KR100594643B1 - 아르테미샤 불가리스(쑥) 화분으로부터의 재조합 주요 알레르겐 - Google Patents
아르테미샤 불가리스(쑥) 화분으로부터의 재조합 주요 알레르겐 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100594643B1 KR100594643B1 KR1020007010686A KR20007010686A KR100594643B1 KR 100594643 B1 KR100594643 B1 KR 100594643B1 KR 1020007010686 A KR1020007010686 A KR 1020007010686A KR 20007010686 A KR20007010686 A KR 20007010686A KR 100594643 B1 KR100594643 B1 KR 100594643B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- art
- host cell
- dna molecule
- allergen
- recombinant
- Prior art date
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 240000006891 Artemisia vulgaris Species 0.000 title description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 4
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 235000009051 Ambrosia paniculata var. peruviana Nutrition 0.000 description 2
- 235000003097 Artemisia absinthium Nutrition 0.000 description 2
- 235000017731 Artemisia dracunculus ssp. dracunculus Nutrition 0.000 description 2
- 235000004355 Artemisia lactiflora Nutrition 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000001138 artemisia absinthium Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 125000003508 trans-4-hydroxy-L-proline group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 102100037084 C4b-binding protein alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 240000008853 Datura stramonium Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241001521394 Maackia amurensis Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 101710136733 Proline-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 235000003142 Sambucus nigra Nutrition 0.000 description 1
- 240000006028 Sambucus nigra Species 0.000 description 1
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 235000008995 european elder Nutrition 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012987 post-synthetic modification Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 108010076805 snowdrop lectin Proteins 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Abstract
본 발명은 알레르겐 Art v 1 또는 이들의 이소형을 코딩하는 DNA 분자, 알레르겐의 서열, Art v 1 분자의 제조 방법, 벡터 및 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
Description
본 발명은 알레르겐 Art v1을 코딩하는 재조합 DNA 분자, Art v1 분자의 제조 방법 및 벡터 및 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
쑥(mugwort)의 화분(花粉)은 늦여름에 유럽에서 가장 큰 알레르기 원인 중의 하나이다(1,2). 꽃가루 과민증(pollinosis)을 앓는 환자 중, 쑥의 화분에 의한 알레르기성 질병의 발병율은 10 내지 14 %이다(2,3). 쑥의 화분 추출물로부터 얻은 전체 단백질의 면역 반점(immunoblot)에 의하면, 환자의 IgE는 Art v1이라 부르는 27~29 kDa의 주요 알레르겐을 인식하는 것으로 나타나 있다. 쑥의 화분에 대하여 알레르기를 나타내는 모든 환자의 95% 이상이 IgE 면역 반점에서 Art v1을 인식한다. 이하, 본 명세서에서는 상기 반점을 "환자 반점"이라고 부른다. 쑥의 화분 추출물 중의 수종의 상이한 단백질은 동일한 겉보기 Mr인 27~29 kDa에서 이동한다. 따라서, Art v1을 코딩하는 cDNA 클론을 분리하기가 매우 어렵고, 또한 이러한 cDNA 클론이 Art v1을 코딩하는 것인지를 증명하기가 매우 어렵다.
본 발명의 목적은 아르테미샤 불가리스(Artmisia vulgaris)로부터 얻은 화분의 알레르겐을 코딩하는 재조합 DNA 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 이는 SEQ ID NO:2에 나타낸 서열을 가진 알레르겐 Art v 1a를 코딩하는 재조합 DNA 분자를 제조하는 방법에 의하여 달성된다. 이는, 아르테미샤 불가리스의 주요 알레르겐이 진단 및 치료의 각각에 이용될 수 있다는 것이 밝혀지게 되었다는 것을 의미한다. 이러한 DNA 분자는 SEQ ID NO:1에 따른 뉴클레오타이드 서열에 그 특징이 있다. 더욱이, 이들 분자는 유전 코드의 퇴화(退化)에 의하여 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열로부터 유도될 수 있다. 우선, 본 발명에 따른 분자는 SEQ ID NO:1의 서열과 서열 동일성이 60% 이상이다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자는 SEQ ID NO:4 및 6에 나타낸 서열을 가진 이소형(isoform) 의 Art v 1b 및 Art v 1c의 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 이들 재조합 DNA 분자는 SEQ ID NO:3 및 5에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자는 SEQ ID NO:1에 나타낸 서열과 혼성화시킬 수 있으며, 엄격한 세척 조건하에서 혼성화에 의하여 결합된 상태로 잔존할 수 있다.
