KR100578525B1 - 아실화 호모세린 락톤 분해 단백질 및 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 밀도인식 신호전달 물질인 아실화 호모세린 락톤(AHLs)을 분해하는, 토양으로부터 분리한 신규한 미생물, 상기 미생물에서 유래하는 AHLs를 분해하는 활성을 가지는 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자 및 상기 분리한 미생물, 유전자 또는 효소를 이용하여 병원성 미생물을 생물학적으로 제어하는 방법에 관한 것이다.

상기의 새로운 병원성 미생물 생태학적 접근 방법은 기존의 문제점인 농약의 잔류 및 항생제 내성 등의 해결과 병원성 미생물의 환경 친화적인 제어에 관한 것이다.

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Description

아실화 호모세린 락톤 분해 단백질 및 유전자{Protein and Gene Degrading AHL}

도 1은 분리된 IBN110 균주의 Biolog 분석조건 및 결과를 보여주는 도표.

도 2은 유일 탄소원으로 N-3-oxohexanoylhomoserine lactone (OHHL)을 함유하는 최소배지에서의 Arthrobacter sp. IBN110 균주의 생장을 보여주는 그래프.

도 3은 유일 질소원으로 OHHL을 함유하는 최소배지에서의 Arthrobacter sp. IBN110 균주의 생장을 보여주는 그래프 및 잔류 OHHL 분석사진.

도 4A 및 4B는 IBN110 균주에 의한 다양한 AHLs의 분해 활성을 보여주는 그래프 및 사진.

도 5는 IBN110 균주로부터 부분 정제된 단백질의 AHL-분해 활성을 보여주는 사진.

도 6은 AHL-분해효소를 코딩하는 ahID 유전자의 핵산서열 및 아미노산 서열.

도 7은 재조합 AhID가 발현된 E.coli에 의한 다양한 AHLs의 분해 활성을 보여주는 사진.

도 8은 Arthrobacter sp. IBN110에 의한 E. carotovora N98 유래의 병원성 감쇄현상을 보여주는 사진.

도 9는 어병 병원균이 분비하는 AI 종류를 보여주는 TLC 결과 사진.

본 발명은 밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤(acylated homoserine lactone; AHL)을 분해하는, 토양으로부터 분리한 신규한 미생물, 상기 미생물에서 유래하는 AHLs를 분해하는 활성을 가지는 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자 및 상기 분리한 미생물, 유전자 또는 효소를 이용하여 병원성 미생물을 생물학적으로 제어하는 방법에 관한 것이다.

많은 그람 음성세균은 Quorum-sensing 메카니즘에 의해 집단의 밀도를 모니터하고, 세균 세포밀도에 따라 특정한 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이러한 신호 메카니즘은 작고 확산성인 신호분자인 AHLs에 의해 결정되는데, 이러한 AHLs은 homoserine lactone ring을 공통의 구조로 가지고 있지만, 아실측쇄의 길이 및 그 치환여부에 각각 차이가 있다.

높은 집단밀도(population density)에서 축적된 AHLs은 특정 regulator에 결합하고, bioluminescence, swarming, antibiotic biosynthesis 및 biofilm differentiation을 포함하는 다양한 유전자의 발현을 유발한다. 특히 Quorum-sensing 시스템은 Erwinia carotovora와 Pseudomonas aeruginosa를 포함하는 병원 성 세균의 병원성(virulence) 유전자의 발현조절에 중요한 역할을 한다. AHLs를 매개로 하는 신호전달 메카니즘은 많은 병원성 세균에 광범위하게 존재하며 그 기작이 매우 유사하기(conserved) 때문에, 새로운 항-감염요법의 매력적인 대상이 되고 있다.

최근, AHL 분자의 효소적 분해에 의해 Quorum-sensing 시스템을 파괴시킬 수 있는 다양한 Bacillus cereus 세균들이 발견되었다. 바실러스 속 240B1의 AHL-lactonase인 AiiA를 발현하는 E.carotovora가 식물-병원성을 감쇄시켰으며, AiiA를 발현하는 형질전환 식물은 식물 병원균 E.carotovora에 저항성을 보였다. 또한 AHL을 유일 탄소원으로 대사하는 그람음성 Variovorax parodoxus는 aminoacylase로 추정되는 효소로 AHL을 분해할 수 있음이 밝혀졌다.

Quorum-sensing은 그람음성균에서의 AHLs를 매개로 하는 다양한 생물학적 기능을 조절하는 신호 메카니즘으로 알려져 있으며, 현재까지 AHL를 대사하는 그람양성균은 알려진 바 없다. 본 발명은 AHL을 대사할 수 있는 신규한 그람양성균에 관한 것이다.

지금까지 농작물의 세균병을 제어하기 위해서 화학농약 및 항생제가 일반적으로 이용되어 왔다. 그러나, 상기의 화학농약 및 항생제의 사용은 토양내의 약물잔류, 유용미생물 사멸, 항생제 내성 균주의 출현 등의 문제점을 안고 있다. 이러한 문제점들을 극복할 수 있는 한 방법으로서 병원성 미생물의 밀도인식 신호 전달 체계를 target으로 하는 새로운 방법이 대두되고 있다.

곤충들이 페로몬이라는 화학물질을 분비하여 배우자를 유인하거나 공격 신호를 보내는 것처럼, 미생물도 병 발생과 관련된 신호물질을 분비하는 것이 호흡기 감염 병원균인 슈도모나스 에어로기노사(Pseudomonas aeroginosa)에서 발견되었다. 그람음성 세균에서 대표적인 신호물질은 AHL류인데, 주로 동식물 병원성 세균의 병원성을 유발시키는 유전자의 발현에 관여하고, 이로 인해 병이 유발되게 한다.

AHL의 종류로는 OHHL(N-β-oxo-hexanoyl-L-homoserine lactone), OOHL(N-β-oxo- octanoyl-L-homoserine lactone), ODHL(N-β-oxo-decanoyl-L-homoserine lactone), HHL(N- hexanoyl-L-homoserine lactone), BHL(N-butanoyl-homoserine lactone) 등이 있다.

섬유성 낭포증 환자의 호흡기 감염을 유발하는 슈도모나스 에이로기노사 (Pseudomonas aeroginosa)의 경우, 상기의 아실화 호모세린 락톤에 의한 병발 신호 전달 기작이 자세히 밝혀져 있으며, 이러한 기작의 교란을 통한 새로운 항생제 개발이 진행 중에 있다.

