KR100660523B1

KR100660523B1 - 활성물질이 인캡슐레이션되어 있는 나노 캐리어의 제조방법

Info

Publication number: KR100660523B1
Application number: KR1020050102307A
Authority: KR
Inventors: 심진기; 조계민; 이상봉
Original assignee: 한국생산기술연구원
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2005-10-28
Publication date: 2006-12-22

Abstract

본 발명은 활성물질이 인캡슐레이션 되어 있는 나노캐리어의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 키토산, 히알루론산(hyaluronic acid), 카라기난 등의 친수성을 가지는 천연 다당류 고분자와 라우릭산, 에틸렌 글리콜 등의 소수성 화합물을 포함하는 수화 겔 자기 집합체를 나노캐리어로 이용하여 활성물질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 나노캐리어는 생체학적으로 안정하여 수용액에서 용해성이 낮고 활성도가 급격히 감소하는 알카로이드류 또는 단백질류 등의 활성물질의 용해성 및 안정성을 높일 수 있으며, 피부친화성 및 피부투과도가 기존 포스페이트 콜린으로 제조된 리포좀에 비하여 우수한 성질을 나타낸다.

나노캐리어, 활성물질, 천연 다당류, 자기집합체, 양쪽성 고분자

Description

활성물질이 인캡슐레이션되어 있는 나노 캐리어의 제조방법{Process for the Preparation of Nano Carrier Encapsulating Active Ingredients}

도 1은 본 발명에 따른 천연 고분자 나노 캐리어의 분자모식도를 도시한 것이다.

도 2는 칼세인을 활성물질로 하여 본 발명의 방법으로 제조되는 나노 캐리어의 종류, 온도 및 pH 조건에 따른 활성물질의 방출률을 나타낸 그래프이다.

도 3은 황련 유래 단백질을 활성성분으로 하여 본 발명의 방법으로 제조되는 나노 캐리어의 종류, 온도 및 pH 조건에 따른 활성물질의 방출률을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 활성물질이 인캡슐레이션 되어 있는 나노캐리어의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 키토산, 히알루론산(hyaluronic acid), 카라기난 등의 친수성을 가지는 천연 다당류 고분자와 라우릭산, 에틸렌글리콜 등의 소수성 화 합물을 포함하는 수화 겔 자기 집합체를 나노캐리어로 이용하여 활성물질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.

활성물질의 안정화 기술개발은 리포좀, 액정 및 나노기술을 이용하여 발전되어왔다. 이런 활성물질의 종류로는 식물추출물에 함유된 플라보노이드류, 비타민류와 같은 알칼로이드 성분과 효소, 호르몬류, 각종 성장인자들과 같은 단백질류로 구분될 수 있다.

단백질 활성물질의 경우에 상대적으로 높은 분자량을 가지고 있으며 온도 및 계면활성제나 제제 내 성분들과의 반응으로 생리활성을 잃게 되는 경우가 많다. 기존의 방법에 의해 제조된 활성물질을 안정화하기 위한 리포좀 등과 같은 다양한 제형들은 높은 포집율과 안정성을 가지고 있음에도 불구하고 단백질류 활성성분의 방출에 있어 많은 약점을 가지고 있다. 즉, 저분자류 활성물질은 리포좀이나 제형 막을 통하여 방출이 잘되는 반면, 단백질들은 분자량 및 구조적 성질로 인해 원활한 방출이 일어나지 않는다. 따라서, 상대적으로 높은 분자량을 가진 단백질이 쉽게 방출될 수 있도록 넓은 자유부피(free volume)를 가지는 수화 겔 타입의 나노입자 제조가 필요하다.

또한, 활성물질의 운반이 주로 피부에서 이루어질 경우 피부와의 친화성이 고려되어야 하므로, 생체친화성이 우수한 성분, 예를 들면 천연 다당류 고분자를 이용는 것이 바람직한데, 이를 위하여는 이러한 천연 성분의 다당류 고분자를 나노입자체로 만들기 위해서 새로운 형태의 자기집합체를 형성하여야 한다.

