KR100567397B1

KR100567397B1 - 온도 감응성과 생체 적합성을 갖는 양친성 고리형포스파젠 삼합체 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR100567397B1
Application number: KR1020040083742A
Authority: KR
Inventors: 손연수; 김해진; 김진규; 김혜영; 전용주; 우다야 토티
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2004-10-19
Filing date: 2004-10-19
Publication date: 2006-04-04
Anticipated expiration: 2024-10-19
Also published as: EP1812452B1; JP2006117674A; WO2006043757A1; DE602005015611D1; EP1812452A4; JP4314229B2; EP1812452A1; US20060084171A1

Abstract

본 발명은 아래 화학식(1)로 표시되는 온도 감응성과 생체 적합성을 갖는 양친성 고리형 포스파젠 삼합체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

식 중, x는 폴리에틸렌글리콜 반복 단위의 수로서 3, 4, 7, 12, 및 16 중에서 선택되고, R은 메틸, 에틸 또는 벤질기이며, R¹은 CH₂CH(CH₃)₂, CH₂C₆H₅, CH(CH₃)CH₂CH₃ 및 CH₃으로 구성된 군에서 선택되는 것이고, R²는 CH₂COOR, CH₂CH₂COOR, CH₂CH(CH₃)₂, 및 CH(CH₃)CH ₂CH₃으로 구성된 군에서 선택되는 것이며, R³및 R⁴는 CH₂COOR, CH₂CH₂COOR 및 H로 구성된 군에서 선택되는 것으로서, 상기 R은 앞에서 정의된 것과 동일한 것이며, a=b=c=1이고, d 및 e는 각각 0 또는 1이다.

Description

온도 감응성과 생체 적합성을 갖는 양친성 고리형 포스파젠 삼합체 및 그 제조 방법{THERMOSENSITIVE AND BIOCOMPATIBLE AMPHIPHILIC CYCLIC PHOSPHAZENE TRIMER AND PREPARATION METHOD THEREOF}

도 1은 실시예 2에서 제조된 고리형 유기 포스파젠 삼합체 마이셀의 입자 크기 분포도이다.

도 2는 실시예 2에서 제조된 고리형 유기 포스파젠 삼합체 + 탁솔 마이셀의 입자 크기 분포도이다.

도 3은 실시예 3에서 제조된 고리형 유기 포스파젠 삼합체의 약물 방출 시험 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 고리형 유기 포스파젠 삼합체와 약물의 혼합에 따른 안정성 변화를 관찰한 크로마토그램(RP-HPLC)이다.

본 발명은 새로운 온도 감응성과 생체 적합성을 갖는 양친성 고리형 유기 포스파젠 삼합체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

최근 사이언스지에 발표된 논문(Radoslav Savic, et al. Science 300, 615- 618(2003))에는 마이셀을 이용하여 체내의 특정 부위에 약물을 선택적으로 전달함으로써 약물의 독성 문제를 효과적으로 완화시킬 수 있는 것으로 보고 되어 있다. 특히 최근에는 기존의 계면활성제를 이용한 불안정한 마이셀의 단점을 극복하고 생체내 안정성, 높은 봉입도, 다양한 변형 등이 가능한 새로운 소재의 마이셀이 약물 전달체로서 개발되고 있다. 특히 친수성 고분자 블록과 친지성 고분자 블록을 결합시킨 블록 공중합체를 이용한 마이셀이 많이 연구되고 있는데, 이들은 양쪽 친화성 고분자로 이루어진 구형의 초분자 집합체로서, 구형의 내부(core)는 소수성의 의약 물질을 담지 할 수 있는 공간을 가지고 있고, 외부는 친수성기로 둘려 쌓인 구조를 갖고 있어서 마이셀을 친수성으로 만들어주기 때문에 수용성이 낮은 소수성 약물을 체내에서 효율적으로 전달할 수 있다는 장점이 있다.

일반적으로 마이셀은 친수성 블럭과 소수성 블럭이 교대로 공중합되어 있는 다이블럭(diblock) 공중합체 혹은 트라이블럭(triblock) 공중합체를 이용하여 만드는데, 대표적으로, 친수성 블록 고분자로는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)이 가장 많이 이용되고 있고, 소수성 블록 고분자로는 폴리락트산(PLA), 폴리아스파트산(PAA) 등과 같은 다양한 소수성 유기산 고분자들이 활용되고 있다(V. P. Torchilin, J. Control. Release, 73, 137-172 (2001)).

그런데 이들 소수성 유기산 고분자로 골격이 이루어진 블록 고분자는 생분해성은 있으나 생분해 시에 유기산의 생성으로 산성화를 가져오므로 단백질과 같은 산성에 민감한 바이오 의약품 전달용으로는 사용할 수 없게 된다. 또한 종래의 이들 블록 고분자들은 대부분 단순한 분자 구조를 갖고 있어서 고분자 골격에 목표 지향제와 같은 새로운 기능성기를 도입하거나 분자 수정을 하는 경우 물성 변화가 심하여 물성 설계에 많은 제약이 따르게 된다. 뿐만 아니라 이들 블록 공중합체로부터 형성되는 대부분의 마이셀들은 온도 감응성이 없다.

일반적으로 약물 전달체가 갖추어야 할 기본 조건은 난용성 약물의 가용화, 약물의 방출 속도 조절 가능성, 약물의 생체내 안정성 향상, 약물의 표적 세포에 대한 효율적인 전달, 그리고 약물의 부작용 최소화 등 다양한 기능을 갖는 것이며, 약물 전달체 자체의 생분해성 역시 필수 조건이다.

그러나 종래의 유기 고분자들은 대부분 생분해성이 결여되어 있고, 상술한 바와 같이 폴리락트산 등 몇 가지 생분해성 고분자들은 생분해에 의하여 산성화되며, 물성 설계의 한계 등으로 인하여 위의 기본 조건을 동시에 만족시킬 수가 없다. 특히 앞으로 프로테오믹스 및 제노믹스 연구 결과로부터 쏟아져 나올 단백질 계열 및 핵산 계열 등의 바이오 의약품 전달용으로는 적합하지가 않다. 따라서 새로운 약물 전달체의 개발이 시급하다.