또한, 한국특허출원 제 10-1997-706614호에 아실화 호모세린 락톤을 미생물 상호간의 신호전달의 매개체로 활용하여 병원성미생물을 제어하고자 하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 특허는 아실화 호모세린 락톤 자체의 저해를 통해 병원성 미생물을 제어하는 것이 아니라 아실화 호모세린 락톤과 구조적으로 유사한 퓨라논(furanone) 및 그 유도체를 사용하여 아실화 호모세린 락톤의 조절단백질과 의 결합을 경쟁적으로 방해함으로써 병원성 미생물을 제어하는 방법에 관한 것이다. 아직까지 아실화 호모세린 락톤 자체의 저해에 대해서는 연구된 바가 없다.

본 발명은 미생물 상호간의 밀도 인식 신호 물질인 아실화 호모세린 락톤을 분해하는 효소를 함유한 미생물 제공하는데 목적이 있다.

또한 본 발명은 상기 미생물에서 유래하는 AHLs를 분해하는 활성을 가지는 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 분리한 미생물, 유전자 또는 효소를 이용하여 병 발생 신호 물질을 분해시킴으로서, 미생물간의 병 발생 신호 전달을 근원적으로 차단하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 미생물 밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤을 분해하는 능력을 가지고 있는 Arthrobacter 속 균주 IBN110 (KCTC 10329BP)를 제공한다.

상기 균주는 다음과 같은 과정을 거쳐 선별·분리하였다. 먼저, 다양한 지역에서 수집한 토양시료를 아실화 호모세린 락톤류가 유일한 탄소원으로 첨가된 최소액체배지에 접종하고 계대배양하여 시료에 함유된 목적 미생물만을 증균배양(enrichment)하였다. 배양액을 영양한천배지에 도말하고 배양하여 얻은 콜로니들을 다시 아실화 호모세린 락톤류가 유일한 탄소원으로 첨가된 최소액체배지에 접종·계대배양하여 최종적으로 가장 생장율이 우수한 균주를 선별·분리하였다.

분리된 균주 IBN110은 16S rDNA 서열의 분석, Biolog 분석 등의 결과로 보아 본 발명에 의한 균주 IBN110은 그람양성균인 아스로박터 속(Arthrobacter sp.)에 속하는 것으로 확인되었다.

하기 실시 예에 기재되어 있듯이, 본 발명에 의한 분리 균주는 OHHL에서 빠르게 생장하며, 아실측쇄(acyl side chain)의 길이나 그 치환여부와 관계없이 HHL과 OHHL 등 다양한 아실화 호모세린 락톤류를 효과적으로 분해할 수 있다.

본 발명은, 상기 AHL-분해 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 이러한 유전자의 일 예로서, 본 발명자들은 본 발명에 의한 IBN110 균주로부터 AHL 분해를 촉매하는 효소를 코딩하고 있는 ahID 유전자를 클로닝하고 서열을 분석하였다. ahID는 273개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩하는 822bp의 염기(전사종결코돈 포함)로 이루어져 있다. 상기 유전자의 염기서열로부터 추정된 N-터미널 아미노산 서열은 상기 AHL-분해 단백질의 화학적 분석에 의한 서열과 동일하였다.

상기 염기서열로부터 추정된 아미노산 서열은, 이미 알려진 AHL-분해효소인 Bacillus 속 240B1에서의 AiiA, Bacillus thuringieusis 아종 Kyushuensis에서의 AiiA 유사체, Agrobacterium tumefaciens에서의 AttM 등의 아미노산 서열과 매우 상이하였다. 그러나 AhlD는 위의 AHL-분해효소들처럼 AHL 분해 활성에 필요한 것으로 판단되는 모티프 (motif)인 HXDH~H~D가 동일한 것으로 나타났다.

또한 본 발명은 상기 AHL의 분해를 촉매하는 단백질(효소)을 제공한다. AHL-분해효소는 약 31kD의 크기의 273개 아미노산으로 이루어져 있으며, 그의 N-말단 아미노산 서열은 NH2-Met-Glu-Lys-Asp-Gln-Leu-Lys-Val 이다. AHL-분해단백질의 아미노산 서열의 일 예를 서열 1에 나타내었다. 여기서 상기 활성 모티프인 HXDH~H~D는 2차원 서열상에서 볼 때, 129∼132번째 아미노산인 His-Leu-Asp-His, 188번째 아미노산인 His 및 210번째 아미노산인 Asp로 이루어져 있다. 따라서 본 발명에 의한 AHL-분해효소는 효소 활성에 필요한 상기 모티프를 필수적으로 포함하면서, 서열의 크기 및/또는 서열의 순서에 있어서 상기 서열 1과 소정의 상동성, 예를 들면, 60% 이상의 상동성이 있고 AHL-분해 능력이 있는 단백질을 의미한다. 이때 상기 상동성은 80% 이상인 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 상기 AHL-분해효소는 효소 활성에 필요한 상기 모티프를 필수적으로 포함하면서, 서열의 크기 및/또는 서열의 순서에 있어서 상기 서열 1과 소정의 상동성을 가지고 있는 AHL-분해능력 있는 단백질이므로, 상기 모티프의 절대적 위치(전체 서열상에서의 순위)가 중요한 것이 아니고, 상기 모티프를 형성하는 아미노산의 서열 및 이들의 상대적 위치가 중요하다. 즉, 본 발명에 의한 상기 AHL-분해효소는 His-Leu-Asp-His, His 및 Asp로 구성되는 필수 모티프를 가진다는 점에 특징이 있는 것이다.

본 발명은 또한 상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. T7 프로모터에 결합된 ahID 유전자가 삽입된 벡터에 의한 재조합 E.coli는 각종의 AHLs에 대해 강한 분해활성을 보인다.

한편, 종래 발표된 논문(Dong, Y. H., L. H. Wang, J. L. Xu, H. B. Zhang, X. F. Zhang, and L. H. Zhang. 2001. Nature (London) 411:813-817; Lee, S. J., S. Y. Park, J. J. Lee, D. Y. Yum, B. T. Koo, and J. K. Lee. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:3919-3924 등) 및 본 발명의 출원인 연구진의 연구 결과(대한민국 특허출원 제10-2001-73348호로 출원됨)에 의하면, 아실화 호모세린 락톤(AHLs)을 분해하는 능력을 갖는 균주, 따라서 AHLs를 분해하는 효소는 병원성 미생물의 병 발생 유도체(Autoinducer)인 AHLs를 분해할 수 있어 실제 병 발생이 억제·제어됨이 명백하다. 예를 들면, 감자무름병 병원성 균주인 어위니아 카로도보아(Erwinia carotovora)에 적용한 결과 감자무름병이 현저하게 감소되었다.

