KR100646612B1 - 꿀벌부채명나방으로부터 분리한 새로운 항진균 단백질 및 그의 ｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

본 발명은 인체 및 식물체의 진균성 질환의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있는 나비목에 속하는 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)의 유충으로부터 분리된 새로운 항진균 단백질의 아미노산 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에 의한 상기 항진균 단백질은 인체 및 식물체의 진균성 질환의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

곤충, 꿀벌부채명나방, 항진균 단백질, galiomicin, Galleria mellonella, 곤충생체방어물질

Description

꿀벌부채명나방으로부터 분리한 새로운 항진균 단백질 및 그의 ｃＤＮＡ{An anti-fungal protein isolated from wax moth, Galleria mellonella, larvae and its ｃＤＮＡ}

도 1은 면역화된 꿀벌부채명나방 유충에서 본 발명에 의한 항진균 단백질이 생성됨을 보여주는 역상 HPLC 결과를 보여주는 그래프.

도 2는 면역화된 꿀벌부채명나방 유충의 혈림프 단백질의 전기영동 결과를 보여주는 사진.

도 3은 본 발명에 의한 항진균 단백질의 분자량을 결정하기 위한 말디-메스(MALDI mass) 스펙트로메터(spectrometer) 실시 결과를 보여주는 그래프.

도 4는 본 발명에 의한 항진균 단백질의 전구체를 코딩하는 cDNA를 포함하는 DNA 염기 서열 및 그에 대응하는 전구체의 아미노산 서열.

도 5는 면역 유도된 꿀벌부채명나방의 유충 혈림프로부터 본 발명에 의한 항진균 단백질을 분리정제하기 위한 gel permeation 크로마토그래피 결과를 보여주는 그래프.

도 6은 분리정제되고 농축된 본 발명에 의한 항진균 단백질 용액의 C18 역상-HPLC 결과를 보여주는 그래프.

도 7은 분리정제되고 농축된 본 발명에 의한 항진균 단백질 용액의 전기영동 결과를 보여주는 사진.

본 발명은 인체 및 식물체의 진균성 질환의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있는 새로운 곤충유래 항진균 단백질(갈리오마이신)의 아미노산 서열 및 그를 암호화하는 cDNA의 서열에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 본 발명은 나비목에 속하는 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)의 유충으로부터 분리된 새로운 항진균 단백질의 아미노산 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 항진균 단백질은 다양한 진균에 대하여 항진균 활성을 나타냄으로써 인체 및 식물체의 진균성 질환의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

곤충과 같은 무척추동물은 척추동물에 비해 생존기간이 짧으며 생식력이 높아 척추동물들과 같이 복잡하고도 효율적인 면역체제가 필요치 않을 것이라고 여겨져 왔다. 그러나 19세기 극피동물(불가사리)의 체강에서 식세포작용(phagocytosis)이 최초로 확인된 이래, 무척추동물들은 척추동물들이 지닌 면역체제(특히, 선천성 면역체제)와 유사한 자기방어체제를 가지고 있는 것으로 알려지게 되었다. 이러한 자기방어체제에 의해 생존 중 지속적으로 접하게 되는 병원성 미생물이나 진핵의 기생충에 대해 저항성 물질을 분비함으로 자신을 외부 물질로부터 방어하는, 이른바 유형에 따른 외부물질의 인식(pattern recognition)에 의한 방어를 하게 되는 것이다.

곤충의 생체방어체제가 고등동물이 지닌 면역인자와 유사한 생체활성물질을 가지고 있다는 사실이 규명되면서 이 분야에 대한 연구는 매우 활발하게 수행되어져 왔다. 특히 인체와 유사한 항병원성 물질을 다른 생명체, 특히 곤충으로부터 큰 조작없이 얻을 수 있다면 이는 인간의 질병예방과 치료에 획기적일 것이기 때문에 이러한 물질의 발견과 분리에 많은 관심이 집중되고 있는 실정이다. 곤충의 면역반응의 일환으로 분비되는 이러한 곤충유래 항병원성 단백질은 인간의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 농작물의 피해 방지 및 치료를 위해서도 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

곤충의 혈림프에는 병원체의 침입으로 인해 합성이 유도되거나 양적으로 증가되는 여러 가지의 항균 단백질들이 존재한다. 이들은 대개 지방체와 혈구세포에서 합성된 후 혈림프로 방출되는데, 혈림프에서 이들 항균 단백질들은 1～10μM의 농도로 존재하며 이 단백질들로 인해 갖게되는 혈림프의 항균활성은 일반적으로 수 일간 지속되는 것으로 알려져 있다.

