KR100646222B1

KR100646222B1 - 돼지 유선특이 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환 동물 유선에서 유전자 발현방법

Info

Publication number: KR100646222B1
Application number: KR1020040040550A
Authority: KR
Inventors: 이풍연; 이연근; 박진기; 김성우; 장원경
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2004-06-03
Filing date: 2004-06-03
Publication date: 2006-11-23
Also published as: KR20050115179A

Abstract

본 발명은 돼지 유선특이 발현조절 염기서열을 포함하는 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환 동물 유선에서 유전자 발현방법에 관한 것으로서, 인슐린, 프로락틴, 하이드로코티존의 3개 수유 호르몬의 유도하에서 서열목록 1(또는 서열목록2와 4)의 염기서열을 사용한 pPBCPEI/luc와 서열목록3과 4를 사용한 p1775/luc벡터를 사용함으로 종래기술에 언급된 기존의 프로모터를 사용한 pPBCP/luc보다 생쥐 유선상피세포 유래 세포주인 HC11에서 높은 발현량을 나타낼 수 있도록 한 것이다.

돼지, 베타-카제인, 프로모터, 형질전환, 발현벡터, 유선, HC11

Description

돼지 유선특이 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환 동물 유선에서 유전자 발현방법{Mammary gland specific expression system using the sequence elements from porcine beta-casein gene.}

도 1은 HC11을 형질도입하기 위해 제작한 일련의 5'-말단 길이 변이 돼지 베타-카제인 프로모터/루시퍼라아제 벡터 모식도.

도 2는 pPBCP/luc, pPBCPE/luc, pPBCPEI/luc와 각각의 5'-말단 길이 변이 돼지 베타-카제인/루시퍼라아제 벡터의 클로닝 사진도.

도 3은 HC11에서 pPBCPEI/luc의 루시퍼라아제활성에 대한 수유 호르몬의 효과를 종래와 비교한 그래프 비교도.(표 2의 결과를 적용)

도 4는 HC11에서 일련의 돼지 베타-카제인 프로모터 5‘-말단 길이 변이체/루시퍼라아제 벡터의 조절하에서의 firefly 루시퍼라아제의 발현 수준 그래프도.(표 3의 결과를 적용)

도 5는 HC11에서 p1775/luc와 p583/luc의 루시퍼라아제활성에 대한 수유 호르몬의 효과를 나타내기 위한 그래프도.(표 4의 결과를 적용)

본 발명은 돼지 유선특이 발현조절 염기서열을 이용한 발현벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 포유동물의 유선에서 유용단백질을 대량으로 생산할 수 있는 형질전환 동물을 생산하기 위해 사용되는 유즙 특이 형질전환 발현벡터를 제작함과 함께 유전자를 발현시키기위한 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 유용한 재조합 단백질을 대량 생산하기 위하여 생체반응기로서 형질전환동물의 유즙, 소변 등이 주목받아 왔으며(Houdebine, 2000), 포유동물의 유선에서 분비되는 유즙은 가장 많은 연구가 이루어 졌다(Reichenstein 등, 2001; Takahashi, 2001).

설치류, 반추동물 및 인간의 주된 유청 단백질은 WAP, 베타-락토글로블린, 알파-락트알부민 등이며, 유즙내 단백질의 주 성분은 카제인 단백질이다(Pauloin, 2000). 칼슘-감수성 카제인들(알파-S1-, 베타-, 알파-S2-카제인)을 암호화하는 3개의 유전자는 하나의 공통적인 조상유전자로부터 유래한 것으로 보이며 5‘ 말단과 5’ 상류에 공통적인 조절부위의 요소를 공유하고 있다. k-카제인 유전자는 그 발현 형태의 유사성이나 유전자 산물이 칼슘 및 인산의 전달에 관련된 교질입자의 형성과 안정성에 필수적인 점 등의 사실에도 불구하고 진화적으로 앞의 세 유전자에 연관되어 있지 않은 것으로 보여진다(Rosen 등, 1999). 베타-카제인은 우유에서 37%, 양젖에서 50%이상의 평균함량을 보이는 가장 풍부한 단백질이다(Beaton 등, 2003; Cerdan 등, 1998).

생쥐, 산양의 WAP(Gorden 등, 1987; Ibanez 등, 1997), 소, 산양의 알파-락트알부민(Bleck과 Bremel 1993; Soulier 등, 1992), 면양, 소, 염소의 베타-락트알 부민(Shani 등, 1992; Hyttinen 등, 1998; Ibanez 등, 1997), 쥐, 토끼, 산양의 베타-카제인(Lee 등, 1988; Buhler 등, 1990; Roberts 등, 1992), 소의 알파-S1-카제인(Maga 등, 1994) 등 다양한 유단백질 유전자 프로모터의 발현조절이 연구되어 왔다.

