KR100645993B1

KR100645993B1 - 신규한 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR100645993B1
Application number: KR1020030075978A
Authority: KR
Inventors: 박관화; 박진희; 이현규; 김용노; 채혜영; 최차란; 신말식; 문태화
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2003-10-29
Filing date: 2003-10-29
Publication date: 2006-11-13
Also published as: KR20050041069A

Abstract

본 발명은 신규한 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 전분의 사이드 체인의 길이가 조절된 맞춤형 전분을 생산할 수 있으며, 식품의 품질 향상 및 저장성 연장에 현저한 효과가 있는 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 제공한다.

써머스 스코토덕터스, 알파-글루카노트랜스퍼라제, 디스프로포셔네이션, 맞춤형 전분, 쌀 가공 식품, 노화 억제

Description

신규한 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 및 이의 용도{NOVEL THERMOSTABLE α-GLUCANOTRANSFERASE AND USE THEREOF}

도 1은 본 발명에 따른 p6xHisTSαGT 벡터의 지도를 간략하게 도시한 것이다.

도 2는 알파-글루카노트랜스퍼라제의 디스프로포셔네이션능을 확인한 박막 크로마토그래피 분석 결과이다.

도 3은 알파-글루카노트랜스퍼라제의 열안정성을 측정한 그래프이다.

도 4a는 쌀 전분의 사이드 체인을 분석한 이온 교환 크로마토그래피로 분석한 결과이고, 도 4b는 알파-글루카노트랜스퍼라제를 반응시킨 쌀 전분의 사이드 체인을 분석한 결과이다.

도 5는 알파-글루카노트랜스퍼라제 처리구(▼)와 무처리구(●)의 전분 노화속도를 측정한 것이다.

도 6a는 알파-글루카노트랜스퍼라제를 무처리한 대조구 가래떡의 주사전자현미경 사진이고, 6b는 알파-글루카노트랜스퍼라제 처리한 가래떡의 주사전자현미경 사진이다.

도 7은 알파-글루카노트랜스퍼라제 처리구와 무처리구에서의 취반미 노화속도를 측정한 것이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 신규한 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전분의 사이드 체인의 길이가 조절된 맞춤형 전분을 생산할 수 있으며, 식품의 품질 향상 및 저장성 연장에 현저한 효과가 있는 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 및 이의 용도에 관한 것이다.

[종래기술]

정미한 쌀의 대부분을 차지하고 있는 쌀 전분(현미의 경우 70 %)은 선형의 아밀로오스와 가지상의 아밀로펙틴으로 구성되어 있다. 쌀을 이루는 아밀로오스와 아밀로펙틴의 함량비는 가열 조리된 쌀 가공품의 찰기와 풍미를 결정하는 데 중요한 요인으로 작용한다. 예를 들면, 육종을 통해 얻은 아밀로오스 함량이 낮은 제품의 멥쌀(10-15 %)은 일반 멥쌀(17-23 %)에 비해 품질과 저장성이 뛰어난 제품으로 평가받고 있다(N. Inouchi, 식품저장과 가공 산업, 1, 17-25, 2002).

일반적으로 호화된 전분을 함유한 식품을 저장하는 경우, 아밀로오스와 아밀로펙틴의 상호작용으로 인한 재결정화로 제품의 품질이 크게 떨어뜨리게 되는데, 이러한 노화현상을 억제하기 위한 방법으로는 지질이나, 지방산과 같은 첨가물을 이용하는 방법과 아밀라아제를 사용하여 전분의 구조 자체를 변화시키는 방법이 사용되고 있다.

상기 방법중, 아밀라아제를 이용한 방법으로 알파 아밀라아제를 빵과 같은 전분 가공식품의 노화 방지제로 사용되고 있다. 그러나 알파 아밀라아제는 약간의 과용에도 제품의 물성이 약해지며 대량의 환원당이 생성되어 마이야르 반응과 같은 원하지 않은 반응이 유발되어 품질의 저하가 초래될 수 있다. 또한 쌀 전분은 다른 전분에 비해 호화 온도가 높으며(68-78 ℃), 특히 쌀 낟알 중 전분입자는 매우 촘촘하고 단단하게 붙어 있어, 호화 온도보다 낮은 온도에서는 효소처리가 힘들거나 시간이 매우 오래 걸리는 어려움이 있다. 따라서 쌀 가공식품의 효소적 처리를 위해서는 쌀 전분의 호화 온도보다 높은 온도에서도 활성이 높은 내열성 효소의 개발이 요구된다.