이제까지 발견된 곤충의 이러한 항균 단백질들은 그들의 구조와 크기에 따라 크게 네 종류로 분류된다. 첫째, α-helical 구조를 지닌 것, 둘째, 이황화 결합(disulfide linkage)을 구조 내에 포함하고 있는 것, 셋째, 단백질 구조 내에 proline 아미노산을 다량 함유하고 있는 것, 마지막으로는 glycine 아미노산을 많 이 포함하고 있는 것이다. 그러나 이러한 항균 단백질의 대부분은 항세균 단백질로 항진균 단백질은 상대적으로 거의 발견되지 않고 있는 실정이다.

현재까지 밝혀진 곤충유래 항진균 단백질로서는 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia)에서 발견된 holotricin 3(Lee et al., Biol. Pharm. Bull., 18:1049-1052, 1995), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서 발견된 dromomycin(Fehlbaum et al., J. Biol. Chem., 269:33159-33163, 1994), 쉬파리과의 Sarcophaga peregrina로부터 발견된 antifungal protein(Iijima et al., J. Biol. Chem., 268:12055-12061, 1993), 갈색거저리(Tenebrio molitor)에서 발견된 tenecin 3(Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:6-11, 1996), 담배나방아과의 Heliothis virescens에서 발견된 heliomicin(Lamberty et al., J. Biol. Chem. 274:9320-9326, 1999), 매미아과의 Cicada flammata에서 발견된 cicadin(Wang and Ng, Peptides, 23:7-11, 2002) 등 소수이다. 특히 나비목의 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)에서 항진균 단백질이 발견되었다는 보고는 전무하며, 나비목 곤충으로부터는 heliomicin이 유일한 실정이다.

현재까지 알려진 곤충의 항진균 단백질은 곤충의 병원성 진균들, 예를 들면 Candida albicans (구강 및 소화관에 병 유발)와 Cryptococcus neoformans (허파 및 수막에 병 발생) 등에 큰 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 꿀벌부채명나방으로부터 새로운 항진균 단백질(갈리오마이신)을 분리 정제하고 전체 아미노산 서열을 밝히는 한편, 상기 항진균 단백질을 암호화하는 cDNA의 구조를 밝히는 한편 다양한 병원성 진균에 대하여 항진균활성을 나타냄을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항진균 활성을 갖는 새로운 항진균 단백질(갈리오마이신)을 나비목 곤충인 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)의 유충으로부터 분리 정제하고, 상기 단백질이 다양한 진균에 대하여 항진균 활성을 확인하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 항진균 단백질의 아미노산 서열을 밝히는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 항진균 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하여 그 염기 서열을 밝히는 것을 또 다른 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 꿀벌부채명나방의 유충으로부터 항진균 활성을 갖는 새로운 단백질을 효과적으로 분리하여 분리된 단백질의 항진균활성을 나타냄을 밝히고, 분리된 단백질의 분자량 및 서열을 밝히는 한편 이 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 또한 본 발명은, 상기 항진균 단백질을 유효성분으로 함유하는 항진균제용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 단계에 따라 보다 구체적으로 설명한다.

(1) 항진균 단백질의 선발 및 아미노산 서열 결정

꿀벌부채명나방 유충으로부터 항진균 단백질을 검색ㆍ분리하기 위하여 먼저 꿀벌부채명나방에 면역유도원으로 그람음성균(Escherichia coli K112)을 주사하고 혈림프를 채취하였다. 상기 혈림프를 이용하여 곤충의 혈림프 내에서 진균과 결합하는 항진균 단백질을 찾기 위한 진균결합실험(fungi bindung test)을 수행하여 본 발명에 의한 항진균 단백질을 선발하였다.

heat killed fungi와 결합된 단백질을 다시 heat killed fungi와 분리한 후 단백질을 용출하고 분획하여 순수한 항진균 단백질을 분리정제하고 분자량을 측정하였다. 분리된 항진균 단백질을 갈리오마이신(galiomicin)이라 명명하였다. 통상의 방법에 따라, 상기 분리된 항진균 단백질의 아미노산 서열을 결정하였다.