이러한 주요 유단백질 유전자의 프로모터 부위를 이용하여 생쥐를 비롯한 소, 면양, 돼지, 산양 등에서 유선으로 외부단백질을 생산하는 형질전환 동물생산이 시도되었다. 이들 중에서도 면양의 베타-락토글로불린, 산양 베타-카제인, 소 알파-S1-카제인의 프로모터는 형질전환 생쥐의 유선에서 외부 단백질의 발현에 가장 효율적으로 알려졌으며, cDNA 대신에 게놈 DNA 서열을 사용하거나 미해독 엑손과 인트론을 벡터에 사용하는 경우 형질전환 유전자의 발현을 증가시키는 경우도 보고된 바 있다 (Murray와 Maga, 1999).

유선에서의 유즙 단백질 유전자 발현과 유즙의 분비는 각각 조직- 및 시기 특이적 유전자 발현 조절을 받는다(Malewski와 Zwierzchowski, 1995; Zhao 등, 2002). Cis-활성의 염기서열이나 CoREs(composite response elements)는 전사인자 결합부위들의 집단으로 구성되어 있으며, 포유동물의 유단백질 유전자의 발현 시기와 장소를 조절하는 전사 활성/억제 인자들 모두 포함하고 있다(Kim 등, 1999; Wyszomierski와 Rosen, 2001).

이러한 조절 부위들은 여러 종간의 유단백질 유전자의 5‘ 상류를 비교분석한 결과, 일반적으로 각 유단백질 유전자의 500bp 상류 부근에서 발견되었다(Gerenscer 등, 2002; Malewski, 1998). 전사인자는 일반적으로 6~16bp 길이의 염기서열을 인식하며, 이론적으로 전사인자 부위가 우연히 나타날 확률은 1/46에서 1/416정도로 낮기 때문에 프로모터상의 다양한 전사인자들의 존재는 어떤 전사인자가 특정 유전자의 발현 조절에 관련되는 지를 예측할 수 있게 해준다. 유단백질 유전자의 프로모터의 CoREs에 결합하는 전사인자들로는 STAT5, 글루코코르티코이드 수용체(GR), NF1, C/EBP, YY1, IREs, Oct1 등이 알려져 있다(Malewski, 1998).

유선상피세포에서 베타-카제인 유전자의 포유의존, 유선특이 발현은 주로 인슐린, 프로락틴, 하이드로코티존 등의 수유 호르몬들의 상호작용과 프로모터 부위의 다양한 cis-활성인자들에 의해 조절된다(Winklehner-Jennewein 등, 1998; Lechner 등, 1997; Satio와 Oka, 1996; Watson, 1996). 인슐린은 IREs를 자극하는 반면에 프로락틴은 JAK-STAT 경로를 통하여 STAT5의 발현을 유도하며, 하이드로코티존은 세포질의 GR에 결합하여, STAT5와 GR이 함께 유단백질 유전자 발현 효율을 높인다(Groner, 2002; Inuzuka 등, 1999; Jolivet, 1996). YY1은 다양한 조직에서 발현되며, 전사를 활성화 또는 억제하는 다기능 단백질로서, 수유 호르몬의 부재 시 베타-카제인 유전자 발현을 억제하지만, 호르몬에 의한 유도 시에는 극히 미약한 기능을 갖거나 전혀 기능하지 않는다(Raught 등, 1994). 이러한 호르몬 활성 전사인자들의 상호작용들의 독특한 조합의 결과로 유단백질 유전자의 유선특이, 포유의존 발현이 이루어진다. Rosen 등(1999)에 의하면 염색질 구조 내에서 소의 베타-카제인 프로모터는 다음과 같은 과정에 의해 활성화된다. STAT5, C/EBPb, GR 등이, 안정적인 활성 복합체를 형성하고, 이들 세 단백질이 함께 베타-카제인 프로모터로 CBP/p300를 효과적으로 끌어들여, 히스톤의 아세틸화를 유도하여 전사가 활성화된다. LIP와 YY1은 베타-카제인 프로모터의 밀크박스부위에 결합하여 복합체 상태로 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs)를 끌어들여 결합하고, 히스톤의 탈아세틸화와 전사 활성의 억제를 가져온다. 이러한 전사인자결합부위들은 일반적으로 유전자의 프로모터 부위에서 발견되지만, 그 외의 인트론 상에서도 발견된다. 유단백질 유전자의 인트론 부위는 유선발현 형질전환 발현벡터의 발현수준을 높여주는 인자의 하나로 고려되어 지고 있다(Whitelaw 등, 1991).

칼슘-감수성 카제인의 일종인 베타-카제인은 소, 산양, 면양의 유즙의 주성분으로서(Beaton 등, 2003), 그 프로모터는 형질전환동물의 유선에서 형질전환 유전자의 발현을 조절하는데 사용하기에 적합한 후보로 여겨진다(Roberts 등, 1992). 소 베타-카제인 유전자의 3.8kb 프로모터가 수유시기의 생쥐 유선에서 시기- 및 조직특이적 발현을 일으키는 것이 확인되었으며(Cerdan 등, 1998), Ebert 등은 산양의 베타-카제인 프로모터를 이용하여 사람의 혈전용해제(tissue plasminogen activator)를 형질전환산양의 유선에서 발현시키는 데 성공하였다(Ebert 등, 1994). 소와 산양의 베타-카제인 유전자의 1번 인트론(인트론1)의 발현 수준 향상효과가 보고된 바 있으며(Kang 등, 1998, Wu 등, 2001), 소의 베타-카제인 프로모터의 발현 수준은 인트론1의 부가적 존재하에서 약 3.6배 높게 나타났다. 인트론1 상에는 C/EBPb와 STAT과 같은 몇가지 발현증진인자들이 존재하며, 이들 인자들은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라아제를 끌어들여 유단백질 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 보인다(Wyszonierski와 Rosen, 2001). 돼지의 베타-카제인 프로모터 3.2kb 의 서열과 이를 이용한 형질전환 벡터가 보고되었으나(Sugawara 등, 1997), 아직까지 그 프로모터 및 인트론 서열상의 cis-활성인자에 대해서는 명확한 분석이 이루어진바 없으며, 인트론 서열의 효과도 알려진바 없다.