또한 어병 병원균인 에드워드시엘라 종(Edwardsiella strains), 비브리오 종(Vibrio strains), 에어로모나스 종(Aeromonas strain)을 배양하여 조사한 결과 이들의 병 발생 신호물질이 AHL의 일종인 BHL(N-butanoyl-homoserine lactone)과 HHL로 확인되었다. 따라서 AHLs 분해능이 있는 균주, 따라서 AHLs 분해효소는 상기 BHL 및 HHL를 분해할 수 있기 때문에 에드워드시엘라 종(Edwardsiella strains), 비브리오 종(Vibrio strains), 에어로모나스 종(Aeromonas strain) 등에 의해 유발되는 어병을 억제·제어할 수 있음을 강하게 시사한다.

그러므로, 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 전술한 균주 IBN110, 상기 재조합 균주 또는 상기 AHL-분해효소를 식물 또는 동물의 표면에 스프레이 하는 등의 방법으로 살포·접종하여 병원성 미생물에 대한 저항성을 유도 또는 증강시킴으로써 식물 또는 동물의 세균병 발생을 억제하거나 치료하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 전술한 균주 IBN110, 상기 재조합 균주 또는 상기 AHL-분해효소를 주요 성분으로 포함하는 식물 또는 동물의 세균병 발생 억제-치료제, 이를 함유하는 동물용 사료, 비료, 농약 등을 제공한다.

이하, 실시 예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 아실화 호모세린 락톤 분해 미생물 분리 및 동정

밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤(AHL)을 분해하는 미생물을 선별하기 위하여, 대한민국 각지에서 채취한 430종의 토양시료를 최소배지에서 증균배양(enrichmenet culture)을 수행하였다.

토양시료 50mg을 유일 탄소원으로 2.5mM OHHL, 질소원으로 NH₄Cl이 함유된 최소배지(NaCl 1.5g/L, KCl 0.4g/L, MgCl2·6H₂O 0.4g/L, CaCl₂·2H₂O 0.3g/L, KH₂PO₄ 0.2g/L, Na₂SO₄ 0.1g/L. MES 1g/L. NH₄Cl 0.2g/L, HCl 100mM, FeSO₄·7H₂O 7.5mM, H₃BO₃ 0.5mM, MnCl₂·4H₂O 0.5mM, CoCl₂·6H ₂O 0.8mM, NiCl₂·6H₂O 0.1mM, CuCl₂·2H₂O 0.01mM, ZnSO₄·7H₂O 0.5mM, Na₂MoO ₄·2H₂O 0.15mM, Na₂SeO₃·5H₂O 0.02mM, Na₂WO₄·2H₂O 0.02mM, pH 6.0) 2ml에 접종하였다. 30℃에서 48시간 배양한 후, 각각 최소배지 190㎕가 들어있는 96 well plate에 상기 배양액 10㎕(5% v/v)를 접종하여 동일한 조건으로 연속배양하였다. 3차 연속배양 후에 혼탁 배양액(sample)을 영양한천배지(nutrient agar plate)에 도말하였다. 각각의 plate에서 상이한 형태를 보이는 콜로니를 OHHL 함유 최소배지 및 OHHL 비함유 최소배지가 든 96 well plate에 각각 접종하고 반복하여 배양하였다. 3차 연속배양 후, 흡광도계(SPECTRAMAX190, Molecular Devices 사 제품)로 600nm에서의 각 배양액(sample)의 흡광도를 측정하였다. OHHL 함유 최소배지에서 높은 흡광도(즉, 높은 생장)를 나타내는 균주인 IBN110 균주를 분리하였다.

분리한 AHL 분해 균주를 동정하기 위하여 16S rDNA 서열분석 및 Biolog 분석을 수행하였다.

(1) 16S rDNA 서열분석

통상의 방법으로 분리된 균주의 16S rDNA 서열을 분석한 결과(서열 3), IBN110 균주의 16S rDNA 서열은 그람양성균 Arthrobacter sp.와 97∼99% 동일성을 나타내었고, Arthrobacter 그룹, 특히 A. nicotinovorans와 A. histidinolvorans과 계통유전학적으로 같은 군에 속함을 확인하였다.

(2) Biolog 분석 및 기타 분석

통상의 방법으로 분리된 균주의 특성을 Biolog 분석을 통해 조사하였다. 분석조건 및 결과를 도 1에 도시하였다.

그람염색 결과 분리된 균주는 그람양성인 것으로 밝혀졌다.

이상과 같은 여러 가지 분석 결과, 상기 선별 분리된 균주는 아스로박터 속(Arthrobacter sp.)에 속하는 것으로 확인되었다. 따라서 AHL-분해하는 IBN110 균주를 Arthrobacter sp. IBN110으로 명명하고, 2002년 08월 27일에 생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 10329BP로 기탁하였다.

실시예 2: IBN110 균주의 AHL를 이용한 생장성 실험

(1) Arthrobacter sp. IBN110의 OHHL에서의 생장을 조사하기 위하여 유일 탄소원으로서 OHHL이 2.5mM 포함된 최소배지에서 상기 분리된 균주의 생장을 조사하였다.

세포생장은 600nm의 흡광도로 측정하였다. 배지에 남아있는 잔류 OHHL의 측정을 위하여, 생장과정 동안 시간대 별로 배양액의 상등액을 수집하여 10 내지 1000배 희석하고 소정양을 A.tumefaciens NT1(PDCI51E33)-overlaid plate(bioassay 고체배지)의 홀에 로딩하여 배양한 후 형성된 푸른색 원의 지름(x)을 측정하였다. bioassay의 구체적인 방법을 하기 (2)에 서술하였다.

사전에 bioassay 고체배지에서 OHHL 농도에 따른 생성된 푸른색 원(violacein zone)의 직경(x)의 관계를 분석하여 얻어진 아래의 상관관계식을 활용하여 실제 AHLs의 잔류농도를 계산하였다. AHLs이 종류에 따른 상관관계식은 각각 아래와 같다.