자기집합체(self-assembly)는 친수성 부분과 소수성 부분으로 구성되는데, 수용액 중에서 친수성 부분은 입자의 바깥쪽에 형성되고 소수성 부분은 입자의 내부에 존재하게 되며, 입자의 내부에는 활성물질을 함유하게 된다. 이때 친수성 부분은 천연 고분자로 구성되고, 소수성 부분은 여러 가지 유기물로 구성될 수 있다. 소수성 물질의 종류에 따라 많은 물성적 변화를 동반할 수 있다. 또한, 형성된 자기집합체의 친수성 다당류 고분자를 가교함으로써 수화 겔 형태를 유지하는 동시에 나노 입자의 강도를 상승시킬 수 있다.

이에 본 발명자들은, 천연 성분의 다당류 고분자에 소수성 화합물을 결합하여 수화 겔 타입의 양쪽성 고분자를 제조하고 이를 이용하여 활성물질을 나노크기로 포집하여 그 안정성을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 친수성 다당류 고분자와 소수성 화합물의 반응에서 얻어진 양쪽성 고분자로부터 자기집합체 성질을 가지는 나노캐리어를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 환경에 따라 생리적 활성의 변화가 심하거나 또는 피부 흡수가 용이하지 못한 활성물질을 자기집합체 성질을 가지는 나노캐리어로 인캡슐레이션하여 안정화하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은

(a) 친수성 다당류와 소수성 화합물을 반응시켜 친수성 다당류의 작용기에 소수성 화합물이 결합된 양쪽성 고분자를 제조하는 단계 ;

(b) 단계 (a)에서 생성된 양쪽성 고분자를 수용액 중에 분산시켜 자기집합체 성질에 의해 나노캐리어를 형성시키는 단계;

(c) 상기 나노캐리어에 가교제를 첨가하여 다당류를 가교하는 단계; 및

(d) 상기 가교된 나노캐리어를 정제한 다음, 여기에 활성물질을 첨가하는 단계를 포함하여서 되는 것을 특징으로 하는 활성물질이 인켑슐레이션 되어 있는 나노캐리어의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, '친수성 다당류'는 자연계에서 입수할 수 있거나 또는 그와 동등하게 합성되는 친수성의 탄수화물 고분자를 의미하는 것으로, 바람직하기로는 키토산, 히알루론산 또는 카라기난 중에서 선택된다.

본 발명에서 '소수성'화합물은 물에 대한 친화성이 낮은 화합물을 의미하는 것으로, 바람직하게는 라우릭산 또는 에틸렌 글리콜이 있다.

본 발명에 따르면, 친수성 다당류를 소수성 화합물과 반응시켜 양쪽성 고분자를 제조한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 이 반응에서는 반응물들이 치환반응을 활성화하는 화합물에 의하여 활성화되어 소수성 화합물이 친수성 다당류의 곁가지 사슬로 결합하게 된다. 이 때, 소수성 화합물의 치환반응을 활성화하는 화합물로는 반응 후에 최종 생성물에 포함되지 않는 활성화 화합물로서, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드 및/또는 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드가 사용될 수 있다.

상기한 방법으로 얻어진 친수성 다당류 고분자와 소수성 화합물은 한 분자 사슬 내에 다른 성질, 즉 친수성과 소수성이 같이 있는 양쪽성(amphiphilic) 고분자를 형성한다.

본 발명은 또한, 상기 방법들에 의해 제조되고, 활성물질이 수용성 천연 다당류 고분자와 소수성 곁사슬로 구성된 자기집합체에 의해 인캡슐레이션(encapsulation)되어 있는 나노캐리어를 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 제조된 양쪽성 고분자를 수용액 중에 분산시켜서 친수성 작용기는 친수성 작용기와, 그리고 소수성 작용기는 소수성 작용기와 집합되어 있는 자기집합체(Self-assembly)를 유도하여 나노캐리어(nano-carrier)를 제조한다.

