KR100662600B1 - PS An edible pPS vector from Bacillus pumilus - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus, KCTC 0750BP) 유래의 식용 가능한 서열목록 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 pMMH1 플라스미드와, 상기 pMMH1 플라스미드의 염기서열 중 제한효소 PstI과 SpeI으로 절단되며 세포 내에서 가장 안정적으로 복제가능한 서열목록 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 DNA 단편에 관한 것이다. The present invention is a pMMH1 plasmid represented by the nucleotide sequence of the edible sequence listing sequence number 1 of Bacillus pumilus ( KCTC 0750BP), and the restriction enzymes PstI and SpeI in the nucleotide sequence of the pMMH1 plasmid and are cut in the cell. It relates to a DNA fragment represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 most stably replicable.
바실러스 푸밀러스, 플라스미드, 식용 벡터Bacillus pumilus, plasmid, edible vector
Description
도 1은 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)(KCTC 0750BP)에서 분리된 pMMH1의 전기영동 사진,1 is an electrophoresis picture of pMMH1 isolated from Bacillus pumilus (KCTC 0750BP),
도 2는 pMMH1의 환형지도(circle map), 2 is a circular map of pMMH1,
도 3은 pMMH1내에서 안정적으로 복제되는 작은 단편을 찾기 위해 만들어진 벡터들의 계열 모식도,3 is a series schematic of vectors created to find small fragments stably replicated in pMMH1.
도 4는 도 3에서 만들어진 벡터들이 갖는 pMMH1의 다양한 크기의 단편들을 나타낸 것이다. 4 illustrates fragments of various sizes of pMMH1 possessed by the vectors created in FIG. 3.
본 발명은 식용가능한 신규 플라스미드 및 그 단편에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장류식품에서 발견되는 야생종 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)에서 분리된 식용가능한 서열목록 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 pMMH1 플라스미드 및 상기 플라스미드의 염기서열 중 제한효소 PstI과 SpeI으로 절단되며 세포 내에서 가장 안정적으로 복제가능한 서열목록 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 DNA 단편에 관한 것이다.The invention edible novel plasmid, and relates to a fragment thereof, and more particularly pMMH1 plasmid represented by the base sequence of the edible Sequence Listing SEQ ID NO: 1 isolated from wild type Bacillus Fu milreoseu (Bacillus pumilus) is found in soy sauce products and The present invention relates to a DNA fragment represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, which is cleaved with restriction enzymes PstI and SpeI in the nucleotide sequence of the plasmid, which is most stably replicable in cells.
식용 벡터 개발을 위한 노력과 연구는 지금까지 활발하게 진행되어 온 것은 아니고 단지 낙농업을 많이 하는 유럽에서 종종 보고되어 왔다. 인체에 무해한 벡터의 선별, 적당한 선별 표지(selection marker)의 선택 및 안정성 있는 적합한 크기의 벡터 선택이 쉽지 않기 때문에 소극적인 시도만이 진행되어 온 것이다. 이러한 과거의 연구개발 성과들은 식용 벡터의 개발이 쉽지 않다는 것을 보여준다. 현재는 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 등에서 분리된 플라스미드를 이용하여 식용 벡터의 개발이 진행되고 있다. 그러나 아직은 사람보다는 동물용 식용 벡터에 그치고 있다. Efforts and research for the development of edible vectors have not been actively carried out to date and have often been reported in Europe, where only a large number of dairy farmers are involved. Only passive attempts have been made because it is not easy to select vectors that are harmless to the human body, select appropriate selection markers, and select a suitable size that is stable. These past R & D achievements show that the development of food vectors is not easy. Currently, the development of food vectors is underway using plasmids isolated from Lactobacillus , Lactococcus lactis , and the like. However, it is still more of an animal food vector than a human.