OHHL 농도(pmole) = 0.0335e^1.3679× (신뢰도 R²=0.9952)

OHL 농도(pmole) = 0.0137e^1.7206x (신뢰도 R²=0.9973)

OdDHL 농도(pmole) = 0.0195e^1.5185x (신뢰도 R² = 0.9937)

유일 탄소원이 OHHL인 경우에 상기 균주의 배증시간(doubling time)은 2.1시간이었다. 세포 농도가 증가함에 따라 배양배지 중의 잔류 OHHL가 급격히 감소하여 대부분의 OHHL은 배양 10시간만에 모두 소모되었다(도 2). 도면에서, ●는 OHHL을 함유하는 배지에서의 균주생장을, ○는 OHHL을 함유하지 않은 배지에서의 균주생장을 나타내며, ◆는 배양액 중의 OHHL 잔류농도를 나타낸다. 도면에서 볼 수 있듯이, OHHL이 없는 최소배지에선 균주의 생장이 관찰되지 않았으며, 소모되는 OHHL의 양과 균주의 농도는 상당한 정도로 반비례관계에 있음을 알 수 있다.

AHL의 반감기는 알칼리 조건(pH 8.0)에서 3시간 이내인 것으로 알려져 있다. 25시간 배양하는 동안 배양배지의 pH가 중성부근(pH 6.5∼7.2)으로 유지(자료 생략)되었는데, 이것으로 보아, pH의 변화와 OHHL의 급격한 감소는 상호 연관관계가 없는 것으로 판단되었다.

탄소원으로 0.2% 포도당과 유일 질소원으로 0.5mM OHHL이 함유된 최소배지(다른 질소원을 첨가하지 않음)에서 Arthrobacter sp. IBN110을 배양하였다. 이때 상기 균주는 대부분의 OHHL를 이용하였다(도 3). 도 3에서 (A)는 배양기간 동안 균주의 성장을 보여주는 그래프이며, (B)는 배양 초기와 말기의 배양액 중 OHHL의 농도를 bioassay한 결과를 보여주는 사진이다. 사진에서 S는 배양 초기(start)의 배양액을 1000배 희석한 것을, L은 배양 24시간 경과 후(last)의 배양액을 10배 희석한 것을 각각 5 ㎕ 씩 로딩한 것이다.

이는, Arthrobacter sp. IBN110가 OHHL을 유일 탄소원으로 뿐만 아니라 유일 질소원으로 대사를 할 수 있다는 사실을 보여준다.

(2) bioassay

30℃, LB배지에서 24시간 동안 배양한 Chromobacterium vioaceum CVO26 또는 Agrobacterium tumefaciens NT1(pDCI41E33)을 LB-고체배지 위에 overlay 하였다. LB 플레이트에 hole을 만든 다음, hole에 배양시간대 별로 채취한 배양액 시료 20㎕를 올려놓았다. 상기 bioasaay용 고체배지를 30℃에서 24시간 배양한 다음, hole 주변에 생긴 푸른색의 바이오라세인 존(violacein zone)의 직경을 구하여 AHL의 잔존량을 측정하였다.

실시예 3: IBN110 균주의 다양한 AHL-분해 활성 bioassay

Arthrobacter sp. IBN110의 AHL에 대한 기질 범위를 알아보기 위하여, 세포 수준(whole cell)에서 다양한 AHLs에 대한 분해능을 조사(assay)하였다.

AHL에 속하는 기질 중에서, BHL(N-butanoyl-L-homoserine lactone), OHL(N-octanoyl-L-homoserine lactone), DHL(N-decanoyl-L-homoserine lactone) 및 OdDHL(N-3-oxododecanoyl-lactone)은 Quorum Sciences사에서 구입하여 사용하였으며, HHL(N-hexanoyl-L-homoserine lactone)과 OHHL(N-3-oxohexanoyl-L-homoserine lactone)은 종래 알려진 방법(Zhang, L., P. J. Murphy, A. Kerr, and M. E. Tate. 1993. Agrobacterium conjugation and gene regulation by N-acyl-L-homoserine lactones. Nature (London) 362:446-448)에 따라 직접 합성하여 사용하였다.

전체 세포 분석(whole cell bioassay)을 위해, 하룻밤 배양된 IBN110 균주를 회수(harvest)하여 100mM Tris-HCl(pH 7.0)에 OD₆₀₀=1.0이 되도록 재현탁하였다. 세포현탁액 50㎕와 40mM AHLs 용액 50㎕를 혼합하고, 천천히 교반하면서 30℃에서 3시간 배양한 후, 배양액을 95℃에서 5분간 가열하여 반응을 중지시켰다.

반응이 중지된 배양액을 적당한 농도로 희석시킨 다음, A.tumefaciens NT1(pDCI41E33)-overlaid plate나 C.violaceum CVO26-overlaid plate의 홀에 로딩하여 추가배양한 다음 color zone의 크기를 측정하였다. 잔류 AHLs의 양은 color zone의 크기와 AHLs의 양과의 관계식(전기 실시예2 참조)으로부터 계산하여 도 4A에 도시하였다. 도면에서, ●, ■ 및 ▲는 각각 OHHL, OHL 및 OdDHL의 농도를 나타내며, 대조구(◆)는 열처리 한 배양액 상등액과 40μM OHHL이 동량 혼합된 반응물에서 OHHL의 농도이다.

도 4A에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 균주 IBN110는 아실측쇄(acyl side chain)의 길이나 그의 치환여부에 관계없이, 실험된 3 종의 AHLs(OHHL, OHL 및 OdDHL)를 효과적으로 분해하였다. 특히 OHL은 배양개시 후 30분 이내에 모두 분해되었다. 그러나 가열 처리된 Arthrobacter sp. IBN110는 OHHL를 분해하지 못했다.

또한 상기 균주는 BHL, HHL 및 DHL도 분해하였다(도 4B). BHL, HHL 및 DHL의 농도를 각각 400μM, 40μM 및 40μM로 한 것을 제외하고는 위와 동일한 방식으로 진행하였다. 즉, 세포현탁액 50㎕와 40μM AHLs 용액 50㎕를 혼합하고, 천천히 교반하면서 30℃에서 3시간 배양한 후, 배양액을 95℃에서 5분간 가열하여 반응을 중지시켰다(C). 각각 10 nmole의 BHL, 300 pmole의 HHL 및 200 pmole의 DHL를 대조군으로 하였다(C). BHL와 HHL의 분해도 assay는 C. violaceum CV026를, DHL의 분해도 assay는 A. tumefaciens NT1(pDCI41E33)를 이용하여 결정하였다. 도에서 볼 수 있듯이, 3시간 배양에 의해 대부분의 AHLs가 분해 제거됨을 확인할 수 있었다.

이상의 실시예 1, 2 및 3의 실험결과로부터, 상기 균주가 효소반응에 의해 다양한 범위의 AHLs를 분해할 수 있는 능력을 가지고 있음을 확인할 수 있다. 즉, 분리한 IBN110 균주는 각종의 AHLs를 분해할 수 있고, 이를 이용하여 성장할 수 있음을 알 수 있다.