이는 SEQ ID NO:3 및 5에 나타낸 서열에 대하여 마찬가지이다. 엄격한 혼성화 조건의 예로는 60℃에서 H2O에 용해된 1M NaCl이며, 엄격한 세척 조건은 예를 들면 50℃에서 5 x SSPE 및 0.1% SDS (1 x SSPE 는 0.18 M NaCl, 0.01 M 인산나트륨, pH 7.4, 1 mM EDTA이다)에서 2회 세척하는 것이다.
이는 SEQ ID NO:3 및 5에 나타낸 서열에 대하여 마찬가지이다. 엄격한 혼성화 조건의 예로는 60℃에서 H2O에 용해된 1M NaCl이며, 엄격한 세척 조건은 예를 들면 50℃에서 5 x SSPE 및 0.1% SDS (1 x SSPE 는 0.18 M NaCl, 0.01 M 인산나트륨, pH 7.4, 1 mM EDTA이다)에서 2회 세척하는 것이다.
Art v 1 알레르겐을 제조하는 본 발명에 따른 방법은, 다음의 공정들을 포함하는 것이 특징이다.
(a) Art v 1을 코딩하는 DNA (SEQ ID NO:1) 또는 상기 서열과의 서열 동일성이 60%인 DNA를 함유하는 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 상기 Art v 1 알레르겐 상기 숙주 세포에 의하여 발현되도록 배양하는 공정과,
(b) 상기 알레르겐 Art v 1을 분리하는 공정.
본 발명의 재조합 알레르겐은 글리코실화시킬 수 있다. 상기 방법과 관련하여, 상기 방법의 공정 (a)에 언급된 DNA 분자를 함유하는 복제 가능한 진핵 또는 원핵 발현 벡터를 지정할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 우선적으로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 피키아 파스토리스(Picchia pastoris)일 수 있는 명명된 숙주 세포 내에 포함된다.
도 1은 쑥 화분의 주요 알레르겐인 Art v 1a를 코딩하는 진정하고도 완전한 cDNA 클론의 분리를 나타내고 있다. Art v 1a 중의 문자 a는 이소형 a를 의미한다. 또한, 진정하고도 완전한 이소형의 Art v 1을 코딩하며, Art v 1b 및 Art v 1c라고 부르는 2종의 클론을 추가로 분리되었다. 상기 2종의 이소형의 서열은 도 2 및 도 3에 나타나 있다. 이들 클론은 전형적인 진핵 콘텍스트(context) 내에 개시 AUG 코돈을 포함하고 있으므로, 이들의 5' 말단에서 종료하고 있다. 이들 클론은 또한 종료 코돈의 뒤에 177~200개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 폴리 A+ 꼬리가 후속되기 때문에, 3' 영역에서 종료한다. 상기 각 도면에는 전사 해석(轉寫解釋) 프레임(open reading frame) 외부의 서열은 나타나 있지 않다. 도 4 및 도 5는 Art v 1a, b 및 c의 뉴클레오타이드와 유추된(deduced) 아미노산 서열의 배열을 각각 보여주고 있다. 이들 비교에 의하면, Art v 1은 뉴클레오타이드와 아미노산 함량의 양자에서 비교적 서로 많은 서열 편차를 나타내는 상이한 이소형 혼합물이다. 이들 상이점은 역시 상기 뉴클레오타이드 서열의 번역되지 않은 상류부와 하류부를 감안하면(도시되어 있지 않음), 더 더욱 현저하다. 상이한 수효의 이소형 및 뉴클레오타이드 치환체들은 본 발명자들이 유전자 패밀리를 다루는 것을 매우 가능하도록 해주고 있다. 상동 서열은 해바라기에서 발견된 바 있으므로(4), 상기 유전자 패밀리가 종특이성(種特異性)인지 또는 속특이성(屬特異性)인지는 확실하지 않다. 상기 해바라기 단백질 (SF18)은 화분특이적 기능을 나타내는 표피 꽃밥 세포 내에서 발현되며, 감마-푸로티오닌 패밀리에 대하여 약간의 유사성을 나타낸다.
도 1은 Art v 1a의 뉴클레오타이드 서열 및 유추된 아미노산 서열에 관한 것이다. 유추된 아미노산 서열 잔기는 개시 메티오닌으로부터 시작하여 번호를 매겼다. 컴퓨터가 예측한 N-말단 신호 펩타이드는 이탤리체로 표시하였다. 에드만(Edman) 분해에 의하여 결정된 N-말단 아미노산 서열은 밑줄을 그어 표시하였다.