한편, 알파-글루카노트랜스퍼라제는 알파 아밀라아제의 그룹 13에 속하는 효소로서 E. coli에서는 아밀로말테이즈, 감자 등의 식물에서는 D-enzyme으로 불리워지고 있다. 알파 글루카노트랜스퍼라제는 E. coli에서 처음 클로닝되었으며, 현재 감자, 고구마, 보리 및 일부 미생물에서 클로닝 되어있다. 알파-글루카노트랜스퍼라제는 공여분자의 비환원성 말단으로부터 수여분자의 비환원성 말단에 글루코오스 단위로 전이하는 효소로서 전분 중 아밀로오스와 아밀로펙틴의 긴 가지들을 가수분해하고, 동시에 가수분해된 저 분자의 글루칸을 α-1,4 결합으로 당전이하여 아밀로펙틴 가지들을 재구성시키는 효소이다. 현재까지 알파-글루카노트렌스퍼라제를 식품에 적용한 예는 보고된 바 없다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 신 규한 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 신규한 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 발현 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 이용한 식품 가공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제에 의하여 가공된 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 처리에 의하여 물성이 개선되고, 노화가 지연된 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 내열성-알파 글루카노트랜스퍼라제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드를 암호하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 발현가능하도록 포함하는 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 발현가능하도록 포함하는 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환된 세포주로부터 생산되는 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 제공한다.

또한 본 발명은 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 전분, 전분이 함유된 곡물 또는 식품에 가하여 반응시키는 것을 포함하는 알파-글루카노트랜스퍼라제가 처리된 가공식품 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 가공식품 제조방법으로 제조된 가공식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 열안정성을 갖는 신규한 알파-글루카노트랜스퍼라제를 클로닝하여 이의 유전자 핵산 서열 및 단백질 아미노산 서열을 분석하였으며, 알파-글루카노트랜스퍼라제 생산 시스템을 확립하였다. 또한 알파-글루카노트랜스퍼라제를 식품에 처리하는 경우 식품의 품질이 개선되고 식품노화를 지연시키는 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명의 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제는 써머스 스코토덕터스(Thermus scotoductus ATCC 27978)에서 유래한 단백질로, 500개의 아미노산으로 이루어지며 이의 분자량은 약 57 kDa이다. 알파-글루카노트랜스퍼라제는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어져 있다.

내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제는 아밀로오스와 아밀로펙틴의 긴 가지들을 가수분해하는 가수분해능과, 동시에 가수분해된 저 분자의 글루칸을 α-1,4 결합으로 당전이하여 아밀로펙틴 가지들을 재구성하는 디스프로포셔네이션(disproportionation) 활성을 가진다. 특히 상기 효소는 아밀 로오스에 대한 가수분해능이 우수하고, 반면에 아밀로펙틴에 대한 가수분해는 통상적인 알파-아밀라아제에 비하여 제한적이므로 처리시 식품 또는 제품이 묽어질 확률이 낮다. 또한 알파-글루카노트랜스퍼라제는 환원당을 제거하며, 아밀로펙틴 사슬을 재구성시킨다. 상기 효소는 상온 또는 상온이상의 고온에서 활성을 가지는데, 특히 45 내지 90 ℃에서 활성을 나타내며, 효소 활성을 갖는 pH 범위는 5.5 내지 8.5 일 수 있다. 효소반응시간은 효소의 반응온도, 반응 pH 또는 효소 역가에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 예컨대 30분 내지 12시간 일 수 있으나, 12시간 이상에서도 반응이 이루어지므로 상기 수치한정에 제한되는 것은 아니다. 상기 효소는 바람직하기로는 반응온도 70 내지 85 ℃에서, pH 범위는 7.0 내지 7.5에서 최적의 활성을 나타낸다.

본 발명의 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 유전자는 서열번호 4의 펩타이드를 암호하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 상기 서열번호 4의 펩타이드를 암호하는 핵산 서열의 예로는 서열번호 3으로 기재한 핵산 서열이 있다.

본 발명의 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제는 미생물 발현 생산시스템을 통하여 생산가능하다. 이에, 본 발명은 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 유전자가 공지의 벡터에 발현가능하도록 삽입된 재조합 벡터를 제공한다. 상기 공지의 벡터는 미생물, 특히 효모, 대장균 또는 곰팡이에서 이종 단백질을 발현하기 위하여 제안된 모든 종류의 벡터일 수 있으며, 선별마크, 리포터 유전자 또는 재조합 단백질의 분리를 용이하게 하기 위한 수단을 더욱 포함할 수 있다. 상기 선별마크 는 항생제 내성 유전자 또는 옥소트로피에 관련된 유전자일 수 있다. 일예로, p6xHis119(김태집, 박사학위논문, 서울대학교, 1998), pUC119 및 pET29(b)가 있다.

일실시예로, 본 발명에서는 서열번호 3의 핵산 서열을 p6xHis119 벡터의 NdeI 및 HindIII 제한요소부위에 삽입하여 p6xHisTSαGT를 제조하였다(도 1).