그리고, 기존에 밝혀진 돼지 베타-카제인 프로모터를 이용한 발현벡터는 프로모터만을 사용하고 있으므로 다양한 개선의 여지를 가지고 있다 하겠다.

따라서 본 발명은 유용단백질을 돼지 등의 포유동물의 유선에서 대량으로 생산할 수 있는 형질전환 동물을 생산하기 위해 유선 특이 프로모터를 이용하여 유즙 특이 형질전환 발현벡터를 제작할 수 있도록 하는데 목적이 있다.

상기 목적을 이루기 위한 본 발명의 구체적인 실시예 및 과정을 이하에서 상세히 살펴보기로 한다.

본 발명에서는 돼지 베타-카제인 유전자의 프로모터 및 인트론1의 염기서열을 결정하여 분석하고 8가지 포유동물종과 5‘ 상류의 공통의 cis-활성 인자들을 비교 분석하였다. 이 결과를 바탕으로 돼지 베타-카제인 유전자 프로모터 염기서열 3,101bp와 인트론1의 2,398bp를 루시퍼라아제 리포터 유전자에 결합한 발현벡터를 제작하였다. 이 리포터 벡터를 생쥐 유선상피세포 유래 세포주인 HC11에 형질전환시켜서 생체 내의 프로모터와 인트론에 의한 발현 효율을 루시퍼라아제의 활성을 이용하여 조사하였다. 또한, 인트론1의 효과 이외에도, cis-활성인자 및 수유 호르몬의 효과 또한 보고하였다. 또한 프로모터의 5’상류 서열을 생략한 변이체를 제 작하여 3,101bp 중 일부분을 사용하여 최소한의 구성요소와 크기로써 고효율을 보이는 발현벡터를 얻고자 하였다.

<형질전환 발현벡터 제작과정>

본 발명의 형질전환 발현벡터는 다음과 같이 제작되었다. 먼저, 돼지 베타-카제인 유전자의 프로모터와 인트론1을 포함하는 부분을 클로닝하고 그 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 MatInspector의 Genomatix 프로그램으로 분석하여 프로모터 및 인트론1의 전사인자 등 cis-활성인자를 결정하였다. 전사인자 및 cis-활성인자의 위치를 감안한 프로모터 5'-말단 길이 변이체를 PCR 방법에 의해 만들어 이를 루시퍼라아제를 리포터 유전자로 하는 pGL3-Basic 벡터에 클로닝하였다. 변이 발현벡터들을 생쥐 유선유래 세포주인 HC11에 형질도입시키고 루시퍼라아제의 발현양으로 발현수준을 측정하였다.

(1) 돼지 베타-카제인 유전자의 프로모터 및 인트론1의 클로닝 및 염기서열을 결정

게놈 DNA 추출을 위한 혈액 및 정액은 축산연구소에서 보유하고 있는 랜드레이스 종축으로부터 얻었다. 대장균 Escherichia coli TOP10(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)이 유전자 클로닝 벡터를 증식하기 위한 숙주로 이용되었다. 게놈 DNA는 돼지의 혈액 및 정액으로부터 MagExtractor(Toyobo, JAPAN)를 사용하여 제조사의 분리방법에 따라 분리하였다. 돼지 베타-카제인 유전자 5‘-말단 3,101bp 와 45bp의 1번엑손(엑손1), 2,398bp의 인트론1을 PCR방법으로 증폭하였다. PCR 반응물(50 ㎕)은 각 10 pM의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머; 100 ng의 돼지 게놈 DNA; 0.4 mM dNTP; 10X 완충용액; 2 단위의 ExTaq™ DNA 중합효소(TaKaRa, JAPAN); 20 mM MgCl2. 각반응물은 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 30 cycle을 수행하였다: 94℃에서 1분간 변성 후, 60℃에서 1분간 프라이머 결합, 72℃에서 1분30초간 신장반응. PCR 산물은 0.8% 아가로즈 겔 상에서 전기영동으로 확인한 후 pCR™2.1-TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.) 벡터에 클로닝하고 이를 대장균 E. coli TOP10에 형질전환시켜 증폭하여 염기서열 결정 및 추가적인 클로닝에 사용하였다. 클로닝한 5.5kb PCR 산물의 전체 염기서열을 결정하고 이를 MatInspector(http://www.genomatix.de)의 Genomatix 프로그램으로 분석하여 프로모터와 인트론1 상의 전사인자결합부위를 검색하였다. 돼지 베타-카제인 프로모터에서 인트론1까지 약 5.5kb 구간을 분석하고 프로모터 및 인트론 상의 전사인자결합부위를 예측하였다. 분석결과 돼지 베타-카제인 프로모터와 인트론1은 TATA, GATA, Ap1, CAAT box과 같은 프로모터의 기본요소와 STAT5, C/EBPb, YY1, IRE, GRE/PRE, Oct1과 같이 유단백질 프로모터 부위에서 일반적으로 발견되는 다음의 cis-활성 인자들을 포함하는 것으로 확인되었다: 5개의 STAT, 6개의 GRE/PRE, 하나의 NF1, 12개의 C/EBPb, 두개의 YY1, 하나의 IRE, 15개의 Oct1. 그 외에도 이 부분에는, growth factor independence 1(GFI1), activator protein 1(AP1), myocyte-specific enhancing factor 2(MEF2), nuclear factor Y(NFY), GATA 등의 결합부위가 나타났다(서열목록1).