상기 나노캐리어는 바깥족 부분이 친수성 다당류로 구성되는데, 추가로 본 발명의 단계 (c)에서는 같은 작용기가 집합되어 있는 자기집합체 성질을 띠는 나노캐리어에서 양쪽성 성분 중 친수성 다당류만을 가교제에 의해 가교시킨다. 나노캐리어의 바깥쪽 부분에서 친수성 다당류가 가교됨으로써 이렇게 형성된 나노캐리어는 안정성을 확보할 수 있게 된다.

이를 위하여 사용되는 가교제로는 포름알데하이드, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 및 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 사용할 수 있다.

생리 활성 성분이 오랫동안 그 효능을 유지하고 제형의 안정화를 이루기 위해서는 캐리어 내에 생리활성 성분이 포집되는 효율을 높이는 것이 필수요건이다.

본 발명에 있어서, '활성물질'은 생체 내에서 생리적 활성을 나타낼 수 있는 물질로 그 종류에 특별한 제한은 없으나, 예를 들면 항생제, 소염제, 항부종제, 라이소자임 클로라이드, 호르몬 의약품, 비타민 A 및 이의 유도체, 비타민 C 유도체, 비타민 E와 이의 유도체 등의 항산화제, 항균제, 미백 원료, 콜라겐 합성 촉진제 등의 주름제거 및 완화제 등이 사용될 수 있다. 바람직하기로는 상기 활성물질로는 단백질류, 더욱 바람직하기로는 황련 유래 단백질이 사용될 수 있다.

항진균 활성을 나타내며, 특히 감염성 아토피성 피부염의 주원인균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 우수한 항진균 활성을 가지고 있고, 기존의 항진균제들과 달리 독성과 부작용이 낮아 진균 감염의 치료뿐 만 아니라 예방적으로 피부 보호를 위해 사용될 수 있는 황련 유래 단백질을 활성물질로 하여 나노 크기의 캐리어 내에 캡슐화하므로써 피부 흡수를 증진시킬 수 있다.

도 2와 3은 각각 칼세인과 황련 유래 단백질을 활성성분으로 포함하는 본 발명의 방법으로 제조된 나노캐리어의 온도 및 pH 조건에 따른 방출률을 나타낸 것이다. 도 2와 3에서 보이는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 활성물질이 인캡슐레이션 되어 있는 나노캐리어는 활성물질의 방출에 있어서 온도나 pH 변화에 거의 영향이 없는 안정된 물성을 나타낸다.

본 발명의 방법으로 제조되는 활성물질이 인캡슐레이션 되어 있는 나노캐리어는 경피용, 경구용 또는 정맥주사용으로 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 경피용으로 사용된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지는 않는다.

특히, 하기 실시예에서는 활성물질로 칼세인과 황련 유래 단백질을 예시하였으나, 알부틴, 경피 투과 의약품 등 피부흡수가 용이하지 못한 활성물질이라면 제한없이 적용이 가능하다는 것은 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1 양쪽성 고분자의 제조

키토산 10 g을 아세트산 20 ml와 증류수 980 ml로 혼합된 용매에 넣고 상온에서 용해시켰다. 용해된 키토산 용액 100ml에 라우릭산과 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 표 1과 같은 비율로 혼합 후 10분간 교반하였다. 교반된 혼합용액에 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 표 1과 같은 비율로 첨가한 후 10분간 교반하여 양쪽성 고분자를 제조하였다.

EDC 첨가 시에는 양쪽성 고분자들의 나노입자들이 뭉치지 않게 하기 위하여 초음파 기기를 사용하여 분산을 유도하였다. 초음파 기기는 VC 505모델 프로브 타입을 사용하였고, 초음파 처리 중 용액의 온도가 과도하게 상승하는 것을 방지하기 위하여 용액 주위를 얼음물로 차갑게 유지하였다.

다음으로, 미반응 라우릭산을 제거하기 위하여 3,000 rpm에서 15분간 원심분리를 실시하여 양쪽성 고분자로부터 자기집합체 성질에 의해 나노캐리어를 제조하였다. 형성된 나노캐리어의 다당류 부분을 가교하기 위하여 원심분리 후 얻어진 용액 100 ml에 1 ml의 글루타르알데히드를 첨가하여 30분간 교반하여 가교된 나노캐리어를 제조하였다.