또한 본 발명은 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 유전자로 형질전환된 세포주를 제공한다. 상기 형질전환된 세포주는 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포에 도입한 것이다. 상기 숙주세포는 통상의 원핵생물, 진핵생물 또는 이들로부터 유래한 세포일 수 있으며, 일예로, 대장균, 효모 또는 곰팡이일 수 있다. 본 발명에서는 일실시예로, p6xHisTSαGT를 Escherichia coli MC1061에 도입하여 형질전환시켰다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포주로부터 발현되는 알파-글루카노트랜스퍼라제 재조합 단백질은 세포외 또는 세포내 발현될 수 있으며, 원심분리 또는 크로마토그래피를 통하여 용이하게 분리 및 정제가능하다. 예컨대, p6xHisTSαGT로 형질전환된 Escherichia coli MC1061은 LB 배지상에서 배양할 수 있으며, 세포내 발현된 알파-글루카노트랜스퍼라제 재조합 단백질은 균체수득, 균체 용혈(lysis), 상청액 분리 및 크로마토그래피를 통하여 정제가능하다. 특히 p6xHisTSαGT는 알파-글루카노트랜스퍼라제 재조합 단백질에 히스티딘 6 개를 접합시킨 상태로 발현시키므로, 니켈 친수성 컬럼을 이용하여 용이하게 정제가능하다. 형질전환된 세포주로부터 발현되는 알파-글루카노트랜스퍼라제는 말토올리고당을 디스프로포셔네이션하여 긴 직쇄상의 말토올리고당을 생성시킨다(도 2).

본 발명에 따른 형질전환된 세포주로부터 발현되는 알파-글루카노트랜스퍼라제는 식품에 처리하여 식품의 품질을 개선시키거나, 식품 저장성을 향상시키는 용도로 사용가능하다.

즉, 알파-글루카노트랜스퍼라제를 전분, 전분이 함유된 곡물 또는 식품에 전분함량 기준으로 15 내지 200 U으로 처리하여 가공식품을 제조할 수 있다. 이때 반응온도는 알파-글루카노트랜스퍼라제가 활성을 나타내는 온도범위일 수 있으며, 반응시간은 식품의 종류 또는 바람직한 전분의 변형정도에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 또한 효소에 의한 전분의 가수분해 및 디스프로포셔네이션 반응을 중지하고자 하는 경우 100 ℃이상의 열을 가하여 반응을 중지시킬 수 있다.

알파-글루카노트랜스퍼라제로 가공가능한 곡물으로는 쌀, 찹쌀, 감자, 밀, 옥수수, 및 콩 등이 있으며, 상기 곡물을 이용한 식품에도 모두 사용가능하다. 식품의 예로는, 취반미, 김밥, 초밥, 쌀음료, 쌀국수, 가래떡, 떡볶이, 백설기, 식빵, 비스켓 등이 있다.

본 발명에서 일실시예로, 쌀전분에 알파-글루카노트랜스퍼라제를 처리하여 전분의 사이드 체인의 길이가 재구성된, 즉 긴 사이드 체인의 수는 감소되고 짧은 사이드 체인의 수는 증가된 맞춤형 전분을 제조할 수 있었다(도 4). 그 외에도, 가래떡 제조시 쌀가루에 알파-글루카노트랜스퍼라제를 처리하거나 또는 취반시 처리하여 식품의 품질변화, 저장성 및 기호성을 확인하였다. 그 결과, 가래떡의 경우 노화가 연장되고 기호도가 향상되며(도 5), 가래떡 조직이 조밀한 망상구조로 전환되었으며(도 6a 및 6b), 취반미 역시 저장성 및 기호도가 증가되는 효과가 있 었다.

이에, 본 발명에 따른 알파-글루카노트랜스퍼라제는 전분함유 식품의 품질을 개선하고 향미를 향상시킬 수 있다. 또한 알파-글루카노트랜스퍼라제는 고온에서 안정하여 열을 가하여 제조되는 식품에 용이하게 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 써머스 스코토덕터스로부터 알파글루카노트랜스퍼라제 유전자 분리

써머스 스코토덕터스(Thermus scotoductus ATCC 27978)를 castenholz TYE 배지(0.02% nitrilotriacetic acid, 0.2% Nitschs's trace elements, 0.006% FeCl₃ solution, 0.012% CaSO₄, 0.02% ㎎SO₄, NaCl, KNO₃, NaNO₃, Na₂HPO₄, 3% agar, 0.2% trypton 및 0.2% yeast extract)에 접종하여 70 ℃에서 배양한 다음 원심분리하여 균체를 회수하였다. 이후 균체로부터 염색체 DNA를 공지의 방법(Dubnau, D. and R. D. Abenson(J. Mol. Biol., 56, 209-221, 1971)을 기초로 분리하였다.