(2) 돼지 베타-카제인 프로모터/루시퍼라아제 벡터의 제작

돼지 베타-카제인 유전자의 5’말단을 인식하는 프라이머와 인트론1의 3‘ 말단을 인식하는 프라이머는 각각 5'-CCCACTATTTCCTGACGCGTGATTAACTTT-3'(밑줄은 MluⅠ제한효소자리)와 5'-ATGGCGATCTCGAGCTGTGAATGGGGAAAT-3'(밑줄은 XhoⅠ제한효소자리)를 사용하여 5.5kb의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 MluⅠ과 XhoⅠ으로 절단후 프로모터가 없는 pGL3-Basic(Promega, Madison, WI, U.S.A.) 벡터의 MluⅠ과 XhoⅠ제한효소자리에 클로닝하여 루시퍼라아제 발현분석를 위한 발현 벡터로 사용하였다. pGL3-Control과 pRL-TK 벡터(Promega, Madison, WI, U.S.A.)를 형질도입의 대조구벡터 및 표준화벡터로 사용하였다. 각각의 5'-말단 길이 변이체 프로모터/엑손1/인트론1 단편은 하기 [표 1]에 기술한 PCR 프라이머쌍을 이용하여 상기 방법으로 증폭하여 pCR™2.1-TOPO 벡터에 클로닝한 후 이를 다시 pGL3-Basic 루시퍼라아제 발현벡터에 MluⅠ과 XhoⅠ제한효소자리를 이용하여 클로닝하였다. (도 1 참조).

돼지 베타-카제인 프로모터/인트론1 및 일련의 5'-말단 길이 변이체 프로모터를 증폭하기위한 프라이머 목록 및 서열. [F는 정방향 프라이머; R은 역방향 프라이머; S는 sense strand; A는 antisense strand를 나타낸다. 밑줄친 서열은 각 제한효소 위치(Mlu I: ACgCgT, XhoI: CTCgAg)를 나타낸다. pPBCPE와 pPBCPEI의 정방향 프라이머는 pPBCP F(Mlu I)와 동일하며, p2575, p1775, p1705, p1095, p583의 역방향 프라이머는 pPBCPEI R(Xho I)과 동일하다]

프라이머 명	염기서열	위치	방향
pPBCP F(Mlu I)	5'-CCCACTATTTCCTgACgCgTgATTAACTTT-3'	+3101/+3072	S
pPBCP R(XhoI)	5'-AggAggAgCTCgAgggATAATCATCCACTT-3'	+15/-15	A
pPBCPE R(XhoI)	5'-gAATCTgAAACTCgAgCCTTTTCTCCAAAg-3'	+62/+33	A
pPBCPEI R(XhoI)	5'-ATggCgATCTCgAgCTgTgAATggggAAAT-3'	+2457/+2428	A
p2575 F(Mlu I)	5'-TggTCCTTTTATTgTACgCgTTAATCCAgC-3'	-2591/-2562	S
p1775 F(Mlu I)	5'-AAATggTTAgggCACgCgTgCTTTTgTATT-3'	-1789/-1760	S
p1705 F(Mlu I)	5'-AACCAAgAgCTAACgCgTAAAggCACAgTg-3'	-1718/-1689	S
p1095 F(Mlu I)	5'-TAgAAgATACgCgTCCAAACTTgAgAggAC-3'	-1104/-1075	S
p583 F(Mlu I)	5'-ATCTCCATCTACTCACTACgCgTTgCACTT-3'	-601/-572	S

