KR100602948B1

KR100602948B1 - 키틴올리고당 및 키토산올리고당을 이용한 엘오엑스-1유전자의 발현억제물질

Info

Publication number: KR100602948B1
Application number: KR1020040030361A
Authority: KR
Inventors: 오천금; 강영희; 박승림
Original assignee: 학교법인 한림대학교; 주식회사 건풍바이오
Priority date: 2004-04-30
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2006-11-23
Also published as: KR20050104910A

Abstract

본 발명은 키틴올리고당 및 키토산올리고당을 이용한 LOX-1 유전자의 발현억제물질에 관한 것이다.

본 발명의 키틴올리고당은 키틴을 화학적 방법 또는 효소를 이용한 방법으로 분해하여 제조되거나, 키토산올리고당을 아세틸화하여 제조되며, 키토산올리고당은 키토산을 화학적 방법 또는 효소를 이용한 방법으로 분해하여 제조되거나, 키틴올리고당을 탈아세틸화하여 제조되며, 분자량이 200 ~ 3,000 이며, 중합도가 2 ~ 15이며, LOX-1 유전자의 발현을 억제시킨다.

본 발명에 의해, 키틴올리고당 및 키토산올리고당을 이용한 LOX-1 유전자 발현 억제물질이 제공된다.

LOX-1, 유전자, 발현억제, 키토산올리고당, 키틴올리고당, 항산화

Description

키틴올리고당 및 키토산올리고당을 이용한 엘오엑스-1 유전자의 발현억제물질{LOX-1 GENE EXPRESSION INHIBITORY MATTERIAL USING THE CHITIN AND CHITOSAN OLIGOSACCHARIDE}

도 1은 키틴올리고당 및 키토산올리고당의 제조방법을 도식화한 그림.

도 2는 LOX-1 유전자 발현억제효과를 나타내는 전기영동사진.

A : oxLDL의 농도 및 시간별 변화를 측정한 결과

B : 키틴올리고당 및 키토산올리고당에 대한 oxLDL에 의한 LOX-1의 발현결과

최근 우리의 식생활이 고칼로리, 고단백질화 되면서 비만과 고지혈증 (hypercholesterol)은 많은 질환을 초래하고 있다. 특히 과도한 콜레스테롤 (cholesterol) 섭취 및 인체내 합성은 고지혈증, 동맥경화, 당뇨(Diabetes), 심근경색, 뇌혈전증과 심장 순환계 질환이 수반된다고 보고되고 있다(Giuseppe G et al 2003; Hodgin J and Maeda, 2002).

그리고, 유년기의 비만 등은 사회문제로 부각되면서 다이어트, 또는 보조식품 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이런 질환은 혈청 콜레스테롤 과잉과 중성지방의 증가는 이들 질환을 악화시키는 주 요인으로 밝혀지고 있다.

따라서, 이런 질환을 사전에 예방하는 노력이 의학과 약학 그리고 기능성식품을 이용하여 극복하고자 하는 노력이 진행중이다. 기능성 식품 및 재료를 개발하고자 하는 연구는 자연적 생성물(nature product)을 중심으로 많은 연구결과 및 식품이 개발되고 있다.

이런 자연적 생성물은 인체에서의 원활한 대사와 인체에 전혀 해가 없다는 장점을 가지고 있다. 최근에 많은 자연 산물 중에 키토산(chitosan) 유도체는 그 대표적 물질에 하나이다.

키틴(chitin)과 그 유도체들로는 키토산(chitosan), 키틴올리고당 (chitinoligosacharides), 키토산올리고당(chitooligosaccharide)으로서 대부분 다당류와 매우 흡사한 화학구조를 가지고 있어서 의학, 약학, 생화학, 폐수처리, 농업 등 다양한 분야에서 신소재로 이용되고 있다.

또한, 키틴과 키토산은 세포활성화, 면역력 강화, 항균작용, 중금속 체외배출 등의 다양한 생리작용을 발휘하는 것으로 보고되고 있으며, 혈압조절작용, 콜레스테롤 저하작용 등의 혈관성 조절기능도 가진다고 알려져 있다.