써머스 스코토덕터스의 염색체 DNA를 제한효소인 Hind III로 절단하고, 아가로오스 젤에 전기영동 한 후, 알려진 알파-글루카노트랜스퍼레이즈의 상동부위를 포함하는 서열번호 5의 프로브를 이용하여 서든 블로팅(Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)을 수행하였다. 서든 블로팅 결과 3.2 kb의 유전자를 포함하는 절편을 얻고 이를 p119 벡터에 삽입하여 재조합 벡 터를 제조하였다.

상기 재조합 벡터로부터 알파-글루카노트랜스퍼레이즈의 개시 인식 프레임(open reading frame)을 클로닝하기 위하여, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트로 PCR을 실시하였으며, PCR 산물은 p6xHis119 벡터의 NdeI 및 HindIII 제한효소 부위에 삽입하여 재조합벡터 p6xHisTSαGT를 제조하였다.

본 발명의 p6xHisTSαGT 벡터 지도는 도 1에 간략하게 나타내었다. p6xHisTSαGT에 클로닝된 알파-글루카노트랜스퍼레이즈 유전자는 ATG를 시작 코돈으로, TAA를 정지 코돈으로 포함하고 있으며, 서열번호 3으로 기재한 바와 같이 총 1,503개의 뉴클레오타이드로 이루어져 있다. 또한 이로부터 발현되는 단백질은 500개의 아미노산(서열번호 4)으로 구성되어 있었다.

실시예 2: 알파-글루카노트랜스퍼라제 생산 및 이의 활성 분석

2-1. 알파-글루카노트랜스퍼라제 생산

실시예 1에서 제조한 p6xHisTSαGT를 Escherichia coli MC1061에 형질전환하였고, LB 배지에 접종하여 37도에서 16시간 배양하고 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.5의 50 mM Tris-HCl 완충용액으로 현탁시킨 다음, 초음파로 파괴한 뒤 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 Ni-NTA 친수성 크로마토그래피에 통과시켜 정제된 알파-글루카노트랜스퍼라제를 수율 50%, fold 1.5배로 수득하였다.

2-2. 알파-글루카노트랜스퍼라제의 디스프로포셔네이션 활성 검증

알파-글루카노트랜스퍼라제 10 U 및 1 % 말토올리고당(말토오스, 말토트리오 스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헵사오스 또는 말토헵타오스)을 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0, 시그마)에 혼합한 후 75 ℃에서 3시간 반응시켰다. 반응 후 5분간 반응액을 끓임으로써 반응을 정지시켰다.

반응생성물을 분석하기 위해서 박막크로마토그래피를 수행하였다. 반응 종결 후, 각 시료를 왓트만 K5F TLC 플레이트(20 ㎝ x 20 ㎝)에 1 ㎕씩 로딩하여 2-프로파놀 : 에틸 아세테이트 : 증류수를 3：1：１로 포함하는 전개액상에서 전개시켰다. 전개 후, 플레이트는 건조하여 0.3 (w/v)% N-(1-나프틸)-에틸렌디아민과 5 (v/v)% 황산을 용해시킨 발색액에 담군 다음 110 ℃ 오븐에서 10분간 발색시켰다.

도 2는 알파-글루카노트랜스퍼라제를 말토올리고당에 반응시킨 후, 그 반응생성물의 박막크로마토그래피 분석결과를 나타낸 것이다. 도 2에서, 알파-글루카노트랜스퍼라제가 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헵사오스 또는 말토헵타오스와 반응하여 이들을 각각 디스프로포셔네이션시키므로써 긴 사슬의 직쇄상의 말토올리고당들이 각각 생성됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 알파-글루카노트랜스퍼라제는 말토올리고당을 성공적으로 디스프로포셔네이션 시킴을 알 수 있었다.

2-3. 알파-글루카노트랜스퍼라제의 열안정성

효소의 열안정성을 보기 위하여 열에 의한 불활성(thermal inactivation) 실험을 수행하였다.

0.25 % 아밀로스, 0.05 % 말토스, 50mM Tris-HCl(pH7.5)에 효소액을 첨가한 후, 온도와 시간별로 일부를 취하여 알파 글루카노트랜스퍼라제의 활성을 조사하였 다. 도 3은 알파-글루카노트랜스퍼라제의 열안정성을 측정한 그래프이다. 도 3에서, D-value(활성이 10분의 1로 줄어드는데 걸리는 시간)가 85 ℃, 90 ℃에서 각각 210분, 90분으로 확인되어, 알파-글루카노트랜스퍼라제는 고온에서 매우 안정함을 확인할 수 있었다.

상기한 효소의 열안정성은 전분의 공정 시 높은 온도에서도 적용이 가능하므로, 효소를 이용한 식품의 응용에 매우 유리하다.

실시예 3: 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 이용한 맞춤형 전분의 생성

알파-글루카노트랜스퍼라제 10 U 및 1 % 쌀 전분을 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0, 시그마)에 혼합한 후 75 ℃에서 12시간 반응시켰다. 반응 후 5분간 반응액을 끓임으로써 반응을 정지시켰다.

