KR100635385B1

KR100635385B1 - 프라이온-프리 골 이식 대체재의 제조방법

Info

Publication number: KR100635385B1
Application number: KR1020050021297A
Authority: KR
Inventors: 이상훈; 정종평; 박윤정
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2005-03-15
Filing date: 2005-03-15
Publication date: 2006-10-17
Also published as: KR20060099819A

Abstract

본 발명은 소뼈를 이용한 골 이식 대체재의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 소뼈를 차아염소산 나트륨과 600℃이상의 고온으로 처리하는 것을 특징으로 하는 광우병 감염위험이 없는 안전한 골 이식 대체재를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 사람의 뼈와 그 구조가 매우 유사한 소의 뼈에서 지방질과 유기질을 효과적으로 제거하여 인체에 이식하였을 때 면역반응을 일으키지 않고, 골전도성이 우수하며, 프라이온을 제거하여 광우병 감염위험이 없는 골 이식 대체재를 간단한 방법으로 제조할 수 있다.

골 이식 대체재, 소뼈, 차아염소산 나트륨, 광우병, 프라이온

Description

프라이온-프리 골 이식 대체재의 제조방법{Method for Preparing a Prion-free Bone Grafting Substitute}

도 1은 600도에서 열처리 후 뼈 분말의 주사전자현미경 사진이다.

도 2는 600도에서 열처리 후 뼈 분말의 XRD 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 600도에서 열처리 후 뼈 분말의 FT-IR 측정결과를 나타낸 것이다.

도 4는 실시예 1에서 제조된 뼈 분말과 Bio-Oss^(R), 및 OsteoGraf^(R))/N을 뉴질랜드산 백색 가토의 원형결손부에 이식한 후 2주째의 조직시편 사진이다.

도 5는 실시예 1에서 제조된 뼈 분말과 Bio-Oss^(R), 및 OsteoGraf^(R)/N을 뉴질랜드산 백색 가토의 원형결손부에 이식한 후 4주째의 조직시편 사진이다.

골 이식 대체재(Bone grafting substitute, BGS)란 여러 가지 치과질환 또는 외상, 질병에 의한 퇴화 또는 기타 조직의 손실로 인하여 뼈 조직의 결손부가 생긴 경우, 이를 대체하여 뼈 조직 내의 공간을 충진 시키고 신생골의 형성을 촉진시키기 위하여 사용하는 이식재를 말한다. 일반적으로 가장 좋은 이식물은 본인의 뼈 중 다른 부위를 떼어내어서 이식하는 자가골로 알려져 있으나, 이차적인 수술이 필요하고, 필요한 만큼의 양을 얻기가 힘들며, 일반 개인의원에서 시행하기가 힘들고, 환자의 통증 및 병적 상태가 심각해질 가능성이 있는 단점을 가지고 있다.

따라서 기증된 사람의 뼈나 인공적인 뼈, 뼈의 성분인 하이드록시 아파타이트로 구성된 인공적인 합성물 등 여러 가지 대체물을 이용하여 이식하는데 사용하여왔다. 상업적으로 사용되는 골 이식 대체재들은 분말, 겔, 슬러리/퍼티(putty), 정제, 칩, 모르슬(morsel) 및 펠렛, 스틱, 쉬트(sheet) 및 블록(block)과 같은 몇 가지 형태로 입수가 가능한 장점이 있으며, 균질성을 가지고, 감염 및 질병에 대한 위험이 적고, 이식을 위하여 환자의 뼈를 채취하는 데서 생기는 통증 및 병증이 없으며, 크기의 제한이 적은 장점이 있으나, 사람의 뼈가 가진 물리적 구조와는 많은 차이가 있어, 조직의 재생 속도가 느린 점 등의 여러 가지 단점을 가지고 있었다.