본 발명자들은 앞서 친수성기로서 폴리에틸렌글라이콜이, 소수성기로서 아미노산이 치환되어 있는 온도 감응성 포스파젠계 삼합체에 대해여 발표(Youn Soo Sohn 등, J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8315) 한 바 있다. 그러나 아미노산을 소수성기로 사용한 이들 삼합체는 온도 감응성은 있지만 아미노산의 낮은 소수성으로 인하여 마이셀 형성이 되지 않으며, 말단 카복실산기가 포스파젠 골격에 근접하게 존재하고 있어서 수용액 내에서의 안정성이 떨어진다.

따라서, 본 발명의 목적은 포스파젠 골격에 친수성기로서 폴리에틸렌글라이콜이, 소수성기로서 아미노산보다 소수성이 강하고 효소 분해성이 있는 올리고펩타이드 에스터기가 도입되어 있고, 수용액 중에서 온도 감응성 마이셀을 형성하며, 의약 전달체용으로 사용되기에 적합한 상전이 온도를 갖는, 온도 감응성 및 생체 적합성을 갖는 고리형 유기 포스파젠 삼합체 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 고리형 포스파젠 삼합체 골격에 친수성기로는 미국 식품 의약국(FDA)에 의하여 사용이 허가된 분자량 100 이상의 폴리에틸렌글라이콜을 도입하고, 소수성기로는 아미노산 대신 소수성의 범위가 보다 넓고 강하며, 세포내 효소에 의한 생분해성을 부여할 수 있는 올리고펩타이드 에스터를 도입함으로써, 수용액 중에서 10-100 nm 크기의 마이셀을 형성하고, 체온 근처의 온도(31~42℃)에서 나노 또는 마이크로 입자 형태의 침전을 형성하는, 온도 감응성 유기/무기 하이브리드형 포스파젠 삼합체를 합성할 수 있음을 발견하였다.

본 발명자들은 또한 고리형 포스파젠 삼합체인 헥사클로로사이클로트리포스파젠 (N₃P₃Cl₆)의 염소 원자를 친수성 치환기인 폴리에틸렌글라이콜과 소수성(친지성) 치환기인 올리고펩타이드 에스터로 치환하여 포스파젠 삼합체에 양친성을 부여하고, 이들 친수성기과 친지성기의 종류를 바꾸어 조합하여 수용액 중에서 체온 근처의 온도를 포함한 다양한 범위에서 온도 감응성을 나타내는 마이셀을 형성하도록 함으로써, 단백질 및 펩타이드 계열의 약물과, 탁솔과 같은 난용성 약물의 전달체로 사용되기에 이상적인 새로운 약물 전달 물질을 발견하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 다음 화학식(1)로 표시되며, 친수/친지 양친성을 가짐으로써 수용액에서 온도 감응성 마이셀을 형성하는 고리형 포스파젠계 삼합체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

식 중, x는 폴리에틸렌글리콜 반복 단위의 수로서, 3, 4, 7, 12, 및 16 중에서 선택되고, R은 메틸, 에틸 또는 벤질기이며, R¹은 CH₂CH(CH₃)₂, CH₂C₆H₅, CH(CH₃)CH₂CH₃ 및 CH₃으로 구성된 군에서 선택되는 것이고, R²는 CH₂COOR, CH₂CH₂COOR, CH₂CH(CH₃)₂ 및 CH(CH₃)CH ₂CH₃으로 구성된 군에서 선택되는 것이며, R³및 R⁴는 CH₂COOR, CH₂CH₂COOR 및 H로 구성된 군에서 선택되는 것으로서, 상기 R은 앞에서 정의된 것과 동일한 것이며, a=b=c=1이고 d 및 e는 각각 0 또는 1이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 (1)의 고리형 포스파젠 삼합체는 친지성기와 친 수성기를 동시에 갖는 양친성 올리고머이다. 본 발명에 있어서, "온도 감응성"이라 함은 분자들 사이의 상호 작용에 의하여 친지성기는 내부(core)로 뭉치고, 외부에는 친수성기로 둘러싸인 마이셀이 형성됨으로써, 특정 온도 이하에서는 외부의 친수성기가 물 분자와 수소 결합하면서 물에 용해되어 나노미터 크기의 마이셀을 형성하고, 특정 임계 온도 이상에서는 물 분자와의 수소 결합이 깨져서 용해도가 급격하게 감소하여 마이셀들이 서로 응집되면서 고형 물질(microsphere/nanosphere)을 형성하는 것을 의미하는 것이다. 이와 같은 상전이가 일어나는 온도를 저임계 용액 온도(lower critical solution temperature, LCST)라고 한다. 본 발명에 따른 양친성 포스파젠 삼합체 분자의 자기 조립에 의하여 형성되는 마이셀은 십 나노미터에서 수백 나노미터 크기의 입자로서, 이들 입자의 내부는 친지성(소수성)기로 구성되어 있으므로 수용성이 낮은 소수성 약물을 감싸는데 이용될 수 있어서 단백질 또는 탁솔과 같은 난용성 약물의 전달체로서 사용되기에 적합하다.