도 2는 Art v 1b의 뉴클레오타이드 서열 및 유추된 아미노산 서열에 관한 것이다. 유cn된 아미노산 서열 잔기는 개시 메티오닌으로부터 시작하여 번호를 매겼다. 컴퓨터가 예측한 N-말단 신호 펩타이드는 이탤리체로 표시하였다. 에드만 분해에 의하여 결정된 N-말단 아미노산 서열은 밑줄을 그어 표시하였다.
도 3은 Art v 1c의 뉴클레오타이드 서열 및 유추된 아미노산 서열을 나타낸다. 유추된 아미노산 서열 잔기는 개시 메티오닌으로부터 시작하여 번호를 매겼다. 컴퓨터가 예측한 N-말단 신호 펩타이드는 이탤리체로 표시하였다. 에드만 분해에 의하여 결정된 N-말단 아미노산 서열은 밑줄을 그어 표시하였다.
도 4는 Art v 1a, Art v 1b, 및 Art v 1c의 뉴클레오타이드 서열 (전사 해석프레임)의 배열을 나타낸다. 공통 서열과 상이한 뉴클레오타이드는 상자 안에 표시하였다.
도 5는 Art v 1a, Art v 1b, 및 Art v 1c의 유추된 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. 공통 서열과 상이한 아미노산 잔기는 상자 안에 표시하였다.
도 6은 정제된 천연 Art v1의 특성화를 나타낸다. 패널 A: Art v 1을 함유하는 3개의 분획 (F1, F2, F3)의 코마쎄 착색 (Coomassie-staining). 이들 분획을 3명의 쑥 화분 알레르기성 환자의 혈청과 결합하는 IgE에 대하여 시험하였다 (패널 B), 패널 C: 쑥 화분 추출물과 정제된 Art v1 분획 (레인 F1, F2, F3)의 DIG 글리칸/단백질 염색. C1, 음성 대조구 (재조합 크레아틴아제); C2, 양성 대조구 (페투인).
도 7은 Art v 1a에 대한 발현 벡터의 제조를 나타낸다. 성숙형 단백질의 대응하는 Art v 1a cDNA 부분이 비융합 단백질로서 E.coli 내에서 발현되었다.
도 8은 재조합 Art v 1a (rArt v 1a)의 IgE 면역 반점을 나타낸다. 15명의 쑥화분 알레르기성 환자의 혈청을 쑥 화분 추출물의 단백질에 대한 IgE 결합 및 E.coli BL 21 내에서 발현된 rArt v 1a에 대한 IgE의 결합에 대하여 시험하였다. 삽입체가 없는 pMW 172 발현 벡터를 함유하는 박테리아 용해물을 대조구로 사용하였다. NHS, 정상의 사람 혈청.
Art v 1a를 코딩하는 cDNA는 다음의 방식으로 단리된다.
파지 람다-ZAP II (Stratagene, La Jolla, California; Catalogue No. 237612) 중의 cDNA 발현 라이브러리를 조제하였다. 출발 물질은 쑥 화분 mRNA이었다. 상기 cDNA 라이브러리를 환자 반점 중의 Art v 1을 인식하는 것으로 나타나 있는 환자 20명의 혼합 혈청 (blood pool)을 이용하여 면역학적으로 선별하였다. 상기 혼합 혈청과 양성(陽性)) 반응하며, 재선별의 반복시 100% 면역 양성 반점을 형성하는 클론을 단리시켰다. 이 클론에 대한 면역 반응은 비교적 약하지만 분명히 양성이었다. 이 클론이 Art v 1을 코딩한다는 것은 다음과 같이 입증하였다.