특히, 키토산과 그 유도체들이 항산화 활성을 가진다는 것이 밝혀지면서 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, 산화된 저밀도지단백(oxidated low density lipoprotein ; oxLDL)은 초기 죽상경화과정(atherogenesis)의 중요한 작용요인으로써, 혈관내피세포 (vascular endothelial cells), 혈관 평활근세포(vascular smooth muscle cells) 및 대식세포(macrophages)에 의하여 산화되어 대식세포를 지질로 침착된 포말세포(foam cells)로 변화시키고, 죽상경화성 병변(atherosclerotic lesions)을 초래한다고 알려져 있다.

최근에는, 동맥경화 초기 작용기작에 있어서 저밀도지단백(LDL)의 산화가 주요인으로 작용하고 있다는 생화학적 근거에 바탕을 두어 비타민 씨(vitamin C), 비타민 이(vitamin E), 베타-카로틴(β-carotene) 등 여러 종류의 항산화제들이 동맥경화 예방 및 억제물질로 제안되어 왔다.

이들 항산화제들은 유리라디칼의 형성에 관여하는 유리금속 이온과 결합하여 유리라디칼의 생성을 억제시켜 지단백의 산화를 억제시키고, 산화 저밀도지단백 (oxLDL)의 생성속도를 저하시켜 동맥경화의 섬유반 증식을 억제시킨다고 알려져 있다.

한국공개특허공보 특2002-0066118(키토산올리고당 착화합물과 생약 추출물을 함유하는 다기능성 천연항균제)에는, 중합도가 6 이상이며 분자량이 2,000 ~ 100,000인 항균력이 높은 키토산 분해물 즉 키토산올리고당에 항균력을 올리기 위해 유산균, 구연산, 비타민 씨, 사과산 등의 유기산을 첨가하고, 항산화력을 올리기 위해 망간염 및 아연염을 처가해서 착체를 현성시키고, 황금을 비롯한 생약추출물을 첨가하여 높은 항산화력을 가지며, 항균력이 높고 항균스펙트럼이 광범위한 다기능성 천연항균제에 관한 것이 공개되어 있다.

한국공개특허공보 특2000-0045197(키토산올리고당과 아스타잔틴이 혼합된 건강영양 조성물)에는, 키토올리고당 30 ~ 50 중량%와 아스타잔틴 0.5 ~ 1 중량%를 함유함으로서 동맥경화예방에 효과적인 건강영양 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 상기의 발명과 같이 종래에는 키토산 유도체를 이용하여 저밀도지단백의 산화를 억제시키는 데 이용하기도 하였으나, 이미 산화된 저밀도지단백(oxLDL)에서 산화 LDL(oxLDL)의 수용체인 LOX-1 유전자의 발현을 억제시켜 동맥경화를 예방하고 혈관을 보호할 수 있는 물질에 대한 연구가 없었다.

한편, 본 발명은 본 발명의 출원인이 선출원한 특허출원 10-2004-0016764(키틴올리고당 및 키토산올리고당을 이용한 피피에이알 유전자의 발현억제물질)의 개량발명이다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위해, 키틴올리고당 및 키토산올리고당을 이용한 LOX-1 유전자 발현억제물질을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 키틴올리고당 및 키토산올리고당을 이용한 LOX-1 유전자 발현 억제물질에 관한 것이다.

키틴과 키토산이 증류수에 불용성인 반면, 본 발명에서 이용하는 키틴올리고당과 키토산올리고당은 가용성이다.

키틴올리고당은 게, 새우껍질 등을 분쇄, 탈염, 단백질제거, 불순물제거 공정에 의해서 키틴으로 분리 정제한 다음, 염산 등 무기산을 이용한 화학적 분해방법, 또는 효소를 이용한 분해방법을 이용하여 제조한다. 또한 키토산올리고당을 아세틸화하여 제조하기도 한다.