또한, 본 발명의 고리형 포스파젠 삼합체는 일종의 올리고머이지만 분자량이 정확한 단량체와 같은 분자 구조를 이루고 있으며, 화학식 (1)에서 볼 수 있는 바와 같이 인(P) 원자와 질소(N) 원자가 교대로 공액 결합을 하여 6각 평면을 이루고 있고, 3개의 친수성기(PEG)와 3개의 소수성기인 올리고펩타이드 에스터기들이 상기 평면의 양쪽에 각각 몰려 있도록 설계되어 있으므로 분자의 친수성과 소수성이 극대화된다. 따라서 수용액 중에서 종래의 블록 공중합체들에 비하여 안정한 마이셀을 형성할 수 있고, 이들 마이셀은 체온 근처에서도 온도 감응성을 나타내므로, 피하 주사나 생체 조직으로의 국부 전달용 등 다양한 약물 전달체로서 적합하다. 예 를 들면, 체온 이하의 저임계 용액 온도를 나타내는 본 발명의 고리형 포스파젠 삼합체의 수용액에 성장 호르몬과 같은 단백질 의약품을 균일하게 용해시키고, 이 용액의 온도를 37℃로 올리면 단백질 약물 대부분이 포스파젠 약물 전달체의 마이셀 내에 포집된 채 침전으로 떨어진다. 따라서 이와 같은 방법으로 조제된 약물 용액을 피하 주사로 인체에 투여하는 경우, 약물은 체내 혈액 전체에 퍼지지 않고 투여 부위에서 침전되어 그 부위에서만 서서히 방출되므로 약물의 생체 이용률이 극대화될 수 있고, 부작용은 최소화될 수 있게 된다.

더 나아가, 본 발명의 포스파젠 삼합체는 동물 시험 결과, 생체 적합성이 우수하다는 것이 확인되었는데, 이는 이들이 체내에서 분해될 때 포스파젠 골격은 인체에 무해한 중성 인산암모늄으로 전환되고 (Kathryn E. Uhrich, Chem. Rev., 1999, 99, 3198), 친수성기인 폴리에틸렌글라이콜은 분자량이 100 이상인 경우 안전한 것으로 인정되어 미국 식품 의약국(FDA)에 의하여 사용이 허가되어 있으며, 올리고펩타이드는 체내에 존재하는 아미노산 성분이기 때문이다.

더욱이 본 포스파젠 삼합체에 결합되어 있는 올리고펩타이드 에스터는 가수 분해에 의하여 기능기화될 수 있어서 목표 지향제나 약물을 이들 기능기에 직접 결합시킴으로써 복합체(conjugate) 형태의 약물 전달체로 활용할 수 있는 등, 친수/친지성을 크게 변화시키지 않으면서 다양한 물성을 갖도록 설계할 수 있다는 장점도 갖고 있다.

이하에서는 화학식(1)로 표시되는 본 발명의 고리형 포스파젠 삼합체의 제조 방법을 설명한다. 화학식(1)의 최종산물은 공기 중에서 안정하지만, 중간체들은 모 두 공기 중에서 매우 불안정하다. 따라서, 모든 제조 과정은 수분이 들어가지 않도록 알곤 라인을 이용하여 수행하여야 하며, 시약과 용매는 모두 수분을 충분히 제거한 후에 사용한다.

우선 아래의 화학식(2)로 표시되는 메톡시 폴리에틸렌글라이콜(MPEG)을 진공 건조법으로 수분을 제거하고, 충분히 건조시킨 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시킨 다음, 이 용액을 70℃의 기름 중탕 속에서 1.0 ~ 1.1 당량의 나트륨(Na) 또는 수소화나트륨(NaH)과 10 ~ 24 시간 동안 반응시켜 화학식(3)으로 표시되는 폴리에틸렌글라이콜의 나트륨 염을 얻는다.

화학식 (2) 및 (3)에 있어서, x는 화학식(1)에서 정의한 것과 동일하다.

그 다음으로는, 아래의 화학식(4)로 표시되는 건조된 헥사클로로사클로트리포스파젠을 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, 이 용액을 드라이아이스/아세톤 중탕에 넣어 -78℃로 냉각시킨다. 그 다음, 헥사클로로사이클로트리포스파젠 1몰에 대하여 앞에서 제조한 화학식 (3)의 폴리에틸렌글라이콜의 나트륨 염 3.0 ~ 3.3 몰 을 30분 ~ 1시간에 걸쳐 서서히 적가하고, 30분 ~ 1시간 더 교반한다. 그 다음, 드라이아이스/아세톤 중탕을 제거하고, 상온에서 다시 8 ~ 12 시간 동안 반응시킨다.

이어서, 분리/정제 과정 없이, 이 반응 혼합물에, 헥사클로로사이클로트리포스파젠 1몰을 기준으로 아래의 화학식(5)로 표시되는 올리고펩타이드 에스터 3.3 ~ 3.9 몰과 과량 (6 ~ 12몰)의 트리에틸아민을 녹인 클로로포름용액을 가하고, 1 ~ 3일 동안 환류 반응 시켜 화학식 (1)의 화합물을 얻는다.

화학식 (4) 및 (5)에 있어서, R, R¹, R², R³, R⁴, a, b, c, d 및 e는 각각 화학식(1)에서 정의된 것과 동일하다. 위 반응을 수행함에 있어서, 반응 용매로서 벤젠, 톨루엔, 클로로포름 또는 이들의 혼합물을 사용할 수도 있다.

상기 치환 반응이 진행되는 동안 인(³¹P) 핵자기 공명 스펙트럼을 수시로 측 정하여 치환 반응의 진행 정도를 판단하여야 한다. 반응이 완료되면 반응 용액을 여과하여 부산물로 생성되는 침전물(NaCl 및 NEt₃ㅇHCl)을 제거하고, 여액을 감압 농축한다. 농축액을 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, 과량의 에틸에테르 또는 헥산을 가하여 침전시키는 과정을 2회 이상 반복하여 정제한 다음, 최소량의 증류수에 녹인 용액을 투석막(통과 분자량: 1000)에 넣고 12 ~ 24 시간 동안 투석한 후 동결 건조하면, 점성이 강한 갈색 고리형 포스파젠 삼합체가 60% 이상의 수율로 얻어진다. 위의 반응 공정을 요약하면 아래의 반응식 (1)과 같다.

실시예

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위는 특허청구의 범위를 벗어나지 않는 한 이들 실시예에 의하여 한정되지 아니한다.