이러한 단점을 해결하고자 사람의 뼈와 비슷한 구조를 가진 동물의 뼈에 물리화학적인 처리를 수행하여 유기물질을 제거하고, 뼈를 구성하는 무기성분만을 얻어내어 이를 치과나 정형외과적인 수술에 사용할 수 있게 제조하여 사용하고 있으 며, 대표적인 상품으로 바이오메트리얼즈 가이스트리히 사의 바이오오스(Bio-Oss^(R))를 들 수 있다.

상기 동물의 뼈를 이용하여 골 이식재를 제조하는 방법은 소과 동물의 대퇴부의 골을 80℃ 내지 120℃의 끓는점을 가지는 용매를 가하여 지방질을 제거한 후, 암모니아 또는 1차 아민을 가하여 단백질 및 유기질을 제거시켜 골 미네랄을 제조한 후, 이를 250~600℃의 고온에서 수 시간 동안 가열하여 건조시키는 단계로 구성되어 있다 (미국특허 5,167,961, 미국특허 5,417,975).

연골에 차아염소산 나트륨을 처리하여 콜라겐 상을 선택적으로 제거하는 데 사용하여, 잔여 연골 구조를 관찰하기 위하여 사용한 예는 있으나(Broz, J. J, et al., J. Mater. Sci. Mater. Med., 8:395, 1997), 골 미네랄을 제조하는데 있어서 모든 단백질을 제거하는데 차아염소산 나트륨을 사용한 예는 아직 보고된 바 없다.

이러한 동물의 뼈 중 가장 많이 사용되고 있는 것은 소의 뼈로서, 상기 바이오오스제품 또한 소의 뼈를 원료로 하여 생산되고 있다. 그러나 최근 광우병의 발병이 빈번해 지면서, 원료가 되는 소가 광우병으로부터 안전하다는 보장이 없어, 소뼈를 골 이식재로 가공하는 단계에서 광우병의 원인이 되는 프라이온을 제거하여야 한다. 프라이온은 600℃의 고온에서도 완전하게 제거되지 않기 때문에, 지금까지의 제조방법으로는 제거할 수 없어 새로운 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 소뼈를 이용하여 골 이식 대체재를 제조하는 공정에서 프라이온을 불활성화 시킬 수 있는 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite)을 사용하여 프라이온 단백질을 불활성화 시키고, 600℃의 고온으로 가열하는 단계를 포함시키는 것으로 광우병으로부터 안전한 골 이식 대체재를 제조하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 소뼈를 차아염소산 나트륨 용액과 고온으로 처리를 하는 것을 특징으로 하며 광우병을 유발하는 프라이온 단백질을 완전히 제거한 골 이식 대체재를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기방법으로 제조된 골 이식 대체재를 함유하는 골 이식 대체용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 혈액성분이 제거된 소뼈를 탈이온수에서 끓여 지방질과 단백질을 1차 제거하고 건조시키는 단계; (b) 상기 건조된 뼈를 분쇄하고, 분쇄된 뼈 분말을 휘발성 극성 유기용매에 침적시켜 진탕하는 단계; (c) 상기 유기용매를 제거하고 건조시키는 단계; (d) 상기 용매가 제거된 뼈 분말을 2~20% 농도의 차아염소산 나트륨 용액으로 처리하는 단계; (e) 상기 뼈 분말에서 차아염소산 나트륨 용액을 제거하고, 수득된 뼈 분말을 건조시키는 단계; 및 (f) 상기 건조된 뼈 분말을 600~1000℃에서 1~6시간 열처리하여 지질과 단백질을 완전히 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 소뼈로부터의 골 이식 대체재의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 뼈 분말을 유기용매에 침적시키는 단계는 소뼈 분말에 존재하는 잔여 지방질을 제거하는 단계로서, 상기 유기용매는 클로로포름/메탄올 혼합용매인 것을 특징으로 할 수 있고, 사용하는 혼합용매의 클로로포름:메탄올 비율은 2~8:8~2일 수 있으며, 1:1인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 차아염소산 나트륨 용액으로 처리하는 단계는 소뼈 분말의 잔여 단백질을 제거시키고, 광우병을 유발하는 프라이온을 불활성화 시키는 단계로서, 사용하는 차아염소산 나트륨은 2~20%(w/v) 농도의 용액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 4%(w/v) 농도의 차아염소산 나트륨 용액을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 프라이온 불활성화 효율을 높이기 위하여 차아염소산 나트륨 용액에 1~10N의 가성소다(sodium hydroxide)를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있고, 가성소다의 농도는 2N인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계 이후에 상기 열처리된 뼈 분말을 212~425 ㎛크기의 체로 거르는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기의 방법으로 제조된 골 이식 대체재를 함유하는 골 이식 대체용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 골 이식 대체용 조성물은 골 성장을 촉진하는 성장인자, 피브린, 골 형태 형성인자, 골성장제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비스포스포네이 트, 스트론툼염, 불소염, 마그네슘염 및 나트륨 염으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 생물학적 활성물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴 황산, 알긴산, 키토산, 콜라겐, 수산화인회석, 탄산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘 및 세라믹으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화학적 화합물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 화학적 화합물이 히알루론산인 것을 특징으로 하는 젤 타입의 골 이식 대체용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 차아염소산 나트륨을 처리하는 단계에서 처리시간은 프라이온을 불활성화 시키기 위하여 20분 이상의 처리가 필수적이며, 잔여 단백질을 제거하기 위하여 72시간 이상 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 "골 이식 대체재(bone grafting substitute)"는 골 조직 내의 공간을 충진하기 위한 물질이며, 골 이식 대체재는 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박, 굳힘 등의 방법을 사용하여, 퍼티, 페이스트, 주형 가능한 스트립, 블록, 칩 등의 형태로 성형하여 사용할 수 있고, 화학적 첨가물을 이용하여 겔, 과립, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형하여 사용할 수 있으며, 분말 형태 그대로 사용하는 것도 가능하다.