알파-글루카노트랜스퍼라제에 의해 변형된 쌀 전분의 사이드 체인의 길이를 확인하기 위해서, 반응액에 α-1,6 결합을 자르는 디브랜칭 효소(debranching enzyme)를 60 ℃에서 3시간 처리하였다. 반응 후, 5분간 끊임으로써 반응을 정지시켰다. 반응액은 원심분리하여 상등액만을 취하고, 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 반응액을 분석하였다.

도 4a는 쌀 전분의 사이드 체인을 분석한 이온 교환 크로마토그래피로 분석한 결과이고, 도 4b는 알파-글루카노트랜스러파제를 반응시킨 쌀 전분의 사이드 체인을 분석한 결과이다. 도 4a 및 4b에서, 쌀 전분의 사이드 체인의 길이가 알파-글루카노트랜스퍼라제 처리에 의하여 현저히 줄어듬을 확인할 수 있었다. 특히, DP10 이상의 긴 사이드 체인의 수는 줄어들고, DP10 이하의 짧은 사이드 체인의 수 는 증가되었다.

상기 실험으로, 알파-글루카노트랜스퍼라제에 의해 전분의 사이드 체인의 길이가 재구성된 ??춤형 전분을 생성할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 첨가한 가래떡의 제조

알파-글루카노트랜스퍼라제의 처리가 가래떡의 물성과 선호도에 미치는 영향을 알아보기 위해, 알파-글루카노트랜스퍼라제를 첨가한 가래떡을 최 (최차란, 박사학위 논문, 전남대학교, 2002)의 방법을 응용하여 제조하였다.

멥쌀을 수세하여 12시간 동안 수침한 후, 물기를 제거하고 롤러 밀(roller mill)로 2회 분쇄하므로써 쌀가루(수분함량 38.7%)를 제조하였다. 효소액을 준비하여 위하여, 20 ㎎의 효소가 함유된 효소 농축액(1 ㎎/㎖로 농축한 알파-글루카노트랜스퍼라제 20 ㎖)에 총 60 ㎖이 되도록 증류수를 더한 후, 3 g의 소금을 넣어 5 % 소금의 농도가 되도록 하였다. 이후 250 g의 쌀가루와 60 ㎖의 효소액을 고루 섞어 37 ℃에서 1시간 동안 방치한 후, 체에 내리고 물 3 L를 넣은 찜기에서 30분간 쪘다. 찐 반죽은 압출기로 3회 압출시켜 직경 1.5 ㎝의 가래떡을 얻었다.

실시예 5: 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 첨가하여 제조된 가래떡의 관능검사

알파-글루카노트랜스퍼라제를 처리한 가래떡을 처리하지 않은 대조구 가래떡과 함께 상온으로 식힌 후, 관능검사를 실시하였다.

관능검사는 가래떡의 특성에 대한 측정항목을 인지하도록 훈련시킨 12명의 대학원생들을 대상으로 실시되었으며, 측정항목은 가래떡의 외관 (색깔, 표면의 매 끄러운 정도), 향미 (쌀가루 특유의 냄새, 이취), 입 안에서의 느낌 (단단한 정도, 촉촉한 정도, 쫄깃한 정도, 치아에 달라붙는 정도), 전체적인 선호도 순으로 평가하도록 하였다. 검사 결과는 분산분석(ANOVA)을 이용하여 통계처리 하였다.

관능검사 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

특성	특성	대조구	효소처리구
외관	색깔 (노란: 1 ~ 15 :흰)	10.9 ± 1.2	10.4 ± 2.0
외관	표면의 매끄러운 정도 (거침: 1 ~ 15 :매끈함)	8.3 ± 1.5	5.9 ± 1.2
향미	쌀가루 특유의 냄새 (약함: 1 ~ 15 :강함)	3.8 ± 1.5	3.4 ± 0.9
향미	이취 (약함: 1 ~ 15 :강함)	2.5 ± 0.8	2.4 ± 0.7
입 안에서의 느낌	단단한 정도 (말랑말랑함: 1 ~ 15 :딱딱함)	3.9 ± 1.2	6.3 ± 2.1
	쫄깃한 정도 (풀어짐: 1 ~ 15 :쫄깃쫄깃함)	4.0 ± 0.9	7.5 ± 1.9
	촉촉한 정도 (마름: 1 ~ 15 :촉촉함)	11.8 ± 0.6	10.5 ± 0.4
	치아에 달라붙는 정도 (약함: 1 ~ 15 :강함)	5.1 ± 1.0	5.7 ± 1.7
전반적인 선호도	(나쁨: 1 ~ 15 :좋음)	7.7 ± 1.7	10.1 ± 1.3

상기 표 1에서, 알파-글루카노트랜스퍼라제를 처리한 가래떡이 처리하지 않은 대조구에 비해 쫄깃한 정도가 두드러지게 향상되었음을 알 수 있었다. 그 외 유의적인 결과로는, 효소를 처리한 가래떡이 대조구에 비해 다소 단단하였고 표면이 덜 매끄러웠다. 색깔은 효소 처리구가 대조구에 비해 유의한 차이를 보이지 않아 일반적으로 아밀라아제 효소 처리 시 환원당 생성으로 인한 갈변화 반응의 심화는 나타나지 않은 것으로 보여진다.