본 발명의 화합물에 대한 탄소, 수소, 질소 원소 분석은 Perkin-Elmer C, H, N 분석기에 의해 수행되었다. 한편, 수소 핵자기 공명 스펙트럼은 Bruker DPX-250 NMR Spectrometer를 사용하여 측정되었으며, 인 핵자기 공명 스펙트럼은 Varian Gemini-400 NMR Spectrometer를 사용하여 측정되었다.

실시예 1.

[(메톡시에틸렌글라이콜350)(글라이실페닐알라닐루이실글라실에틸에스터)]₃, [NP(MPEG350)(GlyPheLeuGlyEt)]₃의 제조

분자량 350의 메톡시폴리에틸렌글라이콜(3.62g, 10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g, 10.4mmol)을 건조된 테트라하이드로퓨란 용매에 넣고 알곤 기류 하에서 24시간 환류하여 메톡시폴리에틸렌글라이콜의 나트륨염을 제조하였다. 헥사클로로사이클로포스파젠(hexachlorocyclophosphazene)(1.00g, 2.88mmol)을 건조된 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, 이 용액을 드라이아이스-아세톤 중탕(-78℃)에 넣어 냉각시킨 다음, 앞에서 제조된 메톡시폴리에틸렌글라이콜의 나트륨염 용액을 30분 동안 적가하였다. 30분후 드라이아이스-아세톤 중탕을 제거하고 상온에서 8시간 동안 반응시킨다. 이 용액에 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 테트라펩타이드(GlyPheLeuGly(Et))(5.44g, 12.9mmol)을 녹인 클로로포름 용액(100ml)를 가하고, 50℃로 온도를 올려 12시간 동안 반응시켰다. 반응액을 여과하여 생성된 염(NEt₃·HCl 과 NaCl)을 1차 제거하고 감압 농축하였다. 이 농축액을 테트라하이드로퓨란에 다시 녹인 후 과량의 에테르와 헥산을 가하여 침전을 유도하였다. 이 과정을 2회 반복하고, 소량의 증류수(20ml)에 녹인 후 투석막(MWCO:1000)을 이용하여 24시간 동안 외부의 물을 4회 교환하여 투석한 다음 동결 건조하여 포스파젠 삼합체 ([NP(MPEG350)(GlyPheLeuGlyEt)]₃)(수율, 74%)를 얻었다. 이렇게 얻은 고체 생성물을 물에 녹여 10%의 용액으로 만든 후 저임계 용액 온도에서 침전을 유도하여 원심 분리 후 상층의 용액은 제거하였다. 이 과정을 3회 반복한 다음 동결 건조하여 최종 생성물(수율 64%)을 얻었다.

조성식: C₃₆H₆₂N₅O₁₃P₁

이론치: C, 53.79; H, 7.77; N, 8.71

원소 분석치: C, 53.23; H, 7.91; N, 8.60

수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR in D₂O, ppm):

δ 0.87 (d, 3H, Leu-(CH ₃ ) ₂ )

δ 1.12 (t, 3H, Gly-OCH₂ CH ₃ )

δ 1.2-1.3 (m, Leu-CHCH ₂ (CH₃)₂

δ 2.95 (dd, 2H, Phe-CH ₂ )

δ 3.2 (s, 3H, MPEG350-OCH ₃ )

δ 3.25-3.6 (b, 30H, MPEG350-OCH ₂ CH ₂ )

δ 3.65 (d, 2H, Gly-CH ₂ )

δ 3.83 (d, 2H, Gly-CH ₂ )

δ 3.82 (m, 2H,Gly-OCH ₂ CH₃)

δ 4.1 (dd, 1H, Leu-CH)

δ 4.42 (t, 1H, Phe-CH)

δ 7.14 (m, 5H, Phe-arom),

저임계 용액 온도: 36℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(in D₂O, ppm): δ 22.03

실시예 2.

[(메톡시에틸렌글라이콜350)(글라이실페닐알라닐루이실아스파틱다이에틸에스터)]₃, [NP(MPEG350)(GlyPheLeuAspEt₂)]₃의 제조

분자량 350의 메톡시폴리에틸렌글라이콜(3.62g, 10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g, 10.4mmol) 및 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 테트라펩타이드(GlyPheLeuAspEt₂) (6.56g, 12.9mmol)을 이용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 최종 포스파젠 삼합체 생성물 N₃P₃(MPEG350)₃(GlyPheLeuAspEt₂) ₃(수율 64%)를 얻었다.

조성식: C₁₂₀H₂₀₄N₁₅O₄₅P₃

이론치: C, 53.98; H, 7.70; N, 7.87

원소분석치: C, 53.77; H, 7.85; N, 7.86

수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR in D₂O, ppm):

δ 0.87 (d, 6H, Leu-(CH ₃ ) ₂ )

δ 1.12 (t, 3H, Gly-OCH₂ CH ₃ )

δ 1.2-1.3 (m, 3H, Leu-CHCH ₂ )

δ 2.95 (dd, 2H, Phe-CH ₂ )

δ 3.2 (s, 3H, MPEG350-OCH ₃ )

δ 3.25-3.6 (b, 30H, MPEG350-OCH ₂ CH ₂ )

δ 3.65 (d, 2H, Gly-CH ₂ )

δ 4.1 (dd, 1H, Leu-CH)

δ 4.2 (d, 2H, Asp-CH ₂ )

δ 4.42 (t, 1H, Phe-CH)

δ 7.14 (m, Phe-arom)

저임계 용액 온도: 33℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(in D₂O, ppm): δ 22.03

실시예 3.

[(메톡시에틸렌글라이콜350)(글라이실페닐알라닐루이실글루타믹산다이에틸에 스터)]_3,[P(MPEG350)(GlyPheLeuGluEt₂)]₃의 제조

분자량 350의 메톡시폴리에틸렌글라이콜(3.62g, 10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g, 10.4mmol) 및 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 테트라펩타이드(GlyPheLeuGluEt₂) (6.73g, 12.9mmol)을 이용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 최종 포스파젠 삼합체 생성물 N₃P₃(MPEG350)₃(GlyPheLeuGlu(Et)₂) ₃(수율 67%)를 얻었다.