본 발명에 의한 상기 항진균 단백질은 4,716.75Da이며, 43개의 아미노산(서열 1)으로 이루어져 있다.

(2) 상기 항진균 단백질을 암호화하는 cDNA 클로닝 및 염기 서열 결정

꿀벌부채명나방 유충으로부터 총세포 RNA로부터 mRNA를 분리하고 cDNA 라이브러리를 제조하고 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 갈리오마이신의 cDNA를 클로닝하고 그의 염기 서열을 결정하였다.

상기 항진균 단백질의 cDNA 중 항진균 단백질 자체에 대응하는 부분을 서열 2에 나타내었다. 서열 2는 129개 염기로 구성되어 있다.

(3) 상기 항진균 단백질의 항진균 활성 분석

Candida albicans (구강 및 소화관에 병유발) 등 6 종의 진균에 대하여본 발명에 의한 상기 항진균 단백질의 항진균 활성을 검정하였다. 그 결과 본 발명에 의한 항진균 단백질이 1.6~50 uM 농도 범위 내에서도 실험된 6 종의 진균들의 생장이 억제되었다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는 다는 것은 당업계에서 통상적인 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 또한 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 항진균 작용이 있는 본 발명에 의한 항진균 단백질을 유효성분으로 함유하는 항진균제용 약학적 조성물이 가능함이 당업자에게 당연할 것이다.

실시예 1 : 꿀벌부채명나방 유충으로부터 항진균 단백질의 순수분리 및 그의 아미노산 서열 결정

(1) 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella)의 면역유도

공시 실험곤충으로 사용한 꿀벌부채명나방을 암 조건 상태 하에서(온도 30℃, 습도65±5%) 사육하였다. 꿀벌부채명나방 유충으로부터 새로운 항진균성 단백질을 분리하기 위하여 꿀벌부채명나방 유충을 면역화하였다.

즉, 그람음성균(E. coli K112)을 Bacto™ Tryptic Soy Broth(Difco, USA) 액체 배지 하에서 37℃ 200rpm의 shaking incubator에서 18시간 1차 배양 후, 동일 조건하에서 다시 2시간 30분 2차 배양한 대수증식기(log phase)에 5×10³ colony forming unit(CFU)를 취한 후 microsyringe를 이용하여 나방의 유충 체강에 주입함으로 꿀벌부채명나방의 면역화를 유도한 후 30℃에서 사육하였다.

(2) 혈림프의 채취

면역 유도 24시간 후 유충의 다리를 미세 핀셋으로 뽑아내고 그 곳으로부터 혈림프를 채취하였다. 이때 혈림프의 암화를 방지하기 위하여 소량의 페닐티오우레아(phenylthiourea)가 첨가된 튜브에 혈림프를 채취하였다. 채취된 혈림프를 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 헤모싸이트(hemocytes)와 세포찌꺼기(cell debris)를 제거하고 상등액만을 모아 -70℃에 보관하면서 실험을 수행하였다.

(3) Fungus binding test

상기 혈림프를 이용하여 곤충의 혈림프 내에서 fungi에 binding하는 항진균 단백질을 찾기 위한 방법으로써 fungi binding test를 시행하였다.

이때 균주로는 Candida albicans를 사용하였다. 상기 균주를 Bacto™ Tryptic Soy Broth(Difco, USA)에서 37℃, 200rpm shaking 조건으로 20시간동안 배양한 후 10mM sodium phosphate(pH 7.4)로 두 번 세척(3,000rpm, 10mim, 4℃)하고, 동일 buffer 100ml로 fungi를 용해시킨 다음 물 중탕으로 100℃에서 20분간 가열하여 heat killed fungi를 제조하였다. heat killed된 fungi를 위와 동일한 방법으로 두 번 세척하였으며, hemocytemeter 및 광학 현미경으로 spore의 개수를 세었고 10mM sodium phosphate buffer(pH 7.4)에 C. albicans의 spore가 10⁹/ml이 되도록 준비하였다.

