KR100686560B1

KR100686560B1 - 니코티아나 타바컴으로부터 분리한 ＮｔＴＬＰ1을 포함한오이모자이크바이러스에 대한 항바이러스제

Info

Publication number: KR100686560B1
Application number: KR1020050033667A
Authority: KR
Inventors: 백경희; 김민정; 함병국
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2005-04-22
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2007-02-26
Also published as: KR20060111205A

Abstract

본 발명은 오이모자이크 바이러스(CMV, Cucumber mosaic virus)에 대한 항바이러스 활성을 갖는 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum)으로부터 분리한 NtTLP1(Nicotiana tabacum Thaumatin-like protein 1), 이를 포함하는 항바이러스제 및 NtTLP1의 full-length cDNA를 함유한 pMBP2 재조합 벡터로 형질전환되어 NtTLP1을 과발현시킴으로서 오이모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 트랜스제닉 담배 식물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 NtTLP1은 CMV에 감염되는 경우에 CMV 1a 단백질들과 상호작용하며 NtTLP1의 발현의 증가가 유도되어 CMV 감염에 대한 민감성을 탁월하게 저해하기에 본 발명의 NtTLP1은 CMV 감염에 대한 항바이러스제로서 사용될 수 있다.

오이모자이크 바이러스, 니코티아나 타바컴, NtTLP1, 항바이러스제

Description

니코티아나 타바컴으로부터 분리한 ＮｔＴＬＰ1을 포함한 오이모자이크바이러스에 대한 항바이러스제{An antiviral agent comprising NtTLP1 isolated from Nicotiana tabacum to CMV infection}

도 1은 담배 게놈 DNA의 겔 블랏 분석을 실시한 도이고,

도 2는 재조합 NtTLP1과 CMV 1a 단백질의 in vitro 상호작용 테스트를 나타낸 도로서, 친화 크로마토그래피를 통해 His-NtTLP1 단백질의 정제(a)를, NtTLP1과 CMV 1a 단백질의 결합을 파 웨스턴 분석(far westhern assay)을 한 결과(b)를 나타낸 도이며,

도 3 및 도 4는 NtTLP1::GFP와 CMV 1a::2xHA의 in planta 에서의 상호작용을 나타내는 도로서, 도 3은 면역침강된 단백질을 항-GFP를 이용하여, 도 4는 항-HA를 이용하여 이뮤노블랏 분석을 실시한 결과를 나타낸 도이며,

도 5는 애기장대 원형질체(Arabidopsis protoplasts)에서의 NtTLP1::GFP의 세포내 위치를 나타낸 도로서, 대조군으로서 GFP 와 NtTLP1::GFP를 애기장대 원형질체로 형질전환 시킨후 이들 도입된 유전자를 발현시킨 후 24시간 후에 형광현미경으로 촬영한 도이며,

도 6은 애기장대 원형질체에서 NtTLP1::GFP와 CMV 1a::RFP의 인접위치를 나 타내는 도이며,

도 7 및 도 8은 양파세포에서 대조군인 GFP(도 7)와 NtTLP1::GFP(도 8)의 세포내 위치를 나타낸 도이며,

도 9는 효모세포에서 NtTLP1와 CMV 이동 관련 단백질(Coat Protein과 MP)의 상호작용을 나타낸 도로서, pVA3-1, pTD1-1 플라스미드는 양성대조군(a), pACT2, pAS2-1 플라스미드는 음성대조군(b)이며, Y187 주 효모가 상호형질전환된 것은 (c) 내지 (f)에서 보여지며, 푸른 점은 양성 β-갈락토시다아제 활성을 나타내며,

도 10은 CMV-Kor 접종에 대한 서로 다른 세가지 TLP(thaumatin-like proteins) 유전자들의 발현 패턴을 RT-PCR 결과를 나타낸 도이며,

도 11 내지 도 14는 NtTLP1 트랜스제닉 T1 담배 식물에서의 NtTLP1 유전자의 발현 및 CMV 처리 후 바이러스의 증식정도를 나타낸 도들로서, 도 11은 형질전환되지 않은 대조군 식물과 비교해서 트랜스제닉 T1 담배 식물의 RT-PCR 과 웨스턴 블랏 분석을 실시한 도이며, 도 12는 접종후 1, 2, 3, 4, 6일 후에 항-CMV lgG(3㎍/㎖)를 이용한 엘리사(ELISA) 분석을 통해 트랜스제닉 T1 담배 식물의 접종엽에서의 CMV-Kor CP의 축적량을 나타낸 도이며,

도 13은 트랜스제닉 T1 담배 식물의 접종엽 상엽에서의 CMV-Kor CP의 축적량을 나타낸 도이며,

도 14는 트랜스제닉과 대조군 식물에서 CMV RNA의 축적을 나타낸 도이다.

본 발명은 오이모자이크 바이러스(CMV, Cucumber mosaic virus)에 대한 항바이러스 활성을 갖는 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum)으로부터 분리한 NtTLP1(Nicotiana tabacum Thaumatin-like protein 1), 이를 포함하는 항바이러스제 및 NtTLP1의 full-length cDNA를 함유한 pMBP2 재조합 벡터로 형질전환되어 NtTLP1을 과발현시킴으로서 오이모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 트랜스제닉 담배 식물에 관한 것이다.

CMV는 전세계에 걸쳐 분포하며 식물체 감염바이러스 중 작물과 잡초를 망라하여 숙주범위가 가장 넓고(1000여종의 식물체에 감염) 세계적으로 중요한 경제성을 갖는다. 병징은 극히 다양하며 가장 일반적인 병징의 한가지는 식물체의 생장이 심히 저해되어 생산성이 없어지는 것인데, 이때 잎에 뚜렷한 모자이크 병증이 나타나는 수도 있다. 과실에 황화반점 또는 괴저반점이 나타나기도 하며, 때로는 과피가 거칠어지고 선명하지 못한 색깔을 띠면서 쭈그러들기도 한다.

CMV는 커커모바이러스(cucumovirus) 그룹에 속하며 (+)sense single-strand의 tripartite genome을 갖는 RNA plant virus이다. goenome은 3종류의 RNA로 구성되며 종종 330 내지 380개의 염기서열을 갖는 위성 RNA를 포함하기도 한다.

CMV는 오이, 호박, 딸기, 배추 및 수박 등 주요작물에 병을 일으키는 바이러스로서, CMV 감염에 대한 숙주의 반응은 저항반응, 일반적인 병리적 반응 그리고 특정 바이러스성 유전적 산물의 존재 또는 활동에 대한 반응 등으로 분류될 수 있 다. 이러한 반응들은 숙주와 바이러스성 인자 사이에서 발생하는 분자적인 상호작용에 의해 관찰된다. 이러한 식물과 바이러스사이의 상호작용은 직접적으로 바이러스 복제, 세포간 이동, 조직적 이동, 징후발전 뿐만 아니라 숙주방어반응의 유도에 까지 영향을 미친다(Carrington and Whitham, 1998). 비록 이 과정과 관련된 바이러스 인자들의 역할과 관련된 정보들이 많이 있더라도 이와 관련된 숙주 인자들에 대해선 많이 알려져 있지 않다. 그 중에서도 CMV 감염에 대한 저항성은 오직 몇가지 예만 보고되어져 있다. 동부(cowpea)에서 CMV 저항성을 지닌 단일의 우성 유전자 Cry가 동정되어 졌고(Nasu et al., 1996), 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 두개의 단일의, 독립적인 열성의 CMV 저항 유전자, cum-1 및 cum2-1이 동정되어 졌다(Yoshii et al.,2004). 그러나 CMV 바이러스성 단백질과 직접적으로 상호작용을 하는 저항성 유전자는 아직 보고되어 진 바 없다.