조성식: C₁₂₃H₂₁₀N₁₅O₄₅P₃

이론치: C, 54.47; H, 7.80; N, 7.75

원소분석치: C, 54.51; H, 7.94; N, 7.82

수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR in D₂O, ppm):

δ 0.87 (d, 6H,Leu-(CH ₃ ) ₂ )

δ 1.11-1.21 (t, 3H, Glu-OCH₂ CH ₃ )

δ 1.2-1.3 (m, 3H, Leu-CH ₃ )

δ 1.8-2.0 (m, 1H, Glu-NHCHCOOCH ₂ CH₂ＣOO-)

δ 2.0-2.2 (m, 1H, Glu-CH ₂ )

δ 2.38 (t, 2H, Glu-CH ₂ )

δ 2.95 (dd, 2H, Phe-CH ₂ )

δ 3.20 (s, 3H, MPEG350-OCH ₃ )

δ 3.25-3.6 (b, 30H,MPEG350-OCH ₂ CH ₂ )

δ 3.65 (d, 2H, Gly-CH ₂ )

δ 4.00-4.11(m, 2H,Glu-CH ₂ )

δ 4.17 (m, 1H, Leu-CH)

δ 4.41 (dd, 1H, Glu-CH)

δ 4.41-4.50 (m, 1H, Leu-CH)

δ 4.7 (m, 1H, Phe-CH)

δ 7.14 (m, 5H, Phe-arom)

저임계 용액 온도: 31℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(in D₂O, ppm): δ 22.03

실시예 4.

[(메톡시에틸렌글라이콜550)(글라이실페닐알라닐루이실아스파틱산다이에틸에스터)]_3,NP(MPEG550)(GlyPheLeuAspEt₂)]₃의 제조

분자량 550의 메톡시폴리에틸렌글라이콜(5.67g, 10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g, 10.4mmol) 및 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 테트라펩타이드(GlyPheLeuAspEt₂) (6.56g, 12.9mmol)을 이용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 최종 포스파젠 삼합체 생성물 N₃P₃(MPEG550)₃(GlyPheLeuAspEt₂) ₃(수율 61%)를 얻었다.

조성식: C₁₅₀H₂₃₇N₁₅O₄₈P₃

이론치: C, 57.13; H, 7.58; N, 7.99

원소분석치: C, 57.26; H, 7.57; N, 7.66

수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR in D₂O, ppm):

δ 0.87 (d, 6H, Leu-(CH ₃ ) ₂ )

δ 1.12 (t, 6H, Asp-OCH₂ CH ₃ )

δ 1.47-1.80 (m, 3H, Leu-CHCH ₂ )

δ 2.95 (dd, 2H, Phe-CH ₂ )

δ 3.20 (s, 3H, MPEG50-OCH ₃ )

δ 3.25-3.6 (b, 48H, MPEG550-OCH ₂ CH ₂ )

δ 3.82 (m, 2H, Gly-OCH ₂ CH₃)

δ 4.12-4.21 (m, 4H, Asp-OCH ₂ CH₃)

δ 4.41-4.50 (m, 1H, Leu-CH)

δ 4.53 (m, 1H, Phe-CH)

δ 4.8-4.9 (m, 1H, Asp-CH)

δ 7.14 -7.29(m, 5H, Phe-arom)

저임계 용액 온도: 53℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(in D₂O, ppm): δ 22.03

실시예 5.

[(메톡시에틸렌글라이콜350)(글라이실페닐알라닐루이신에틸에스터)]_3,NP(MPEG350)(GlyPheLeuEt)]₃의 제조

분자량 350의 메톡시폴리에틸렌글라이콜(3.62g, 10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g, 10.4mmol) 및 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 트리펩타이드(GlyPheLeuEt) (4.70g, 12.9mmol)을 이용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 최종 포스파젠 삼합체 생성물 N₃P₃(MPEG350)₃(GlyPheLeuEt)₃(수율 64%)를 얻었다.

조성식: C₁₀₈H₁₉₅N₁₂O₃₆P₃

이론치: C, 55.66; H, 8.43; N, 7.21

원소분석치: C, 53.95; H, 8.07; N, 6.84

수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR in D₂O, ppm):

δ 0.86-0.90 (d, 6H, Leu-(CH ₃ ) ₂ )

δ 1.25 (t, 3H, Leu-OCH₂ CH ₃ )

δ 1.50-1.65 (m, 1H, Leu-CHCH ₂ )

δ 3.05 (dd, 2H, Phe-CH ₂ )

δ 3.31 (s, 2H, Gly-CH ₂ )

δ 3.35 (s, 3H, MPEG350-OCH ₃ )

δ 3.35-3.6 (b, 30H, MPEG350-OCH ₂ CH ₂ )

δ 4.00-4.11(m, 2H,Gly-OCH ₂ CH₃)

δ 4.48 (m, 1H, Leu-CH)

δ 4.68 (dd, 1H, Phe-CH)

δ 4.41-4.50 (m, 1H, Leu-CH)

δ 7.19-7.31 (m, 5H, Phe-arom)

저임계 용액 온도: 41℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(in D₂O, ppm): δ 18.96

실시예 6.

[(메톡시테트라에틸렌글라이콜)(글라이실페닐알라닐루이실아스파틱다이에틸에스터)]_3,NP(TetEG)(GlyPheGlyEt)]₃의 제조

메톡시트라에틸렌글라이콜(1.69g, 10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g, 10.4mmol) 및 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 트리펩타이드(GlyPheGlyEt) (3.98g, 12.9mmol)을 이용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 최종 포스파젠 삼 합체 생성물 N₃P₃(TetEG)₃(GlyPheGlyEt)(수율 71%)를 얻었다.