heat killed fungi에 binding하는 단백질을 선발하기 위하여 꿀벌부채명나방의 상기 혈림프 2ml, heat killed C. albicans 1ml, insect ringer solution 7ml를 섞고 bovine serum albumin(BSA)을 전체 부피의 1%(약 1ml)가 되게 넣은 후 25℃에서 3시간 동안 교반하여 binding incubation을 실시하였다. 3시간 후에 원심분리(7,000rpm, 10min, 4℃)하여 상등액을 제거하고 침전물을 10mM sodium phosphate buffer(pH 7.4)로 두 번 세척하였다. 마지막 원심 분리 후에는 상등액을 제거한 침전물에 500mM sodium chloride가 포함된 50mM sodium acetate buffer(pH 3.6)을 2ml 넣어 resuspension한 후 다시 위와 같은 조건에서 30분간 elution incubation을 수행하였다. 이어서 배양액을 원심분리(10,000rpm, 10min, 4℃)하여 상등액 만을 취하였다. 상등액을 다시 Tris buffer로 3회 세척한 후 세척된 C. albicans을 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.0 containing 0.5 M NaCl)에서 1시간동안 반응시킴으로써 표면에 결합된 단백질들을 분리하였다.

(4) 본 발명에 의한 항진균 단백질의 분리

fungi binding test를 통하여 얻어 C. albicans 표면에서 떨어진 단백질들을 역상-HPLC(Gilson 512)에 장착한 218TP C₁₈ 역상 칼럼(Reversed-Phase Column)(Vydac Co. USA)을 사용하여 용출하였다.

Solution(Sol.) A는 0.1% trifloroacetic acid(TFA)를 포함하는 HPLC water(Fisher, USA)를, Solution(Sol.) B는 0.1% trifloroacetic acid(TFA)를 포함하는 acetonitrile(Fisher, USA)를 사용하였다. 흡광도 214nm에서 10분 간 100%의 Sol. A로 평형을 유지한 후 0.5ml/min 속도로 Sol. B를 1분당 1%씩 0%-60%로 60분간 linear gradient를 형성하여 단백질을 elution 하였으며 각각의 용출된 fraction들은 214nm에서 peak 별로 분획하였다. 분획결과 그래프를 도 1에 나타내었다. 도에서 (a)는 면역화되지 않은 정상 혈림프로부터 얻은 fungus binding protein에 대한 분획 peak 그래프이고, (b)는 E. coli에 의해 면역화된 꿀벌부채명나방 유충 혈림프로부터 얻은 fungus binding protein에 대한 분획 peak 그래프이다. P3의 아미노산 서열을 분석하고 검토한 바(하기 실시예 4 참조), P3가 본 발명에 의한 항진균 단백질에 의해 만들어지는 peak임이 확인되었다.

(5) 본 발명에 의한 항진균 단백질의 정제 및 서열 분석

상기 역상-HPLC에서 heat killed fungi에 binding하는 단백질을 궁극적으로 순수하게 단일물질로 정제하고 이의 아미노산 서열을 결정하기 위해서는 단백질이 순수하게 단일 물질로 정제되었는지를 확인하고 그 분자량을 측정하기 위하여 Tricine SDS-PAGE를 실시하였다.

본 실시예에서는 Schagger and Von Jagow (Anal. Biochem., 166:368-379, 1987)의 Tricine-SDS PAGE 방법을 일부 수정하여 활용하였다. 즉, 4% stacking gel과 16.5% separating gel에 upper buffer로 anode buffer (0.4M Tris, 0.4M Tricine, 0.4% SDS)와 low buffer에 cathode buffer (0.8M Tris)를 사용하였다. 전기영동한 gel은 쿠마시에 블리리언트 블루(Coomassie Brillient Blue) R-250으로 염색한 다음 표준품 단백질의 밴드와 비교하여 목적 단백질의 크기 및 순도를 확인하였다(도 2 참조). 이때 단백질 농도를 결정하기 위하여 Bischinchronic acid(BCA) Assay(Smith et al., Anal. Biochem. 150:76, 1985) 방법을 이용하였다. Bovin serum albumin (BSA)의 농도에 따른 단백질량을 표준곡선으로 562nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량 하였다.

Tricine SDS-PAGE 겔을 25 mM의 Tris-HCl과 25% methanol을 포함하는 glycine이 없는 buffer하에서 폴리비닐아이데네디플로라이드(poly-vinylidenedifluroride) 막(membrane)에 부착하여 쿠마시에 블리언트 블루(Coomassie Brillient Blue) R-250으로 염색한 다음 본 발명의 목적 밴드를 자른 후 아미노산 서열(서열 1)의 분석을 실시하였다.

아미노산 서열분석은 서울 기초과학지원연구소(서울)에 의뢰하였으며 분석 절차는 다음과 같이 요약하였다. 폴리비닐아이데네디플로라이드 막에 부착된 목적 단백질은 SDS가 포함된 20% methanol을 사용하여 막에서 분리하였고, 이는 Speed-Vacuum dryer (Centra Evaporator, Bioneer, 대한민국)를 통하여 완전 건조시켰다. 건조시킨 목적 단백질은 P. Edman이 개발한 단백질의 화학적 degradation을 자동화한 방법을 사용하여 아미노산 서열분석을 하였다. 목적 단백질에 phenylisothiocyanate를 첨가 후, 50oC, 20분, 무산소 상태에서 반응시킴으로서, N-말단 아미노산을 derivatization시키고, 이를 무수 TFA(trifluoroacetic acid)로 처리하여 화학적으로 polypeptide로부터 분리한 후, 분리된 아미노산을 보다 안정된 형태의 아미노산으로 전환시키기 위하여 물이 포함된 TFA를 처리하였고, 이를 PTH(phenylthiohydantion) analysis column 2.1 x 220 mm (PE Applied Biosystems, USA)이 장착된 HPLC로 분석하였는데 이때 사용된 완충액으로 Solution A는 3.5% THF(tetrahydrofurane)가 포함된 물을, Solution B는 12% isopropanol이 포함된 acetonitrile을 사용하였다.

분석결과 도1의 P3가 본 발명에 의한 항진균 단백질에 의해 만들어지는 peak로 확인 되었다.

(6) 갈리오마이신의 분자량 측정

상기 단백질의 분자량을 측정하기 위하여 상기 아미노산 분석을 위해 준비한 동일 밴드를 MALDI TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry) 질량분석법 (Hill et al., Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5:395, 1991)에 의거하여 메스 기구 (Mass Instrument, Voyager-DE STR, PerSeptive Biosystems, USA)로 측정하였다. 그 결과 정제된 갈리오마이신의 분자량은 4,716.75 Da인 것으로 확인되었다(도 3 참조).

실시예 2 : 본 발명에 의한 항진균 단백질의 cDNA 클로닝 및 아미노산 서열 연역/확정

(1) cDNA 합성 및 PCR 수행

대수증식기의 그람음성균(E. coli K112)을 종령기 꿀벌부채명나방 유충 체강에 주입하여 면역화한 후 종령 유충의 지방체로부터 SV Total RNA Isolation System(Promega, USA)을 이용하여 총세포 RNA를 추출하였다. 첫 번째 사슬 cDNA 제작은 10X 역전사 반응 완충용액 2ul, 20mM dNTP 2㎕, 10pM 올리고 dT 프라이머(5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT-3')(서열 3) 1㎕, 10unit/ul RNA 분해 억제제 1㎕, 4unit/ul 역전사효소 1㎕ (Quiagen, USA)를 넣고, 3차 증류수로 전체 부피를 20㎕로 조정한 다음, 37℃에서 1시간 및 93℃에서 5분 동안 반응시킴으로 첫 번째 사슬 cDNA를 제조하였다. 참고로 서열 3에서 말단의 폴리 티(poly-T)는 mRNA의 말단에 존재하는 poly A에 대한 상보적인 염기서열이나 서열 3의 5 프라임 쪽의 poly-T 앞의 모든 염기서열(GGCCACGCGTCGACTAGTAC)은 PCR 반응의 안정성을 위하여 부착된 것이다. 따라서 실질적으로 서열 3의 5프라임 쪽의 poly-T 앞의 모든 염기가 없거나 일부 없는 프라이머라도 서열 3과 동일한 효과를 나타내게 될 것이다.