상기 가교 혼합물질 중의 미반응 저분자 물질을 제거하기 위하여 투석(Mw Cut-off: 12,000 Da)을 3일 동안 증류수에서 실시하였다. 최종적으로 투석된 용액을 냉동건조하여 친수성 다당류의 가교로 안정된 구조를 가지는 나노캐리어를 얻었다.

양쪽성 고분자 물질 제조를 위한 초기 성분 혼합비율

샘플명	키토산 점도(cps)	탈아세틸화도(%)	초기 혼합 비율 (mol)
샘플명	키토산 점도(cps)	탈아세틸화도(%)	라우릭산	키토산	NHS	EDC
LaCs1-11	20,000	78	1	1	1	1
LaCs1-12			1	2	1	1
LaCs1-14			1	4	1	1
LaCs1-18			1	8	1	1
LaCs2-11	200,000	91	1	1	1	1
LaCs2-12			1	2	1	1
LaCs2-14			1	4	1	1
LaCs2-18			1	8	1	1

실시예 2 나노 캐리어의 분석

1. 치환율

표 2는 상기 실시예 1에서 제조된 양쪽성 고분자에 함유된 라우릭산 치환율을 나타내고 있다.

샘플명	치환율 (%)	평균입자 크기 (nm)
LaCs1-11	55.1	561.9
LaCs1-12	54.9	675.8
LaCs1-14	53.1	418.3
LaCs1-18	52.7	271.0
LaCs2-11	44.2	640.6
LaCs2-12	39.8	710.0
LaCs2-14	39.7	731.8
LaCs2-18	39.6	470.1

2. 평균 입자 크기

상기 표 2는 증류수 중에서의 나노캐리어의 평균 입자 크기를 비교한 것이다. 입자 크기는 레이저 광산란 장치(Nicomp380 모델)를 사용하여 측정되었다.

표 3에는 다양한 pH 완충 용액에서의 나노 캐리어의 평균 입자 크기를 기재하였다.

pH 에 따른 나노 캐리어의 평균 입자 크기

샘플명	pH	가교여부	평균입자 크기 (nm)
LaCs1-12	3	O	234
	3	X	198
	5	O	156
	5	X	154
	7	O	297
	7	X	1102
	9	O	256
	9	X	-
LaCs2-12	3	O	35
	3	X	25
	5	O	33
	5	X	24
	7	O	140
	7	X	430
	9	O	311
	9	X	-

실시예 3 인캡슐레이션 효율

칼세인과 황련 유래 단백질을 표지물질로 사용하여 상기 실시예 1에 따라 제조된 나노 캐리어에 포집시킨 후 각각의 인캡슐레이션 효율을 측정하였다. 측정방법은 다음과 같다: 실시예 1에서 제조한 나노캐리어 3 g을 2 g의 칼세인 및 황련 유래 단백질을 함유한 10 ml의 증류수에 각각 첨가하고 1시간 동안 방치하였다. 상기 용액을 수 회 원심분리시켜 상등액과 침전된 나노캐리어로 각각 분리하였다. 분리된 상등액의 부피와 칼세인 및 황련 유래 단백질 농도로부터 나노캐리어 내부에 인캡슐레이션되지 않은 칼세인과 황련 유래 단백질의 양을 측정하였다.

포집 효율은 나노 캐리어에 첨가된 전체 칼세인 질량 중 캐리어 안으로 포집된 칼세인의 질량으로 정의하였다.

칼세인의 농도는 형광광도계 (Varian, Cary Eclipse model)에서 칼세인의 최대 흡광파장을 493.93 nm에서 고정한 후, 520 nm 근처의 방출파장에서의 강도를 측정해서 구하였다. 황련에서 분리된 단백질 확인은 상업용 BCA 프로테인 에세이(BCA protein Assay, Pierce, USA)) 방법을 이용하였다. BSA(Bovine serum albumin, Pierce, USA)를 표준 단백질로 하여 표준 곡선을 구하고 비교 정성 및 정량을 실시하였다. 얻어진 결과를 다음 표 4에 기재하였다.