따라서 본 발명에 의한 균주 IBN110, AHL-분해효소 및 AHL-분해효소를 분비하는 재조합 미생물을 식물 또는 동물의 표면에 스프레이하는 등의 방법으로 살포·접종하거나, 본 발명에 의한 AHL-분해효소를 동물체에 주사하거나 복용시키는 등 의 경우, 상기 분해효소 또는 균주가 생산한 분해효소가 병원성 미생물의 신호물질을 분해함으로써 병에 대한 저항성을 유도하거나, 저항성을 증강시킬 수 있음을 추론할 수 있다. 또한 본 발명에 의한 균주, AHL-분해효소 및 AHL-분해효소를 분비하는 재조합 미생물을 주요 성분으로 포함하는 식물 또는 동물의 세균병 발생 억제-치료제, 이를 함유하는 동물용 사료, 비료, 농약 등이 가능할 것이다.

나아가 본 발명에 의한 균주 IBN110, AHL-분해효소 및 AHL-분해효소를 분비하는 재조합 미생물을 이용하여, 인간을 포함하는 동물의 호흡기에 섬유성 낭포증을 유발하는 슈도모나스 에이로기노사(Pseudomonas aeroginosa)에 의한 세균병 발생을 억제-치료하는 의약품을 제조하는 것도 가능할 것이다.

실시예 4: IBN110 균주의 AHL-분해효소의 정제 및 N-말단 서열분석

본 발명에 의한 IBN110 균주의 AHL-분해효소를 정제하고 그의 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다.

(1) 배양액에서 수확한 세포들을 10mM phenylmethlsulfonyl fluoride를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH7.0)에 현탁하였다. 현탁세포를 260MPa 압력의 French pressure 장치(FA-030, Aminco사 제품)에 3회 통과시켜 세포를 파괴하였다. 세포 파쇄물을 40∼70% 암모늄 설페이트용액으로 처리하여 단백질을 침전·수득하였다. 수득한 단백질 샘플을 10mM Tris-HCl(pH7.0)에 녹이고 같은 버퍼용액에서 투석하였다. 투석결과물을 DEAE-Sepharose CL-6B column(Pharmacia사 제품)에 로딩한 후 Nacl 농도구배액(0∼1M)으로 용출시켰다. AHL-분해 활성을 나타내는 분획을 모아 서 Centriprep-10 tube(Millipore사 제품)로 농축하였다. 농축액을 5ml Hitrap Q-sepharose column(Pharmacia사 제품)에 로딩한 후 단백질을 NaCl 농도구배액(0∼1M)으로 용출시켜서 활성 분획을 수득하였다.

각각의 분획에 대하여 효소활성과 단백질 밴드 형태를 비교하였다. 30kD 부근의 단백질의 양(intensity)과 분획들의 AHL-분해 활성이 잘 일치하였다. AHL-분해효소를 동정하기 위하여, 부분적으로 정제한 단백질들을 SDS-12% PAGE로 분리한 후(도 5의 A), 2.5% Triton X-100과 1mM ZnSO₄를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 7.0) 용액으로, 상온에서 15 분 동안 천천히 교반하면서 gel을 3회 세척하여 분리 단백질을 renaturing하였다. 염색한 동일한 겔에 나타난 밴드들에 대응하는 renaturing된 gel의 부위를 잘라서 gel 조각들을 수득하였다. 수득된 조각들을 20mM OHL 용액과 혼합하고 천천히 교반하면서 30℃에서 3시간 동안 배양하였다. 200배 희석된 시킨 반응 혼합물 30㎕(3pmole의 OHL)를 A.tumefaciens NT1(pDCI41E33)-overlaid plate에 로딩하여 효소활성을 측정하였다(도 5의 B). Renatured gel 조각을 이용한 활성 분석의 결과 도 3의 A에 나타난 3 개의 후보 단백질 중 30kD 크기의 단백질(밴드 2) 만이 AHL-분해 활성을 보였다(도 5의 B). 도 5에서 대조구(C)는 겔 조각 없이 OHL(3pmole)만을 가한 것이다.

(2) 이렇게 활성 단백질 밴드를 확인한 후, AHL-분해 활성을 갖는 단백질 샘플을 SDS-PAGE에서 polyvinylidene difluoride membrane(Bio-Rad사 제품)으로 옮겼다. 관심의 대상이 된 밴드를 잘라서 회수하고, 자동 Edman 분해장치(Procise model 491, Applied Biosystems사 제품)로 아미노-말단의 서열을 분석하였다.

분석결과, 상기 단백질의 아미노-말단의 서열은 NH2-Met-Glu-Lys-Asp-Gln-Leu-Lys-Val인 것으로 확인되었다.

실시예 5: ahlD 유전자의 클로닝

ahlD(acyl-homoserine lactone degradation) 유전자의 클로닝을 수행하였다.

많은 Bacillus cereus 그룹과 A.tumefaciens 균의 AHL-lactonase에서 zinc-binding 부위(motif)가 보존적(conserved)이라는 사실에 근거하여, 상기 보존된 부위(motif)에 해당하는 프라이머를 제작하고, Arthrobacter sp. IBN110의 전체 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.

PCR 프라이머는 AiiA 와 AttM의 추정 아미노산 서열 중에서 가장 잘 보존된(the most conserved) 서열로부터 디자인되었다. 제작된 프라이머 서열은 각각 다음과 같았다.

5'-GAGGATCCCA(C/T)CTICA(C/T)(T/G)(T/C)NGA(C/T)CA 서열 4

5'-ATGAATTCGGIGT(G/A)TGNCCNGGNGT 서열 5

(서열 중 밑줄은 각각 BamH1과 EcoR1 사이트임)

PCR 증폭은 PCR Master Mix(Roche사 제품)를 이용하여 94℃에서 30초, 50℃에서 45초, 72℃에서 45초 동안 수행하였다. PCR 증폭 결과물을 pT7Blue T-vector(TaKaRa사 제품)에 서브클로닝하였고, ABI3700 자동서열기(Applied Biosystems사 제품)으로 서열분석하였다.

PCR 결과 1 종의 PCA 산물(0.2kb)을 얻을 수 있었고, 이를 서열 분석하였다(도 6 참조). BLAST 조사 결과 0.2kb DNA 조각의 추정 아미노산 서열은 zinc-binding 부위(motif)를 가지는 metallohydrolase들과는 낮은 상동성을 보였다(자료 생략).