매우 온화한 조건, 즉 실온하에서 쑥 화분으로부터 주요 알레르겐 Art v 1을 추출하고, 가볍게 진탕면서 15~30분간 물로 추출하였다. 이 추출액을 예비 겔 전기 영동에 의하여 더 분리하고, 분획들을 면역 반점에 의하여 시험하였다. 도 6a는 코마쎄 착색 단백질 불순물이 없고, 22 내지 29 kDa의 겉보기 분자량에서 영동(泳動)하는 단백질을 함유하는 3개의 분획 (F1, F2 및 F3)을 나타내고 있다. 때로는, 약 50 kDa에 해당하는 이량체 밴드도 역시 나타난다. 도 6b는 이들 분획의 환자 반점을 나타낸다. Mr이 가장 큰 분획은 피검 환자 3명 전부로부터 얻은 IgE에 결합하는 반면, Mr이 가장 적은 분획은 단지 환자 혈청에 의하여 약하게 인식된다는 것이 자명하다. 도 6c는 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)의 당단백질 탐지 키트 (DIG 글리칸/단백질 이중 표지 키트, 카탈로그 번호 1500783)를 사용하여 동일한 반점을 염색한 후에 얻은 것이었다. 3개의 분획은 전부 당단백질로 이루어져 있다는 것이 분명하다. 3개의 분획을 전부 N-말단 에드만 분해로 분석하고, 도 1 ~ 3에서 밑줄그은 동일한 N-말단 서열을 형성하였다. 닐슨 (Nielsen 등에 따른 도 1의 유추된 단백질 서열의 컴퓨터 분석치에 의하면(5), Art v 1이 소포체 및 골지체에 대한 표적을 삼는 전형적인 N-말단 소수성 신호 서열을 가진다는 것이 예상된다. 이 컴퓨터 알고리즘에 의하여 예상된 성숙형 단백질이 개시된 후의 서열은 천연 단백질에서 발견되는 N-말단 서열과 동일하다 (도 1 ~ 3의 밑줄그은 부분). 매우 유사한 N-말단 부분 서열은 마티센(Matthiesen)과 그의 공동 연구자들에 의하여 이미 발견되었다(6). Art v 1은 N-말단이 전형적인 ER 신호 서열을 제거함으로써 형성된 분비 (分泌) 당단백질이라는 결론을 내릴 수 있다. 천연 단백질은 글리코실화도의 차이때문에 불균질성이며, 충분히 글리코실화한 형태 (도 6의 F3)는 IgE에 가장 양호하게 결합한다.
Art v 1a의 주요 cDNA 클론은 무작위 프라이밍법(priming method)에 의하여 32P로 표지한 후에 혼성화 프로브로서 이용하였다. 이 프로브를 이용하여 전술한 라이브러리를 선별하여, 2종의 클론을 더 얻고, 이를 Art v 1b 및 Art v 1c라고 명명하였다. 이들 클론을 DNA 서열 분석법으로 분석하였다. 그 서열은 도 2 및 3에 나타나 있다.
E.coli를 사용하여 발현계 pMW 172 중의 cDNA의 적당한 부분을 재클로닝한 후의 비융합 재조합 단백질로서 성숙형(단축형) Art v 1a 단백질을 발현시켰다. E.coli에서 발현된 재조합 단백질은 합성 후 변형(postsynthetic modification)(N-말단 메티오닌 절단은 제외)을 나타내지 않으며, 특히 당을 포함하지 않는다는 것은을 잘 알려져 있다. 발현 플라스미드의 제조법은 도 7에 나타나 있다. Art v 1a 단백질은 E.coli 단백질의 가용성 분획 중에 풍부하였다. 도 8은 15명의 각 환자 의 가용성 분획의 면역 반점을 나타낸 것이다. 천연 단백질의 겉보기 Mr은 약 27 kDa (표 8, 쑥 화분)인 반면, 재조합 단백질의 겉보기 Mr은 글리코실화가 없기 때문에 약 18 kDa이다. 이론상의 Mr은 10.8 kDa이며, 이로부터 재조합 단백질이 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에서 매우 독특한 전기 영동 이동성을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 15명 중 10명의 환자들의 IgE가 글리코실화되지 않은 단백질을 인식함은 명백하나, 환자들이 이러한 형태의 단백질을 전혀 인식하지 못한 채 존재한다는 것도 명백하다 (도 8, rArt v 1a). 매우 놀랍게도, 환자 3, 4 및 10은 천연 글리코실화형보다는 글리코실화되지 않은 단백질을 더 잘 인식한다. 도 8에 나타낸 대조구에 의하면, E.coli 단백질은 환자들과 2차 항체에 의하여 단지 약하게 인식되거나 인식되지 않는다는 것을 나타낸다. 이들 약한 밴드는 도 8에 나타낸 3명의 모든 환자의 환자 반점 중에 나타낼 수 있다.
전술한 실험 결과를 설명하기 위하여, 다음의 가설을 제시한다. Art v 1의 당 부분은 단백질 골격을 단백질의 천연 형태로 하는 데 필요하므로 어떤 환자들의 IgE가 이러한 방식으로 생성된 에피토프 (epitope)를 결합시킬 수 있다고 생각할 수 있다. 한편, 기타 어떤 에피토프는 당의 부재하에 환자의 혈청에 의하여 용이하게 인식될 수 있다. 상기 관찰에 대한 또 한 가지 설명은, 가능성이 적기는 하지만, 글리코실화하지 않은 형태를 인식하지 못하는 환자의 혈청은 사실상 당으로 이루어진 에피토프를 인식한다는 것이다.
아르테미샤 불가리스 (Artemisa vulgaris), Art v 1의 천연 주요 알레르겐의 당 부분의 예비 특성화
아르테미샤 불가리스의 천연 주요 알레르겐을 다음의 방법으로 정제하여 동질화시켰다.