상기 제조된 첫번째 사슬 cDNA를 주형으로 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 방법으로 갈리오마이신 단백질의 cDNA를 클로닝하였다. 이때 PCR 조건은 94℃에서 7분간의 가열로 주형을 변성시킨 후 35 사이클동안 94℃ 1분간 변성(denaturation), 50℃에서 1분간 결합(annealing), 72℃에서 1분간 연장(extension)을 반복하였으며 마지막으로 72℃에서 7분간 두었다. PCR은 총 20㎕로 하였으며 주형 DNA 1㎕, 10X PCR 반응 완충용액 2㎕, 25mM MgCl₂ 1.2㎕, 10mM dNTP 1.6㎕를 넣었다. 3-프라임 쪽의 프라이머로는 상기 염기서열(서열 3)을 가진 올리고 dT 20pM 1㎕를 넣었으며, 5-프라임 쪽의 프라이머로는 갈리오마이신의 N-말단 아미노산 서열 분석으로부터 얻어진 아미노산서열을 연역하여 작성한 디제너레이티브(degenerative) 프라이머(5'-GAYACIYTIATHGGIWSITGYGTITGG-3')(서열 4)를 20pM 농도로 3차 증류수에 희석한 후 1㎕를 넣었다. 마지막으로 5units/ul 중합효소를 0.1㎕ 넣은 후 PCR 사이클을 시작하였다.

이렇게 얻은 PCR산물(갈리오마이신을 포함)을 피젬티이지벡터(p-GEM-T Easy Vector, Promega, USA)에 클로닝하였다. 목적 PCR산물을 포함하는 피젬티이지벡터로부터 Plasmid Extraction Kit(Quiagen, USA)를 이용하여 플라스미드를 추출한 후 상기 플라스미드로부터 PCR에 의해 클론닝된 PCR산물을 증폭하였다. 이때 사용된 프라이머는 피젬티이지벡터내에 존재내의 T7과 SP6사이트를 인식하는 프라이머인 T7과 Sp6를 이용하였다. 이로부터 증폭된 PCR산물(T7-SP6산물)의 DNA 염기서열 분석은 ABI 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 분석함으로 상기 갈리오마이신의 cDNA 뉴클레오타이드 중 갈리오마이신 단백질을 포함하는 부분부터 3프라임 말단의 폴리 에이 (Poly-A)까지를 확정하였다.

갈리오마이신 cDNA에서 미지의 5-프라임 말단, 즉 갈리오마이신 단백질의 5- 프라임 상부에서 이 mRNA의 전사개시 코돈까지의 염기서열을 완벽히 밝혀내기 위하여 5-프라임-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)-PCR법을 수행하였다. 이를 위하여 앞서 언급한 것과 같이 종령 유충의 지방체에서 총 세포 RNA를 추출한 후 이로부터 다시 RNA만을 분리하였다(Promega, USA). 분리된 mRNA는 reverse transcription 과정을 통하여 첫 번째 및 두 번째 사슬 cDNA를 합성하였다. 이를 위하여 CLONTECH(USA)사의 Marathon cDNA Amplification Kit을 사용하였다.

이렇게 얻어진 이중나선의 cDNA의 양 말단에 adapter 뉴클레오타이드 서열을 부착하였다. 그 다음으로 이렇게 얻어진 뉴클레오타이드를 주형으로 하여 PCR을 실시함으로 미지의 5-프라임 말단을 얻었는데, 이때 PCR 조건은 94℃ 30 sec, 94℃ 5sec 72℃　2min으로 하여 25 cycles를 반복하였다. 또 이때 사용한 프라이머는 5-프라임 말단은 CLONTECH(USA)사에서 제공된 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3‘(서열 5)를 사용했으며 3-프라임 말단은 앞서 분석된 갈리오마이신의 3-프라임 부위의 염기서열을 주형으로 제작된 5'-GAATTCTAGGCTGCAGTGGTAGTCC-3’(서열 6)를 사용하였다.

이렇게 얻은 PCR product를 피젬티이지벡터(pGEM-T Easy Vector, Promega, USA)에 삽입 E. coli(DH-5α)에 transformation 하였다. 피젬티이지벡터로부터 목적 PCR산물을 포함하는 플라스미드를 Plasmid Extraction Kit (Quiagen, USA)를 사용하여 추출한 후 상기 플라스미드로부터 PCR에 의해 클론닝된 PCR 산물을 증폭하는데 이때 사용된 프라이머는 피젬티백터 내에 존재내의 T7과 SP6사이트를 인식하는 프라이머인 T7과 Sp6를 이용한다. 이로부터 증폭된 PCR산물(T7-SP6산물)은 DNA 염기서열을 ABI 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, USA)로 분석하여 상기 갈리오마이신의 cDNA 뉴클레오타이드 중 갈리오마이신 단백질을 포함하는 3-프라임 부분부터 5-프라임의 전사개시 코돈까지를 확정함으로 궁극적으로 갈리오마이신의 전구체 전체 cDNA 구조분석을 완료하였다(서열 7 참조).

즉 서열 7의 start codon부터 stop codon까지 전사?번역되어 72개의 아미노산 형태인 갈리오마이신 전구체가 만들어진 후 번역후 수정(post-translational modification)을 통해 나머지는 떨어져 나가고 실질적으로 항진균 작용을 하는 것은 43개 아미노산 서열(서열 1)로 이루어진 갈리오마이신이 생성되는 것이다(하기 실시예 3 참조).

실시예 3 : 본 발명에 의한 항진균 단백질의 대량정제

갈리오마이신의 항진균 효과 분석을 위해 우선적으로 이를 대량정제하였다.

E. coli에 의해 면역 유도된 꿀벌부채명나방의 유충 혈림프를 10% 초산과 동일한 부피로 혼합하여 16시간 동안 교반시킨 후 원심분리(15,000 g)로 상등액을 취하여 이를 Sephadex G-50 Gel Permeation Chromatography(GPC)로 분리하였다. 구체적으로는, separdex G-50을 직경 1.8cm, 길이 55cm의 glass column에 충진하고 50mM sodium acetate(pH 3.6)으로 충분히 equilibration 시킨 G-50 GPC를 준비하고, 여기에 상기 상등액 5ml를 가하였다. 이때 GPC 조건은 시간당 1ml/10min 유속으로 20분당 하나의 fraction으로 2ml씩을 분리 채취하였고, 각 fraction은 280nm에서 흡광도를 측정하였다. Fraction 당 5%(100ul)를 취하여 Tricine-SDS PAGE를 시행하여 갈리오마이신의 존재를 검색한 후(도 5 참조) 존재가 확인된 분획들을 함께 모아 Speed-Vacuum dryer (Centra Evaporator, Bioneer, 대한민국)로 약 30%의 부피로 농축하였다.

확인을 위하여, 상기 농축된 분획을 전술한 실시예 1에서와 동일하게 역상-HPLC를 수행한 바(도 6), 도 1의 (b)에서와 같이, 동일한 용출시간에 본 발명에 의한 항진균 단백질이 용출되었다. 또한 상기 농축된 분획을 전술한 실시예 1에서와 동일하게 전기영동을 수행한 바(도 7), 도 2에서와 같은 분자량을 가지는 본 발명에 의한 항진균 단백질(서열 1)이 확인되었다.

실시예 4 : 본 발명에 의한 항진균 단백질의 항진균 활성분석

(1) 각종 균주의 배양조건

항세균 활성분석(antibacterial assays)에 사용한 E. coli 및 Bacillus subtilis는 21g/liter 농도의 Mueller-Hilton broth(MHB)에서 37℃, 200rpm 조건으로 24시간 배양 후, 다시 동일조건에서 약 2시간 30분간 2차 배양 후 2×10⁴～10⁶ colony forming units/ml 농도로 MHB에서 위와 같은 조건으로 배양하였다.

항진균 활성분석을 위한 진균 중 Trichoderma viride, Pyricularia grisea, Fusarium oxysporum 및 Geotrichum candidum는 104 spores/ml의 농도로 12g/liter 농도의 Potato Dextrose Broth(Difco, USA)에서, 그리고 Cryptococcosis neoformans는 21g/liter 농도의 Yeast Malt Broth(YMM, Difco, USA)에서 30℃, 200rpm 조건으로 24시간 배양하였으며, Candida albicans는 30g/liter의 농도로 Bacto™ Tryptic Soy Broth(Difco, USA)에서 37℃, 200rpm 조건으로 24시간 배양 후 사용하였다.

(2) 갈리오마이신의 각종 진균류에 대한 항진균력

microplate well에 80㎕의 fugal 혹은 yeast solution을 넣고, 20㎕의 갈리오마이신을 가하되, 각 well의 농도가 50uM, 25uM, 12.5uM, 6.25uM, 3.12uM, 1.6uM, 0.8uM이 되게 한다. 각 농도의 sample은 균주에 따라 30℃ 또는 37℃에서 24시간 배양 후, 현미경 또는 육안으로 갈리오마이신에 의한 진균의 생장억제 정도를 관찰하였다(표 1 참조).