돼지 베타-카제인 유전자의 게놈 DNA 서열중 -3,101에서 +2,398까지의 부분을 pGL3-Basic 벡터에 클로닝하여 pPBCPEI/luc를 제작하였다. 발현 벡터 pPBCPEI/luc는 3,101bp의 베타-카제인 프로모터/45 bp의 엑손1/2,398bp의 인트론1을 포함하는 5,544bp 단편을, pPBCPE/luc는 3,101bp의 베타-카제인 프로모터/45bp의 엑손1을 포함하는 3,146bp 단편을, pPBCP/luc 는 3,101bp의 돼지 베타-카제인 프로모터를, 각각 pGL3-Basic 벡터의 프로모터 위치에 클로닝하여 제작하였다. 발현 벡터 p2575/luc, p1775/luc, p1705/luc, p1095/luc와 p583/luc은 전사인자의 위치를 참고로 특정 전사인자를 포함하는 부분이 결손된 일련의 5‘-말단길이 변이체들에서 5’-말단의 염기서열번호에 따라 명명하였으며, 이들의 크기는 각각 5,018, 4,218, 4,148, 3,538, 3,026bp였다(도 1, 도 2 참조). 이들은 각각 pGL3-Basic에 MluⅠ과 XhoⅠ제한효소를 이용하여 클로닝하였으며, 전체 벡터의 크기는 pPBCP/luc, pPBCPE/luc, pPBCPEI/luc, p2575/luc, p1775/luc, p1705/luc, p1095/luc, p583/luc이 각각 7.6, 7.65, 10, 9.5, 8.7, 8.6, 8, 7.5kb였다(도 2 참조).

(3) HC11 세포배양

각 발현 벡터에 대한 수유 호르몬에 의한 발현 조절을 조사하기 위해 생쥐 유선상피세포유래 세포주인 HC11을 사용하였다. HC11은 유선특이 유전자 발현을 연구하는데 널리 사용되는 세포주로서 유즙으로 단백질을 생산하는 형질전환 동물 생산에 사용되는 발현벡터의 조절부위의 효율을 측정하기 위해 사용되었다. HC11의 배양은 RPMI 1640(GIBCO Cat. No. 31800-022, Grand Island, NY, U.S.A.)에 10% 열불활성화 FBS(GIBCO 16000-044, U.S.A.), 5㎍/㎖의 인슐린(Sigma I9278, U.S.A.), 10ng/㎖의 EGF(Sigma, U.S.A.), 그리고 50units/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신(GIBCO 15140-122, U.S.A.)을 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO2 가습 배양조건에서 배양하였다.

(4) HC11의 임시 형질도입과 호르몬 유도.

형질도입은 리포펙타민제(LIPOFECTAMINETM 2000, Invitrogen, U.S.A.)를 사용하여, 제조사의 방법을 변형한 리포펙틴법에 의해 다음과 같이 수행하였다. 임시형질도입 전일에, HC11 세포를 0.05% 트립신/EDTA(GIBCO, U.S.A.)로 처리하고, 그 세포수를 측정한 후, 24-well plate에 well 당 0.5x10⁵ 개의 세포수가 되도록 분주하고, 0.5㎖의 일반 생장배지(혈청첨가, 항생제 무첨가)에서 37℃, 5% CO2 가습 배양조건하에 24시간 배양하였다(90% 협착). 배지를 무혈청 Opti-MEM(GIBCO 31985-070, U.S.A.)으로 바꾸고, 형질도입을 수행하였다. 형질도입에 앞서 수유 호르몬의 영향을 확인하기 위하여 5㎍/㎖의 인슐린 (Sigma, U.S.A.), 3㎍/㎖의 양(羊) 프로락틴 (Sigma, U.S.A.), 1㎍/㎖의 하이드로코티존(Sigma, U.S.A.)을 사용하여 다음과 같은 조간으로 호르몬 유도를 수행하였다; 인슐린(I); 인슐린 + 프로락틴(IP); 인슐린 + 하이드로코티존(IH); 인슐린 + 프로락틴 + 하이드로코티존(IPH). 공형질도입(co-transfection)을 위한 각각의 벡터(그림1)는 well당 1.0x10¹¹ 개를, Renilla 리포터유전자를 가진 pRL-TK 는 형질도입 효율을 표준화하기 위해 Firefly 리포터벡터와 1:25(R:F)의 비율로 사용하였다. 각각의 DNA를 Opti-MEM으로 희석하여 전체를 50㎕로 맞춘 혼합물과, 3㎕의 리포펙타민제를 50㎕의 OPTI-MEM 배지에 첨가한 혼합물을 상온에서 5분간 두었다. 이들 희석한 DNA와 희석한 리포펙타민제를 섞어서 20분간 두었다가, 이를 각각의 well에 첨가한 후 plate를 흔들어 섞어 주었다. 형질도입된 HC11 세포는 37℃, 5% CO₂ 가습 배양조건하에 14시간 배양한 후, 일반 생장배지(혈청첨가, 항생제 무첨가, 수유 호르몬첨가)로 배지를 교환하고 37℃, 5% CO₂가습 배양조건하에서 28시간, 공형질도입 후, 총 42시간 동안 배양하였다. 앞에 기술한 바와 같이, STAT5와 GR은 유단백질 유전자 발현 효율을 높이는데 함께 기여하며, 이들은 수유 호르몬의 조절을 받는다. 이 효과를 확인하기 위하여, 먼저 가장 큰 단편으로서 프로모터, 엑손, 인트론의 전체요소를 포함하는 pPBCPEI/luc를 사용한 실험에서, 인슐린, 프로락틴, 하이드로코티존을 모두 처리한 처리군은 다른 처리군에 비해 높은 발현을 보였으며, 인슐린만을 처리한 처리군은 가장 낮은 발현율을 보이는 것을 하기 [표 2]를 통해 확인할 수 있었다.

pPBCPEI/luc를 형질도입시킨 HC11 세포에서 루시퍼라아제 활성에 대한 수유 호르몬의 효과.