키토산올리고당은 게, 새우껍질 등을 분쇄, 탈염, 단백질제거, 불순물제거 공정에 의해서 키틴으로 분리 정제한 다음, 탈아세틸화하여 키토산을 제조한 다음, 키토산을 염산 등 무기산을 이용한 화학적 분해방법, 또는 효소를 이용한 분해방법을 이용하여 제조한다. 또한 키틴올리고당을 탈아세틸화하여 제조하기도 한다.

키토산은 초산, 젓산, 비타민-C, 피친산 등 유기산과 염산, 인산, 질산 등 무기산, 아스파라긴산, 글루탐산 등의 아미노산에 용해하며, 이들 산을 단독 또는 2종 이상 혼합하여 키토산을 용해하는데 사용한다.

키틴올리고당 및 키토산올리고당의 제조시 효소를 이용한 분해방법을 이용하는 경우, 분해효소는 바실러스속 세균이나 스트렙토마이세스속과 같은 방선균에서 유래된 것을 이용하기도 한다.

키틴올리고당 및 키토산올리고당을 제조하는 방법으로는 도 1에 도식화한 그림과 같이, 여러방법이 있다. 그 중 몇가지 방법을 설명하면 다음과 같다.

먼저, 효소분해법을 이용하여 키틴올리고당을 제조하는 방법으로써, 키틴을 pH가 4 ~ 6으로 조절된 콜로이달 키틴용액으로 만들고, 키틴 분해효소를 첨가하여 30 ~ 50 ℃에서 10 ~ 30 시간 동안 키틴을 분해하고, 불용물을 여과, 제거하면서 열교환기를 이용하여 80 ~ 90 ℃에서 효소를 불활성화시킨 후, 탈염. 정제하여 제조한다.

또 키토산의 아세틸화에 의한 방법으로써, 키토산을 키토산 분해효소를 이용하여 분해시킨 다음, 불용물을 여과, 제거하면서 열교환기를 이용하여 효소를 불활성화시키고, 다시 열교환기를 이용하여 용액의 온도를 낮추어 키토산올리고당용액을 제조한 다음, 아세틸화하여 키틴올리고당을 제조한다.

또 산분해법에 의한 키틴올리고당을 제조하는 방법으로써, 키틴에 염산을 가하여 반응시킨 다음, 수산화나트륨, 수산화칼륨을 가하여 중화시킨 후, 불용물을 여과하고 탈염, 정제한 다음, 동결건조하여 키틴올리고당을 제조한다.

상기와 같이 제조한 키틴올리고당은 분자량이 200 ~ 3,000 이고, 중합도가 2 ~ 15이며, LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타낸다.

또한, 키토산올리고당은, 먼저 효소분해법을 이용하는 방법으로써, 키토산에 증류수를 가한 후 교반하여 키토산현탁액을 만들고, 산을 첨가하여 pH가 4 ~ 6이 되도록 조절한 다음, 키토산 분해효소를 첨가하여 30 ~ 50 ℃에서 10 ~ 30 시간 동안 분해하고, 불용물을 여과, 제거하면서 열교환기를 이용하여 80 ~ 90 ℃에서 효소를 불활성화시킨 후, 탈염. 정제하여 제조한다.

또 키틴올리고당의 탈아세틸화에 의한 키토산올리고당을 제조하는 방법으로써, 키틴올리고당을 증류수에 넣고 교반하여 용해시킨 다음, 수산화나트륨 또는 수 산화칼륨을 첨가하여 탈아세틸화시키고, 불용물을 여과, 탈염, 정제한 후 동결건조하여 키토산올리고당을 제조한다.

또 산분해법에 의한 키토산올리고당을 제조하는 방법으로써, 키토산에 염산을 가하여 반응시킨 다음, 수산화나트륨, 수산화칼륨을 가하여 중화시킨 후, 불용물을 여과하고 탈염, 정제한 다음, 동결건조하여 키토산올리고당을 제조한다.