상기와 같이 골 이식 대체재를 제형하여 사용할 경우에는 생물학적 활성물질을 첨가하여 사용하는 것이 바람직하며, 상기 생물학적 활성물질로, 골 성장을 촉진하는 성장인자, 피브린, 골 형태 형성인자, 골성장제, 화학요법제, 항생제, 진통 제, 비스포스포네이트, 스트론툼염, 불소염, 마그네슘염 및 나트륨 염 등을 사용할 수 있다.

상기 성장인자로는 BMP(bone morphogenic protein), PDGF(Platelet-derived growth factor), TGF-beta(Transgenic growth factor), IGF-I(Insulin-like growth factor), IGF-II, FGF(Fibroblast growth factor) 및 BGDF-II(beta-2-microglobulin) 등을 사용할 수 있다. 상기 골형태 형성인자로는 오스테오칼신(osteocalcin), 본사이알로프로테인(bonesialo protein), 오스테오제닌(osteogenin), BMP 등을 사용할 수 있다. 상기 골 성장제는 인체에 무해하고 골 성장을 촉진하는 물질이라면 제한 없이 사용이 가능하며, 골 형성을 증진시키는 펩타이드나 핵산, 골 형성을 억제하는 물질의 길항제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 골 이식 대체재를 제형하는데 사용되는 화학적 첨가물은 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴 황산, 알긴산, 키토산, 콜라겐, 수산화인회석, 탄산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 세라믹 등이 있으며, 상기 첨가물의 종류에 따라 겔, 스트립, 과립, 칩, 펠렛, 정제, 페이스트 등의 형태로 제형이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 골 이식 대체재의 제조방법

[전처리 및 분쇄공정]

소의 대퇴부 부위에서 취득한 뼈를 골절단기를 이용하여 약 5cm³ 크기로 절단하였다. 상기 절단된 뼈 조각을 탈이온수에서 24시간 동안 침적하여 뼈에 존재하는 혈액 성분을 제거하였다. 상기 탈 이온수로 세척된 뼈 조각을 12시간마다 탈이온수를 교환하며 72시간 동안 끓여, 뼈에 존재하는 지방질과 단백질을 1차적으로 제거하였다. 상기 1차적으로 지방질과 단백질이 제거된 뼈 조각을 60℃의 오븐에서 24시간 동안 완전히 건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 0.7mm 이하의 크기가 되도록 분쇄하였다.