1. pH 5.2에서 세파로스 Q (Pharmacia, Uppsala, Sweden)을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피.
2. TSK-겔 G2000SW (Tosohaas, Stuttgart, Germany)을 이용한 HPLC-겔 여과 크로마토그래피.
상기 물질은 N-말단 단백질 서열 및 아미노산 분석에 의하여 판단되는 바와 같이 균질하였으나, 글리코실화 패턴이 상이하기 때문에 분자량은 불균일하였다. MALDI-TOF 질량 광학계로 분자량을 측정한 결과, 평균 분자량은 각각 13.5 kDa 및 15.5 kDa인 2개의 넓은 피크가 나타났다. 반면에, SDS-PAGE로 측정한 겉보기 분자량은 24 내지 28 kDa이었는데, 이는 당 부분의 매우 독특한 구조 또는 매우 독특한 단백질 구조를 나타내는 것으로 볼 수 있다. 폴리펩타이드 사슬에 공유 결합된 당을 가수 분해와 HPLC로 예비 분석한 결과, 어떠한 N-글리코실화도 Art v 1 알레르겐에 존재하지 않으며, 매우 유사한 전형적인 Ｏ-글리코실화 역시 Art v 1 알레르겐에는 존재하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 오히려, 종전의 히드록시프롤린 잔기상의 식물 Ｏ-글리코실화가 그 경우에 해당하는 것으로 보인다. Art v 1은 프롤린이 풍부한 단백질 (20 %의 프롤린)이고, 합성 후 변형되므로 성숙한 단백질 프롤린과 히드록시프롤린 잔기는 4:6의 비율로 존재한다. 공지의 N-글리칸 및 Ｏ-글리칸에 특이적인 5종의 상이한 렉틴 [갈란투스 니발리스 (Galanthus nivalis) 아글루티닌, 엘더베리 니그라 (Sambucus nigra) 아글루티닌, 다릅나무 (Maackia amurensis) 아글루티닌, 땅콩 아글루티닌 및 독말풀(Datura stramonium) 아글루티닌]에 대한 집중적인 연구의 결과, 이들 당 구조는 Art v 1 알레르겐에 존재하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이 주요 알레르겐의 B-세포 에피토프의 형성에 대한 이러한 독특한 단백질 구조 및 독특한 당 부분의 역할은 현재 연구 중에 있다. 도 8은 당 부분이 Art v 1 알레르겐의 IgE 인식에 있어서 중요한 역할을 수행할 것이라는 최초의 암시를 제공하고 있다.
참고 문헌:
1. Charpin, U., Surinyach, R., and Frankland, A.W. (1974) Atals of European Allergenic pollen. Sandoz, Paris.
2. Spieksma, F.T.M., Charpin, H., Nolard, N., and Stix, E.(1980) Clin. Allergy 10:319-329.
3. Cornillon, J., Bernard, J-P., Gueho, E., and Touraine, R. (1972) Rev. Franc. Allergol. 12: 131-135
4. Domon, C., Evarard, J.L., Herdenberger, F., Pillay, D.T.N., and Sterinmetz, A. (1990) Plant Mol. Biol. 15:643-646
5. Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S., and von Heijne, G. (1997) Prot. Eng. 10:1-6
6. Matthiesen, F., Ipsen, H., and Lowenstein, H. (1991) In: Allergenic pollen and pollinosis in Europe. pp36-44. D'Amato, G., Spieksma, F.T.M., and Bonini, S. eds., Blackwell Scientific Publications, Cambridge.
<110> biomay producktion- und handelsgesellschaft m.b.H.