상기 0.2kb의 DNA 조각을 포함하는 완전한 ORF를 얻기 위하여, IBN110 균주의 genomic DNA에 대한 Kpnl 라이브러리를 만든 후, 상기 0.2kb의 DNA 조각을 탐침으로 하여 콜로니 혼성화(colony hybridization) 방식으로 스크리닝하였다. 양성 신호를 보이는 클론이 2.3kb 크기의 인서트(insert)를 가지고 있음을 확인하고 이를 서열 분석하였다. 추정 아미노산 서열로 보았을 때, 상기 2.3kb 인서트 내의 ORF는 보존된 zinc-binding 부위를 가지고 있다.

상기 ORF는, 앞에서 언급된 정제 AHL-분해효소의 크기에 대응되는, 31kD 분자량의 273개 아미노산으로 이루어진 단백질(서열 1)을 코딩하는 822bp의 염기서열(서열 2)로 이루어져 있다. 또한 상기 단백질의 추정된 아미노-터미널 서열은 앞에서 언급된 정제 단백질의 화학적 서열과 일치하였다(도 6): 도면에서, Edman 분해방법에 의해 결정된 N-말단 아미노산 서열은 박스로 표시하였고, 프라이머 디자인을 위해 이용된 서열은 밑줄로 표시하였다.

이 결과는, 상기 2.3kb 크기의 KpnI 처리 DNA 조각이 AHL-분해효소를 코딩하는 ahID 유전자 전체를 포함하고 있음을 의미한다. ahID 유전자의 위 아래방향 염기서열 분석 결과 ahID 유전자의 위쪽 방향에는 ABC transporter-유사 단백질 유전자가 아랫 방향에는 lacl repressor-유사 전사 조절유전자가 위치하였다.

본 발명에서의 상기 ahID 유전자의 핵산서열을 코드번호(Nucleotide Accession Number) AF525800로 하여 GenBank-EMBL 데이터베이스에 제출하였다.

실시예 6: E.coli 에서의 재조합 AhID의 발현

전기 ahlD 유전자로 E.coli를 형질전환시키고 AhlD의 발현을 조사하였다.

(1) 하기 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 ahID 유전자 서열을 증폭하였다.

5'-ATGGAGTCATATGGAAAAAGATCA 서열 6

5'-TCGTAGAAAGCTTCTGGTAGTGCC 서열 7

(서열 중 밑줄은 각각 Ndel과 HindIII 사이트임)

PCR 결과물을 Ndel과 HindIII로 처리한 후, 사전에 Ndel과 HindIII로 처리된 벡터 pET22b(+)(Novagen사 제품; T7 프로모터를 가지고 있음)에 라이게이션시켜 ahID 발현 벡터인 pAhID를 얻었다. pAhID를 E.coli BL21(DE3)에 도입하여 형질전환시켰다.

(2) 상기 pAhID가 도입된 E.coli BL21(DE3)를 IPTG induction후 30℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 10mM Tris-HCl(pH7.0) 용액 내에서 초음파처리(sonicated)한 후, 세포 추출물을 polyacrylamide gel에 로딩하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였다(도 7의 A). AHL-분해활성 측정을 위해 IPTG-유도 재조합 세포를 수확하여 100mM Tris-HCl(pH 7.0)에 재현탁하였다. 세포현탁액(OD₆₀₀=1.0) 50㎕와 동일 부피의 40mM AHLs를 혼합하였다. 이하 HHL의 분해 활성은 C.violaceum CVO26을, OOHL, OHL, DHL 및 OdDHL의 분해 활성은 A.tumefaciens NTI(pDCI41E33)을 기준균주로 한 것을 제외하고, 전기 실시예 3에서 서술한 바와 같이 각종의 AHLs의 분해활성을 분석하여 재조합 단백질의 발현을 조사하였다(도 7의 B): 도 7의 B에서 1 레인은 ahID 유전자가 없는, 벡터 pET22b(+)가 도입된 E.coli BL21(DE3)의 것을, 2 레인은 ahID 유전자가 삽입된 벡터 pAhID가 도입된 E.coli BL21(DE3)의 것을 나타낸다.

도 7에서 볼 수 있듯이, 형질전환된 E.coli BL21(DE3)에서 재조합 AhID가 강하게 발현되었으며, 발현된 재조합 AhlD의 분자량은 계산에 의한 분자량(31kD)와 일치하였다(도 5의 A에서 ◀ 부분 참조). AhID가 발현된 재조합 E.coli는, Arthrobacter sp. IBN110와 같이, 각종의 AHLs(HHL, OHHL, OHL, DHL 및 OdDHL)을 효과적으로 분해할 수 있었다(도 7의 B). 또한 상기 재조합 E.coli는 OHL과 OdDHL보다 OHHL에 대한 분해 활성이 낮음이 확인되었는데, 이는 IBN110의 AHL분해 형태와 매우 유사하였다(도 4 참조).

이러한 결과들은, Arthrobacter sp. IBN110의 ahID 유전자가 넓은 기질 특이성을 가지는 AHL-분해효소를 코딩하고 있음을 나타내는 것이다.

실시예 7: Arthrobacter sp. IBN110 균주를 이용한 식물병 억제실험

(1) IBN110 균주의 병조절 능력 확인

밀도인식 신호물질인 AHL을 분해하는 IBN110 균주가 실제로 식물병을 조절하 는 능력이 있는지를 살펴보았다.

식물 병원성 균주로는 AI(autoinducer; AHLs)로 인해 병원성이 나타난다고 알려져 있는 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora)를 사용하였으며, 적용 대상 작물로는 감자를 이용하였다. 병원균인 어위니아 카로토보라와 본 발명에 의한IBN110 균주의 농도를 다양하게 혼합하고, 혼합균주를 감자에 처리하여 병발생 억제여부를 확인하였다.

성장이 왕성한 E. carotovora N98 및 Arthrobacter sp. IBN110 균주를 회수하여 OD가 1 및 10이 되도록 식염수에 재현탁하였다. 이와는 별도로, 가로 세로 약 5 ×3㎝ 크기의 감자조각을 페트리디시에 준비하였다. 준비한 E. carotovora N98 및 Arthrobacter sp. IBN110 균주를 각각 연속 희석한 다음 하기 표 1과 같은 비율로 균주 혼합액을 준비하였다. 균주 혼합액 5 ㎕를 피펫팁으로 절단된 감자의 표면에 살짝 상처를 내면서 접종하고 30℃에서 수분을 충분히 유지시키면서 24시간 배양한 후, E. carotovora N98에 의한 감자 무름병의 여부를 육안으로 관찰하였다(도 8).