본 발명의 pMMH1은, 콩유래 발효식품의 주 발효균주로서 오랫동안 식용되어 국제적으로 그 안전성이 공인된 균주인 바실러스(Bacillus subtilis 및 그 유사균주)로부터, 본 발명자에 의해 최초로 분리된 플라스미드로서, 섭취시 인체에 무해한 장점이 있다. 이에 본 발명자는 상기와 같은 장점을 가진 pMMH1 플라스미드를 이용하여 상기 플라스미드의 염기서열을 결정한 후, 상기 pMMH1 플라스미드의 염기서열 중 세포 내에서 보다 안정적으로 복제가 되는 DNA 단편을 찾고자 하였다. PMMH1 of the present invention is a plasmid first isolated by the present inventors from Bacillus ( Bacillus subtilis and its similar strains), a strain that has been edible for a long time as a main fermentation strain of soybean-derived fermented foods and has been internationally recognized for its safety. It is harmless to human body. The present inventors determined the nucleotide sequence of the plasmid using the pMMH1 plasmid having the above-described advantages, and then sought to find a DNA fragment that is more stably replicated in the cell of the nucleotide sequence of the pMMH1 plasmid.
따라서, 본 발명은 전통적으로 섭취해 온 장류식품에 서식하는 야생 바실러스로부터 플라스미드를 분리하여 이를 사람이 섭취할 수 있는 식용벡터의 제조에 활용하는데 목적이 있다.Therefore, an object of the present invention is to isolate a plasmid from wild Bacillus inhabited in traditionally ingested food products and to use it in the preparation of an edible vector for human consumption.
상기 본 발명의 목적은, 바실러스 푸밀러스(KCTC 0750BP)에서 플라스미드 pMMH1을 분리하여 염기서열을 결정하고, 분리된 상기 플라스미드에서 복제 가능한 작은 단위를 찾기 위하여 pMMH1의 각 부분을 하나씩 제거하고, 여기에 대장균 플라스미드 pGEM5z(＋)를 연결하여 바실러스와 대장균에서 모두 이용할 수 있는 벡터를 구축하고, 이를 구축된 벡터의 숙주인 바실러스에 형질전환 하여 항생제가 없는 조건에서 100세대까지 연속적으로 회분 배양한 후 안정성을 확인하여, pMMH1의 염기서열 중 제한효소 PstI 및 SpeI로 절단되는 서열목록 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 DNA 단편이 세포 내에서 가장 안정적으로 복제된다는 것을 확인함으로써 달성되었다. The object of the present invention is to isolate the plasmid pMMH1 from Bacillus pumilus (KCTC 0750BP) to determine the sequencing, and to remove each part of pMMH1 one by one to find a replicable small unit in the isolated plasmid, E. coli Connect the plasmid pGEM5z (+) to construct a vector that can be used in both Bacillus and Escherichia coli, transform it to Bacillus, the host of the constructed vector, and continuously culture it for up to 100 generations in the absence of antibiotics. This was achieved by confirming that the DNA fragment represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 which is cleaved with restriction enzymes Pst I and Spe I among the nucleotide sequences of pMMH1 is most stably replicated in the cell.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.Hereinafter, the configuration and operation of the present invention.
본 발명은 식용 벡터 개발에 활용할 목적으로 바실러스 푸밀러스(KCTC 0750BP)에서 pMMH1 플라스미드를 분리하여 염기서열을 결정하는 단계; pMMH1의 복제기원점을 포함하는 부분을 제외한 나머지를 하나씩 제거하여 5개의 벡터를 구축하는 단계; 및 상기 구축된 벡터들을 대상으로 작은 사이즈의 가장 안정하게 복제되는 부분을 탐색하는 단계로 구성된다.The present invention is to determine the base sequence by separating the pMMH1 plasmid from Bacillus pumilus (KCTC 0750BP) for the purpose of utilizing in the development of an edible vector; constructing five vectors by removing one another except for a part including a replication origin of pMMH1; And searching for the most stablely replicated portion of small size with respect to the constructed vectors.
pMMH1 플라스미드의 분리 및 염기서열 결정과정과 안정적으로 복제되는 작은 단위의 플라스미드 절편의 확인은 하기와 같은 과정에 의해 수행되었다. Isolation and sequencing of the pMMH1 plasmid and identification of small plasmid fragments that were stably replicated were performed by the following procedure.