상기와 같이 제조한 키토산올리고당은 분자량이 200 ~ 3,000 이며, 중합도가 2 ~ 15로써, LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타낸다.

한편, LOX-1(Lectin-like oxLDL receptor-1)은 혈관내피세포의 산화된 저밀도지단백(oxLDL)의 수용체로 알려져 있는 유전자이다.

산화된 저밀도지단백은 LOX-1에 결합하여 세포 내로 들어와서 분해된다.

종래의 여러 연구들에서 LOX-1 유전자의 발현은 산화된 저밀도지단백 (oxLDL), 안지오텐신 Ⅱ(angiotensin Ⅱ), 종양괴사인자(Tumor necrosis factor-α ; TNF-α)와 같은 감염성 사이토킨스(cytokines) 및 전단응력(shear stress)에 의하여 증가된다고 보고된 바 있다.

또한, LOX-1은 활성화된 혈소판과 중성백혈구에 대한 부착분자(adhesion molecule)로 작용하고 중성백혈구의 혈관내피조직에서의 rolling과 transmigration을 도모하여 동맥경화 초기단계에 관여한다고 알려져있다.

본 발명에서는 본 발명의 키틴올리고당 및 키토산올리고당을 이용하여 제조 한 물질이 산화된 저밀도지단백(oxLDL)으로 인하여 유도된 LOX-1 유전자발현을 억제시킬 수 있는 지를 실험하였다.

이를 위하여 LOX-1 단백질과 특이한 항체를 사용하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 시도하였고, 산화된 저밀도지단백(oxLDL)으로 인한 LOX-1의 발현정도를 비교하기 위하여 TNF-α가 대조물질로 처리되었다.

도 2A는 LOX-1 유전자발현에 있어서 산화된 저밀도지단백(oxLDL)의 농도별 시간별 변화를 측정한 결과이다.

저밀도지단백(LDL) 또는 종양괴사인자(TNF-α) 등이 전혀 처리되지 않은 혈관내피세포 배양시에는 LOX-1 단백질 발현이 아주 미약하지만, 10 ng/ml TNF-α를 처리하였을 때는 LOX-1 단백질의 발현이 크게 증가되었다.

산화된 저밀도지단백(oxLDL)을 40 ㎍ protein/㎖과 80 ㎍ protein/㎖ 농도로 4, 8, 12, 24 시간 처리하였을 때, LOX-1의 발현은 배양 후 4시간에서 8시간 사이에 발현이 최고에 도달하였으며, 12시간 이후에는 점차 발현이 감소되는 것을 확인되었다.

Fig. 2B에서는 40 ㎍ protein/㎖ oxLDL을 4시간 배양한 경우에 전처리 된 수용성 키틴올리고당이 LOX-1 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 보여주고 있다.

키틴올리고당 및 키토산올리고당은 oxLDL에 의한 LOX-1의 발현을 거의 완전히 차단시킨다는 것을 보여 주었다.

즉, 본 발명의 키틴올리고당 및 키토산올리고당은 혈관내피세포의 oxLDL에 의하여 유도되는 LOX-1의 발현을 억제시켜 산화된 저밀도지단백(oxLDL)에 의한 혈 관내벽에서의 포말세포 형성을 저하시키고, 부착분자로 작용하는 LOX-1의 발현억제로 인하여 혈관내피세포에서의 활성화된 혈소판이나 백혈구의 응집이 감소되어 초기 동맥경화가 진행되는 것을 차단시킬 수 있는 소재로서 이용될수 있음을 보여주는 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 키틴올리고당을 이용한 LOX-1 유전자 발현억제물질의 제조 1

98 % 키틴(lancastert사)을 구입하여 준비하였다.

준비한 키틴 100 g을 가지고 pH 6.0으로 조절된 2 % 콜로이달 키틴용액을 제조하였다.

키틴 분해효소인 키틴아제(chitinase EC 3.2.1.14 ; Sigma Co.) 50 유니트를 첨가하여 43 ℃에서 20 시간 동안 키틴을 분해하였다.

