 1 unit / ml heparin, 50 μg / ml MVI, antibiotic (100 U / ml penicillin). Incubated in alpha-MEM solution containing 100 μg / ml streptomycin and 10 μg / ml ciprofloxacin.
2주 후 조직 절편에서 섬유모세포와 표피세포가 성장하면 0.01% 트립신-에틸렌디아민 4아세트산 나트륨(trypsin-EDTA)를 이용하여 섬유 모세포만 분리한다.Two weeks later, when fibroblasts and epidermal cells grow in tissue sections, only fibroblasts are separated using 0.01% trypsin-ethylenediamine sodium tetraacetate (trypsin-EDTA).
이렇게 분리된 섬유모세포 1×105개를 4.76×9.52×2mm3 크기의 생체적합성 및 다공성이 뛰어난 콜라겐 스폰지 (Sulzer Dental Inc., Carlsbad, CA)에 파종하고, 2주간 배양하여 세포성 인공진피 조직을 구축한다. 이 때 Dulbecco's modified Eagle's medium과 Ham's nutrient mixture F-12가 1:1 혼합된 배지 (DMEM/F-12, Sigma Chemical Co.)에 10% FBS와 50 ㎍/㎖ L-ascorbic acid, 100 U/㎖ penicillin와 100 ㎍/㎖ streptomycin이 첨가된 배지를 이용한다.The fibroblasts 1 × 10 5 were separated and seeded in a collagen sponge (Sulzer Dental Inc., Carlsbad, CA) with a high biocompatibility and porosity of 4.76 × 9.52 × 2mm 3 size, and cultured for 2 weeks to carry out cellular artificial dermal tissue. Build it. At this time, Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 were mixed 1: 1 (DMEM / F-12, Sigma Chemical Co.) with 10% FBS and 50 ㎍ / mL L-ascorbic acid, 100 U / mL Medium containing penicillin and 100 μg / ml streptomycin were used.
이렇게 제조된 세포성 인공조직 진피를 표 1과 같은 동결보존액 조성비에 따라 세포성 인공조직을 다음과 같은 방법으로 동결보존한다. Thus prepared cellular artificial tissue dermal cryopreserved cellular artificial tissue in the following manner according to the cryopreservation liquid composition ratio as shown in Table 1.
우선, 구축된 세포성 인공진피 조직을 4℃ 상태의 동결보존액에 현탁한다. 이후 4℃에서 평형을 유지시키고, -1℃/분씩 내려가는 cryo-tank(냉동탱크)에 옮긴 후 냉동고(-20℃)에 1시간, 초저온 냉동고(deep freezer, -80℃)에서 2시간 동안 냉각하고, -196℃ 액체질소탱크(liquid nitrogen tank)에서 반영구적으로 보존한다.First, the constructed cellular artificial dermal tissue is suspended in cryopreservation solution at 4 ° C. After equilibration at 4 ° C, transfer to cryo-tank (freezing tank) down to -1 ° C / min, cool in freezer (-20 ° C) for 1 hour, deep freezer (-80 ° C) for 2 hours And stored semi-permanently in a -196 ° C. liquid nitrogen tank.
[표 1] 동결보존액의 조성비[Table 1] Composition ratio of cryopreservative
상기와 같은 동결보존액의 조성비에 따른 동결보존된 세포성 인공조직의 생존율을 분석하여 보면 다음과 같다.The survival rate of the cryopreserved cellular artificial tissue according to the composition ratio of the cryopreservation solution as described above is as follows.
37℃의 항온 수조에서 빠르게 해동된 세포성 인공조직의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 통해 측정하였다. 조직 샘플을 1~2 mm3 조각으로 잘게 자르고, 200㎕ HBSS에 부유한 후 5㎎/㎖의 MTT 용액 20㎕를 첨가하였다. 이후 37℃에서 4시간 반응시키고, 10mM 염화수소(HCl)를 포함하는 10% sodium dodecyl sulfate(SDS) 200㎕를 첨가한 후 8시간 동안 용해시켰다. 200㎕를 96-well 플레이트에 옮긴 뒤 570nm 파장에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Spectra Ⅲ, SLT, Austria)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 생존율은 해동 후의 MTT 값을 동결 전의 MTT 값으로 나누어 백분율 하였으며, 그 결과는 아래의 표 2와 같다.Survival rates of rapidly thawed cellular artificial tissues at 37 ° C were measured by 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2 and 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analysis. Tissue samples were chopped into 1-2 mm 3 pieces, suspended in 200 μl HBSS and 20 μl of 5 mg / ml MTT solution was added. Thereafter, the reaction was carried out at 37 ° C. for 4 hours, and 200 μl of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) containing 10 mM hydrogen chloride (HCl) was added thereto and then dissolved for 8 hours. 200 μl was transferred to a 96-well plate and absorbance was measured using a microplate reader (Spectra III, SLT, Austria) at 570 nm wavelength. The survival rate was divided by the MTT value after thawing by the MTT value before freezing, and the results are shown in Table 2 below.