조성식: C₆₆H₁₀₅N₁₂O₂₄P₃

이론치: C, 51.36; H, 6.86; N, 10.89

원소분석치: C, 50.33 ; H, 7.10 ; N, 9.86

수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR in D₂O, ppm):

δ 1.33(t, 3H, Gly-OCH₂ CH ₃ )

δ 3.25-3.6 (b, 18H, Phe-CH ₂ , TetEG-OCH ₂ CH ₂ )

δ 3.65 (d, 2H, Gly-CH ₂ )

δ 3.94 (d, 2H,Gly-CH ₂ )

δ4.82(m, 1H, Phe-CH)

δ 7.14 (m, 5H, Phe-arom)

저임계 용액 온도: 34℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(in D₂O, ppm): δ 21.71

실시예 7.

[(메톡시트리에틸렌글라이콜)(글라이실루이실글라이실에틸에스터)]_3,[NP(TEG)(GlyLeuGlyEt)]₃의 제조

메톡시트리에틸렌글라이콜(2.14g,10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g,10.3mmol) 및 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 트리펩타이드(GlyLeuGlyEt) (3.53g, 12.9mmol)을 이용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 최종 포스파젠 삼합체 생성물 N₃P₃(TEG)₃(GlyLeuGlyEt)₃(수율 71%)를 얻었다.

조성식; C₆₃H₁₂₃N₁₂O₂₇P₃

이론치; C, 48.08; H, 7.88; N, 10.68

원소분석치: C, 48.12 ; H, 7.92; N, 10.50

수소 핵자기 공명 스펙트럼(D2O, ppm):

δ 0.83(d, 6H, Leu- (CH ₃ ) ₂ )

δ 1.22(t, 3H, Gly-OCH₂ CH ₃ )

δ 1.57-1.72(s, 3H, Leu-CHCH ₂ )

δ 3.25-3.6 (b, 14H, Phe-CH ₂ , TEG-OCH ₂ CH ₂ )

δ 3.85-3.98 (d, 4H, Gly-CH ₂ )

δ 4.16 (t, 2H, Gly-OCH ₂ CH₃)

δ4.47(m, 1H, Leu-CH)

저임계 용액 온도: >100℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(CDCl₃, ppm); δ 21.31

실시예 8.

[(메톡시에틸렌글라이콜550)(글라이실페닐알라닐루이실페닐알라닐글루타믹산다이에틸에스터)]_3,[NP(MPEG550)(GlyPheLeuPheGluEt₂)]₃의 제조

분자량 550의 메톡시폴리에틸렌글라이콜(5.67g, 10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g, 10.4mmol) 및 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 펜타펩타이드(GlyPheLeuPheGluEt₂) (8.28g, 12.9mmol)을 이용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 최종 포스파젠 삼합체 생성물 N₃P₃(MPEG550)₃(GlyPheLeuPheGlu(Et)) ₃(수율 62%)을 얻었다.

조성식: C₁₂₀H₂₉₇N₁₈O₆₃P₃

이론치: C, 56.68; H, 7.85; N, 6.61

원소분석치: C, 57,32 ; H, 8.02; N, 6.50

수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR in D₂O, ppm):

δ 0.76-0.90 (d, 6H, Leu-(CH ₃ ) ₂

δ 1.11-1.21 (t, 3H, Glu-OCH₂ CH ₃ )

δ 1.8-2.0 (m, 1H, Glu-CH ₂ )

δ 2.0-2.2 (m, 1H, Glu-CH ₂ )

δ 2.38 (t, 2H, Glu-CH ₂ )

δ 2.95 (dd, 2H, Phe-CH ₂ )

δ 3.20 (s, 3H, MPEG350-OCH ₃ )

δ 3.25-3.6 (b, 48H, MPEG550-OCH ₂ CH ₂ )

δ 3.65 (d, 2H, Gly-CH ₂ )

δ 4.00-4.11(m, 2H,Glu-CH ₂ )

δ 4.17 (m, 1H, Leu-CH)

δ 4.41 (dd, 1H, Glu-CH)

δ 4.41-4.50 (m, 1H, Leu-CH)

δ 4.68 (m, 1H, Phe-CH)

δ 4.82(m, 1H, Phe-CH)

δ 7.14 (m, 5H, Phe-arom)

저임계 용액 온도: 35℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(in D₂O, ppm): δ 22.13

실시예 9.

[(메톡시에틸렌글라이콜550)(글라이실페닐알라닐루이실페닐알라닐글루타믹산다이에틸에스터)]_3,[NP(MPEG550)(GlyPheLeuGlyGluEt₂)]₃의 제조

분자량 550의 메톡시폴리에틸렌글라이콜(5.44g, 10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g, 10.4mmol) 및 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 펜타펩타이드 (GlyPheLeuGlyGluEt₂) (7.48g, 12.9mmol)을 이용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 최종 포스파젠 삼합체 생성물 N₃P₃(MPEG550)₃(GlyPheLeuGlyGluEt₂)₃(수율 60%)를 얻었다.

조성식: C₁₅₉H₂₇₉N₁₈O₆₃P₃

이론치: C, 53.89; H, 7.94; N, 7.11; O, 28.44; P, 2.62

원소분석치: C, 54.21 ; H, 8.22; N, 6.98

수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR in D₂O, ppm):

δ 0.87 (d, 6H, Leu-(CH₃)₂)

δ 1.11-1.21 (t, 6H, Glu-OCH₂ CH ₃ )

δ 1.8-2.0 (m, 1H, Glu-CH ₂ )

δ 2.0-2.2 (m, 1H, Glu-CH ₂ )

δ 2.38 (t, 2H, Glu-CH ₂ )

δ 2.95 (dd, 2H, Phe-CH ₂ )

δ 3.20 (s, 3H, MPEG350-OCH ₃ )

δ 3.25-3.6 (b, 48H, MPEG550-OCH ₂ CH ₂ )

δ 3.65 (d, 2H, Gly-CH ₂ )

δ 3.85-3.98 (d, 4H, Gly-CH ₂ )

δ 4.00-4.11(m, 2H,Glu-OCH ₂ CH₃)

δ 4.17 (m, 1H, Leu-CH)

δ 4.41 (dd, 1H, Glu-CH)

δ 4.68 (m, 1H, Phe-CH)

δ 7.14 (m, 5H, Phe-arom)

저임계 용액 온도: 42℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(in D₂O, ppm): δ 22.03

실시예 10.