불용물을 여과, 제거하면서 열교환기를 이용하여 90 ℃에서 효소를 불활성화시켰다.

탈염. 정제하여 건조한 분말의 무게는 31 g으로 수율은 31 %를 나타내었고, N-아세틸-D-글루코사민 함량은 94 % 였다.

제조된 키틴올리고당의 당분포를 HPTLC로 확인해 본 결과 1당인 N-acetylglucosamine은 3 wt%, 2당인 N-acetylchitobiose는 45 wt%, 3당인 N-acetylchitotriose는 33 wt%, 4당인 N-acetylchitotetrose는 12 wt%, 5당인 N- acetylchitopentose는 5 wt%, 6당인 N-acetylchitohexose는 2 wt%, 7당인 N-acetylchitoheptose는 검출되지 않았다.

<실시예 2> 키틴올리고당을 이용한 LOX-1 유전자 발현억제물질의 제조 2

98 % 초산을 물에 희석하여 만든 3.0 % 초산용액 1,000 g에 탈아세틸화도 90 %인 키토산 100 g을 균일하게 용해시키고, 50 ℃로 가온하였다.

키토산 분해효소인 키토산아제(chitosan N.acetylglucosaminohydrolase EC 3,2,1,132 ; Sigma Co.) 50 유니트를 첨가하여 10 시간 동안 키토산을 분해시켰다.

다시 열교환기를 이용하여 용액의 온도를 20 ℃로 낮추어 키토산올리고당 용액(키토산올리고당 농도 10 %(w/v))을 제조하여 반응원액으로 사용하였다.

키토산올리고당액 30 ℓ/min의 유속에서 인라인 믹서에 통과시키면서, 50 %(w/v) 수산화나트륨수용액을 먼저 2 L/min의 속도로 연속주입하고, 이어서 95 % 무수초산을 1 L/min의 속도로 연속주입하였다.

이때, 수산화나트륨의 주입량은 키토산올리고당 반응원액과 수산화나트륨용액 및 무수초산이 균일하게 혼합된 상태에서 pH 6.8이 유지되도록 조절한 것이다.

상기 방법을 3 회 반복하여 아세틸화 반응을 종료하였다.

염을 제거하고, 건조하여 95 % 아세틸화된 키틴올리고당의 분말 100 g을 얻어 수율 97 %를 나타내었다.

HPTLC로 확인해 본 결과 1당인 N-acetylglucosamine은 검출되지 않았고, 2당인 N-acetylchitobiose는 26 wt%, 3당인 N-acetylchitotriose는 25 wt%, 4당인 N-acetylchitotetrose는 20 wt%, 5당인 N-acetylchitopentose는 16 wt%, 6당인 N-acetylchitohexose는 8 wt%, 7당인 N-acetylchitoheptose는 5 wt%로 나타났다.

<실시예 3> 키틴올리고당을 이용한 LOX-1 유전자 발현억제물질의 제조 3

98 % 키틴(lancastert사)을 구입하여 준비하였다.

준비한 키틴 100 g에 12N 염산 400 ㎖를 가한 후, 45 ℃항온기에서 3 시간동안 교반하면서 반응한 후, 반응액에 냉수 400 ㎖를 첨가하여 반응을 종료하였다.

이 반응액을 상온에서 유지하면서 25 % 수산화나트륨 용액으로 pH를 7.0으로 중화시킨 후 불용물을 여과하고, 탈염.정제하여 건조한 분말무게가 최종 42 g 으로 수율 42 %를 나타냈었으나, 분석결과 다량의 단당이 함유되어 있어 2당 이상의 키틴올리고당의 함량은 27 g이었으며, N-아세틸-D-글루코사민 함량은 96 % 였다.

제조된 키틴올리고당의 당분포를 HPTLC로 확인해 본 결과 1당인 N-acetylglucosamine은 35 wt%, 2당인 N-acetylchitobiose는 19 wt%, 3당인 N-acetylchitotriose는 15 wt%, 4당인 N-acetylchitotetrose는 12 wt%, 5당인 N-acetylchitopentose는 8 wt%, 6당인 N-acetylchitohexose는 6 wt%, 7당인 N-acetylchitoheptose는 5 wt%로 나타났다.