표에서, fungi에 대한 갈리오마이신의 최소성장저해농도(MIC, Minimum Inhibitory Concentration)는 진균의 성장이 나타나는 농도와 100% 성장 저해가 관찰된 농도로 표시하였다. 표에서 ND는 최고 농도인 50uM에서 조차 활성이 관찰되지 않은 경우를 나타낸다.

표에 나타난 바와 같이 갈리오마이신의 항진균 활성은 세균에 대하여는 전혀 검정되지 않았고, 진균 중 filamentous 곰팡이의 경우 1.6 - 3.12uM의 농도(F. oxysporum 및 P. grisea) 또는 25 - 50uM의 농도(F. oxysporum)가 최소억제 농도로 나타났고, 이스터성 곰팡이의 경우 3.12 - 6.25uM(C. albicans) 또는 1.6 - 3.12uM(G. candidum) 또는 25 - 50uM(C. neoformans)가 최소억제 농도롤 나타나 갈리오마이신은 비교적 다양한 범위의 진균에 효과가 있는 것으로 나타났다.

ND, 최고농도인 50 uM에서 조차 활성이 관찰되지 않은 경우.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 꿀벌부채명나방 유충으로부터 대량 분리된 새로운 항진균 단백질과 이 단백질의 아미노산 서열 그리고 이를 암호화하는 뉴클레오타이드(nucleotide)의 서열을 제공한다. 본 발명의 새로운 항진균 단백질은 트리코더마 비리데, 피리쿠라리아 그리시에, 푸사리움 옥시스포럼, 캔디다 알비칸스, 지오트리춤 칸디덤, 크립토코코시스 네오포르만스에 대해 항진균 활성을 나타냄으로 트리코더마 비리데에 의해 유발되는 오이과 농작물의 덩굴 마름병, 피리 쿠라리아 그리시에에 의해 유발되는 농작물의 도열병, 푸사리움 옥시스포럼에 의해 유발되는 농작물의 구근부패병, 지오트리춤 칸디덤에 의해 유발되는 흰곰팡이병 등 농작물 관련 진균에 대한 효과는 물론 인체와 관련하여 캔디다 알비칸스에 의해 유발되는 캔디다증, 크립토코코시스 네오포르만스에 의해 유발되는 크립토코코시스에 대한 천연소재의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> An anti-fungal protein isolated from wax moth, Galleria mellonella, larvae and its cDNA <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> Galleria mellonella <400> 1 Asp Thr Leu Ile Gly Arg Cys Val Trp Gly Ala Thr Asn Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Asp Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys 20 25 30 Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu 35 40 <210> 2 <211> 129 <212> DNA <213> Galleria mellonella <400> 2 gatacgctga tagggaggtg cgtgtggggt gcgacgaatt acacctctga ttgcaatgct 60 gagtgcaaac gtcgtgggta taaaggtggt cattgcggca gcttcttgaa cgtcaattgt 120 tggtgcgag 129 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer cloning for galiomicin gene <400> 3 ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt tttt 34 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer cloning for galiomicin gene <400> 4 gayacnytna thggnwsntg ygtntgg 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer cloning for galiomicin gene <400> 5 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer cloning for galiomicin gene <400> 6 gaattctagg ctgcagtggt agtcc 25 <210> 7 <211> 216 <212> DNA <213> Galleria mellonella <400> 7 atggcgaaaa atttccagtc cgttttgttg ttggtctgcc tatcattttt agtgatcgta 60 tcgtcaccgc aaaatgctgt acaagcggat acgctgatag ggaggtgcgt gtggggtgcg 120 acgaattaca cctctgattg caatgctgag tgcaaacgtc gtgggtataa aggtggtcat 180 tgcggcagct tcttgaacgt caattgttgg tgcgag 216

Claims (8)

1. 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 항진균 단백질.
2. 삭제
3. 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA.
4. 제 3 항에 있어서,

   서열 2에 기재된 염기 서열을 가진 DNA.
5. 삭제
6. 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 서열 7에 기재된 염기 서열을 가진 DNA.
7. 제 1 항에 의한 항진균 단백질을 유효성분으로 함유하는 항진균제용 약학적 조성물.
8. 삭제

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