[탈지처리 공정]

분쇄된 뼈 분말 1g당 20ml의 클로로포름과 메탄올이 1:1 부피비로 혼합된 용매를 첨가하고 120rpm의 회전 속도로 24시간 동안 진탕하여 탈지처리를 수행하였다. 탈지처리가 완료된 뼈 분말 중 잔존하는 용매를 제거하기 위하여 뼈 분말 1g 당 50g의 비율로 탈이온수를 첨가한 후 120rpm으로 12시간 동안 진탕하여 분말에 잔존하는 용매를 제거하였다. 이때, 매 2시간 마다 새로운 탈이온수로 교환하여 수세효율을 높였다. 수세가 완료된 뼈 분말은 60℃의 오븐에서 완전히 건조시켰다.

[탈단백 처리공정]

탈지 처리가 완료된 건조 뼈 분말 1g당 25ml의 4%(w/v) 농도의 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 첨가하고 120rpm의 회전속도로 24시간 동안 진탕하여 뼈 분말 중에 존재하는 단백질을 제거하고, 광우병을 유발하는 프라이온 프로테인을 불활성화 시켰다. 탈단백 처리가 완료된 뼈 분말에 잔존하는 용매를 제거하기 위하여 뼈 분말 1g 당 50g의 탈이온수를 첨가하고 120rpm에서 72시간동안 진탕하여 잔존하는 차아염소산 나트륨을 제거하였다. 이때, 처음 12시간 동안은 매 2시간 마다 새로운 탈이온수로 교환하여 주었으며, 그 후에는 매 12시간 마다 새로운 탈이온수로 교환하였다. 수세가 완료된 뼈 분말은 60℃의 오븐에서 완전히 건조시켰다.

[열처리 공정]

탈지와 탈단백 처리가 완료된 건조 뼈 분말은 고온 열처리하여 잔존하는 지질과 단백질을 제거하였다. 열처리에 사용되는 전기로는 분당 2도로 승온시켰으며, 뼈 분말은 600℃에서 3시간 동안 열처리시킨 후 노냉시켰다.

[체가름 공정]

열처리가 완료된 뼈 분말은 215~425㎛ 크기의 체를 사용하여 거르고, 걸러진 뼈 분말을 탈이온수로 수차례 수세하여 표면에 잔존하는 미세 분진들을 제거한 후 60℃ 오븐에서 24시간 건조하고 수득하여 골 이식 대체재로 사용하였다.

상기 공정을 거친 뼈분말을 주사전자현미경을 통해 분석한 결과, 50~80nm 크기의 하이드록시 아파타이트 입자들이 관찰되었다 (도 1). 또한, XRD를 수행한 결 과 본 발명의 뼈 분말은 순수한 저결정성 아파타이트 상이 생성되었음을 확인할 수 있었으며, 사람뼈와 유사하게 탄산기를 포함하는 저결정성 탄산 아파타이트임을 FT-IR 분석 결과로 확인하였다 (도 2 및 도 3).

실시예 2: 골 이식 대체용 조성물의 제조방법

탈염수 100g에 대해 히아루론산 20g을 첨가하여 점도가 있는 히아루론산 용액을 제조하고 이 용액에 실시예 1에서 제조된 뼈 분말 10g을 첨가하여 혼합페이스트를 제조, 주사형 페이스트를 완성하였다.