호르몬 조합	루시퍼라아제 활성^* (RLUx10³, 평균±표준편차)
호르몬 조합	대조구^**(n)	pPBCPEI/luc (n)
I	4.49±0.92 (5)	7.71±0.38 (5)
IP	5.08±1.06 (6)	9.79±2.18 (6)
IH	5.20±1.34 (6)	9.27±2.64 (6)
IPH	5.66±1.28 (6)	11.31±3.35 (6)

[RLU: Relative luciferase unit (3.9x10¹⁰ RLU/㎎),

^*측정치는 평균치의 1.5 x 표준편차(S.D)를 벗어나는 값을 제거하여 보정.

^**대조구: 돼지 베타-카제인 프로모터가 없는 pGL3-Basic 벡터를 형질도입시킨 HC11.

pPBCPEI/루시퍼라아제 벡터를 형질도입시킨 HC11 세포를 24-well plates에서 배양하고, 인슐린(I: 5㎍/㎖), 프로락틴(P: 3㎍/㎖), 하이드로코티존(H: 1㎍/㎖)을 조합하여 첨가. 결과는 평균치(mean) ± 표준편차(S.D)로 나타냄. 6회 반복 실험하였으며, 괄호속의 n은 보정에서 제거되지 않은 반복 수행 횟수.]

인슐린과 프로락틴, 또는 인슐린과 하이드로코티존 두가지 만을 처리한 경우는 비슷한 수치를 보였다(도 3 참조).

이러한 결과는 pPBCPEI/luc가 형질도입된 HC11 세포에서 Firefly 루시퍼라아제의 발현은 세가지 수유 호르몬에 모두 영향을 받는 다는 것을 보여준다.

(5) 루시퍼라아제 리포터 발현분석에 의한 프로모터 활성 측정.

형질도입된 HC11 세포에서의 루시퍼라아제 활성은 dual-luciferase assay system kit(Promega, Madison, WI, U.S.A.)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였다. Plate에서 배양액을 제거한 후 배양세포를 차가운 1X DPBS 완충용액(GIBCO, U.S.A.)로 2회 세척하고, 15분간 100㎕의 passive lysis 완충용액첨가 후 흔들면서 세척하였다. 20㎕의 용출물에 대한 Firefly와 Renilla 루시퍼라아제의 활성은 100㎕의 기질을 첨가하여 TD-20/20 루미노미터(Promega, U.S.A.)에서 각각 측정하였다. 각 lysates의 단백질 농도는 8㎍의 전체 단백질을 사용하여 Bradford 분석(BIO-RAD 500-0006, U.S.A.)에 의해 측정하였다. 루시퍼라아제 활성은 QuantiLum™ 재조합 루시퍼라아제(Promega, U.S.A.)를 사용하여 상대 루시퍼라아제 단위(relative luciferase units: RLU)로 계산하였다. 측정치는 평균치의 1.5 x 표준편차(S.D)를 벗어나는 값을 제거하여 보정하였다. 돼지 베타-카제인 유전자의 엑손1과 인트론1의 첨가는 활성을 확연히 증가시켰으며, 이는 이 부위에 발현을 증가시키는 소수 또는 다수의 발현증진인자(enhancer) 혹은 그 집합이 존재한다는 것을 말해준다.

방법에서 기술된 8가지 돼지 베타-카제인 프로모터 5‘ 말단 길이 변이체/루시퍼라아제 벡터의 HC11에서의 루시퍼라아제 활성은 다음과 같이 나타났다. 엑손1과 인트론1을 포함하는 pPBCPEI/luc는 프로모터만을 포함하는 pPBCP/luc에 비해 매우 높은 활성을 보였으며, pPBCPE/luc, pPBCPEI/luc, p2575/luc, p1775/luc, p1705/luc, p1095/luc, p583/luc의 활성은 pPBCP/luc에 비해 각각 1.9-, 4.2-, 3.3-, 4.2-, 2.4-, 3.2-, 5.2-배의 활성을 보였다.[표 3]

돼지 베타-카제인 프로모터/루시퍼라아제 벡터를 형질도입시킨 HC11 세포에서 루시퍼라아제 활성.

벡터	루시퍼라아제 활성^* (RLUX10³, 평균±표준편차)
No DNA(n)	1.66±0.00 (9)
대조구^*8(n)	5.02±0.68 (9)
pPBCP/luc (n)	3.40±0.39 (9)
pPBCPE/luc (n)	6.40±1.60 (9)
pPBCPEI/luc (n)	14.22±1.64 (8)
p2575/luc (n)	11.09±2.32 (9)
p1775/luc (n)	14.11±2.96 (9)
p1705/luc (n)	8.22±1.24 (9)
p1095/luc (n)	10.66±2.16 (9)
p583/luc (n)	17.67±1.52 (8)

[RLU: Relative luciferase unit (3.9X10¹⁰ RLU/㎎)

각각의 돼지 베타-카제인 프로모터 5‘-말단 길이 변이체/루시퍼라아제 벡터를 형질도입시킨 HC11 세포를 24-well plates에서 배양하고, 인슐린(I: 5㎍/㎖), 프로락틴(P: 3㎍/㎖), 하이드로코티존(H: 1㎍/㎖)을 첨가. 이 실험은 Bradford 분석에 의해 정량된 8㎍의 전체 단백질에 대해 실시하고, 결과는 평균치(mean)±표준편차(S.D)로 나타냄. 10회 반복 실험하였으며, 괄호속의 n은 보정에서 제거되지 않은 반복 수행 횟수.]