<실시예 4> 키토산올리고당을 이용한 LOX-1 유전자 발현억제물질의 제조 1

탈아세틸화도 99 %인 키토산을 28 g을 증류수 460 ㎖에 넣고, 10 분간 교반하여 키토산 현탁액을 제조하였다.

이 현탁액에 아스코르빈산 19 g을 첨가하여 2 시간동안 교반하여 용해시킨 다음, 아스코르빈산으로 pH를 5.0으로 조절하였다.

키토산 분해효소인 키토산아제(chitosan N.acetylglucosaminohydrolase EC 3,2,1,132 ; Sigma Co.) 60 유니트를 첨가하여 39 ℃에서 13 시간 동안 키토산을 분해시켰다.

분해 종료후 효소를 불활성화 시키기 위해 80 ℃에서 10 분간 열처리한 후, 여과하고, 이 조성물을 동결건조하여 키토산올리고당 분말 44 g을 수득하였다.

HPTLC로 확인해 본 결과 1당인 D-glucosamine은 검출되지 않았고, 2당인 chitobiose는 31 wt%, 3당인 chitotriose는 27 wt%, 4당인 chitotetrose는 18 wt%, 5당인 N-acetylchitopentose은 11 wt%, 6당인 chitohexose은 8 wt%, 8당인 N-acetylchitoheptose는 4 wt%, 7당 이상은 1 wt%로 나타났다.

<실시예 5> 키토산올리고당을 이용한 LOX-1 유전자 발현억제물질의 제조 2

탈아세틸화도 99 %인 키토산 100 g을 준비하였다.

준비한 키토산에 농염산 900 ㎖를 가한 후, 45 ℃항온기에서 3 시간동안 교반하면서 반응한 후, 이 반응액을 상온으로 유지하면서 25 % 수산화타트륨 용액으로 pH를 5.0으로 조절시킨 후, 불용물을 여과하고, 탈염.정제하여 이 조성물을 동결건조하여 키토산올리고당 46 g을 수득하였다.

키토산올리고당의 당분포를 HPTLC로 확인해 본 결과 1당인 D-glucosamine은 33 wt%, 2당인 chitobiose는 20 wt%, 3당인 chitotriose는 21 wt%, 4당인 chitotetrose는 16 wt%, 5당인 chitopentose는 8 wt%, 6당인 chitohexose는 2 wt%로 나타났다.

<실시예 6> 키토산올리고당을 이용한 LOX-1 유전자 발현억제물질의 제조 3

실시예 2에서 제조한 키틴올리고당 100 g을 준비하였다.

준비한 키틴올리고당을 증류수 500 ㎖에 넣고 2 시간동안 교반하여 용해시킨 다음, 수산화나트륨 150 g을 넣어 110 ℃에서 3 시간 처리 후, 염산으로 pH 7.0으로 중화시켰다.

이 조성물을 여과, 탈염, 정제한 후 동결건조하여 키토산올리고당 70 g을 수득하였다.

키토산올리고당의 당분포를 HPTLC로 확인해 본 결과 1당인 D-glucosamine은 검출되지 않았고, 2당인 chitobiose는 38 wt%, 3당인 chitotriose는 29 wt%, 4당인 chitotetrose는 24 wt%, 5당인 chitopentose는 13 wt%, 6당인 chitohexose는 5 wt%, 7당인 chitoheptose는 1 wt%로 나타났다.

<실험예 1> LOX-1 유전자발현 억제효과

1. 실험준비

본 발명의 실시예 3의 키틴올리고당과 실시예 6의 키토산올리고당을 준비하 였다.

혈관내피세포(Human umbilical vein endothelial cells)는 콜라겐가수분해효소(collagenase type II, Worthington Biochemicals Co., Lakewood, NJ)를 이용하여 분리하였고, 37 ℃에 95 % 공기와 5 % CO₂ 배양조건에서 일차배양 하였다.