CMV의 게놈에는 3개의 capped messenger-sense RNAs인 RNAs 1, 2, 3 가 존재한다(Palukaitis et al., 1992). RNAs 1 과 2는 1a 과 2a 단백질을 코딩한다. 1a 및 2a 단백질은 세포내에서 바이러스 복제 복합체를 형성함으로써 viral RNA 복제에 필수적이고(Hayes and Buck, 1990; Nitta et al., 1988), RNA 2는 또한 2b 단백질을 코딩하는데(Ding et al., 1994), 이는 CMV 바이러스의 숙주 특이적 장거리 이동에 관련이 있으며(Ding et al., 1995), 또한 바이러스로 유도된 gene silencing의 서프레서(suppressor) 기능을 한다(Brigneti et al., 1998). RNA 3은 단백질 3a 및 CP(the coat protein)를 코딩하는데, CP는 하위게놈인 RNA 4로부터 번역되는데 반하여, 3a 단백질은 RNA 2로부터 직접적으로 번역된다(Schwinghamer and Symons, 1975). 3a 단백질과 CP는 CMV의 세포간의 효율적인 이동에 있어서 필수적이다(Boccard and Baulcombe, 1993; Canto et al., 1997; Ding et al., 1995; Suzuki et al., 1991).

PR 단백질은 병원성 감염 또는 그와 관련된 상황동안 유도되어진 식물 단백질로서(van Loon et al., 1994), 비독성 병원체가 저항 식물을 공격하는 비친화적 상호작용에 있어서 보다 더 빠르게 식물 저항성 유도 성분으로서 발현되어 진다(Dong et al., 1991). 최근, PR 단백질과 PAD3, PAD4, PR1, TLP, BG2 및 cf-2 resistance gene-like gene를 포함하는 또 다른 방어 유전자들이 동정되어졌고, 이들은 몇몇 바이러스들과 친화적 상호작용을 하는 동안에도 유도되어지는 것으로 밝혀졌다(Whitham et al., 2003). 비록 다양한 PR 단백질의 생물학적 또는 생화학적인 기능이 지난 수십년동안 연구되어 졌지만, 키틴나아제(chitinase)와 β-1, 3-글루카나아제(β-1,3-glucanase)을 포함한 몇몇 PR 단백질만이 그들의 촉매적 작용과 관련된 것만 규명되어 졌고(Mauch et al., 1988), 몇몇 TLPs(thaumatin-like proteins)들은 항균인자로서 β-1, 3-글루칸을 가수분해하는 것으로만 인식되어져 왔다(Grenier et al., 1999). 한편으로는 식물 방어 작용에 있어서 다른 PR 단백질의 기능이 충분히 밝혀져야 한다. 게다가 숙주와 바이러스의 친화적 관계에서 유도된 PR 단백질의 기능에 대해서 밝혀진 바가 별로 없다.

이에 따라 본 발명자들은 CMV 바이러스 분열에 영향을 미치는 인자로서, CMV 1a 단백질과 상호작용을 하는 숙주인자를 이스트 투 하이브리드 시스템(yeast two-hybrid system)을 통하여 PR 단백질의 PR-5 그룹에 속하는 NtTLP1(Nicotiana tabacum thaumatin-like protein 1)을 분리하였으며, NtTLP1이 in vitro 뿐만 아니라 in planta에서 CMV 1a 단백질과 직접적인 상호작용을 함을 확인하였고, 또한 NtTLP1 유전자 발현은 CMV의 공격의 결과물이며, NtTLP1 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물이 CMV 감염에 대한 민감성이 감소되고, NtTLP1이 효모에서 바이러스 이동에 관여하는 CMV MP와 CP와도 상호작용하는 것을 확인함으로서 NtTLP1은 항바이러스 단백질로서 기능하며 바이러스의 복제 및 이동을 저해하는 기능을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 오이모자이크 바이러스(CMV, Cucumber mosaic virus)에 대한 항바이러스 활성을 갖는 니코티아나 타바컴으로부터 분리한 NtTLP1(Nicotiana tabacum Thaumatin-like protein 1), 이를 포함하는 항바이러스제 및 NtTLP1의 full-length cDNA를 함유한 pMBP2 재조합 벡터로 형질전환되어 NtTLP1을 과발현시킴으로서 오이모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 트랜스제닉 담배 식물을 제공하는 것이다.

본 발명은 오이모자이크 바이러스(CMV, Cucumber mosaic virus)에 대한 항바이러스 활성을 갖는 서열번호 1의 유전자 서열에 의해 코딩되는 NtTLP1(Nicotiana tabacum Thaumatin-like protein 1)을 제공한다.

상기 NtTLP1은 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum)으로부터 분리된 PR-5 그룹에 속하는 단백질을 의미한다.

또한, 본 발명은 오이모자이크 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 서열번호 1의 유전자 서열에 의해 코딩되는 NtTLP1을 유효성분으로 함유하는 항바이러스제를 제공한다.

또한, 서열번호 1의 유전자 서열을 함유한 pMBP2 재조합 벡터로 형질전환되어 NtTLP1을 과발현시킴으로서 오이모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 트랜스제닉 담배 식물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 상기 NtTLP1을 코딩하는 유전자는 21개의 아미노산 분비 신호펩티드를 가진 226개의 아미노산 잔기 단백질을 코딩하며, NtTLP1은 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum)으로부터 분리된 PR-5 그룹에 속하는 단백질로서, 분자량이 24.6kDa이며 등전점은 5.3이며, 다른 TLPs(Thaumatin-like protein)와 유사한 성질을 보인다.

상기 NtTLP1은 CMV의 접종으로 NtTLP1의 전사가 유도되어 발현되고, 처음엔 세포질내에서 존재하다가 점차 세포벽 또는 세포외부공간으로 방출되어진다. 상기 NtTLP1은 세포내 바이러스 복제 복합체를 형성함으로서 viral RNA복제에 필수적인 단백질인 CMV 1a 단백질과 CMV 1a 단백질의 헬리케이즈 부위(CMV-Hel)와 메틸트랜스퍼레이즈 부위(CMV-MT) 두 부위와 상호작용을 하며, in vitro에서는 CMV 1a 단백질과 직접적인 결합을 하며, in planta에서 NtTLP1과 CMV 1a 단백질은 복합체를 형성함으로서 상호작용을 한다. 뿐만 아니라 NtTLP1은 CMV의 피복단백질인 CP와 이동단백질인 MP와도 상호작용을 함으로서 CMV의 숙주세포에서의 증식 뿐만아니라 그 증속의 속도 및 범위에 까지 영향을 미침으로서 상기 NtTLP1은 CMV에 대하여 항바이러스 활성을 갖는다.