[표 2] 동결보존액 조성비에 따른 세포성 인공조직의 생존율[Table 2] Survival rate of cellular artificial tissue according to cryopreservative composition ratio
상기의 표 2는 동결보존액의 조성비에 따른 세포성 인공조직의 생존율을 나타내고 있는바, 80~95%의 UW 용액에 5~20% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 동결보존한 세포성 인공조직이 대조군으로 사용된 100% UW 용액 (그룹 Ⅰ)과 10% DMSO(그룹 Ⅵ) 보다 높은 생존율을 나타내는 것을 알 수 있다.Table 2 shows the survival rate of cellular artificial tissue according to the composition ratio of cryopreservation solution, the cellular artificial tissue cryopreserved by adding 5-20% dimethyl sulfoxide (DMSO) to 80-95% UW solution It can be seen that the survival rate is higher than the 100% UW solution (Group I) and 10% DMSO (Group VI) used as a control.
한편, 다음의 실시 예는 인간섬유 모세포와 콜라겐 담체로 구성된 세포성 인공조직의 동결보존액 및 그에 따른 동결보존방법에 관한 예이다.On the other hand, the following embodiment is an example of a cryopreservation solution and a cryopreservation method of the cellular artificial tissue consisting of human fibroblasts and collagen carrier.
사람의 피부에서 분리한 섬유 모세포를 4회 계대배양한 후, 0.01% 트립신(trypsin)-EDTA를 이용하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 4.76mmㅧ 9.52mmㅧ 2mm의 콜라겐(Sulzer Dental lnc.) 담체에 1×105개의 세포를 파종하였다. 담체에 파종된 섬유 모세포는 2주간 배양하여 아래의 표 3과 같은 조성으로 4℃ 상태의 동결보존액에 현탁한다. 이후, 4℃에서 10분간 평형을 유지시키고, -1℃/분씩 내려가는 cryo-tank에 옮긴 후, 냉동고(-20℃)에 1시간, 초저온 냉동고(deep freezer, -80℃)에서 2시간 동안 냉각하고, -196℃ 액체질소탱크(liquid nitrogen tank)에서 반영구적으로 보존한다.Fibroblasts isolated from human skin were passaged four times, and then cells were recovered using 0.01% trypsin-EDTA. The recovered cells were seeded with 1 × 10 5 cells in a collagen (Sulzer Dental lnc.) Carrier of 4.76 mm × 9.52 mm × 2 mm. The fibroblasts seeded on the carrier are cultured for 2 weeks and suspended in cryopreservation solution at 4 ° C with the composition shown in Table 3 below. After equilibration at 4 ° C. for 10 minutes, transfer to cryo-tank descending -1 ° C./minute, and then 1 hour in freezer (-20 ° C.) and 2 hours in deep freezer (−80 ° C.). And stored semi-permanently in a -196 ° C. liquid nitrogen tank.
[표 3]TABLE 3
위의 표 3과 같은 동결보존액을 이용한 경우의 상기 인간섬유 모세포와 콜라겐 담체로 구성된 인공조직의 생존율을 평가하면 아래와 같다.When the survival rate of the artificial tissue consisting of the human fibroblasts and the collagen carrier in the case of using the cryopreservation solution as shown in Table 3 above is as follows.