5'-말단 길이 변이체 돼지 베타-카제인 프로모터-엑손1-인트론1/루시퍼라아제 벡터들(p2575/luc, p1775/luc, p1705/luc, p1095/luc, p583/luc)은 모두 pPBCP/luc보다 높은 활성을 보였다(도 4 참조).

이러한 결과는 돼지 베타-카제인의 인트론1상에 cis-활성 인자가 존재하며, 돼지 베타-카제인의 발현을 향상시키는 역할을 한다고 보인다. 인슐린, 프로락틴, 하이드로코티존의 3개 수유 호르몬의 유도에 의해, 가장 짧은 벡터인 p583/luc의 RLU가 가장 높게 나타났으며, pPBCPEI/luc와 p1775/luc의 RLUs가 비슷한 수준을 보였고, p2575/luc, p1705/luc, p1095/luc의 RLU가 pPBCPEI/luc보다 낮은 수준으로 나타났다(그림4). pPBCPEI/luc와 p1775/luc의 RLUs는 각각 p2575/luc와 p1705/luc보다 높게 나타난 반면에, p2575/luc와 p1705/luc의 RLUs는 각각 p1775/luc와 p583/luc보다 낮게 나타났다. 이는 감소된 활성을 갖는 벡터간의 서열차이가 발현억제요소(repressor)를 포함하고, 증가된 활성을 갖는 벡터간의 서열차이는 발현활성인자(activator)를 포함한다고 설명가능하다. 이 결과는 pPBCPEI/luc와 p2575/luc간의 염기서열 사이(-3,101~-2,575)와 p1775/luc와 p1705/luc사이(-1,775~-1,705)에 존재하는 어떤 인자가 돼지 베타-카제인의 발현을 향상시키는 효과를 가져오는 것으로 생각된다. p1775/luc와 p1705/luc 사이에 존재하는 서열은 매우 짧은(70bp) 서열임에도 불구하고 활성을 크게 감소시켰으며, 이는 여기에 포함되는 요소들이 유단백질 유정자의 발현을 활성화한다는 것을 의미한다. 서열목록1에 의하면 이 요소는 한개의 STAT5(-1775~-1705)예상결합부위이다. 반면에, p2575/luc와 p1775/luc사이(-2,575~-1,775)와 p1705/luc와 p583/luc사이(-1,705~-583)에는 (비특이적인) 발현을 억제하는 인자가 존재하는 것으로 보여진다. 프로락틴 유도하에 JAK-STAT 경로에 의해 발현되는 STAT5(-1775~-1705)는 프로락틴에 의한 발현조절에 필수적일 것으로 예측된다. 돼지 베타-카제인 프로모터/인트론1 상에는 중요한 전사활성인자인 C/EBPb의 결합부위가 12개 존재하 며, 유전자 발현의 활성과 억제의 두 기능을 모두 갖는 Oct1의 결합부위가 15개 존재한다. 돼지 베타-카제인 유전자의 발현은 이러한 여러인자들(STAT5, C/EBPb, YY1, GR)의 조합에 의해 이루어지는 것으로 보인다.

(6)HC11에서 가장 높고 특이적인 루시퍼라아제 발현효율을 갖는 벡터: p1775/luc

인슐린, 프로락틴, 하이드로코티존의 3개 수유 호르몬의 유도하에서 pPBCPEI/luc와 p1775/luc의 RLU는 비슷한 수준을 보였으며, p583/luc의 RLU는 가장 높은 수치를 보였다(도 4 참조). 만약 p1775/luc와 p583/luc가 수유 호르몬의 조절을 pPBCPEI/luc와 동일하게 받았다면, 다양한 호르몬 조합에 의한 조절의 결과가 pPBCPEI/luc에서와 유사한 형태를 보일 것이며, 이러한 발현이 수유 호르몬의 조절과 무관하다면 이와 다른 형태를 보일 것이다.

p1775/luc이 HC11에서 루시퍼라아제 유전자의 조직- 및 시기특이적 발현의 필요충분조건을 만족시키는 형태이거나, p583/luc이 HC11에서 유전자 발현을 가능케하는 최소한의 형태라는 두가지 가능성을 검증하기 위하여, p1775/luc와 p583/luc을 각각 형질도입 시킨 HC11 세포를 pPBCPEI/luc에서와 같이 여러 가지 수유 호르몬들의 조합하에 유도시켜 그 발현량을 비교하였다(표 4, 도 5 참조).

p1775/luc, 583/luc를 형질도입시킨 HC11 세포에서 루시퍼라아제 활성에 대한 수유 호르몬의 효과.