<120> recombinant major allergen of Artemisia vulgaris(mugwort) pollen
Art v1
<130> KP-CH-004074
<150> AT 539/98
<151> 1998-03-26
<160> 6
<170> KOPATIN 1.5
<210> 1
<211> 399
<212> DNA
<213> Artemisia vulgaris
<400> 1
atggcaaagt gttcatatgt tttctgtgcg gttcttctga ttttcatagt tgctatcgga 60
gaaatggagg ccgctggttc aaagttgtgt gaaaagacaa gcaagacgta ttcgggtaag 120
tgcgacaaca agaaatgtga caaaaagtgt atagagtggg agaaagcgca acatggtgct 180
tgtcacaaga gagaagccgg caaagaaagt tgcttttgct actttgactg ttccaaatcg 240
cctcctggag caacaccagc gcctcctggt gcagctcctc ccccagctgc tggcggctct 300
ccgtcacctc ccgctgatgg tggctcacca cctcctccag ctgatggtgg atctcctcct 360
gtagatggtg gctctccacc tcctccgtcc actcactaa 399
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> Artemisia vulgaris
<400> 2
Met Ala Lys Cys Ser Tyr Val Phe Cys Ala Val Leu Leu Ile Phe Ile
1 5 10 15
Val Ala Ile Gly Glu Met Glu Ala Ala Gly Ser Lys Leu Cys Glu Lys
20 25 30
Thr Ser Lys Thr Tyr Ser Gly Lys Cys Asp Asn Lys Lys Cys Asp Lys
35 40 45
Lys Cys Ile Glu Trp Glu Lys Ala Gln His Gly Ala Cys His Lys Arg
50 55 60
Glu Ala Gly Lys Glu Ser Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Ser Lys Ser
65 70 75 80
Pro Pro Gly Ala Thr Pro Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Pro Pro Ala
85 90 95
Ala Gly Gly Ser Pro Ser Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro
100 105 110
Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Val Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro
115 120 125
Pro Ser Thr His
130
<210> 3
<211> 399
<212> DNA
<213> Artemisia vulgaris
<400> 3
atggcgaggt gttcatatgt tttctgcgct gttcttctga ttttcgtact tgctatcgga 60
gaaattgagg ccgctggttc aaagctgtgt gaaaagacaa gcaagacgta ttcgggtaag 120
tgcgacaaca agaaatgtga caaaaagtgt atagaatggg agaaagcaca acatggtgct 180
tgtcacaaga gagaagccgg taaagaaagt tgcttttgct actttgactg ttccaaatcg 240
cctcctggag cgacaccagc gcctcctgga gcatctcctc ccccagctgc tggcggctct 300
ccaccacctc ccgccgatgg tggctcacca cctcctccag ctgatggtgg atctcctcct 360
gccgatggtg gctctccacc tcctccgtcc gctcactaa 399
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> Artemisia vulgaris
<400> 4
Met Ala Arg Cys Ser Tyr Val Phe Cys Ala Val Leu Leu Ile Phe Val
1 5 10 15
Leu Ala Ile Gly Glu Ile Glu Ala Ala Gly Ser Lys Leu Cys Glu Lys
20 25 30
Thr Ser Lys Thr Tyr Ser Gly Lys Cys Asp Asn Lys Lys Cys Asp Lys
35 40 45
Lys Cys Ile Glu Trp Glu Lys Ala Gln His Gly Ala Cys His Lys Arg
50 55 60
Glu Ala Gly Lys Glu Ser Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Ser Lys Ser
65 70 75 80
Pro Pro Gly Ala Thr Pro Ala Pro Pro Gly Ala Ser Pro Pro Pro Ala
85 90 95
Ala Gly Gly Ser Pro Pro Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro
100 105 110
Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro
115 120 125
Pro Ser Ala His
130
<210> 5
<211> 399
<212> DNA
<213> Artemisia vulgaris
<400> 5
atggcaaagt gttcatatgt tttctgtgcg gttcttctga ttttcatact tgctatcgga 60
gaaatagagg ccgctggttc aaagctgtgt gaaaagacaa gcaagacgta ttcaggtaag 120
tgcgacaaca agaaatgtga caaaaagtgt atagaatggg agaaagcaca acatggtgct 180
tgtcacaaga gagaagccgg taaagaaagt tgcttttgct actttgactg ttccaaatcg 240
cctcctggag cgacaccagc gcctcctgga gcatctcctc ccccagctgc tggcggctct 300
ccaccacctc ccgccgatgg tggctcacca cctcctccag ctgatggtgg atctcctcct 360
gccgatggtg gctctccacc tcctccgtcc gctcactaa 399
<210> 6
<211> 132
<212> PRT
<213> Artemisia vulgaris
<400> 6
Met Ala Lys Cys Ser Tyr Val Phe Cys Ala Val Leu Leu Ile Phe Ile
1 5 10 15
Leu Ala Ile Gly Glu Ile Glu Ala Ala Gly Ser Lys Leu Cys Glu Lys
20 25 30
Thr Ser Lys Thr Tyr Ser Gly Lys Cys Asp Asn Lys Lys Cys Asp Lys
35 40 45
Lys Cys Ile Glu Trp Glu Lys Ala Gln His Gly Ala Cys His Lys Arg
50 55 60
Glu Ala Gly Lys Glu Ser Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Ser Lys Ser
65 70 75 80
Pro Pro Gly Ala Thr Pro Ala Pro Pro Gly Ala Ser Pro Pro Pro Ala
85 90 95
Ala Gly Gly Ser Pro Pro Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro
100 105 110
Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro
115 120 125
Pro Ser Ala His
130
Claims (21)
- SEQ ID NO:2에 나타낸 서열을 가진 알레르겐 Art v 1a을 코딩하는 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 서열을 가진 것인 재조합 DNA 분자.