상기 CMV 1a 단백질과 상호작용을 하는 NtTLP1은 이스트 투 하이브리드 스크리닝(yeast two-hybrid screening)을 통하여 동정할 수 있고, in vitro에서의 NtTLP1과 CMV 1a 단백질 사이의 상호작용은 파 웨스턴 분석(Far-western assay)을 수행하여 관찰할 수 있고, in planta에서의 양 단백질의 상호작용은 면역침강실험을 수행함으로서 관찰할 수 있다. 또한, NtTLP1 및 CMV 1a 단백질의 위치확인을 위하여는 각각 GFP(green fluorescence microscope) 및 RFP(red fluorescence micoscope)를 이용한 in vivo 표적화 실험을 실시하여 형광 전자 현미경을 통하여 관찰할 수 있다.

또한 본 발명은 오이모자이크 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 서열번호 1의 유전자 서열에 의해 코딩되는 NtTLP1을 유효성분으로 함유하는 항바이러스제를 제공한다. CMV의 증식 및 증식의 속도와 범위에 까지 영향을 미치며 항바이러스 활성을 나타내는 상기 NtTLP1을 유효성분으로 함유한 항바이러스제는 CMV로 인하여 피해를 입는 식물에 투여함으로서 CMV를 극복하여 식물의 생산성을 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 유전자 서열을 함유한 pMBP2 재조합 벡터로 형질전환되어 NtTLP1을 과발현시킴으로서 오이모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 트랜스제닉 담배 식물을 제공한다.

상기 트랜스제닉 담배 식물은 바이너리 벡터인 pMBP2 벡터에 NtTLP1의 cDNA를 폴리링커 사이트에 클론하고 이를 호에케마 등의 방법(Hoekema, A., Hirsch, P., Hooykaas, P.J.J. and Schilperoort, R., A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid., Nature, 303, pp179-180, 1983)을 응용하여 아그로박테리움 매개 형질전환을 이용하여 담배식물로 삽입함으로서 제조할 수 있다.

상기 NtTLP1을 과발현시킨 트랜스제닉 담배 식물의 경우 NtTLP1을 과발현시킨 결과 CMV-Kor의 피복단백질인 CP의 축적 및 CMV RNA의 축적이 현저히 감소되어 결국 CMV의 증식이 저해된다. 따라서 담배 식물 뿐만 아니라 오이모자이크 바이러스에 의해 피해를 입을 수 있는 모든 식물에 대하여 상기 NtTLP1을 과발현 시킨 트랜스제닉 식물을 제조함으로서 오이모자이크 바이러스에 대한 피해를 줄일 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것이며 발명의 범위가 이에 의하여 한정되지는 않는다.

실시예 1. CMV-Kor RNAs의 추출(Virus strain and RNA extraction)

CMV-Kor의 증식과 정제는 권 등의 방법을 응용하여 이용하였다(Kwon, C.S., Paek, K.H. and Chung W.I., Full-length cDNA cloning and nucleotide sequence analysis of Cucumber mosaic virus (Strain Kor) RNA 2., J. Plant Biol., 39, pp265-271, 1996). 상기에서 증식 및 정제한 CMV-Kor의 RNAs를 추출하기 위하여, 바이러스 입자로부터 TNE(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM Na₂-EDTA)를 사용하여 CMV-Kor의 RNAs를 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 상기 추출한 RNAs는 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate)를 처리한 물에 용해시키고, 259 nm의 흡광도에서 관측하여 정량하였다.

실시예 2. 담배 식물의 준비 및 바이러스 접종

담배(Tobacco, Nicotiana tabacum cv. NC82) 식물은 16시간의 빛/8 시간의 어둠의 명암주기로, 25℃에서 성장시켰다. 인산 완충액(0.25 M Na2HPO4, 5 mM EDTA)에서 감염된 잎을 갈아 상기 실시예 1에서 수득한 CMV-Kor 입자를 함유한 담배 식물 액즙을 준비하였고, 이를 2-3개의 담배 묘목(8-10 잎의 단계) 어린잎의 표면에 카보런덤(carborundum, mesh 500, Hayashi Chemical)을 섞어 문질렀다. 대조군으로서 거짓접종된 식물은 인산완충액으로만 문질러 준비하였다. 상기 잎들은 접 종 후 48시간 후에 거두어 유전자 도서관 작성을 위한 RNA 소스로서 사용하였다. 담배(Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) 잎 조직에 TMV(Tobacco mosaic virus, strain P0)를 신 등의 방법을 응용하여 접종하였다(Shin, R., Park, C.J., An, J.M. and Paek, K.H., A novel TMV-induced hot pepper cell wall protein gene(CaTin2) is associated with virus-specific hypersensitive response pathway., Plant Mol. Biol., 51, pp687-701, 2003).

실험예 1. NtTLP1( Nicotiana tabacum Thaumatin-like protein 1)의 분리 및 NtTLP1과 CMV 1a 단백질사이의 상호작용

CMV 1a 단백질은 CMV는 바이러스의 복제 뿐만 아니라 조직적 감염의 과정에도 연루되어 있다(Palukaitis and Garcia-Arenal, 2003). CMV 감염은 또한 바이러스 유래의 다른 단백질 간의 상호작용 및 추정숙주인자와 CMV 1a 단백질의 상호작용에 의해 조절되어진다고 추정된다. 따라서, CMV 1a 단백질과 상호작용을 하는 숙주인자를 동정하기 위하여 하기의 이스트 투 하이브리드 스크리닝(Yeast two-hybrid screening) 실험을 수행하였다.

1-1. 이스트 투 하이브리드 스크리닝(Yeast two-hybrid screening) 실험

매취메이커 Ⅱ GAL4 투 하이브리드 시스템(MatchMaker II GAL4 two-hybrid system)은 클론테크 레보레이토리(Clontech Laboratories)에서 구입하였다. 상기 실시예 2에서 수득한 CMV에 감염된 담배 잎에서 추출한 RNA로 pACT2 활성화 부위 발현벡터(pACT2 activation domain expression vector)를 이용하여 담배 cDNA 도서관(tabacco cDNA library)을 작성하였다. 상기 담배 cDNA 도서관은 pAS2-1/CMV 1a 결합부위 퓨전벡터(pAS2-1/CMV 1a binding domain fusion vector)를 이용하여 스크린하였다. 상기 두 퓨전벡터는 사크로마이세스 세레비지에 주 Y190(Saccharomyces cerevisiae strain Y190, MATa, HIS3, lacZ, trp1, leu2, cyhr2) 또는 HF7c(MATa, HIS3, lacZ, trp1, leu2)에서 상호 형질전환된 것이다. 그 형질전환된 효모세포들은 Leu, Trp 및 His이 결실된 최소 SD(synthetic dropout) 배지에서 선별하였다. 상기 선별과정에서 거짓 양성 클론을 제거하기 위하여, SD 배지 플레이트를 3-아미노-1,2,4-트리아졸(3-amino-1, 2, 4-triazole) 50 mM(Y190) 또는 5 mM(HF7c)로 보충하였다. 상기에서 선별된 효모 세포들은 8-12일동안, 30℃에서 성장시킨 후에, 5-브로모-4-클로로-3-인돌리-β-d-갈락토시드(X-gal)을 기질로 사용하여 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)을 활성을 콜로니-리프트 필터 분석(colony-lift filter assays)을 통하여 관찰하였다. 상기 분석에 의해 동정된 추정 양성 클론들(Leu+, Trp+, His+)을 재형질전환으로 선별하였다. 플라스미드는 각 Leu+, Trp+, His+ 및 LacZ+ 형질전환체(transformant)로부터 효모 플라스미드 분리키트(the Yeast Plasmid Isolation Kit, Clontech)를 이용하여 분리하였다. 일렉트로포레이션(electroporation)을 통해 상기에서 분리한 플라스미드로 E.coli XL1-블루 세포(Escherichia coli XL1-Blue cells, Stratagene)를 형질전환시켰다. 세균으로 증식된 pACT2 퓨전 플라스미드를 동정하고 분석하였다. 또한 이스트 쓰리 하이브리드(yeast three-hybrid) 분석을 위하여, CMV 1a 와 CP 또는 CMV 1a 와 MP를 pBridge 벡터(Clontech)에 클론하였다.