실시예 6: 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 첨가하여 제조된 가래떡의 노화정도 측정

알파-글루카노트랜스퍼라제의 처리가 가래떡의 노화에 미치는 영향을 알아보기 위해 실시예 4에서 제조한 알파-글루카노트랜스퍼라제가 첨가된 가래떡과 효소 가 첨가되지 않은 가래떡 대조구를 폴리에틸렌 봉지에 각각 넣어 4 ℃에서 저장하면서 5일과 8일에 시차주사열량계(Differential Scanning Calorimeter)로 노화 정도를 측정하였다.

약 10 ㎎의 시료를 알루미늄 용기에 넣고, 25 ℃부터 130 ℃까지 분당 5 ℃로 가열하면서 얻어지는 약 40 ℃부근의 흡열곡선의 면적을 단위 무게당 호화 열량으로 환산하여 노화 정도를 판단하였다.

도 5는 알파-글루카노트랜스퍼라제 처리구(??)와 무처리구(??)의 노화정도를 확인한 것으로, 대조구에 비해 알파-글루카노트랜스퍼라제를 처리한 가래떡에서 노화가 현저히 억제되었다.

실시예 7: 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 첨가하여 제조된 가래떡의 미세 조직 관찰

실시예 4에서와 같이 알파-글루카노트랜스퍼라제를 처리하여 제조한 가래떡의 미세 조직을 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰하였다.

도 6a는 알파-글루카노트랜스퍼라제를 무처리한 대조구 가래떡의 주사전자현미경 사진이고, 6b는 알파-글루카노트랜스퍼라제 처리한 가래똑의 주사전자현미경 사진이다. 도 6에서 보는 바와 같이, 대조구 가래떡에 비해 알파-글루카노트랜스퍼라제를 처리한 가래떡이 보다 작고 촘촘한 내부 공극을 보였으며, 보다 조밀한 망상구조를 나타내었다.

실시예 8: 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 첨가한 취반미의 제조

쌀밥을 제조하기 위하여 100 g의 쌀에 물을 쌀 부피의 1 : 1.3 의 비율이 되 도록 첨가하였다. 알파글루카노트랜스퍼라제가 처리된 밥에는 10 ㎎(1 ㎎/㎖로 농축한 알파-글루카노트랜스퍼라제 효소액 10 ㎖, 150U)의 알파글루카노트랜스퍼라제를 첨가하고, 이후 과정은 대조구와 동일시하였다. 실온에서 1시간 침지한 후, 취반/보온 겸용 전기보온밥솥(SJ-M032R, Samsung Electronics Co., Seoul)으로 취반하였다. 전기보온 밥솥의 취사 신호가 보온으로 바뀌는 순간으로부터 10분간 뜸들이기를 실시한 후, 밥솥 중심부의 밥만을 꺼내어 실온에서 1시간 방치 후에 분석에 이용하였다.

실시예 9: 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 첨가하여 제조된 취반미의 물성 분석

알파-글루카노트랜스퍼라제의 처리가 취반미의 물성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 물성분석기 (Texture Analyzer, TA-XT2i)를 이용하여 밥알의 단단한 정도(hardness)와 표면의 끈적거림 정도(Stickiness)를 측정하였다.

실시예 8에서 제조한 시료 중 5개의 밥 알갱이를 집어내어 물성분석기 위에 적당한 간격으로 올려놓고 35 ㎜ 원통형 프로브를 사용하여 분당 0.5 ㎜, 50 % 스트레인으로 세팅하여 분당 10 ㎜의 속도로 떼어내어, 누를 때의 힘(g)과 떼어낼 때의 힘(g)을 측정함으로써 밥알의 단단한 정도와 끈적거림 정도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

특성	Strain	대조구 취반미	효소를 처리한 취반미
단단함(Hardness)	90%	3,463 g ± 253	4,086 g ± 541
단단함(Hardness)	50%	854 g ± 55	793 g ± 68
끈적거림(Stickiness)	90%	1,155 g ± 134	985 g ± 79
끈적거림(Stickiness)	50%	173 g ± 29	100 g ± 15

표 2에서, 알파-글루카노트랜스퍼라제를 처리한 밥 알갱이와 처리하지 않은 밥 알갱이는 비슷한 단단한 정도를 나타내어 효소 처리에 의한 물러짐은 없는 것으로 나타났으며, 표면의 끈적거림은 덜 한 것으로 나타났다.