24시간 배양 후 감자 표면에 썩고 문드러진 형태가 나타나고 짙은 갈색을 띠면 감자에 병이 발생한 것으로 판단하였다.

도 8에서 볼 수 있듯이, E. carotovora N98 단독 처리구(A 및 D)에서는 상당한 면적에서 병발생이 확인되었으며, 접종된 E. carotovora N98의 균체 농도가 높을수록 병이 발생하는 면적이 증가됨을 알 수 있다.

Arthrobacter sp. IBN110가 함께 처리된 처리구(B, C, E 및 F)에서는 E. carotovora N98 단독 처리구(A 및 D)에 비해 병증이 약하게 나타났으며, 특히 Arthrobacter sp. IBN110의 비율이 높은 처리구(C 및 F)에서는 아무런 병증도 발견되지 않았다.

이상의 결과로부터, 감자무름병을 유발하는 병원성 미생물보다 높은 농도로 AHL-분해성 Arthrobacter 균주가 존재하는 경우, 감자무름병의 병증이 현저하게 감쇄(attenuation)되거나, 병증 자체가 발생하지 않음을 확인할 수 있다.

(2) IBN110 균주의 병억제 메카니즘 확인

본 발명에 의한 균주 IBN110이 병원성 균주를 사멸시켜 병을 억제하는지, AHL과 같은 AI(autoinducer) 물질을 분해하여 병을 억제하는지, 접종한 부위에 병원성 균주가 살아 있는지를 확인하였다.

병원균 어위니아 카로토보라가 존재함에도 높은 IBN110 균주의 농도하에서 병발이 억제된 C 및 F구의 실험샘플(즉, 접종한 뒤 24시간 경과 샘플)의 감자 표면에 AI로서 5 nmole의 합성 OHHL 50㎕를 가하고 다시 24시간 배양하였다. 그 결과 처음에 병 발생이 억제되었던 C 및 F 실험구에서 모두 전기 (1) 실험의 실험구 A와 유사한 정도의 병증이 관찰되었다(도시 생략).

따라서, 본 발명에 의한 IBN 균주에 의해 병이 억제된 부위에도 병원균이 살아있다는 것, 즉 IBN 균주가 병원균을 직접 사멸시키는 것은 아니라 AI를 분해함으로써 간접적으로 병 발생을 방해하는 것임을 확인하였다.

추정실시예 8: IBN110 균주에 의한 어병 병원균 제어 분석

실시예 7에서 식물병 제어에 효과가 있는 본 발명에 의한 IBN110 균주가 어류 병원성 미생물에도 효과가 있는지를 살펴보았다.

어류 병원성을 나타내는 세균에서 생산하는 신호물질이 본 발명에서 분리한 신호물질 분해 균주 IBN110에 의해서 실제적으로 분해되는지, IBN110 균주가 어병(魚病)제어의 가능성이 있는지를 확인하기 위하여 어병균주로부터 생성되는 다양한 신호물질들을 조사하였다.

폐사된 광어로부터 에드워드병(Edwordsieuosis)의 원인균인 에드워드시엘라 종(Edwardsiella sp.)과 비브리오 병균(Vibriosis sp.)을, 피부와 지느러미에 발적을 일으키는 에어로모나스 종(Aeromonas sp.)을 그 병으로 폐사된 은어의 신장으로부터 분리하였다.

폐사된 광어의 콩팥 분쇄물을 SS(Salmonella Shigella agar) 선택배지에 접종하여 30℃에서 배양 후 집락의 중심부가 검게 변하는 colony를 선별하여 에드워드시엘라 종을 분리하였다. 역시 폐사된 광어의 콩팥을 TCBS(Thiosulfate citrate salts agar)에 접종하고 25℃에서 배양 후 황색의 집락을 선별하여 비브리오 종을 분리하였다.

에어로모나스 종의 경우 폐사된 은어의 신장 분쇄물을 TSA(Tryptic Soy Agar)에 접종한 후 25℃, 48시간 배양하여 갈색 수용성 색소를 나타내는 집락을 선별하여 얻었다.

상기의 방법을 통하여 분리한 각종 어병 병원균을 LB 배지에서 25℃, 24시간 동안 배양 한 다음, 배양액을 에틸아세테이트 용매로 추출하여 TLC(thin layer chromatograph)를 수행하였다. 전개 용매로는 60% 메탄올를 사용하였다. TLC상에서 전개된 신호물질을 조사 한 결과, 분리한 병원균들의 주된 신호물질은 BHL(N-butanoyl-homoserine lactone)과 HHL(N-hexanoyl-homoserine lactone)로 확인되었다(도 9).

상기의 신호물질들은 모두 본 발명에 의한 미생물 IBN110에 의해서 분해가 가능하므로 본 발명에 의한 균주 KH32를 활용하여 물고기의 병을 제어할 수 있음을 추정할 수 있다.

본 발명에 의한 병원균의 밀도인식 신호물질인 아실화 호모세린 락톤을 분해하는 미생물, 아실화 호모세린 락톤 분해효소 및 분해효소를 생산하는 재조합 미생물을 이용하여 병원성 미생물을 생물학적으로 제어할 수 있게 된다.

이러한 병원성 미생물 제어에 관한 새로운 생태학적 접근 방법은 기존의 생화학적 병원성 미생물 제어의 문제점인 농약의 잔류 및 항생제 내성 등을 해결하면서 효과적이고 환경 친화적인 병원성 미생물 제어방법으로 유용하게 된다.