1-2. NtTLP1의 분리

상기 실험 과정에서 작성된 담배 cDNA 도서관을 완전한 CMV 1a 유전자(full-length CMV 1a gene)을 이용하여 스크린하였을때, 스크린된 1.5×10⁶형질전환체 중에서 초기에 368개의 콜로니가 Leu, Trp 및 His가 결핍된 플레이트에서 자랐다. 이 369개의 콜로니를 재형질전환시키고, 콜로니-리프트 필터 분석(colony-lift filter assay)을 실시하였다.

상기 실험예 1-2에서 수행한 콜로니-리프트 필터 분석의 결과 14개의 클론에서 β-갈락토시다아제 활성을 확인하였다. 상기 14개의 클론들중에서 시퀀스 분석에 의해 이 클론들 중 2개의 클론이 PR 단백질의 PR-5 그룹에 속한 TLP 식물 유전자와 상동성이 있음을 확인하였다. NtTLP1으로 추정되는 이 유전자는 21개의 아미노산 분비 신호 펩타이드를 가진 226개의 아미노산 잔기 단백질을 코딩하고, 다른 TLPs의 성질과 유사하다(Malehorn, D.E., Borgmeyer, J.R., Smith, C.E. and Shah, D.M., Characterization and expression of an antifungal zeamatin-like protein (ZIP) gene from Zea mays., Plant Physiol., 106, pp1471-148, 1994).

도 1에서 보는 바와 같이, NtTLP1은 담배 게놈에서 작은 유전자 패밀리의 한 멤버임을 서던 블랏 분석(Southern blot analysis)을 통해 확인할 수 있었다. 예상 단백질의 분자량은 24.6 kDa이고, 계산된 등전점 (isoelectric point)은 5.3이다(GenBank accession number AY745249).

상기 실험예 1-2에서 분리한 NtTLP1이 CMV와 상호작용을 하는 것은 하기 표1에서 보는 것처럼, GAL 4 결합 또는 활성부위와 직접적인 상호작용이 배제된 HIS3 및 lazZ 리포터 유전자(HIS3 and lazZ reporter genes)의 자동 활성화를 위한 실험을 위한 추가적인 플라스미드 조합과 구성의 사용에 의해 증명되었다. pAS2-1::CMV 1a(bait) 뿐만 아니라 pACT2::NtTLP1(prey)는 그 자체로서는 HIS3 또는 lazZ 리포터 유전자를 활성화시키지 못하였다. NtTLP1(expressed from pACT2::NtTLP1)는 GAL4 DNA-결합 도메인과 그 스스로 상호작용하지 못할 뿐만 아니라, GAL4 DNA-결합부위 또는 GAL4 활성화 부위를 모두 코딩하는 부모 플라스미드와 상호 형질전환 되었을때 CMV 1a(expressed from pAS2-1::CMV 1a) 또한 플라스미드가 어떤 혼합된 시퀀스 없이 GAL4 활성화 도메인과 상호작용을 하지 못하였다.

반면, NtTLP1은 CMV 1a 단백질의 헬리케이즈 부위인 CMV-Hel 뿐만 아니라 CMV 1a 단백질의 메틸트랜스퍼레이즈 부위를 가진 CMV-MT와 상호작용하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 NtTLP1은 효모에서 full-length CMV 1a 단백질과 CMV 1a 단백질의 두개의 도메인과 상호작용함을 확인할 수 있었다.

효모세포에서의 CMV 1a 와 NtTLP1과의 상호작용

GAL 4 BD^a Vector	GAL 4 AD^b Vector	His	β-갈락토시다아제
pAS2-1::CMV 1a	-^c	-	-
-	pACT2::NtTLP1	-	-
pAS2-1::CMV 1a	pACT2	-	-
pAS2-1	pACT2::NtTLP1	-	-
pAS2-1::CMV 1a	pACT2::NtTLP1	+	+
pAS2-1::CMV 1a-MT^d	pACT2::NtTLP1	+	+
pAS2-1::CMV 1a-Hel^e	pACT2::NtTLP1	+	+

(주) ^aBD : DNA-결합부위(Binding domain), ^bAD : 활성화 부위(activation domain), ^c : 비발현 벡터(no coexpressed vector) , ^d: CMV 1a 단백질의 메틸트랜스퍼레이즈 부위(Methyltransferase domain of CMV 1a protein) , ^e : CMV 1a 단백질의 헬리케이즈 부위(Helicase domain of CMV 1a protein)

실험예 2. in vitro 에서 CMV 1a 단백질과 NtTLP1의 직접적인 상호작용

in vitro에서 CMV 1a 단백질과 NtTLP1이 직접적으로 상호작용을 하는지 여부를 확인하기 위하여 파 웨스턴 분석(Far-western assay)를 실시하였다.

2-1. NtTLP1의 full-length cDNA clones의 분리

상기 실험예 1-2에서 분리한 NtTLP1의 완전한 cDNA 클론(full-length cDNA clones)을 분리하기위하여, 부분적인 cDNAs의 시퀀스에 기초하여 NtTLP1을 위한 특정 프라이머, 5'- CCTTAAGCTGGGCTGGTTACCTCCTACAGCATT-3'를 고안하였다. 상기 실험예 1-1에서 이스트 투 하이브리드 스크리닝(yeast two-hybrid screening)을 위해 구축된 cDNA 도서관은 특정 프라이머와 일반적인 프라이머(T7 primer and Reverse primer)을 이용한 PCR 증폭의 주형으로서 사용하였다.

2-2. 파 웨스턴 분석(Far- westhern assay)

NtTLP1 cDNA 프래그먼트는 PCR로 준비하여 pQE30 벡터(Qiagen)의 BamHI 자리에 클론시켰다. 이 증폭을 위해 사용된 프라이머 세트는 NtTLP1 △S-5'(5'-GGGATCCATGCATGCTGCCACTTTTG-3')와 NtTLP1-3'(5'- GGATCCAAGGGCAGAAGACAACCC-3')이다. 이 결과 획득된 프래임 퓨전 플라스미드는 E. coli 주인 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. N말단에 6개의 히스티딘잔기가 부착된 NtTLP1의 과발현은 30℃에서 3시간동안 0.4 mM 이소프로필-β-d-티오갈락토시드(isopropyl-β-d-thiogalactoside)에 의해 유도하였다. 상기 유도후에 세균은 펠렛되고, 용해 완충액(50 mM Na2HPO4, pH 8.0, 300 mM NaCl)에 담궈 두었다가 비브라셀 소니파이어(Vibracell Sonifier, Sonics and Materials)로 1시간동안 얼음에서 소니케이션(sonication)하였다. 그 여액(lysate)은 13,000×g의 속도로, 10분간 원심분리한 후에, 그 상층액은 Ni-NTA 친화 레진(QIAGEN)상에서 크로마토그래피를 하였다. 재조합 단백질은 용출 완충액(50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 10% glycerol)에서 pH 6.0 내지 4.0에서 용출시켰다. 단백질은 12% SDS-PAGE을 통해 분리하였고, 니트로셀룰로오즈 세포막(nitrocellulose membranes)으로 수송하였다. 이 세포막은 5% 우유를 함유한 4℃, AC 완충액(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, and 75 mM KCl)에서 3회 세척하고, 동일 용액내에서 방사선표지된 CMV 1a 단백질의 존재하에서 2시간동안 배양하였다. 그 후에 상기 세포막은 프로브없는 AC 완충액으로 4℃에서 3회 세척하고, 간단히 건조시킨 후 오토레디오그래피(autoradiography)로 시각화하였다.

2-3. in vitro 전사/ 번역 실험

CMV 1a 단백질의 경우, ³⁵S-Met이 표지된 CMV 1a 단백질을 T7 프로모터의 다운스트림에 있는 CMV 1a cDNA로부터 직접적으로 상기 단백질을 합성할 수 있는 진핵세포 i n vitro 번역 시스템을 사용하여 획득하였다. in vitro 전사/ 번역 실험은 T7 프로모터의 제어아래에 있는 CMV 1a 단백질의 코딩 시퀀스가 있는 pGBKT7 플라스미드를 TNT wheat germ system(Promega)을 이용하여 in vitro 전사/번역 반응에서의 주형으로서 사용하였다. 방사선표지로 ³⁵S-Met(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 1시간동안 단백질을 합성하였다. 상기 합성한 단백질을 추출하고, His 벡터(lane 1) 또는 His-NtTLP1(lane 2)로 형질전환된 E. coli 컬쳐로부터 정제하였다. 상기 단백질들은 SDS-PAGE로 분해하고, 니트로셀룰로오즈로 수송하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 재조합 His-NtTLP1로 추정되는 크기와 유사한 약 26 kDa의 폴리펩티드가 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 근접 상동성에서 정제되었다(도 2의 a 참조). 레인 1은 His 벡터로 형질전환된 E.coli 컬쳐로부터 정제된 단백질을 나타내며, 레인 2는 재조합 His-NtTLP1 단백질(5 ㎍)을 정제한 것이다.

또한, 상기 NtTLP1과 CMV 1a 단백질의 결합여부를 확인하기 위한 파 웨스턴 분석의 결과, ³⁵S-Met로 표지된 CMV 1a 단백질로부터의 방사선을 오직 재조합 His-NtTLP1이 용해된 레인 2에서만 확인할 수 있었다(도 2의 b 참조). 이 결과가 상기 실험예 1-2에서 이스트 투 하이브리드 스크리닝에 의해 분리한 NtTLP1이 in vitro에서 CMV와 직접적으로 결합할 수 있음을 명시적으로 나타내는 것이다.

실험예 3. in planta 에서 CMV 1a 단백질과 NtTLP1의 직접적인 상호작용

in planta에서 CMV 1a 단백질과 NtTLP1의 직접적인 상호작용 여부를 확인하기 위하여 면역침강실험(Immunoprecipitation)을 수행하였다.

HA(hemagglutinin) 에피토프(YPYDVPDYA)의 두 반복서열은 35S 프로모터와 Nos 터미네이터를 가진 변형된 pCAMBIA2300 vector(CAMBIA)의 SacI 사이트에 삽입시켰다. CMV 1a cDNA의 상위에 HA 에피토프가 융합되어졌다. 면역침강(Immunoprecipitation)은 크래프트 등의 방법을 응용하여 수행하였다(Crofts, A.J., Leborgne-Castel, N., Pesca, M., Vitale, A. and Denecke, J., BiP and Calreticulin form an abundant complex that is independent of endoplasmic reticulum stress., Plant Cell, 10, pp813-824, 1998).

또한 폴리에틸렌 글리콜이 매개된 원형질체 형질전환과 in planta에서의 상호작용을 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

NtTLP1의 in vivo 표적화를 위해, 신호 서열을 가진 프래그먼트는 프라이머 NtTLP1-5(5'-GGGATCCATGAACTTCCTCAAAAGCTTC-3')와 NtTLP1 Nonstop (5'-AAGGATCCAAGGGCAGAAGACAACCC-3')를 사용하여 PCR에 의해 합성하였다. NtTLP1-GFP(NtTLP1-green fluorescent protein)와 CMV 1a-RFP(CMV 1a-red fluorescent protein) 혼합 구성물은 종결코돈없이 GFP 코딩 지역의 N 말단을 주형으로 NtTLP1과 CMV 1a cDNAs의 코딩 지역을 위치 지정함으로서 합성하였다. 그 후에 혼합 구성물은 진 등에 기재된 폴리에틸렌 글리콜이 매개된 형질전환 과정을 응용하여(Jin, J.B., Kim, Y.A., Kim, S. J., Lee, S.H., Kim, D. H., Cheong, G.W. and Hwang, I., A new dynamin-like protein, ADL6, is involved from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis., Plant Cell, 13, pp1511-1526, 2001) 묘목으로부터 준비한 애기장대 원형질체(Arabidopsis protoplasts)로 삽입하였다. 이 혼합 구성물의 발현은 제시 액시오플랜 형광전자현미경(Zeiss Axioplan fluorescence microscope, Jena)을 이용하여 형질전환 후의 시점(time points)의 다양성을 관측하였고, 그 이미지는 악시캠 디지털 카메라(Axiocam digital camera, Jena)로 촬영하였다. 세포 전체 추출물을 수득하기 위하여, 원형질체(protoplasts)는 형질전환 17시간 후에 채취하여 50g의 속도로 5분동안 원심분리한 후, 50 mM HEPES 완충액(pH 7.5, 0.1 M NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM 2-mercaptoethanol을 함유) 200ℓ에 다시 담궈두었다. 그 원형질체는 소니케이션(sonication)에 의해 용해되고, 5,000×g 속도로 원심분리 하였다. 그 세포 전체 추출물은 그 후 100,000×g 속도의 초고속원심분리(ultracentrifugation)로 가용층과 막부분으로 분리하였다. 그 펠릿(pellets)들은 그 후 HEPES 완충액의 오리지날 볼륨(original volume)에 다시 담궈두었다. 이 분획물은 폴리클로날 항-GFP(polyclonal anti-GFP, Clontech) 또는 항-HA 항체(anti-HA antibodies, Clontech)를 사용한 단백질 겔 블랏 분석(protein gel blot analysis)에 의해 NtTLP1-GFP 또는 CMV 1a-2XHA의 존재 확인을 위한 프로브로 사용하였다. 상기의 단백질 젤 블랏 분석은 신 등의 방법을 응용하였다(Shin, R., Park, C.J., An, J.M. and Paek, K.H., A novel TMV-induced hot pepper cell wall protein gene (CaTin2) is associated with virus-specific hypersensitive response pathway., Plant Mol. Biol., 51, pp687-701, 2003). 수송된 막은 제1차 항체(anti-HA, 1:500 희석; anti-GFP, 1:500 희석, Clontech)에 대응하는 것으로 이뮤노 블랏(immunoblot)하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이 NtTLP1과 CMV 1a 단백질 사이에 일어나는 상호작용은 NtTLP1은 GFP(green fluorescent protein)가 혼합되어져 있고, CMV 1a는 HA(hemagglutinin) 항원결정부가 붙여진 상호 형질전환된 애기장대 원형질체를 사용한 상호 면역침강 실험법으로 확인할 수 있었다.

도 3에서 보는 것과 같이, 분자량 밴드가 50.0 kDa에서 확인할 수 있는바, 이는 NtTLP1::GFP과 CMV 1a::HA로 상호 형질전환된 애기장대 원형질체 추출물에서의 재조합 NtTLP1::GFP로 추정되는 크기이다. GFP와 CMV 1a::HA로 상호 형질전환된 애기장대 원형질체 추출물로부터의 레인 1에서는 어떠한 중요한 상호작용도 확인할 수 없었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 대조 실험에 있어서 HA-tagged CMV 1a 단백질의 합성은 폴리클로날 HA 항체를 첨가한 웨스턴 블랏을 통해 확인할 수 있었다. 상기 결과는 식물 세포에서 NtTLP1와 CMV 1a가 단백질 복합체를 형성하는 것을 보여주는 것이다.

실험예 4. NtTLP1의 위치와 NtTLP1와 CMV 1a 단백질 복합체의 위치

4-1. NtTLP1의 위치확인

in vivo에서 NtTLP1의 위치를 파악하기위하여 GFP(green fluorescence microscope)를 이용하여 in vivo 표적화 실험을 실시하였다. 종결코돈만 결실된 NtTLP1 cDNA은 GFP와 함께 형질전환된 애기장대 원형질체의 N 말단에 혼합시켜 형광 전자 현미경(fluorescence microscope)을 사용하여 GFP 단백질과 NtTLP1::GFP 혼합 단백질의 위치를 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 NtTLP1::GFP 혼합 단백질의 형광은 세포 내부에 축적되어 있었는바, 이는 그 단백질이 높은 농도에서 세포기질 내에 분포되어있음을 보여주는 것이다(도 5의 CH는 클로로필이다). 이는 신호 서열이 존재 함에도 성숙된 단백질이 세포질 내부에 보유되어질 수 있음을 추정한 크리스필스 등의 논문 결과와 유사한 것이다(Chrispeels, M.J and Tague, B.W., Protein sorting in the secretory system of plant cells., Int. Rev. Cytol., 125, pp1-45, 1991). 분비 신호 서열 존재는 NtTLP1가 세포외부로 보내진다는 것을 시사하고, 산성 TLPs가 세포외부공간으로 방출되는 것은 일반적으로 알려져 있다(Bednarek, S.Y., Wilkins, T.A., Dombrowski, J.E. and Raikhel, N.V., A carboxyl-terminal propeptide is necessary for proper sorting of barley lectin to vacuoles of tobacco., Plant Cell, 2, pp1145-1155, 1990). pSORT 프로그램을 이용한 컴퓨터 분석을 한 결과, NtTLP1은 ER의 막(endoplasmic reticulum, certainty = 0.55), 세포기질(certainty = 0.10) 및 세포외부공간(certainty = 0.10)에 위치함을 확인할 수 있었다.

4-2. 세포외부공간으로의 NtTLP1의 분비 가능성 확인

세포 외부 공간으로의 NtTLP1 분비의 가능성을 확인하기 위하여, 상기 실험예 3-1에서 수득한 NtTLP1::GFP 혼합 단백질을 이타야 등의 방법을 응용하여 양파의 상피세포에 삽입하였다(Itaya, A., Hickman, H., Bao, Y., Nelson, R. and Ding, B., Cell-to-cell trafficking of Cucumber mosaic virus movement protein: green fluorescent protein fusion produced by biolistic gene bombardment in tobacco., Plant J., 12, pp1223-1230, 1997). GFP 단백질과 NtTLP1::GFP 혼합 단백질의 위치는 형광전자현미경을 이용하여 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, CaMV 35S 프로모터의 제어하에 삽입된 유전자는 양파세포의 상위 상피 세포에서 높은 수준으로 발현하였다. 그 발현 후에 NtTLP1::GFP 혼합 단백질의 형광이 식물세포의 세포막과 세포벽 사이 공간(periphery)에서 처음으로 발견되었으며, 세포기질에서는 낮은 수준으로 관찰되었다(도 8 참고). 한편, GFP 단백질의 형광은 세포내부 전역에 축적되어져 있음을 확인할 수 있었다(도 7 참조). 이러한 결과는 NtTLP1이 세포내부에 위치하였다가 이들 중 몇몇은 세포외부 또는 세포벽으로 분비되었음을 보여주는 것이다.

4-3. 식물세포에서 NtTLP1과 CMV 1의 공동위치 여부 확인

식물세포에서 NtTLP1과 CMV 1a 단백질이 공동으로 위치하는지 여부를 확인하기 위하여, 종결코돈만 결실된 전체 CMV 1a cDNA를 RFP의 N 말단에 혼합하여, CMV 1a::RFP의 위치를 형광 전자현미경을 이용하여 확인하였다.

발현 후, 붉은 형광 CMV 1a::RFP가 시토졸에서 집합된 형태로 관찰되었다. 이미 발표된 논문에서 CMV 1a 단백질은 액포막(tonoplasts)과 소포낭막(vascular membrane)에 위치한다고 알려져 있었다(Cillo, F., Roberts, I.M. and Palukaitis, P., In situ localization and tissue distribution of the replication-associated proteins of Cucumber mosaic virus in tobacco and cucumber., J. Virol., 76, pp19654-19664, 2002).

NtTLP1::GFP와 CMV 1a::RFP 복합체로 상호 형질전환시킨 애기장대 원형질체는 형질전환 24시간 후에 형광 현미경 검사로 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 6에서 보는바와 같이, NtTLP1::GFP와 CMV 1a::RFP로 상호 형질전환된 애기장대 원형질체의 녹색과 붉은색 신호가 형질전환된 후 24 내지 30시간 사이에서 확인할 수 있었는바, 이는 NtTLP1::GFP와 CMV 1a::RFP 단백질이 결합된 모습으로 명백하게 나타났고 이로서 세포질내에서 두 단백질이 함께 위치함을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 세가지 TLPs의 CMV-encoded 단백질과의 상호 작용 패턴 확인실험

TLPs는 강산성에서 강염기에 이르기까지 다양한 pH 값을 가지고 있어(range of 3.4 to 12), 산성, 중성, 염기성 TLPs가 존재한다. 이 세가지 타입 모두가 단백질 수준에서 담배에서 동정되어졌다(Koiwa, H., Sato, F. and Yamada, Y., Characterization of accumulation of tobacco PR-5 proteins by IEF-immunoblot analysis. Plant Cell Physiol., 35, pp821-827, 1994). 이 세가지 타입의 TLPs의 서로 다른 물리화학적인 성질에 따라, 그들의 세포에서의 위치도 또한 다르다. 혈관(또는 다른 소낭)의 TLPs가 염기성인 반면, 일반적으로 세포외부에 존재하는 TLPs는 산성이다. 이러한 경향들이 어떤 생물학적인 의의를 갖는지는 아직 밝혀지지 않았다. 이러한 TLPs의 경향들이 CMV 1a 단백질과의 상호작용과의 관련여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