생명공학연구소 KCTC에서 구입한 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus, KCTC 0750BP)에 환형의 플라스미드가 존재한다는 사실을 도 1에서처럼 확인하고, 상기 플라스미드의 이름을 pMMH1으로 명명, 그 염기서열을 염기서열 분석 대행회사인 그 린진 회사(경기도 용인시 남동 산 38-2)에 의뢰하여 수행한 결과, 서열목록 서열번호 1과 같이 5,812개의 염기서열로 구성되어 있다는 사실을 확인하였다. 그리고 이 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 홈페이지의 유전자 분석 프로그램(HomoloGene, RefSeq)을 사용하여 유전자 지도를 도 2와 같이 완성하였다. Bacillus pumilus ( KCTC 0750BP) purchased from the Biotechnology Research Institute KCTC confirmed that the cyclic plasmid is present as shown in Figure 1, the name of the plasmid pMMH1, the base sequence is a sequencing agency As a result of request from Ingrinjin Company (38-2, Namdong San-dong, Yongin-si, Gyeonggi-do), it was confirmed that it consists of 5,812 base sequences as shown in SEQ ID NO: 1. The nucleotide sequence was completed using a genetic analysis program (HomoloGene, RefSeq) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) homepage as shown in FIG. 2.
pMMH1 플라스미드 내의 어떤 지역이 높은 복제수를 가지는 안정한 벡터유지를 위해 필요한지 알아보기 위하여 pMMH1 플라스미드의 일부분들을 절단하였다. 이를 쉽게 성취하기 위해, 대장균에서 복제가 가능하도록 pMMH1을 대장균 복제 벡터인 pGEM5zf(+) 벡터(Promega, U.S.A.)의 NcoI 위치로 삽입하여 pMMG를 제조하였다. Portions of the pMMH1 plasmid were digested to determine which regions in the pMMH1 plasmid were needed for stable vector maintenance with high copy numbers. To easily accomplish this, pMMG was prepared by inserting pMMH1 into the Nco I position of the pGEM5zf (+) vector (Promega, USA), which is an E. coli replication vector.
또한, 바실러스(Bacillus)에서 쉽게 복제 여부를 확인할 수 있도록, 선택마커로 cat(chloramphenicol acetyltransferase) 유전자의 1.4 kb SalI 절편을 pGEM5zf(+)의 SalⅠ위치에 클론하여 pGEMC를 구축하였다. In addition, 1.4 kb Sal I fragment of cat (chloramphenicol acetyltransferase) gene was cloned into Sal I position of pGEM5zf (+) to construct pGEMC so as to easily identify replication in Bacillus .
pGEMC의 EcoRV-NcoI 절편을 pMMH1의 PvuII-NcoI 절편에 삽입하여 pEN을 구축하였다. NdeI로 pEN을 절단하고, 그 결과물인 DNA 결합 단백질 코팅 지역(DNA binding protein coding region), 복제원점(replication origin), 그리고 분비 단백질 코딩 지역(secretion protein coding region)을 함유하는 4.0 kb 절편을 pGEM5zf(+)에 결합시켜 pMN을 구축하였다. EcoRI에 의해 pEN의 DNA 결합 단백질 코딩 지역(DNA binding protein coding region)을 절단한 후 자기결합시켜 pME를 제조하였다. pENMC was constructed by inserting the EcoR V- Nco I fragment of pGEMC into the Pvu II- Nco I fragment of pMMH1. The pEN was cleaved with Nde I, and a 4.0 kb fragment containing the resulting DNA binding protein coding region, replication origin, and secretion protein coding region was pGEM5zf. PMN was constructed by binding to (+). PME was prepared by cleaving DNA binding protein coding region of pEN by EcoR I and then self-bonding.