<110> IN BIONET. INC <120> Microorganism and Gene Degrading AHL, and Method of Using Thereof <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 273 <212> PRT <213> Arthrobacter sp. <400> 1 Met Glu Lys Asp Gln Leu Lys Val Arg Val Leu Glu Thr Gly Val Met 1 5 10 15 Glu Ala Asp Met Ala Trp Leu Leu Leu Lys Pro Gly Arg Ile Ile Ala 20 25 30 Asp Arg Asn Asn Lys Glu Arg Gln Arg Glu Trp Gly Glu Ile Pro Thr 35 40 45 His Ala Val Leu Ile Glu His Pro Glu Gly Arg Ile Leu Trp Asp Thr 50 55 60 Gly Val Pro Arg Asp Trp Ser Ser Arg Trp Gln Glu Ser Gly Met Asp 65 70 75 80 Asn Tyr Phe Pro Val Lys Thr Glu Ser Ser Ser Glu Ser Gly Phe Leu 85 90 95 Asp Ser Ser Leu Ala Gln Val Gly Leu Glu Pro Ala Asp Ile Asp Leu 100 105 110 Leu Ile Leu Ser His Leu His Leu Asp His Ala Gly Asn Ala Arg Leu 115 120 125 Phe Asp Asn Gly Lys Thr Lys Ile Val Ala Asn Arg Lys Glu Leu Glu 130 135 140 Gly Val Gln Glu Ile Met Gly Ser His Leu Gly Gly His Leu Lys Ala 145 150 155 160 Asp Phe Glu Gly Leu Lys Ile Asp Ala Ile Glu Gly Asp Thr Glu Ile 165 170 175 Val Pro Gly Val Ser Val Ile Asp Thr Pro Gly His Thr Trp Gly Thr 180 185 190 Met Ser Leu Gln Val Asp Leu Pro Asp Asp Gly Thr Lys Ile Phe Thr 195 200 205 Ser Asp Ala Val Tyr Leu Arg Asp Ser Phe Gly Pro Pro Ala Ile Gly 210 215 220 Ala Ala Val Val Trp Asn Asn Leu Leu Trp Leu Glu Ser Val Glu Lys 225 230 235 240 Leu Arg Arg Ile Gln Glu Arg Thr Asn Ala Glu Met Ile Phe Gly His 245 250 255 Glu Ser Glu Gln Thr Ser Gln Ile Arg Trp Ala His Gln Gly His Tyr 260 265 270 Gln <210> 2 <211> 822 <212> DNA <213> Arthrobacter sp. <400> 2 atggaaaaag atcagctgaa ggtccgtgta cttgagaccg gggtcatgga agcagacatg 60 gcctggctcc tgttgaagcc gggacggatc attgcggacc ggaacaacaa ggagcgtcag 120 cgtgagtggg gcgagatccc aacccatgca gtcttgattg agcatcccga gggtcgaatt 180 ctttgggaca ccggcgtccc ccgggattgg agttcccgct ggcaagagag cggcatggac 240 aactacttcc cagtcaagac tgaatcatcg agtgaatccg gattcttgga ctcttctctt 300 gcccaagtgg gtctcgagcc cgccgacata gacctgctca tactttccca cctgcatctt 360 gaccacgcgg gtaacgcgcg actattcgac aacggcaaga ccaagatcgt cgccaaccgc 420 aaggaactcg agggggtgca ggaaataatg ggctcgcacc tgggtgggca tctaaaagcg 480 gactttgaag gtctgaagat cgatgccatc gaaggcgaca ccgaaattgt tcccggggtt 540 tctgtcatag acacccccgg ccacacctgg ggaaccatgt ctcttcaggt cgacctcccg 600 gacgacggaa ctaagatctt cacctcggac gcagtctact tgcgggactc attcggccca 660 ccagccatag gtgccgccgt cgtctggaac aacctcctct ggcttgaatc agtagagaaa 720 cttcggcgga tccaagagcg gacgaacgcc gagatgattt tcggacacga gtccgagcaa 780 acaagtcaga ttcgatgggc gcatcagggg cactaccagt ga 822 <210> 3 <211> 630 <212> DNA <213> Arthrobacter sp. <400> 3 ggtgagtaac acgtgagtaa cctgcccttg actctgggat aagcctggga aactgggtct 60 aataccggat atgactcctc atcgcatggt ggggggtgga aagcttttgt ggttttggat 120 ggactcgcgg cctatcagct tgttggtggg gtaatggcct accaaggcga cgacgggtag 180 ccggcctgag agggtgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 240 ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgagg 300 gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cagtagggaa gaagcgtaag tgacggtacc 360 tgcagaagaa gcgccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggcgcaagc 420 gttatccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggt ttgtcgcgtc tgctgtgaaa 480 gaccggggct caactccggt tctgcagtgg gtacgggcag actagagtgc agtaggggag 540 actggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatca ggaggaacac cgatggcgaa 600 ggcaggtctc tgggctgtaa ctgacgctga 630 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Arthrobacter sp. <400> 4 gaggatccca cctcacttng acca 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Arthrobacter sp. <400> 5 atgaattcgg gtgtgnccng gngt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Arthrobacter sp. <400> 6 atggagtcat atggaaaaag atca 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Arthrobacter sp. <400> 7 tcgtagaaag cttctggtag tgcc 24

Claims (21)

1. 삭제
2. 서열 1로 이루어지는 아실화호모세린락톤(AHL)-분해 단백질.
3. 제 2 항에 있어서,

   Arthrobacter 속 균주 IBN110 (KCTC 10329 BP) 유래인 것을 특징으로 하는 AHL-분해 단백질.
4. 제 2 항에 의한 AHL-분해 단백질을 코딩하는 유전자.
5. 제 4 항에 있어서,

   상기 유전자는 서열 2에 기재된 핵산 서열로 이루어지는 유전자.
6. 제 4 항에 의한 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
7. 제 5 항에 의한 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
8. 제 6 항에 의한 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 속 미생물.
9. 제 7 항에 의한 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 속 미생물.
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 의한 균주를 식물 또는 인간을 제외한 동물에 처리하여 세균병 발생을 억제-치료하는 방법.
11. 제 8 항 또는 제 9 항에 의한 균주를 함유하는 식물 또는 동물의 세균병 발생 억제-치료제.
12. 제 11 항에 있어서,

    인간을 포함하는 동물의 호흡기에 섬유성 낭포증을 유발하는 슈도모나스 에이로기노사(Pseudomonas aeroginosa)에 의한 세균병 발생 억제-치료제.
13. 제 11 항에 의한 세균병 발생 억제-치료제를 함유하는 동물용 사료.
14. 제 11 항에 의한 세균병 발생 억제-치료제를 함유하는 비료.
15. 제 11 항에 의한 세균병 발생 억제-치료제를 함유하는 농약.
16. 제 2 항에 의한 단백질을 식물 또는 인간을 제외한 동물에 처리하여 세균병 발생을 억제-치료하는 방법.
17. 제 2 항에 의한 단백질을 함유하는 식물 또는 동물의 세균병 발생 억제-치료제.
18. 제 17 항에 있어서,

    인간을 포함하는 동물의 호흡기에 섬유성 낭포증을 유발하는 슈도모나스 에이로기노사(Pseudomonas aeroginosa)에 의한 세균병 발생 억제-치료제.
19. 제 17 항에 의한 세균병 발생 억제-치료제를 함유하는 동물용 사료.
20. 제 17 항에 의한 세균병 발생 억제-치료제를 함유하는 비료.
21. 제 17 항에 의한 세균병 발생 억제-치료제를 함유하는 농약.

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