37℃의 항온 수조에서 빠르게 해동된 세포성 인공조직의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 통해 측정하였다. 조직 샘플을 1~2 mm3 조각으로 잘게 자르고, 200㎕ HBSS에 부유한 후 5㎎/㎖의 MTT 용액 20㎕를 첨가하였다. 이후 37℃에서 4시간 반응시키고, 10mM 염화수소(HCl)를 포함하는 10% sodium dodecyl sulfate(SDS) 200㎕를 첨가한 후 8시간 동안 용해시켰다. 200㎕를 96-well 플레이트에 옮긴 뒤 570nm 파장에서 마이크로플레 이트 리더(microplate reader)(Spectra Ⅲ, SLT, Austria)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 생존율은 해동 후의 MTT 값을 동결 전의 MTT 값으로 나누어 백분율 하였으며, 그 결과는 아래의 표 4와 같으며, 아래의 표 4는 그룹별 5개의 시편을 이용하여 MTT를 분석한 결과이다.Survival rates of rapidly thawed cellular artificial tissues at 37 ° C were measured by 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2 and 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analysis. Tissue samples were chopped into 1-2 mm 3 pieces, suspended in 200 μl HBSS and 20 μl of 5 mg / ml MTT solution was added. Thereafter, the reaction was carried out at 37 ° C. for 4 hours, and 200 μl of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) containing 10 mM hydrogen chloride (HCl) was added thereto and then dissolved for 8 hours. 200 μl was transferred to a 96-well plate and absorbance was measured using a microplate reader (Spectra III, SLT, Austria) at 570 nm wavelength. The survival rate was divided by the MTT value after thawing by the MTT value before freezing. The results are shown in Table 4 below, and Table 4 below shows the results of MTT analysis using five specimens of each group.
[표 4] 생존율[Table 4] Survival rate
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 동결보존액을 본 발명의 실시 예에 따른 UW용액+10% 디메틸설폭사이드(DMSO)의 용액으로 한 경우, 동결보존한 세포성 인공조직이 해동 후에 87.7±3.8%의 가장 높은 생존율을 보인 것으로 판명되었다.As shown in Table 4 above, when the cryopreservation solution was a solution of UW solution + 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) according to the embodiment of the present invention, the cryopreserved cellular artificial tissue was thawed after 87.7 ± 3.8%. It was found to have the highest survival rate.
이후, 해동 후 세포성 인공조직에서의 세포의 사멸정도(Apoptotic index)를 알기 위해서 Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling(TUNEL)방법을 이용하였다. 즉, 파라핀 블록에 고정되어 있는 인공조직 시편을 4㎛ 두께로 자른 뒤, Superfrost PLUS® 슬라이드에 올려놓았다. Subsequently, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) was used to determine the apoptotic index of cellular tissues after thawing. In other words, the artificial tissues fixed to the paraffin block were cut to a thickness of 4 μm and placed on a Superfrost PLUS ® slide.
이후, 크실렌(Xylene)에 10분간 2번 담가 두어 파라핀을 제거하고, 점차 낮은 농도의 에탄올(ethanol) 수용액에 담가 수화하였다. 수화된 조직절편을 10mM 시트르산염(Citrate) 완충용액에 10분간 반응시키고, 정제된 물에 세척 후, 내재성 peroxidase 활성을 막기 위해 10분간 3% 과산화수소(hydrogen peroxide) 수용액을 처리하였다. 절편을 hematoxylin으로 염색한 후, 점차 높은 농도의 알코올(ethanol) 수용액에 탈수한 후, 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과 아래의 표 5 와 같이 해동 후 1일째 가장 많은 세포들이 죽었고, 본 발명의 실시 예의 경우에는 10% 이하로 가장 적은 세포들이 죽었음을 알 수 있었다.Thereafter, the mixture was immersed twice in xylene for 10 minutes to remove paraffin, and gradually hydrated in an aqueous solution of ethanol at a low concentration. The hydrated tissue sections were reacted with 10 mM Citrate buffer for 10 minutes, washed with purified water, and treated with 3% hydrogen peroxide (10%) solution to prevent endogenous peroxidase activity. Sections were stained with hematoxylin, gradually dehydrated in an aqueous solution of alcohol, and observed with an optical microscope. As a result, as shown in Table 5 below, most cells died on the first day after thawing, and in the case of the present invention, it was found that the least cells died at 10% or less.
[표 5] 세포의 사멸Table 5 Death of Cells
또한, 세포성 인공조직의 기능성 회복을 평가하기 위해 세포성 인공조직을 5mM HCl-cysteine, 100mM Na2HPO4, 5mM Na2-EDTA, 그리고 250㎍/㎖ 파파인(papain)으로 이루어진 파파인 소화 효소(papain digestion) 용액으로 65℃에서 24시간 동안 용해하였다. PicoGreen®DNA detection kit를 이용하여 디옥시리보핵산(DNA)양을 측정하였다. 이때, 480nm excitation, 520nm emission에서 형광광도계(Fluorescence spectrophotometer, Hitach, Japan)를 이용하였다. 한편, Blyscan assay(Biocolor, Belfast, lreland) kit를 이용하여 glycosaminoglycans(GAGs)을 정량하였다. DNA 및 GAG의 양은 해동 후 24시간과 72시간에 측정하였다. 그 결과, 아래의 표 6, 7과 같이 본 발명의 실시 예에 따른 세포성 인공조직이 DNA 및 GAG 양의 증가가 동결보존 되지 않은 대조군에 가장 근접하였다. In addition, in order to evaluate the functional recovery of cellular artificial tissue, the cellular artificial tissue was treated with papain digestive enzyme (5 mM HCl-cysteine, 100 mM Na 2 HPO 4 , 5 mM Na 2 -EDTA, and 250 μg / ml papain). It was dissolved for 24 hours at 65 ℃ in papain digestion) solution. Deoxyribonucleic acid (DNA) levels were measured using a PicoGreen ® DNA detection kit. In this case, fluorescence spectrophotometer (Hitach, Japan) was used at 480 nm excitation and 520 nm emission. Meanwhile, glycosaminoglycans (GAGs) were quantified using a Blyscan assay (Biocolor, Belfast, lreland) kit. The amount of DNA and GAG was measured at 24 hours and 72 hours after thawing. As a result, the cellular artificial tissue according to the embodiment of the present invention as shown in Tables 6 and 7 below was the closest to the control group that the increase in the amount of DNA and GAG is not cryopreserved.
[표 6] 세포성 인공조직의 DNA 양Table 6 DNA amount of cellular artificial tissue
[표 7] 세포성 인공조직의 GAG 양[Table 7] GAG amount of cellular artificial tissue
한편, 세포성 인공조직을 3% 포르말린(formalin)으로 고정하여 파라핀(Paraffin) 블록에 심은 후, 이 파라핀 블록을 4㎛두께로 절단하여 hematoxylin-esin(H&E)으로 염색하였다. 또한, 세포성 인공조직의 기능성 회복은 면역조직화학(immunohistochemistry)염색법으로 metalloproteinase-1(MMP-1) 프로틴(Protein) 발현을 조사하여 분석하였다. 그 결과 도 1a 내지 1c에 나타난 바와 같이, MMP-1 발현에 있어서 모든 군의 세포성 인공조직에서 섬유 모세포의 세포질 전체에 골고루 발현되었다. 특히 본 발명의 실시 예를 이용하였을 경우(도 1c), 세포성 인공조직이 다른 군에 비해 MMP-1 발현이 가장 두드러짐을 알 수 있다.Meanwhile, the cellular artificial tissue was fixed with 3% formalin and planted in a paraffin block, and the paraffin block was cut to 4 μm and stained with hematoxylin-esin (H & E). In addition, functional recovery of cellular artificial tissue was analyzed by examining the expression of metalloproteinase-1 (MMP-1) protein by immunohistochemistry staining. As a result, as shown in Figures 1a to 1c, the expression of MMP-1 was evenly expressed throughout the cytoplasm of the fibroblasts in the cellular artificial tissues of all groups. In particular, when using the embodiment of the present invention (Fig. 1c), it can be seen that MMP-1 expression is most prominent in the cellular artificial tissue compared to other groups.