한편, pMMH1의 복제원점(replication region)을 함유하는 2,400개의 염기서 열로 구성된 PstI-PstⅠ 절편과, 2,230개의 염기서열로 구성된 서열목록 서열번호 2의 PstI-SpeI 절편을 pGEMC로부터 분리하였고, 각각 pGEM5zf(+) 속으로 삽입하여 pPP와 pPS를 구축하였다(도 3). Meanwhile, a Pst I- Pst I segment consisting of 2,400 sequences and a Pst I- Spe I segment of SEQ ID NO: 2 consisting of 2,230 sequences, containing a replication region of pMMH1, were isolated from pGEMC. PPP and pPS were constructed by inserting into pGEM5zf (+), respectively (FIG. 3).
바실러스 푸밀러스(B. pumilus)로부터 분리된 플라스미드, pMMH1은 비선택적 조건에 있어 매우 안정하게 복제가 된다. 이 플라스미드의 시퀀스 분석은 pMMH1이 복제원점(replication origin), γ-GTP의 2개의 오픈 리딩 프레임(open reading frames; ORFs), 타입 Ⅰ 시그날 펩티다제(type I signal peptidase; sipP)를 가지고 있음을 나타내었다. Plasmid, pMMH1, isolated from B. pumilus , replicates very stably under nonselective conditions. Sequence analysis of this plasmid showed that pMMH1 had a replication origin, two open reading frames (ORFs) of γ-GTP, and a type I signal peptidase (sipP). Indicated.
pMMH1 벡터의 안정성에 필요한 지역을 확인하고자, pMMH1에서 각각의 지역을 제거하였다. 그 결과 다섯 개의 벡터(pPS, pPP, pEN, pMN, pME)가 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)-에스세리시아 콜라이(E. coli) 셔틀벡터(shuttle vectors)로 제조되었다. γ-GTP 코딩 시퀀스가 제거된 pEN은 100세대가 지나도록 98%이상의 안정성을 보였으며, 이는 γ-GTP 코딩 시퀀스가 플라스미드 안정성에 불필요하다는 것을 암시한다. ORF2 (pME) 또는 γ-GTP 코딩 시퀀스에 더하여 타입 Ⅰ 시그날 펩티다제(type I signal peptidase; pMN) 또한 플라스미드의 안정성에 결정적으로 영향을 미치지는 않았다. pPP 와 pPS 둘 다에 있어서, γ-GTP 코딩시퀀스, ORF1, ORF2, 타입 Ⅰ 시그날 펩티다제(type I signal peptidase)는 완전히 제거되었으나, ORF1는 pPP 보다 pPS에서 더 많이 제거되었다. 그리하여 pPS가 pMMH1 플라스미드의 2,230개의 염기서열로 구성된 가장 작은 벡터였다. To identify the regions necessary for the stability of the pMMH1 vector, each region was removed from pMMH1. As a result, five vector (pPS, pPP, pEN, pMN , pME) Bacillus subtilis (B. subtilis) - was produced in S. serie cyano coli (E. coli) shuttle vectors (shuttle vectors). The pEN from which the γ-GTP coding sequence was removed showed more than 98% stability over 100 generations, suggesting that the γ-GTP coding sequence is unnecessary for plasmid stability. In addition to ORF2 (pME) or γ-GTP coding sequences, type I signal peptidase (pMN) also did not critically affect the stability of the plasmid. For both pPP and pPS, the γ-GTP coding sequence, ORF1, ORF2, type I signal peptidase was completely eliminated, but ORF1 was more removed from pPS than pPP. Thus pPS was the smallest vector of 2,230 base sequences of the pMMH1 plasmid.
구축된 모든 플라스미드들이 100세대를 지나서도 90%이상의 안정성을 보였다. γ-GTP 코딩 시퀀스, ORF1, ORF2, 타입 Ⅰ 시그날 펩티다제(type I signal peptidase)의 제거는 플라스미드의 안정성에 중대하게 영향을 미치지 않았다.All the constructed plasmids showed over 90% stability even after 100 generations. Removal of the γ-GTP coding sequence, ORF1, ORF2, type I signal peptidase did not significantly affect the stability of the plasmid.