실시예 10: 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 첨가하여 제조된 취반미의 노화정도 측정

알파-글루카노트랜스퍼라제가 취반미의 노화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위해 실시예 8에서와 같이 효소를 처리하여 밥을 짓고 대조구와 함께 4 ℃에서 저장 중 4일과 8일째 노화 정도를 실시예 6에서와 같은 방법으로 측정하였다.

도 7은 알파-글루카노트랜스퍼라제 처리구와 무처리구의 노화정도를 확인한 것으로, 대조구에 비해 알파-글루카노트랜스퍼라제를 처리한 취반미에서 노화가 현저히 억제되었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제공한 고온성 균주로부터 분리한 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제는 식품내 전분의 구조를 재구성하고, 식품이 저장성을 향상시키며, 또한 식품의 물성 및 기호성을 현저히 개선시키는 용도로 사용가능하다.

<110> PARK, Kwan-Hwa <120> NOVEL THERMOSTABLE alpha-GLUCANOTRANSFERASE AND USE THEREOF <130> dpp20033768kr <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nde-TSaGT primer <400> 1 gggtaaactg ggcatatgga gcttccg 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSaGT-Hd primer <400> 2 cccttaagct tcccaccctg gccg 24 <210> 3 <211> 1503 <212> DNA <213> Thermus scotoductus <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <223> alpha-glucanotransferase <400> 3 atg gag ctt ccg cgc gcc tat ggc ctg ctt ctg cac ccc acc agc ctt 48 Met Glu Leu Pro Arg Ala Tyr Gly Leu Leu Leu His Pro Thr Ser Leu 1 5 10 15 ccc gga ccc tat ggg gtt ggc gtt nna aaa nag gag gct ttt gcc ttc 96 Pro Gly Pro Tyr Gly Val Gly Val Xaa Lys Xaa Glu Ala Phe Ala Phe 20 25 30 ctc cga ttc ctg ggg gag tct ggg gcc cgc tac tgg cag gtt ttg ccc 144 Leu Arg Phe Leu Gly Glu Ser Gly Ala Arg Tyr Trp Gln Val Leu Pro 35 40 45 tta ggg ccc aca gga tac gga gac tcc ccc tac cag tcc ttc agc gcc 192 Leu Gly Pro Thr Gly Tyr Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Ser Ala 50 55 60 ttt gcc ggg aac ccc tac ctc atc gac ctc cgc cta agg cgg agg cgg 240 Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Ile Asp Leu Arg Leu Arg Arg Arg Arg 65 70 75 80 ggg tac ctc cgc ctc gag gac ccc ggt ttt ccc gag ggc cgg gtg gta 288 Gly Tyr Leu Arg Leu Glu Asp Pro Gly Phe Pro Glu Gly Arg Val Val 85 90 95 tac ggc tgg ctc tac gcc tgg aaa tgg ccg gcg ctt agg gaa gcc ttc 336 Tyr Gly Trp Leu Tyr Ala Trp Lys Trp Pro Ala Leu Arg Glu Ala Phe 100 105 110 cgg ggt ttc cag gag cgg gct agc cgg gag gaa aag gag gcc ttt cag 384 Arg Gly Phe Gln Glu Arg Ala Ser Arg Glu Glu Lys Glu Ala Phe Gln 115 120 125 cct ttt ggg acc cgg gaa agg agc tgg ttg gat gac tac acc ctc ttc 432 Pro Phe Gly Thr Arg Glu Arg Ser Trp Leu Asp Asp Tyr Thr Leu Phe 130 135 140 atg gcc ttg aag ccc acc cac gga ggc ctt cct tgg aac cgc tgg ccc 480 Met Ala Leu Lys Pro Thr His Gly Gly Leu Pro Trp Asn Arg Trp Pro 145 150 155 160 atg ccc cta cgc ctg agg gag gaa aag gct tta agg gaa gca tct ttg 528 Met Pro Leu Arg Leu Arg Glu Glu Lys Ala Leu Arg Glu Ala Ser Leu 165 170 175 gcc ctc tcc caa gag gtg gcc ttc cac gcc tgg acc cag tgg ttt ttc 576 Ala Leu Ser Gln Glu Val Ala Phe His Ala Trp Thr Gln Trp Phe Phe 180 185 190 ttc cgg cag tgg cag gcc ttg agg gag gcg gcg gag gcc ttg ggc ctc 624 Phe Arg Gln Trp Gln Ala Leu Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Leu 195 200 205 tcc ttg atc ggc gac atg ccc atc ttc gtg gcc gag gac tcc gcg gag 672 Ser Leu Ile Gly Asp Met Pro Ile Phe Val Ala Glu Asp Ser Ala Glu 210 215 220 gtc tgg gcc cac ccc gag tgg ttc cac ctg gat gag gag gga agg ccc 720 Val Trp Ala His Pro Glu Trp Phe His Leu Asp Glu Glu Gly Arg Pro 225 230 235 240 acg gtg gtg gcg ggg gtg ccg ccg gat tac ttt tcg gaa acg ggc cag 768 Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe Ser Glu Thr Gly Gln 245 250 255 cgc tgg ggg aat ccc ctg tac cgc tgg gag gtg ctg gaa agg gag ggg 816 Arg Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Glu Val Leu Glu Arg Glu Gly 260 265 270 ttc tcc ttc tgg ata gag cgc ctg agg aag gcc ttg gag ctt ttc cac 864 Phe Ser Phe Trp Ile Glu Arg Leu Arg Lys Ala Leu Glu Leu Phe His 275 280 285 ctg gtg cgc atc gac cac ttc cgg ggc ttt gaa gcc tac tgg gag atc 912 Leu Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp Glu Ile 290 295 300 cct gcc tcc tgc ccc acg gca gtg gag gga cgc tgg gtg aag gcc ccg 960 Pro Ala Ser Cys Pro Thr Ala Val Glu Gly Arg Trp Val Lys Ala Pro 305 310 315 320 ggg gag aag ctc ttt cag aag att cag gaa acc ttt ggc cgg gtg ccc 1008 Gly Glu Lys Leu Phe Gln Lys Ile Gln Glu Thr Phe Gly Arg Val Pro 325 330 335 atc ctg gcg gag gac ctg ggg gtg atc acc ccc gag gtg gag gcc ctg 1056 Ile Leu Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr Pro Glu Val Glu Ala Leu 340 345 350 agg gac cgg ttt ggc ctt ccg ggg atg aag gtc ctg cag ttc gcc ttt 1104 Arg Asp Arg Phe Gly Leu Pro Gly Met Lys Val Leu Gln Phe Ala Phe 355 360 365 gac ggg ggg atg gaa aac ccc ttc ctg ccc cac aac tac ccc tcc cac 1152 Asp Gly Gly Met Glu Asn Pro Phe Leu Pro His Asn Tyr Pro Ser His 370 375 380 ggc cgg gtg gtg gtc tac acc ggc acc 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Arg Gln Trp Gln Ala Leu Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Leu 195 200 205 Ser Leu Ile Gly Asp Met Pro Ile Phe Val Ala Glu Asp Ser Ala Glu 210 215 220 Val Trp Ala His Pro Glu Trp Phe His Leu Asp Glu Glu Gly Arg Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe Ser Glu Thr Gly Gln 245 250 255 Arg Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Glu Val Leu Glu Arg Glu Gly 260 265 270 Phe Ser Phe Trp Ile Glu Arg Leu Arg Lys Ala Leu Glu Leu Phe His 275 280 285 Leu Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp Glu Ile 290 295 300 Pro Ala Ser Cys Pro Thr Ala Val Glu Gly Arg Trp Val Lys Ala Pro 305 310 315 320 Gly Glu Lys Leu Phe Gln Lys Ile Gln Glu Thr Phe Gly Arg Val Pro 325 330 335 Ile Leu Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr Pro Glu Val Glu Ala Leu 340 345 350 Arg Asp Arg Phe Gly Leu Pro Gly Met Lys Val Leu Gln Phe Ala Phe 355 360 365 Asp Gly Gly Met Glu Asn Pro Phe Leu Pro His Asn Tyr Pro Ser His 370 375 380 Gly Arg Val Val Val Tyr Thr Gly Thr His Asp Asn Asp Thr Thr Leu 385 390 395 400 Gly 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Claims

서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드로 이루어진 내열성-알파 글루카노트랜스퍼라제.
제 1항의 펩타이드를 암호하는 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
제 2항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 3으로 기재된 서열인 것인 폴리뉴클레오티드.
제 2항의 폴리뉴클레오티드를 발현가능하도록 포함하는 벡터.
제 4항의 벡터로 형질전환된 세포주.
제 5항에 있어서, 상기 세포주는 E.coli, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포주.
제 5항 또는 6항에 따른 세포주로부터 생산되는 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제.
청구항 1항의 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제를 전분, 전분이 함유된 곡물 또는 식품에 가하여 반응시키는 것을 포함하는 알파-글루카노트랜스퍼라제가 처리된 가공식품 제조방법으로서,

상기 전분이 함유된 곡물은 쌀, 밀, 감자, 옥수수 및 콩으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고, 상기 내열성 알파-글루카노트랜스퍼라제는 150 내지 200 U으로 가해지며, 상기 반응은 75 내지 80℃에서 실시되는 것인 알파-글루카노트랜스퍼라제가 처리된 가공식품 제조방법.
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제 8항에 의하여 만들어지며 알파-글루카노트랜스퍼라제 150 내지 200 U로 처리된 내열성 곡물 가공식품.