참고로, 도 1a 내지 1c는 본 발명의 실시 예에 따른 동결보존된 세포성 인공조직의 조직학적 검사에 따른 세포의 사멸, 세포내부의 팽창 및 공포로 인한 세포의 변성 여부를 투과전자현미경으로 촬영한 화면을 도시한 것으로서, 도 1a는 동결보존액으로서 DMEM/F-12(10 FBS)을 사용한 경우이고, 도 1b는 HTS+10% DMSO를 사용한 경우이며, 도 1c는 본 발명의 실시 예에 따른 UW용액+10% DMSO)를 사용한 경우이다. 또한, 도면에서 (→)모양은 세포의 사멸(apoptosis)을 나타내고, (▶)모양은 세포내 팽창 및 공포로 인한 세포의 변성을 나타낸다.For reference, FIGS. 1A to 1C are photographed by transmission electron microscopy to determine whether cells are denatured due to histological examination of cryopreserved cellular artificial tissue according to an embodiment of the present invention, expansion of cells, and fear of intracellular expansion. 1 shows a case in which DMEM / F-12 (10 FBS) is used as a cryopreservation solution, FIG. 1B illustrates a case where HTS + 10% DMSO is used, and FIG. 1C illustrates an embodiment of the present invention. UW solution + 10% DMSO). In addition, (→) shape indicates apoptosis of cells, and (▶) shape indicates cell degeneration due to intracellular expansion and fear.
또한, 본 발명의 실시 예에서는 투과전자현미경(transmission electron microscopy) 분석을 위해서 2% 글루타알데하이드(glutaraldehyde, Sigma, St. Louis, MS)에 고정하였다. 그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 새롭게 생성된 GAG의 양은 동결보존 되지 않은 대조군과 거의 대등하였다. 뿐만 아니라, 대조군에 비해 새롭게 생성된 콜라겐 섬유(collagen fiber) 또한 대등하였고, 특히 미성숙한 콜라겐 섬유는 더욱 비슷하였다. 그리고 세포막의 기포(membrane bleb) 및 세포내 소기관의 파열 등의 미세구조의 손상은 거의 나타나지 않았다. 참고로, 도 2는 본 발명의 실시 예에 다른 동결 보존된 투과전자 현미경상의 섬유세포를 나타낸 것이다.In addition, in the embodiment of the present invention it was fixed in 2% glutaraldehyde (glutaraldehyde, Sigma, St. Louis, MS) for transmission electron microscopy analysis. As a result, as shown in Figure 2, the amount of newly produced GAG was almost equivalent to the control group not cryopreserved. In addition, the newly produced collagen fibers were also comparable to those of the control group, especially immature collagen fibers were more similar. In addition, there was almost no damage to the microstructures such as membrane bleb and rupture of intracellular organelles. For reference, Figure 2 shows a fiber cell on a cryopreserved transmission electron microscope according to an embodiment of the present invention.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시 예를 설명하였으나, 본 발명은 다양한 변화와 변경 및 균등물을 사용할 수가 있고, 상기 실시 예들을 적절히 변형하여 동일하게 응용할 수가 있음이 명확하다. 따라서 상기 기재 내용은 하기의 특허청구범위의 한계에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.Although preferred embodiments of the present invention have been described above, it is clear that the present invention can use various changes, modifications, and equivalents, and that the above embodiments can be appropriately modified and applied in the same manner. Accordingly, the above description does not limit the scope of the invention as defined by the limitations of the following claims.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명의 실시 예에 따른 세포성 인공조직의 동결보존액의 조성 및 동결보존방법을 다음과 같은 효과가 있다.As described above, the composition and cryopreservation method of the cryopreservation solution of the cellular artificial tissue according to an embodiment of the present invention has the following effects.
인트라셀룰러(intracellular) 형태의 운반용액과 투과성(permeating) 동결보존액을 병행하여 사용함으로써, 구조가 복잡한 세포성 인공조직을 동결 및 해동 과정에서 동반되는 손상을 최소화하여 해동 후 세포성 조직 내 세포의 생존율을 높이고, 소멸 정도를 최소화하며, 인공조직 내 생물학적 기능을 반영구적으로 보관 유지할 수가 있다.By using intracellular carrier solution and permeating cryopreservation solution in parallel, the survival rate of cells in cellular tissue after thawing is minimized by minimizing the damages involved in freezing and thawing complex cellular tissues. It is possible to increase the level, minimize the extinction, and semi-permanently maintain the biological function in the artificial tissue.
또한, 동결보존액에 FBS를 첨가하지 않음으로써 동결 및 해동과정에서 불필요한 감염 가능성을 배제할 수 있으며, 동결보존된 세포성 인공조직을 치료목적으로 사용할 수가 있다.In addition, by not adding FBS to the cryopreservation solution, the possibility of unnecessary infection can be excluded during freezing and thawing, and cryopreserved cellular artificial tissue can be used for therapeutic purposes.
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