오스모틴(osmotin, 염기성)과 pTOL1(중성)을 분리하여, GAL4 활성화 부위에 혼합하여 CMV 1a 단백질과의 상호작용을 관찰하였다. 추가적으로 바이러스의 복제 및 운동에서 TLPs의 위치적인 역할을 확인하기 위하여, 세가지 TLPs가 CMV-encoded 단백질, RNA 의존 RNA 폴리머레이즈 2a, CP 및 MP들과 상호작용을 할 수 있는지 여부를 상기 실험예 1에서 수행한 방법과 동일하게 이스트 투 하이브리드 분석을 통하여 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 NtTLP1은 CMV 1a 단백질뿐만 아니라 CP, MP와도 상호작용을 하지만, CMV 2a 단백질과는 상호작용을 하지 않음을 확인할 수 있었다. 게다가 NtTLPs, CMV 1a 단백질, CP와의 상호작용은 pBridge 벡터 시스템을 이용한 이스트 쓰리 하이브리드 분석을 통하여 확인하였으나, MP는 이 시스템에서 NtTLP1과 CMV 1a와 복합체를 형성하지 않음을 확인하였다(도 9 참고). 그러나 오스모틴과 pTOL1은 오직 CMV 1a과만 상호작용을 하며, 다른 어떤 단백질과도 상호작용을 하지 않는 것으로 나타났다. 또한 NtTLP1이 TMV 레플리케이즈 또는 TMV-CP와도 상호작용을 할 수 있는지 여부를 확인하였으나, 이들과는 상호작용을 하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과들은 NtTLP1이 CMV 바이러스 단백질과 특이적으로 상호작용을 함을 나타내며 이는 CMV의 증식 뿐만 아니라 증식의 속도 및 범위에 까지 영향을 미치는 것임을 보여주는 것이다.

효모세포에서 TLPs와 CMV 바이러스성 단백질사이의 상호작용

CMV 바이러스성 단백질	NtTLP1	pTOL1	Osmotin
1a	+	+	+
2a	-	-	-
MP	+	-	-
CP	+	-	-

(주) + : β-갈락토시다아제 활성의 결과 푸른 콜로니

- : β-갈락토시다아제 활성의 결과 흰색 콜로니

실험예 6. CMV 접종에 대한 TLPs의 발현 패턴

TLPs의 발현 패턴을 담배 식물에서의 RT-PCR 분석으로 관찰하였다. 전체 RNA는 오스벨 등에 기재된 방법(Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J. A. and Struhl, K., Short protocols in molecular biology, New York: Wiley, 1995)을 응용하여 4주차 담배 잎에서 분리하였다. RT-PCR 분석을 위하여, cDNA는 MMLV-역전사효소(Promega)와 6-hexamer random primers을 이용하여 상기에서 수득한 전체 RNAs을 처리한 DNase Ⅰ로부터 합성하였다.

NtTLP1(5'- ATGAACTTCCTCAAAAG-3', 5'-TCAAGGGCAGAAGACAAC-3'), pTOL1(5'- ATGAGTCACTTGACAAC-3', 5'-CTACTTGGCCACTTCATG-3'), 오스모틴(5'- ATGGGCAACTTGAGATC-3', 5'-CTACTTAGCCACTTCATC-3'), PR-1(5'- GCGAAAACCTAGCTTGGGGAAG-3', 5'-TATATAACGTGAAATGGACGC-3'), PR-2(5'-CAATGCAGCAACTTACTTGAG-3', 5'- ACTTACGAGAGAAGCAGTAGC-3')을 위해 PCR(94℃에서 3분동안 변성; [94℃에서 1분; 57℃에서 45초; 72℃에서 2분]의 조건으로 25회 annealing; 72℃에서 7분동안 합성)을 25회 수행하였다.

또한 카보런덤(carborundum)을 문질렀을때 발생하는 어떤 잘못 유도된 TLP 유전자 발현(any wounding-induced TLP gene)의 가능성을 배제하기 위하여, 가접종 처리를 대조구로서 유도하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, 가접종된 잎에서는 TLP 유전자의 어떤 측정할만한 축적도 확인할 수 없었다. NtTLP1 전사는 CMV 접종 1일 후부터 축적되어, 5일째에 가장 많이 축적되었다. 유사한 유전자 발현의 패턴이 비록 몇몇 변화가 있기는 하지만, 오스모틴과 pTOL1의 경우에서도 관찰할 수 있었다. 오스모틴의 경우, 전사는 CMV 접종 1일째(on day 1)에 관측되었고, 5일 후까지 많이 증가하였으며, 반대로 pTOL1의 전사는 CMV 접종 후 1일째에 관찰되고, 비록 감소가 4일째부터 줄어드는 수준이 둔해지기는 하나 5일 후까지 유전자 발현 수준의 변화가 없었다. CMV 바이러스 유전자의 발현은 CMV 증식의 양성대조군으로 사용된 CMV RNAs의 보존된 3´말단의 관찰을 통해 확인할 수 있었다. 또한 CMV에 감염반응동안 유도되어지는 것으로 알려진 PR-1과 PR-2의 유전자 발현 패턴이 밝혀졌다(Whitham et al., 2003). 18S rRNA의 수준은 cDNA quantity를 위한 내부적 표준으로 추정된다. 추가적으로 CMV 감염이 유도하는 CMV 1a와 PRs사이의 상호작용이 PRs의 일반적인 성질인지여부를 확인하기 위하여, CMV 1a와 두 PRs(PR-1 and PR-2)의 상호작용을 측정한 결과, PR-1 뿐만 아니라 PR-2는 CMV 1a 단백질과 상호작용 하지 않는 것으로 밝혀졌다(data not shown).

상기 결과들로 세가지 타입의 서로 다른 TLP 유전자 모두가 CMV 감염의 반응으로 유도되어지는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7. CMV 감염에 대한 NtTLP1을 과발현시킨 트랜스제닉 담배 식물의 감염 정도의 변화관찰

in planta에서의 NtTLP1의 생물학적 기능을 더 관찰하기위하여, 센스와 안티센스-오리엔트 NtTLP1 트렌스제닉 식물(sense and antisense-oriented NtTLP1 transgenic tobacco plants)을 생산하였고, 하기와 같은 방법으로 분석하였다.

담배의 형질전환에 이용되었던 플라스미드는 전체 NtTLP1 cDNA의 센스와 안티센스 오리엔테이션으로 구성되어졌고, 바이너리 벡터(binary vector)인 pMBP2(Han, S.J., Cho, H.Y., You J.S., Nam Y.W., Park E.K., Shin J.S., Park Y.I., Park W.M. and Paek K.H., Gene silencing-mediated resistance in transgenic tobacco plants carrying potato virus Y coat protein gene., Mol. Cells, 9, pp376-383, 1999)의 폴리링커 사이트(polylinker site)에 클론되어졌다. 그 구성체(construct)는 호에케마 등에 기재된 아그로박테리움 매개 형질전환(Agrobacterium-mediated transformations)을 이용하여 담배 식물(tobacco cv Smasun NN)로 삽입되어졌다(Hoekema, A., Hirsch, P., Hooykaas, P.J.J. and Schilperoort, R., A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid., Nature, 303, pp179-180, 1983).

7-1. RT-PCR 실험

센스 와 안티센스 트랜스제닉 담배 식물 모두에서 RNA를 추출하여 상기 실험예 5에서 행한 RT-PCR과 동일한 방법으로 수행하여 RNA를 분석하였다.

7-2. 웨스턴 블랏 분석

트랜스제닉 식물에서의 총 잎 단백질을 NtTLP1을 위한 폴리클로날 항체을 사용하여 웨스턴 블랏에서 측정하였다.