[(메톡시에틸렌글라이콜750)(글라이실페닐알라닐루이실페닐알라닐글루타믹산다이에틸에스터)]_3,[NP(MPEG750)(GlyPheLeuPheGluEt₂)]₃의 제조

분자량 750의 메톡시폴리에틸렌글라이콜(7.74g, 10.3mmol)과 나트륨 조각(0.24g, 10.4mmol) 및 트리에틸아민(2.61g, 25.80mmol)과 펜타펩타이드(GlyPheLeuPheGluEt₂) (8.28g, 12.94mmol)을 이용하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 최종 포스파젠 삼합체 생성물 N₃P₃(MPEG750)₃(GlyPheLeuPheGluEt₂)₃(수율 58%)를 얻었다.

조성식: C₂₀₄H₃₄₅N₁₈O₇₅P₃

원소분석치: 55.92; H, 7.90; N, 5.51

이론치:, 56.42; H, 8.01; N, 5.81

수소 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR in D₂O, ppm):

δ 0.80-1.0 (d, 6H, Leu-CH ₃ )

δ 1.11-1.21 (t, 3H, Glu-OCH₂ CH ₃ )

δ 1.2-1.3 (m, 3H, Leu-CHCH ₂

δ 1.8-2.0 (m, 1H, Glu-CH ₂ )

δ 2.0-2.2 (m, 1H, Glu-CH ₂ )

δ 2.38 (t, 2H, Glu-CH ₂ )

δ 2.95 (dd, 2H, Phe-CH ₂ )

δ 3.20 (s, 3H, MPEG750-OCH ₃ )

δ 3.25-3.6 (b, 64H, MPEG750-OCH ₂ CH ₂ )

δ 3.65 (d, 4H, Gly-CH ₂ )

δ 4.00-4.11(m, 2H,Glu-CH ₂ )

δ 4.17 (m, 1H, Leu-CH)

δ 4.41 (dd, 1H, Glu-CH)

δ 4.41-4.50 (m, 1H, Leu-CH)

δ 4.68 (m, 1H, Phe-CH)

δ 4.82(m, 1H, Phe-CH)

δ 7.14 (m, 5H, Phe-arom)

저임계 용액 온도: 45℃

인 핵자기 공명 스펙트럼(in D₂O, ppm): δ 22.03

실시예 11. 분자크기 측정 및 지용성 의약 물질의 담지 확인

본 발명에 따라 합성된 양친성 포스파젠 삼합체가 수용액 중에서 친지성기들의 상호 작용에 의하여 응집되어 마이셀을 형성하는지 여부를 이하에 설명된 절차에 따라 DLS(Dynamic light scattering)법으로 결정하였다.

실시예 2의 삼합체를 증류수에 0.1~0.5%로 용해시킨 수용액과, 이 용액에 탁솔(삼합체의 3 wt%)을 녹인 용액의 입도를 측정하였다. 도 1 및 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 지름 50ㅁ 2nm 크기의 마이셀이 형성된다는 것이 확인되었다.

0,2% 이하의 낮은 농도에서는 저임계 용액 온도 현상이 나타나지 않았지만, 50nm 정도의 일정한 크기를 갖는 마이셀을 형성하였다.

한편, 0.2% 이상의 농도의 용액에서는 저임계 용액 온도 현상이 나타난다는 사실을 UV 스펙트럼을 이용하여 확인하였다. DLS를 이용하여 입자의 크기를 관측하였는데, 낮은 농도에서와는 달리, 0.2% 농도 이상에서는 저임계 용액 온도 근처에서 포스파젠 삼합체는 2차 구조를 형성하여 지름이 200nmㅁ 10 이상의 일정한 크기를 갖는 거대 분자체를 형성하는 것으로 확인되었다. 이는 낮은 농도에서 마이셀 구조를 형성하고 있던 포스파젠 삼합체가 저임계 용액 온도 근처에서는 더 응집되어 2차 구조를 형성함으로써 입자 크기가 갑자기 커지기 때문인 것으로 판단된다.

위와 같은 결과로부터, 본 발명에 따른 포스파젠 삼합체는 낮은 농도(0.1%)에서는 마이셀 구조를 형성하며, 고농도(0.2% 이상)에서는 나노미터 크기 내지는 미세 미립구(microparticle/nanoparticle)를 형성한다는 것을 확인하였다. 따라서, 이와 같은 구조 내에 약물체가 흡착될 수 있음이 확인되었다.

실시예 12. 고리형 포스파젠 삼합체 제형의 약물 방출 시험

인간 성장 호르몬(hGH) 함유 포스파젠 삼합체에 대한 시험관 실험(in vitro) 방출 실험을 실시하여, 그 결과를 그림 3에 나타내었다.

도 3은 실시예 3에서 제조된 포스파젠 삼합체의 12.5% 수용액에 인간 성장 호르몬(hGH)을 1mg/ml 농도로 혼합하고, 37℃에서 침전시킨 다음, 둘베크 인산 완충 용액(DPBS) 중으로 방출되는 인간 성장 호르몬의 양을 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 측정한, 인간 성장 호르몬 누적 방출 프로필을 나타낸 것이다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 초기 0.25일 동안에 완충액 중으로 방출된 인간 성장 호르몬의 양은 약 30.8%로서 그다지 높지 않은 초기 방출을 나타내어 초기 과다 방출의 우려는 없는 것으로 확인되었다. 이후 1차에 가까운 누적 방출 곡선을 나타내었고, 7일 동안 총 누적 방출량은 약 100%이다. 따라서, 실시예 3의 포스파젠 삼합체는 1주 제형에 적당한 생체 외(in vitro) 방출 거동을 보여주는 것으로 판단되었다.