나노 캐리어의 포집 효율

샘플명	활성물질	가교여부	포집율 (%)
LaCs1-12	칼세인	O	20
	칼세인	X	33
	황련 유래 단백질	O	5
	황련 유래 단백질	X	9
LaCs2-12	칼세인	O	25
	칼세인	X	44
	황련 유래 단백질	O	7
	황련 유래 단백질	X	12

실시예 4 나노캐리어의 방출 효율

나노캐리어 내에 포집된 형광물질 칼세인 및 황련 유래 단백질의 시간 및 온도에 따른 방출률을 측정하여 실시예 3에서 제조된 활성물질을 포함하는 나노캐리어의 방출 효율을 평가하였다.

칼세인의 농도는 형광 스펙트로포토미터 (Fluorescence spectrophotometer: Varian Cary Eclipse model)에서 흡광파장을 493.93 nm에서 고정한 후 방출(emission) 피크의 광도를 측정하여 형광광도-농도 간의 정량적 관계로부터 구하였다. 황련 유래 단백질의 농도는 BCA 프로테인 에세이 방법을 이용하였다.

방출 실험에서 시료는 다음과 같은 방법으로 준비하였다 : 칼세인 및 황련 유래 단백질 수용액을 상기 실시예 1에서 제조된 나노캐리어 용액에 첨가하고, 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 후, 상등액을 걸러내고 아래에 침전된 나노캐리어들을 수집하였다. 수집된 나노캐리어들을 PBS 용액으로 반복 세척하여 나노캐리어 내에 인캡슐레이션 되지 못하고 외부에 남아있던 칼세인 및 황련 유래 단백질을 제거하였다. 세척된 나노캐리어 2 ml를 채취한 후, 이를 다시 PBS 용액으로 희석하여 전체 100 ml의 나노캐리어 용액을 만들었다.

이렇게 희석된 용액을 다시 10 ml씩 담아 여러 조건 별로 일정 시간 저장 보관한 후, 다시 원심분리하여 얻어진 상등액의 형광광도 및 BCA 세기를 측정하여 각 조건에서의 방출률을 결정하였다. 각각의 방출률은 아래의 식에 의해 결정하였다.

일정시간 경과 후 방출되어 나온 활성물질의 양

방출률 (%) = -----------------------------------------------

나노캐리어 내 초기 활성 물질의

상기한 방법으로 얻어진 온도 및 pH 조건에 따른 칼세인과 황련 유래 단백질의 방출거동 결과를 도 2와 3에 나타내었다. 도 2와 3에서 보이는 바와 같이, 가교되기 이전의 나노캐리어와 가교된 이후의 나노캐리어의 방출거동은 유의할 만한 차이는 없었으며 온도와 pH 변화에 안정한 것을 알 수 있다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 활성물질을 안정화할 수 있는 나노 캐리어의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 활성물질이 인캡슐레이션 되어 있는 나노캐리어는 기능성 화장품 및 의약 활성물질의 운반체로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

(a) 친수성 다당류와 소수성 화합물을 반응시켜 친수성 다당류의 작용기에 소수성 화합물이 결합된 양쪽성 고분자를 제조하는 단계 ;

(b) 단계 (a)에서 생성된 양쪽성 고분자를 수용액 중에 분산시켜 자기집합체 성질에 의해 나노캐리어를 형성시키는 단계;

(c) 상기 나노캐리어에 가교제를 첨가하여 다당류를 가교하는 단계; 및

(d) 상기 가교된 나노캐리어를 정제한 다음, 여기에 활성물질을 첨가하는 단계를 포함하여서 되는 것을 특징으로 하는 활성물질이 인켑슐레이션 되어 있는 나노캐리어의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 친수성 천연 다당류 고분자가 키토산, 히알루론산 또는 카라기난인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 소수성 화합물이 라우릭산 또는 에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (c)에서는 자기 집합체 중에서 친수성 천연 다당류만을 가교시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 활성물질이 황련 단백질 추출물, 알부틴 및 알칼로이드류 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 따른 방법으로 제조되는 활성물질이 인캡슐레이션된 나노캐리어.