총 가용성 잎 단백질은 Lindbo 등의 방법을 응용하여 T1 트랜스제닉 담배 식물의 잎 조직으로부터 추출하였다(Lindbo, J.A. and Dougherty, W.G., Pathogen-derived resistance to potyvirus: Immune and resistant phenotypes in transgenic tobacco expressing altered forms of a potyvirus coat protein nucleotide sequence. Mol. Plant Microbe Interact., 5, pp144-153, 1992). 그 단백질의 농도는 브래드포드 분석(Bradford assay)로 정량하였고, 12% 폴리아크릴아마이드 젤상에서 분리하고, Hoefer SemiPhor(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 polyvinylidene difluoride membranes(Millipore)로 수송하였다. 라 등의 방법을 응용하여 막에서 조직으로의 단백질을 항체면역방응 블랏 분석을 하였다(La, Y.J, Han J.H., Sim, G.B., Kim, B.D. and Ahn, K.K., Detection of cymbidum mosaic virus and odontoglossum ringspot virus in orchid plants by tissue-blot immunoassay., J. Kor. Soc. Hort. Sci., 40, pp481-484, 1999). NtTLP1에 대한 제1차 항체는 3 g/ml의 농도에서 사용하였으며, 그 후 1 g/ml 농도의 제2차 항체(anti-goat-rat IgG conjugated with alkaline phosphatases, Sigma)를 처리하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 11는 트렌스제닉 식물에서의 RNA 와 단백질 발현 수준을 RT-PCR과 웨스턴 블랏 분석을 한 결과로서, 형질전환되지 않은 식물에서는 내생적인(endogeneous) NtTLP1 유전자 발현의 수준이 낮았으며, 안티센스 트랜스제닉 담배 식물에서는 낮은 내생적인(endogeneous) NtTLP1 유전자 발현의 수준이 감소되었다. 반면, 센스 트랜스제닉 담배 식물에서의 NtTLP1의 유전자 발현 수준은 현저하게 증가하였다. 안티센스 트랜스제닉 담배 식물에서는 유의성있는 NtTLP1 단백질 측정이 불가한 반면, 센스 트랜스제닉 담배 식물에서는 상당히 많은 양의 NtTLP1 단백질을 확인할 수 있었다.

7-3. 엘리사(ELISA) 실험

NtTLP1 트랜스제닉 담배 식물이 바이러스의 접종에 대한 변경된 반응을 보이는지 여부를 관찰하였다. 각 독립된 라인마다 10개의 6개의 잎 단계의 트랜스제닉 담배 T1 식물과 10개의 비 형질전환대조군의 4장의 잎들을 CMV로 감염시키고 바이러스의 증식을 관찰하였다.

처음에 CP(coat proteins)의 축적패턴을 실험하였다. 감염후의 다양한 시점에서 감염된 식물의 접종엽과 접종엽의 상엽 둘다 실험하였고, CMV-Kor CP의 축적정도를 닷 ELISA 테스트를 실시하였다.

간접적인 엘리사 테스트(ELISA)는 CMV 관측에 수행되어졌다. 모든 시약들은 마이크로티터 플레이트상에서 차단단계(200㎕/well)를 제외하고 150㎕/well로 사용하였다. 잎 디스크(8 mm diameter)는 마이크로센트리퓨즈 튜브(microcentrifuge tube)에 넣어두고 200㎕의 추출 완충액(0.1 M Tris-HCl with 1% sodium sulfite, pH 7.4)에서 글라인더로 분말화하였다. pH 9.8에서 세배의 0.15M 카보네이트 완충액으로 희석시킨 추출액은 37℃에서 3시간동안 웰에서 배양하였다. pH 7.4에서 0.85% 염화나트륨과 0.05% Tween-20(TBST)을 함유한 0.01 M Tris-HCl로 3회 세척한 후, 그 플레이트는 pH 7.4에서 0.85% 염화나트륨(TBS)를 가진 0.1 M Tris-HCl에서 1% BSA로 40분동안 차단시켰다. 항원을 첨가하여 배양을 시킨 후, 플레이트는 TBST로 세척하고, 3㎍/㎖의 CMV 항체를 첨가하여 2시간동안 배양하였다. 그 플레이트는 다시 세척하고 1㎍/㎖의 2차 항체를 첨가하여 다시 배양하였다. TBST로 3회의 세척후, pH 9.8에서 0.2 M carbonate buffer에 p-nitrophenyl phosphate (1 mg/ml)을 포함한 기질 용액을 첨가하였고, 첨가후 30분 뒤에 ELISA Reader (Bio-Rad)로 A₄₀₅ nm에서 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, 센스 트랜스제닉 담배 식물의 접종된 잎의 CMV-Kor CP의 축적은 비형질전환 식물과 비교하였을 때 9-38% 감소된 수준이었다. 비슷한 결과가 감염된 후 12일 까지 비접종된 상위 잎에서도 나타났다(도 13 참조). 접종 후 16일 후, NtTLP1-과발현 트랜스제닉 식물이 대조군과 비슷한 정도의 민감성을 나타내었다(도 13 참조).

7-4. RNA 블랏 분석

또한, 감염 후 6일된 비접종된 상위 잎(the uninoculated upper leaf tissue at 6 DPI)에서의 바이러스 RNA 축적에 대한 RNA 블랏 분석을 실시하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 14에서 보는 바와 같이 센스 트랜스제닉 담배 식물에서 CMV RNA 축적의 정도가 비형질전환체의 그것보다 4 -23% 감소되었다. 반면, 안티센스 트랜스제닉 담배 식물은 CMV RNA 축적 또는 CP 축적 패턴 모두와 관련하여 영향을 받지 않았다. 이러한 결과들로 NtTLP1 과발현이 CMV 증식을 저해함을 확인할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 NtTLP1(Nicotiana tabacum thaumatin-like protein 1)은 니코티아나 타바컴으로부터 부닐된 PR 단백질의 PR-5 그룹에 속하는 단백질로 CMV 1a 단백질과 상호작용을 하는 숙주인자로서, in vitro 뿐만 아니라 in planta에서 CMV 1a 단백질과 직접적인 상호작용을 하며, 또한 NtTLP1 유전자 발 현은 CMV의 공격의 결과물이며, NtTLP1 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물이 CMV 감염에 대한 민감성이 현저히 감소되고, NtTLP1이 효모에서 CMV MP와 CP와 상호작용하므로 NtTLP1은 CMV 바이러스의 복제 및 이동을 저해하여 CMV에 대한 항바이러스 단백질로서 기능하기에 이를 포함하여 CMV 항바이러스제로서 이용이 가능하다. 또한 NtTLP1의 full-length cDNA를 함유한 pMBP2 재조합 벡터로 형질전환되어 NtTLP1을 과발현시킴으로서 오이모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 트랜스제닉 담배 식물을 제조에 이용하여 오이모자이크 바이러스에 대한 피해를 줄일 수 있다.

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오이모자이크 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 서열번호 1의 유전자 서열에 의해 코딩되는 NtTLP1을 유효성분으로 함유하는 항바이러스제.
서열번호 1의 유전자 서열을 함유한 pMBP2 재조합 벡터로 형질전환되어 NtTLP1을 과발현시킴으로서 오이모자이크 바이러스에 대한 저항성을 갖는 트랜스제닉 담배 식물.