혈관내피세포의 진위 판별은 DiI(1.1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, Molecular Probes Co., Eugene, OR)의 형광물질로 표지된 아세틸화된 LDL의 탐식실험을 통하여 이루어졌다.

일차배양으로 준비된 혈관내피세포는 10 % FBS와 2 mM 글루타민(glutamine), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 0.9 ㎎/㎖ bovine brain extract, 0.75 mg/ml 인간표피세포 성장인자(human epidermal growth factor), 그리고 0.075 mg/ml 하이드로코르티손(hydrocortisone)이 첨가되어 있는 25 mM HEPES-M199 배지에서(Sigma Co.) 배양하였다.

2. 실험방법

준비한 혈관내피세포의 LOX-1 단백질 발현을 측정하기 위하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 시도하였다.

웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 위하여 우선 혈관내피세포에서 100 % 글리세롤(glycerol), 10% SDS, 1% 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 0.1 M Na₃VO₄, 0.5 M NaF 그리고 단백질효소분해 억제제(protease inhibitor cocktail)이 함유된 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) lysis 용액을 사용하여 세포 추출물( extracts)을 준비하였다.

준비된 세포 추출물(extracts)의 단백질은 10% SDS-PAGE 젤 상에서 전기영동을 수행하였다.

젤 상에 있는 단백질은 니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane)으로 전이시킨 다음, 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 5 % skim milk와 함께 배양하였다.

블랏은 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)과 LOX-1 단백질의 일차항체(monoclonal mouseanti-human LOX-1 antibody, 일본 National Cardiovascular Center Research Institute의 Sawamura 교수로부터 제공받았음)를 500 배로 희석하여 교반하면서 배양하였다.

배양후에, HRP가 접합된 항마우스 IgG 항체(horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody ; 1:1,000, Jackson ImmunoResearch Lab., West Grove, PA)의 이차항체로 1시간 배양하였다.

니트로셀룰로스 막(Nitrocellulose membrane)에 있는 LOX-1 단백질은 X-ray 필름에 노출시켜 수퍼시그날 웨스트 피코 화학발광검출기(Supersignal West pico chemiluminescence ; Pierce Biotech. Inc., Rockford, IL)로 검출하여 X-레이(Konica X-ray 필름)로 촬영하였다.

3. 실험결과

산화된 저밀도지단백(oxLDL)으로 인하여 유도된 LOX-1 단백질 발현을 키틴올리고당 및 키토산올리고당이 억제시킬 수 있는 지를 조사하였다.

이를 위하여 LOX-1 단백질과 특이한 항체를 사용하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 시도되었고, oxLDL로 인한 LOX-1의 발현정도를 비교하기 위하여 TNF-α가 대조물질로 처리되었다.

도 2A는 LOX-1 단백질 발현에 있어서 oxLDL의 농도별 시간별 변화를 측정한 결과이다.

oxLDL 또는 TNF-α 등 전혀 처리되지 않은 혈관내피세포 배양시에는 LOX-1 단백질 발현이 아주 미약하지만, 10 ng/ml TNF-α를 처리하였을 때는 LOX-1 단백질의 발현이 크게 증가되었다.

OxLDL을 40 ㎍ protein/ml과 80 ㎍ protein/ml 농도로 4, 8, 12, 24시간 처리하였을 때, LOX-1의 발현은 배양 후 4시간에서 8시간 사이에 발현이 최고에 도달하였으며 12시간 이후에는 점차 발현이 감소되는 것을 확인되었다.

도 2B에서는 40 ㎍ protein/ml oxLDL을 4시간 배양한 경우에 전처리 된 키틴올리고당이 LOX-1 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 보여주고 있다.

키틴올리고당, 그리고 키토산올리고당은 oxLDL에 의한 LOX-1의 발현을 거의 완전히 차단시킨다는 것을 보여 주었다.