- SEQ ID NO:4에 나타낸 서열을 가진 알레르겐 Art v 1b을 코딩하는 재조합 DNA 분자.
- 제3항에 있어서, 상기 DNA 분자는 SEQ ID NO:3의 뉴클레오타이드 서열을 가진 것인 재조합 DNA 분자.
- SEQ ID NO:6에 나타낸 서열을 가진 알레르겐 Art v 1c을 코딩하는 재조합 DNA 분자.
- 제5항에 있어서, 상기 DNA 분자는 SEQ ID NO:5의 뉴클레오타이드 서열을 가진 것인 재조합 DNA 분자.
- 삭제
- 삭제
- (a) 제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 Art v 1을 Art v 1 알레르겐이 숙주 세포에 의하여 발현되도록 코딩하는 DNA를 함유하는 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 배양하는 공정과,(b) 상기 Art v 1 알레르겐을 분리하는 공정을 포함하는 재조합 Art v 1 알레르겐의 제조 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 재조합 알레르겐은 글리코실화한 것인 방법.
- 삭제
- 제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 DNA 분자를 삽입체로서 함유하는 복제 가능한 진핵 또는 원핵 발현 벡터.
- 제12항에 따른 발현 벡터를 포함하는 진핵 또는 원핵 숙주세포.
- 제13항에 있어서, 상기 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 것인 숙주 세포.
- 제13항에 있어서, 상기 숙주 세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것인 숙주 세포.
- 제13항에 있어서, 상기 숙주 세포는 식물 유래인 것인 숙주 세포.
- 제16항에 있어서, 상기 숙주 세포는 담배 (Nicotiana)의 세포 배양물인 것인숙주세포.
- 숙주 식물체가 담배(Nicotiana) 식물인, 제12항에 따른 진핵 발현 벡터를 포함하는 숙주 식물체.
- 알레르기성 환자의 진단 및 치료용 제품을 제조하기 위하여 제9항 기재의 방법에 의하여 제조된 재조합 Art v 1 알레르겐.
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ATA539/98 | 1998-03-26 | ||
| AT0053998A AT407048B (de) | 1998-03-26 | 1998-03-26 | Rekombinantes hauptallergen des pollens von artemisia vulgaris (beifuss) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010042199A KR20010042199A (ko) | 2001-05-25 |
| KR100594643B1 true KR100594643B1 (ko) | 2006-06-30 |
Family
ID=3493301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020007010686A KR100594643B1 (ko) | 1998-03-26 | 1999-03-25 | 아르테미샤 불가리스(쑥) 화분으로부터의 재조합 주요 알레르겐 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6984726B1 (ko) |
| EP (1) | EP1068323B1 (ko) |
| JP (1) | JP4233757B2 (ko) |
| KR (1) | KR100594643B1 (ko) |
| AT (1) | AT407048B (ko) |
| AU (1) | AU768681B2 (ko) |
| CA (1) | CA2324165C (ko) |
| DE (1) | DE59909811D1 (ko) |
| DK (1) | DK1068323T3 (ko) |
| ES (1) | ES2224616T3 (ko) |
| NO (1) | NO325952B1 (ko) |
| SI (1) | SI1068323T1 (ko) |
| WO (1) | WO1999049045A2 (ko) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1369483A1 (en) * | 2002-06-04 | 2003-12-10 | BIOMAY Produktions- und Handels- Aktiengesellschaft | Allergen from mugwort pollen |
| EP2110383A1 (en) * | 2008-04-14 | 2009-10-21 | Biomay AG | Hypoallergenic variants |
| CN116410276A (zh) * | 2021-12-30 | 2023-07-11 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组北艾花粉i型变应原及其制备方法和应用 |
| CN114933642B (zh) * | 2022-06-30 | 2023-09-12 | 吉林大学中日联谊医院 | Art v 1重组蛋白及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT402505B (de) * | 1995-08-02 | 1997-06-25 | Biomay Prod & Handel | Rekombinantes 60 kda pflanzliches panallergen (kofaktor-unabhängige phosphoglyceratmutase; e.c. 5.4.2.1.) |
-
1998
- 1998-03-26 AT AT0053998A patent/AT407048B/de not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-25 JP JP2000538006A patent/JP4233757B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-25 CA CA2324165A patent/CA2324165C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-25 SI SI9930643T patent/SI1068323T1/xx unknown
- 1999-03-25 ES ES99911505T patent/ES2224616T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-25 WO PCT/AT1999/000081 patent/WO1999049045A2/de active IP Right Grant
- 1999-03-25 AU AU30176/99A patent/AU768681B2/en not_active Ceased
- 1999-03-25 US US09/647,234 patent/US6984726B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-25 KR KR1020007010686A patent/KR100594643B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-03-25 DE DE59909811T patent/DE59909811D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-25 EP EP99911505A patent/EP1068323B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-25 DK DK99911505T patent/DK1068323T3/da active