따라서, 이상에서 살펴본 바와 같이, 벡터로서 크기가 커지면 세포내에서 불안정하므로, 세포내에서 안정하게 복제하는데 있어 불필요한 부분이 삭제되고 안정하게 복제하는데 꼭 필요한 부분, 즉 pMMH1의 2,230개의 염기서열로 구성된, 서열목록 서열번호 2의 DNA 단편(PstI-SpeI)이 크기 면에서 식용 벡터로 응용하기에 가장 적합한 부분임을 알 수 있다.Therefore, as described above, since the size is increased as a vector is unstable in the cell, the unnecessary portion in the stable replication in the cell is deleted and composed of the necessary parts, ie 2,230 nucleotide sequences of pMMH1, which is necessary for stable replication, DNA fragment of SEQ ID NO: 2 ( Pst I- Spe I) is the size of the most suitable for use as an edible vector.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to the following Examples.
실시예 1: 바실러스 푸밀러스(Example 1 Bacillus pumilus ( Bacillus pumilusBacillus pumilus )로부터 pMMH1 플라스미드의 분리 및 염기서열 결정Separation and sequencing of pMMH1 plasmid
바실러스 푸밀러스(B. pumilus) (KCTC 0750BP)로부터 pMMH1을 준비하기 위하여, 클로람페니콜(chloramphenicol;10ug/ml)이 포함된 3ml LB broth에 균체를 접종하여 하룻밤 배양한 후, 10,000rpm으로 원심 분리하여 cell을 모았다. 용액 Ⅰ(Solution Ⅰ: 50mM glucose, 10mM EDTA, 25Mm Tris, 10mg/ml lysozyme, pH8.0) 1ml에 상기 cell을 현탁시키고, 37℃에서 30분간 방치하였다. 용액 Ⅱ(Solution Ⅱ: 0.2M NaOH, 1% SDS) 1.5ml를 첨가하여 얼음물에 5분간 방치한 후, 용액 Ⅲ (Solution Ⅲ: 3 M Sodium acetate, pH4.8) 2ml 넣고 얼음물에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 4℃, 15,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 조심스럽게 새 튜브로 옮긴 후, 페놀/클로로포롬(phenol/chloroforome(1:1))을 동량 넣어 다시 4℃, 15,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액과 침전물을 분리하였다. 그런 후 상등액을 조심스럽게 따서 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 넣어 섞은 다음 -20℃에서 20분간 방치하였다. 그리고 15,000rpm에서 원심분리하여 용액은 버리고 침전물만을 수득하여 70% 에탄올로 세척한 후 건조시켰다. 건조된 침전물을 TE (tris-EDTA) 완충용액 2ml에 녹였다. 이렇게 준비된 DNA를 0.7% 아가로즈 젤에 로딩하여 ETBR이 포함된 TAE 완충용액에서 100mV 하에 전기영동을 실시하였다. 약 20분 경과 후 전기영동을 멈추고 UV 일루미네이터(illuminator) 위에 아가로스 젤을 올려 pMMH1 플라스미드 밴드를 확인하였다. 이 때 밴드 부분을 면도칼로 잘 오려서 새로운 튜브로 옮긴 후 아가로스로부터 DNA를 추출하는 QIAEX II gel extraction kit (Qiagen Inc. USA)를 사용하여 pMMH1을 분리하였다. 이렇게 분리된 DNA를 염기서열 분석에 사용하였으며, 염기서열 분석은 염기서열 분석 대행 회사 그린진(경기도 용인시 남동 산 38-2) 회사에 의뢰하여 수행하였다. 이 때 얻어진 염기서열의 분석은, NCBI 의 GeneBank 내의 유전자 분석 프로그램 Sequin, RefSeq 등을 사용하여 분석하였다. 그 결과 얻어진 pMMH1 플라스미드의 DNA의 염기서열을 서열목록 서열번호 1에 표시하였다.To prepare pMMH1 from B. pumilus (KCTC 0750BP), the cells were inoculated with 3 ml LB broth containing chloramphenicol (10ug / ml) overnight, and then centrifuged at 10,000 rpm. Collected. The cells were suspended in 1 ml of Solution I (Solution I: 50mM glucose, 10mM EDTA, 25Mm Tris, 10mg / ml lysozyme, pH8.0) and left at 37 ° C for 30 minutes. 1.5 ml of solution II (Solution II: 0.2 M NaOH, 1% SDS) was added and left in ice water for 5 minutes, and then 2 ml of solution III (Solution III: 3 M Sodium acetate, pH4.8) was placed in ice water for 1 hour. . Then, the supernatant was carefully transferred to a new tube by centrifugation at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and then the same amount of phenol / chloroforome (1: 1) was added and again at 4 ° C. and 15,000 rpm for 15 minutes. The supernatant and the precipitate were separated by centrifugation. Then, the supernatant was carefully picked, and the same amount of isopropanol was added and mixed, and then left at -20 ° C for 20 minutes. The solution was discarded by centrifugation at 15,000 rpm, and only precipitate was obtained, washed with 70% ethanol, and dried. The dried precipitate was dissolved in 2 ml of TE (tris-EDTA) buffer. Thus prepared DNA was loaded on 0.7% agarose gel and subjected to electrophoresis at 100mV in TAE buffer containing ETBR. After about 20 minutes, the electrophoresis was stopped and agarose gel was placed on the UV illuminator to check the pMMH1 plasmid band. At this time, the pMMH1 was separated using a QIAEX II gel extraction kit (Qiagen Inc. USA), which cuts the band well with a razor, transfers it to a new tube, and extracts DNA from agarose. The separated DNA was used for sequencing, and the sequencing was performed by a sequencing company Greenjin (38-2, Namdong, Yongin-si, Gyeonggi-do). The nucleotide sequences obtained at this time were analyzed using a gene analysis program Sequin, RefSeq, etc. in NCB GeneBank. The base sequence of the DNA of the resulting pMMH1 plasmid is shown in SEQ ID NO: 1.
실시예 2: 바실러스 푸밀러스(Example 2: Bacillus pumilus ( Bacillus pumilusBacillus pumilus )에서 분리된 pMMH1 플라스 미드를 이용한 벡터 구축Vector construction using pMMH1 plasmid isolated from
생명공학연구소에서 분양받은 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) (KCTC 0750BP)를 LB 배지에 하룻밤 배양하여 pMMH1 플라스미드를 분리하고, 이 플라스미드를 제한효소 NcoI으로 절단한 다음 대장균 플라스미드 pGEM5zf(+)를 같은 효소로 절단하여 연결하였다. 이를 pMMG라하고 이를 기준으로 pMMH1에 포함된 5개 부분 즉, 복제 기원점(replication origin), 오픈 리딩 프레임 1(orf1), 타입 I 시그널 펩티데이즈(type I signal peptidase), 감마 지티피 (gamma-GTP), 분비 단백질 암호화 지역(secretion protein coding region) 중 복제 기원점만 제외하고 하나씩 제거하는 방법으로 플라스미드의 크기를 줄여 5개(pEN, pMN, pME, pPS, pPP) 벡터를 구축하였다(도 3).Bacillus received pre-sale in Biotechnology Institute Fu milreoseu (Bacillus pumilus) (KCTC 0750BP) for overnight culture in LB medium to remove the pMMH1 plasmid, and cutting the plasmid with a restriction enzyme Nco I, and then the enzyme of the E. coli plasmid pGEM5zf (+) Cut and connected. This is called pMMG and based on this, the five parts contained in pMMH1 are: replication origin, open reading frame 1 (orf1), type I signal peptidase, and gamma-tipi. GTP), secretion protein coding region (5) (pEN, pMN, pME, pPS, pPP) vector was constructed by reducing the size of the plasmid by removing one by one except for the replication origin. ).
더욱 상세한 벡터 구축는 하기와 같은 과정에 의해 수행되었다. More detailed vector construction was performed by the following procedure.
어떤 지역이 높은 복제수를 가지는 안정한 벡터유지를 위해 필요한지 알아보기 위하여, pMMH1 플라스미드의 일부분들을 절단하였다. 편리한 DNA 조작을 위해, pMMH1를 pGEM5zf(+) 벡터(Promega, U.S.A.)의 NcoI 위치로 삽입하여 pMMG를 제조하였다. 바실러스(Bacillus)에서 선택마커로 사용되는 cat(chloramphenicol acetyltransferase) 유전자의 1.4 kb SalI 절편을 pGEM5zf(+)의 SalⅠ에 클론하여 pGEMC을 구축하였다. pGEMC의 EcoRV-NcoI 절편을 pMMH1의 PvuII-NcoI 절편에 삽입하여 pEN을 구축하였다. To determine which regions are required for stable vector maintenance with high copy numbers, portions of the pMMH1 plasmid were cut. For convenient DNA manipulation, pMMG was prepared by inserting pMMH1 into the Nco I position of the pGEM5zf (+) vector (Promega, USA). 1.4 kb Sal I fragment of cat (chloramphenicol acetyltransferase) gene used as a selection marker in Bacillus was cloned into Sal I of pGEM5zf (+) to construct pGEMC. pENMC was constructed by inserting the EcoR V- Nco I fragment of pGEMC into the Pvu II- Nco I fragment of pMMH1.
NdeI로 pEN을 절단하고 그 결과물인 DNA 결합 단백질 코팅 지역(DNA binding protein coding region), 복제원점(replication origin), 분비 단백질 코딩 지역 (secretion protein coding region)을 함유하는 4.0 kb 절편을 pGEM5zf(+)에 결합시켜 pMN을 구축하였다. EcoRI에 의해 pEN의 DNA 결합 단백질 코딩 지역(DNA binding protein coding region)을 절단하고 그 후 자기결합시켜 pME을 제조하였다. The pEN was cleaved with Nde I and a 4.0 kb fragment containing the resulting DNA binding protein coding region, replication origin and secretion protein coding region was prepared using pGEM5zf (+ ) To construct pMN. PME was prepared by cleaving the DNA binding protein coding region of pEN by EcoR I and then self-bonding.
한편, pMMH1의 복제원점(replication region)을 함유하는 2.4 kb PstI-PstⅠ 절편과 2,230개의 염기서열로 구성된 서열목록 서열번호 2의 PstI-SpeI 절편을 pGEMC으로부터 분리하였고, 이를 각각 pGEM5zf(+) 속으로 삽입하여 pPP와 pPS를 구축하였다(도 3).Meanwhile, a 2.4 kb Pst I- Pst I fragment containing a replication region of pMMH1 and a Pst I- Spe I fragment of SEQ ID NO: 2 consisting of 2,230 nucleotide sequences were isolated from pGEMC, respectively. pPP and pPS were constructed by inserting into pGEM5zf (+) (FIG. 3).
실시예 3: 구축된 벡터를 대상으로 가장 안정성 있는 부분 탐색Example 3: searching for the most stable part of the constructed vector
상기 실시예 2에서 구축한 벡터를 대상으로 안정성 여부를 조사하고 식용 플라스미드로 사용할 부분을 찾기 위해, pMMH1의 각 부분으로 구성된 플라스미드를 바실러스에 형질전환시키고 이 형질전환체를 3ml LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양기에서 배양한 다음 50ml LB 액체 배지가 포함된 250ml 삼각 플라스크에 2% (1 ml) 접종하였다. 이후 20세대까지 새 배지로 옮겨 배양하였다. 그런 후 미리 따뜻하게 만든 배지에 계대하여 같은 조건에서 연속으로 100 세대까지 항생제가 없는 배지에서 연속으로 회분 배양하였다. 배양은 20세대마다 새로운 배지로 옮겼다. 100세대 후 50ml 배양액 중에서 약 200㎕만 취하여 항생제 없는 배지로 도말하여 하룻밤 배양하였다. 이후 여기서 자란 균체 (colony)를 항생제(클로람페니콜)가 포함된 배지로 약 200개 균체를 따서 옮겨 다시 하룻밤 배양하였다. 최종적으로 항생제가 포함된 배지에서 몇 개의 균체가 살아남는지 여부를 보고 플라스미드의 안정성 여부를 확인하였다. 구축된 벡터는 하기 표 1의 결과와 같이 모두 90% 이상의 높은 안정성을 나타내었다.In order to investigate the stability of the vector constructed in Example 2 and find a portion to be used as an edible plasmid, a plasmid consisting of each part of pMMH1 was transformed into Bacillus, and the transformant was inoculated in 3ml LB liquid medium. Incubated overnight at 37 ° C. incubator and then inoculated 2% (1 ml) in a 250 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml LB liquid medium. Since then, up to 20 generations were transferred to fresh medium and cultured. Subsequently, the batch was cultured continuously in a medium without antibiotics for up to 100 generations under the same conditions. Cultures were transferred to fresh medium every 20 generations. After 100 generations, only about 200 μl of 50 ml culture was taken and plated with antibiotic-free medium and incubated overnight. Then, the cells grown here (colony) were transferred to a medium containing antibiotics (chloramphenicol), and about 200 cells were collected and cultured again overnight. Finally, the stability of the plasmid was confirmed by looking at how many cells survived in the medium containing antibiotics. The constructed vectors all exhibited high stability of 90% or more as shown in Table 1 below.