상기의 실험으로, 본 발명의 키틴올리고당 및 키토산올리고당이 산화된 저밀도지단백(oxLDL)으로 인하여 유도된 LOX-1 유전자발현을 억제한다는 사실을 알 수 있었다.

본 발명에 의해, 키틴올리고당 및 키토산올리고당을 이용한 LOX-1 유전자의 발현을 억제하는 물질이 제공된다.

Claims

키틴을 화학적 방법 또는 효소를 이용한 방법으로 분해하여 제조되거나, 키토산올리고당을 아세틸화하여 제조되며, 중합도가 2 ~ 15 이고, 분자량이 200 ~ 3,000 인 키틴올리고당이 포함된,

LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타내는 동맥경화 예방 및 개선용 조성물.
키틴을 pH가 4 ~ 6으로 조절된 콜로이달 키틴용액으로 만들고, 키틴 분해효소를 첨가하여 30 ~ 50 ℃에서 10 ~ 30 시간 동안 키틴을 분해하고, 불용물을 여과, 제거하면서 열교환기를 이용하여 80 ~ 90 ℃에서 효소를 불활성화시킨 후, 탈염. 정제하여 제조되며, 중합도가 2 ~ 15 이고, 분자량이 200 ~ 3,000 인 키틴올리고당이 포함된,

LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타내는 동맥경화 예방 및 개선용 조성물.
키틴에 염산을 가하여 반응시킨 다음, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨으로 중화시킨 다음, 탈염. 정제하여 제조되며, 중합도가 2 ~ 15 이고, 분자량이 200 ~ 3,000 인 키틴올리고당이 포함된,

LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타내는 동맥경화 예방 및 개선용 조성물.
키토산을 키토산 분해효소를 이용하여 분해시킨 다음, 불용물을 여과, 제거하면서 열교환기를 이용하여 효소를 불활성화시키고, 다시 열교환기를 이용하여 용액의 온도를 낮추어 키토산올리고당용액을 제조한 다음, 아세틸화하여 제조되며, 중합도가 2 ~ 15 이고, 분자량이 200 ~ 3,000 인 키틴올리고당이 포함된,

LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타내는 동맥경화 예방 및 개선용 조성물.
키토산을 화학적 방법 또는 효소를 이용한 방법으로 분해하여 제조되거나, 또는 키틴올리고당을 탈아세틸화하여 제조되며, 중합도가 2 ~ 15 이고, 분자량이 200 ~ 3,000인 키토산올리고당이 포함된,

LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타내는 동맥경화 예방 및 개선용 조성물.
키토산에 증류수를 가한 후 교반하여 키토산현탁액을 만들고, 산을 첨가하여 pH가 4 ~ 6이 되도록 조절한 다음, 키토산 분해효소를 첨가하여 30 ~ 50 ℃에서 10 ~ 30 시간 동안 분해하고, 불용물을 여과, 제거하면서 열교환기를 이용하여 80 ~ 90 ℃에서 효소를 불활성화시킨 후, 탈염. 정제하여 제조되며, 중합도가 2 ~ 15 이고, 분자량이 200 ~ 3,000인 키토산올리고당이 포함된,

LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타내는 동맥경화 예방 및 개선용 조성물.
키토산에 염산을 가하여 반응시킨 다음, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨으로 중화시킨 다음, 탈염. 정제하여 제조되며, 중합도가 2 ~ 15 이고, 분자량이 200 ~ 3,000인 키토산올리고당이 포함된,

LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타내는 동맥경화 예방 및 개선용 조성물.
키틴올리고당을 증류수에 넣고 교반하여 용해시킨 다음, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 첨가하여 탈아세틸화시키고, 불용물을 여과, 탈염, 정제한 후 건조하여 제조되며, 중합도가 2 ~ 15 이고, 분자량이 200 ~ 3,000인 키토산올리고당이 포함된,

LOX-1 유전자의 발현억제 효과를 나타내는 동맥경화 예방 및 개선용 조성물.