실시예 3: 골이식 대체재의 골전도성 평가

본 발명의 골이식 대체재의 골전도성을 확인하기 위하여, 실시예 1의 방법으로 제조한 골 대체재와 대조군으로서 기존 시판 중인 골 대체재인 Bio-Oss^(R) 및 OsteoGraf^(R)/N을 사용하여 골 전도성 평가를 수행하였다. 본 실시예에서는 뉴질랜드산 백색 가토를 사용하였으며 두개골에 지름 8 mm의 원형결손을 만든 후 본 발명의 골 대체재, Bio-Oss^(R) 및 OsteoGraf^(R)/N과립을 각각 임플란트 한 후 2주 및 4주 경과 후 조직시편을 제조하여 골 대체재 주위에 생성된 뼈의 양과 결체조직의 생성 유무로 골 전도성을 비교분석하였다.

그 결과, 상기 세 가지 골 대체재를 이식한 후 2주 경과한 조직시편에서, Bio-Oss^(R)와 OsteoGraf^(R)/N을 이식한 주위에는 대부분 결체조직들 만이 생성되었으며, 신생골의 형성은 거의 관찰되지 않았다 (도 4). 반면 실시예 1에서 제조된 골 대체재를 이식한 시편은 도 4의 (c)에서 나타난 바와 같이 많은 양의 신생골이 생성되었음을 확인할 수 있었다 (도 4(c)의 화살표).

도 5는 상기 세 가지 골 대체재를 이식한 후 4주 경과 시의 조직시편 사진으로서 Bio-Oss^(R)와 OsteoGraf^(R)/N를 사용한 조직시편에서는 아주 적은 양의 신생골이 발생하였고, 대부분은 결체조직이 이들을 둘러싸고 있는 반면, 실시예 1에서 제조된 골 대체재를 사용한 조직시편의 경우는 골 대체재 주위에 많은 양의 신생골이 생성·성장한 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 본 발명의 방법으로 제조된 골 대체재가 기존의 골 대체재에 비하여 탁월하게 우수한 골 전도성을 갖는 것으로 판단되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 소뼈에 차아염소산 나트륨 용액과 고온 처리를 하는 것을 특징으로 하는 프라이온-프리 골 이식 대체재를 제조하는 방법 및 상기 골 이식 대체재를 함유하는 조성물을 제공하는 효과가 있다.

Claims

하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 소뼈로부터의 골 이식 대체재의 제조방법:

(a) 혈액성분이 제거된 소뼈를 탈이온수에서 끓여 지방질과 단백질을 1차 제거하고 건조시키는 단계;

(b) 상기 건조된 뼈를 분쇄하고, 분쇄된 뼈 분말을 휘발성 극성 유기용매에 침적시켜 진탕하는 단계;

(c) 상기 유기용매를 제거하고 건조시키는 단계;

(d) 상기 용매가 제거된 뼈 분말을 2~20% 농도의 차아염소산 나트륨 용액으로 처리하는 단계;

(e) 상기 뼈 분말에서 차아염소산 나트륨 용액을 제거하고, 수득된 뼈 분말을 건조시키는 단계; 및

(f) 상기 건조된 뼈 분말을 600~1000℃에서 1~6시간 열처리하여 지질과 단백질을 완전히 제거하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 유기용매는 클로로포름/메탄올 혼합용매인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 차아염소산 나트륨 용액의 농도는 4%(w/v)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (d) 단계는 차아염소산 나트륨 용액에 1~10N의 가성소다(sodium hydroxide)를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 가성소다의 농도는 2N인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (f) 단계 이후에 상기 열처리된 뼈 분말을 212~425㎛크기의 체로 거르는 단계와 수세 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 골 이식 대체재를 함유하는 골 이식 대체용 조성물.
제7항에 있어서, 골 성장을 촉진하는 성장인자, 피브린, 골 형태 형성인자, 골성장제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비스포스포네이트, 스트론툼염, 불소염, 마그네슘염 및 나트륨 염으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 생물학적 활성물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 골 이식 대체용 조성물.
제7항에 있어서, 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴 황산, 알긴산, 키토산, 콜라겐, 수산화인회석, 탄산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘 및 세라믹으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화학적 화합물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 골 이식 대체용 조성물.
제9항에 있어서, 화학적 화합물이 히알루론산인 것을 특징으로 하는 젤 타입의 골 이식 대체용 조성물.