호르몬 조합	루시퍼라아제 활성^*(RLUX10^3, 평균±표준편차)
호르몬 조합	대조구^**(n)	p1775/luc (n)	p583/luc (n)
I	4.93±0.95 (3)	7.26±0.11 (4)	11.33±0.96 (4)
IP	5.68±0.66 (4)	9.92±0.20 (4)	11.25±1.59 (4)
IH	5.91±1.01 (4)	10.14±0.95 (4)	11.38±1.16 (4)
IPH	6.43±0.59 (4)	13.67±0.41 (4)	15.27±0.11 (4)

[^*측정치는 평균치의 1.5 x 표준편차(S.D)를 벗어나는 값을 제거하여 보정.

p1775/luc, p583/luc 벡터를 형질도입시킨 HC11 세포를 24-well plates에서 배양하고, 인슐린(I: 5㎍/㎖), 프로락틴(P: 3㎍/㎖), 하이드로코티존(H: 1㎍/㎖)을 조합하여 첨가. 결과는 평균치(mean)±표준편차(S.D)로 나타냄. 4회 반복 실험하였으며, 괄호속의 n은 보정에서 제거되지 않은 반복 수행 횟수.]

상기 결과에서 p1775/luc의 경우 pPBCPEI/luc의 RLU와 비슷한 양상을 보였으나, p583/luc의 경우는 차이를 보였다. p583/luc은 3가지 호르몬(인슐린, 프로락틴, 하이드로코티존)을 모두 사용한 경우, 또는 인슐린과 프로락틴, 또는 인슐린과 하이드로코티존 유도하에서는 p1775/luc의 경우와 유사한 활성을 보였으나, 인슐린을 단독으로 사용한 경우에도 매우 높은 발현을 보였다.

이는 p583의 조직특이성에 의문을 갖기에 충분한 결과로 보인다. 따라서 앞의 두가설중 p1775가 HC11에서 루시퍼라아제 유전자의 조직- 및 시기특이적 발현에 충분한 형태라는 가설을 신뢰할 수 있는 것이다.

pPBCPEI/luc의 RLU(14.22±1.64)는 p1775/luc의 활성(14.11±2.96)과 유사한 수준을 보였다. 이를 뒷받침할 만한 가설은 유단백질 유전자의 특이적인 발현에 p1775(-1775~+2443)가 충분조건이라는 것이다. p1775가 포유의존, 유선특이 발현을 보이지 않는 다면, 다양한 수유 호르몬의 조절하에서 활성의 차이를 보이지 않을 것이며, 반면에, p1775가 특이적으로 발현되려면, pPBCPEI와 유사한 형태로 수유 호르몬의 조절을 받아야 할 것이다. 기대한 바와 같이, 다양한 수유 호르몬의 조절하에서 p1775/luc의 RLUs는 pPBCPEI/luc에서와 유사한 수준을 보였던 반면에, p583의 RLUs는 모든 조합의 수유 호르몬에서 유사한 활성을 보였으며(표2, 표4, 도 3, 도 5 참조),

이는 곧, p583이 유단백질 유전자의 발현 특이성을 가지고 있지 않다는 반증으로 볼 수 있다. 일반적으로, 형질전환동물을 만들기 위해서 미세주입되는 유전자의 크기가 작을 수록 유전자내 삽입(integration)의 효율이 증가한다고 알려져 있다(Brinster 등, 1985).

상기 결과에 따라 p1775는 유단백질 유전자의 포유의존, 유선특이 발현을 보이기 위한 필요충분조건을 만족하는 형태임을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와같은 본 발명은, 인슐린, 프로락틴, 하이드로코티존의 3개 수유 호르몬의 유도하에서 서열목록 1(또는 서열목록2와 4)의 염기서열을 사용한 pPBCPEI/luc와 서열목록3과 4를 사용한 p1775/luc벡터의 사용은 종래기술에 언급된 기존의 프로모터를 사용한 pPBCP/luc보다 생쥐 유선상피세포 유래 세포주인 HC11높은 발현량을 나타낼 수 있게된다.

또한, 유즙으로 유용단백질을 생산하기 위한 형질전환동물(돼지 등)을 생산에 있어서, 본 발명의 발현벡터를 이용함으로서 발현량을 크게 증대시킬 수 있게됨을 알 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

유전자 발현 조절을 위해 서열목록 1의 돼지 게놈 DNA 단편 염기서열을 포함하는 발현벡터.
유전자 발현 조절을 위해 서열목록 2 및 서열목록 4의 돼지 게놈 DNA 단편 염기서열을 포함하는 발현벡터.
유전자 발현 조절을 위해 서열목록 3 및 서열목록 4의 돼지 게놈 DNA 단편 염기서열을 포함하는 발현벡터.
유전자 발현 조절을 위해 서열목록 4의 돼지 게놈 DNA 단편 염기서열을 포함하는 발현벡터.
청구항 1 내지 청구항 4중 어느 한 항의 발현벡터를 이용하여 배양세포 및 형질전환 동물의 유선에서 외래 단백질을 생산하는 것을 특징으로하는 발현벡터를 이용한 형질전환 동물 유선에서 유전자 발현방법.