이중 pMMH1의 2,230개의 염기서열로 구성된, 서열목록 서열번호 2의 DNA 단편(PstI-SpeI)이 안정성에도 문제가 없으면서 pMMH1에서 가장 작은 부분을 포함하고 있으므로 식용 벡터로 사용하기에 적합하다고 판단된다. 안정한 벡터로서 작은 것이 유용한 이유는 벡터에 이어 그 크기가 커지면 세포내에서 불안정하기 때문이다. 그리고 벡터내에 목적으로 하는 유전자를 삽입할 경우 필요 이상으로 벡터가 커지게 되며 이는 벡터가 수용 할 수 있는 크기를 넘어서게 되어 결국 안정성을 잃게 된다. 따라서 세포내에서 안정하게 복제하는데 있어 불필요한 부분을 그냥 남길 필요가 없다. DNA fragment ( Pst I- Spe I) of SEQ ID NO: 2 consisting of 2,230 nucleotide sequences of pMMH1 contains the smallest part of pMMH1 without any problems in stability, and thus is suitable for use as an edible vector. . The reason why small ones are useful as stable vectors is that they become unstable intracellularly after their size. In addition, when the target gene is inserted into the vector, the vector becomes larger than necessary, which exceeds the size that the vector can accommodate and eventually loses stability. Therefore, there is no need to leave unnecessary parts for stable replication in the cell.
결론적으로 안정하게 복제하는데 꼭 필요한 부분이 2,230개의 염기서열로 구성된, 서열목록 서열번호 2의 DNA 단편(PstI-SpeI)임을 확인하였다.In conclusion, it was confirmed that the essential part for stable replication was a DNA fragment ( Pst I- Spe I) of SEQ ID NO: 2 consisting of 2,230 nucleotide sequences.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 안정성이 있으면서도 외래유전자의 생산이 용이한 서열목록 서열번호 1의 염기서열로 구성된 환형의 식용 플라스미드를 확보하였으며, 또한 상기 플라스미드의 염기서열 중 2,230개의 염기서열, 즉 서열목록 서열번호 2의 염기서열로 구성된 절편만 있어도 세포 내에서 안정적으로 복제가 가능하다는 사실을 확인하였다. 따라서 이를 이용하여 발현 벡터를 개발한다면 식품에 부족하기 쉬운 비타민이나 단백질 등의 생리적으로 유용한 물질을 보충할 수 있으므로, 본 발명은 식품 및 의약품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the present invention has secured a cyclic edible plasmid composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, which is stable and easy to produce a foreign gene, and also 2,230 of the nucleotide sequence of the plasmid. It was confirmed that even a single base sequence, that is, a fragment consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 can be stably replicated in a cell. Therefore, if an expression vector is developed using the same, it is possible to supplement physiologically useful substances such as vitamins or proteins, which are likely to be insufficient in food, and the present invention is a very useful invention for the food and pharmaceutical industries.
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