실시예 13. 포스파젠 삼합체를 이용한 약물 전달체의 국소 자극성 시험 결과

포스파젠 삼합체와 약물(인간 성장 호르몬, hGH)의 혼합에 따른 약물 안정성 변화와 국소 자극성을 시험하였다.

우선, 실시예 3에서 제조된 포스파젠 삼합체의 12.5% 수용액에 약물을 혼합 (7.5 mg/ml)하여 약물과 포스파젠 삼합체의 반응 유무를 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 확인하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 의하면, 포스파젠 삼합체와 약물이 혼합되기 전의 약물의 크로마토그램과 약물을 실시예 3에서 제조한 포스파젠 삼합체와 혼합한 후 약물의 크로마토그램을 비교한 결과, 본 발명에 따른 포스파젠 삼합체는 약물의 안정성에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

또한 위와 같은 조제 약물을 토끼의 어깨 쪽에 피하 주사로 1㎖ 씩 투여한 후 피부 국소 자극성 여부를 관찰한 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

일수	구분	임상 증상 및 피부 반응	부검 소견		비고
			근육	피부
3	T1(-hGH)	-	시료 엷게 산재	-	약물 함유 여부에 따른 차이 없음
	T2(+hGH)	-	시료 엷게 산재	-
7	T1(-hGH)	-	시료 엷게 산재	-
	T2(+hGH)	-	시료 엷게 산재	-

표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 약물인 인간 성장 호르몬의 함유 여부에 무관하게 피부 반응 (홍반, 출혈, 경결감, 부종 등)이 나타나지 않았으며, 부검 소견에서도 자극과 관련된 변화 (변색, 유착, 반점 등)가 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명에 따른 포스파젠 삼합체는 국소 자극성이 없는 것으로, 즉 생체 적합성을 갖 는 것으로 판명되었다.

본 발명에 따라서, 포스파젠 골격에 친수성기로서 폴리에틸렌글라이콜이, 소수성기로서 아미노산보다 소수성이 강하고 효소 분해성이 있는 올리고펩타이드 에스터기가 도입되어 있고, 수용액 중에서 온도 감응성 마이셀을 형성하며, 의약 전달체용으로 사용되기에 적합한 상전이 온도를 갖는, 생체 적합성 고리형 포스파젠 약물 전달체 및 그 제조 방법이 제공되었다.

Claims

아래의 화학식 (1)로 표시되는 고리형 유기 포스파젠 삼합체.

[화학식 1]

식 중, x는 3, 4, 7, 12 및 16 중에서 선택되는 수이고, R은 메틸, 에틸 또는 벤질기이며, R¹은 CH₂CH(CH₃)₂, CH₂C₆H ₅, CH(CH₃)CH₂CH₃ 및 CH₃으로 구성된 군에서 선택되는 것이고, R²는 CH₂COOR, CH₂CH₂COOR, CH₂CH(CH ₃)₂ 및 CH(CH₃)CH₂CH₃으로 구성된 군에서 선택되는 것이며, R³및 R⁴는 CH₂COOR, CH₂CH₂COOR 및 H로 구성된 군에서 선택되는 것으로서, 상기 R은 앞에서 정의된 것과 동일한 것이며, a=b=c=1이고, d 및 e는 각각 0 또는 1이다.
(1) 화학식 (3)으로 표시되는 폴리에틸렌글라이콜의 나트륨염을 화학식 (4)로 표시되는 헥사클로로사이클로트리포스파젠 삼합체과 반응시키는 단계와

(2) 단계 (1)의 생성물을 화학식 (5)로 표시되는 올리고펩타이드 에스터와 반응시키는 단계를 포함하는, 화학식 (1)로 표시되는 고리형 유기 포스파젠 삼합체의 제조 방법.

[화학식 1]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

식 중, x는 3, 4, 7, 12 및 16 중에서 선택되는 수이고, R은 메틸, 에틸 또 는 벤질기이며, R¹은 CH₂CH(CH₃)₂, CH₂C₆H ₅, CH(CH₃)CH₂CH₃ 및 CH₃으로 구성된 군에서 선택되는 것이고, R²는 CH₂COOR, CH₂CH₂COOR, CH₂CH(CH ₃)₂ 및 CH(CH₃)CH₂CH₃으로 구성된 군에서 선택되는 것이며, R³및 R⁴는 CH₂COOR, CH₂CH₂COOR 및 H로 구성된 군에서 선택되는 것으로서, 상기 R은 앞에서 정의된 것과 동일한 것이며, a=b=c=1이고, d 및 e는 각각 0 또는 1이다.
제2항에 있어서, 상기 단계 (2)의 반응을 트리에틸아민 존재 하에서 수행하는 것인 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (1) 및 (2)의 반응 용매가 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 헥사클로로사이클로트리포스파젠 삼합체 1몰에 대하여 폴리에텔렌글라이콜의 나트륨염을 3.0 ~ 3.3몰 사용하는 것인 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (2)에서 단계 (1)의 생성물 1몰에 대하여 올리고 펩타이드를 3.3 ~ 3.9몰 사용하는 것인 제조 방법.
제3항에 있어서, 트리에틸아민을 단계 (1)의 생성물 1몰에 대하여 6 ~ 12 몰의 양으로 사용하는 것인 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (2)의 반응 완료 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 농축한 다음, 잔류물을 테트라하이드로퓨란에 다시 용해시키고, 여기에 에틸에테르 또는 헥산을 가하여 생성물의 침전을 형성시키고, 이 침전물을 여과하고 증류수에 용해시킨 다음 투석하여, 정제된 화학식 (1)의 고리형 포스파젠 삼합체를 얻는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조 방법.