-
2000
- 2000-09-21 NO NO20004727A patent/NO325952B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002508943A (ja) | 2002-03-26 |
| CA2324165A1 (en) | 1999-09-30 |
| AT407048B (de) | 2000-11-27 |
| DE59909811D1 (de) | 2004-07-29 |
| JP4233757B2 (ja) | 2009-03-04 |
| DK1068323T3 (da) | 2004-11-01 |
| ES2224616T3 (es) | 2005-03-01 |
| EP1068323B1 (de) | 2004-06-23 |
| AU3017699A (en) | 1999-10-18 |
| KR20010042199A (ko) | 2001-05-25 |
| NO20004727L (no) | 2000-11-03 |
| ATA53998A (de) | 2000-04-15 |
| CA2324165C (en) | 2011-01-04 |
| US6984726B1 (en) | 2006-01-10 |
| AU768681B2 (en) | 2003-12-18 |
| WO1999049045A3 (de) | 2000-02-10 |
| NO20004727D0 (no) | 2000-09-21 |
| WO1999049045A2 (de) | 1999-09-30 |
| NO325952B1 (no) | 2008-08-25 |
| SI1068323T1 (en) | 2004-12-31 |
| EP1068323A2 (de) | 2001-01-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3290651B2 (ja) | 新規の蛋白質及びその製法 | |
| JP2783385B2 (ja) | ヒト血管浸透性因子のｃＤＮＡ | |
| KR100260342B1 (ko) | 더마토파고이드로 부터 유래된 알레르겐의 t세포 에피토프 | |
| Fukumori et al. | Primary structure of a fucose-specific lectin obtained from a mushroom, Aleuria aurantia | |
| Cameron et al. | Purification to homogeneity and amino acid sequence analysis of two anionic species of human interleukin 1. | |
| Yuuki et al. | Cloning and expression of cDNA coding for the major house dust mite allergen Der f II in Escherichia coli | |
| Duro et al. | cDNA cloning, sequence analysis and allergological characterization of Par j 2.0101, a new major allergen of the Parietaria judaica pollen | |
| CA2037333C (en) | Dna encoding a major mite allergen and the use thereof | |
| Butkowski et al. | Characterization of type IV collagen NC1 monomers and Goodpasture antigen in human renal basement membranes | |
| WO1992002621A2 (en) | Allergens of alder pollen and applications thereof | |
| KR100594643B1 (ko) | 아르테미샤 불가리스(쑥) 화분으로부터의 재조합 주요 알레르겐 | |
| Klotz et al. | Comparative sequence of myosin light chains from normal and hypertrophied human hearts. | |
| CA2128215C (en) | Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy | |
| CA2152210C (en) | Modified epimorphin | |
| CA2370393C (en) | Dna sequence, and recombinant production of a gramineae allergen | |
| Fincham et al. | Isolation and partial characterization of a human amelogenin from a single fetal dentition using HPLC techniques | |
| AU680820B2 (en) | T cell epitopes of the major allergens from dermatophagoides(house dust mite) | |
| CA2121134A1 (en) | Novel thrombin-inhibitory protein from ticks | |
| Bolzacchini et al. | Purification and molecular weight studies on the components of a Parietaria pollen extract | |
| US7285650B2 (en) | Cloning and sequencing of the allergen Dac g5 of Dactylis glomerata pollen, its preparation and its use | |
| WO2003080837A1 (es) | PRODUCCIÓN DEL ALERGENO RECOMBINANTE DE CHENOPODIUM ALBUM Che a 1, Y SISTEMA DE AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN | |
| CAMERON | PURIFICATION TO HOMOGENEITY AND AMINO ACID SEQUENCE ANALYSIS OF TWO ANIONIC SPECIES OF HUMAN INTERLEUKIN 1 BY PATRICIA M. CAMERON,* GUADALUPE A. LIMJUCO,* JAYNE CHIN,* LESLIE SILBERSTEIN,* AND JOHN A. SCHMIDT | |
| CN1318100A (zh) | 新的人肝癌细胞衍生生长因子编码序列、其编码的多肽及制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130408 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140415 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |