KR100559121B1

KR100559121B1 - 대장균의 열-불안정성 장독소와 돼지콜레라 바이러스의외피단백질을 이용한 경구용 백신

Info

Publication number: KR100559121B1
Application number: KR1020040001374A
Authority: KR
Inventors: 이청호; 이영기
Original assignee: 주식회사 케이티앤지
Priority date: 2004-01-09
Filing date: 2004-01-09
Publication date: 2006-03-10
Also published as: KR20050073157A

Abstract

본 발명은 대장균의 열-불안정성 장독소 B 소단위체와 돼지콜레라 바이러스의 E2를 이용한 경구용 백신에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 경구용 백신은 열-불안정성 장독소 B 소단위체(LTB)와 돼지콜레라 바이러스 (CSFV, Classical Swine Fever Virus)의 E2 에피토프 유전자를 chimeric으로 재조합하여 발현시킨 다음, 분리 및 정제하여 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명의 재조합 경구용 백신의 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열

을 가지며, 경구용 백신의 아미노산 서열은 서열번호 2와 같다.

본 발명에 의해, 경구투여로 점막면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 신

규한 재조합 경구용 백신과 그 유전자 및 아미노산 서열과 그 제조방법이 제공된다.

LTB, CSFV, Chimeric 항원, E2 단백질, 경구투여, 점막면역반응

Description

대장균의 열-불안정성 장독소와 돼지콜레라 바이러스의 외피단백질을 이용한 경구용 백신{EDIBLE VACCINE USING E.coli HEAT-LABILE TOXIN B AND CSFV E2}

도 1은 본 발명의 경구용 백신의 재조합 유전자 서브클로닝 과정도

도 2는 본 발명의 재조합 단백질의 발현에 따른 SDS-PAGE 및 Western Blot 분석 결과

도 3은 본 발명의 재조합 단백질의 발현 후, 분리 정제된 키메라 항원 단백질의 SDS-PAGE 및 Western Blot 분석 결과

도 4는 본 발명의 경구용 백신에 의한 총혈청 면역글로불린 조사결과

도 5는 본 발명의 경구용 백신에 의한 분비성 면역글로불린 조사결과

도 6은 본 발명의 경구용 백신에 의한 면역글로불린 서브클래스(subclass) 분석결과

도 7은 본 발명의 경구용 백신에 의한 면역글로불린E(IgE) 역가 조사결과

도 8은 본 발명의 경구용 백신에 의한 B 세포의 면역글로불린A(IgA) 발현 패턴 조사결과

도 9는 본 발명의 경구용 백신에 의한 T 세포 활성화도 조사결과

재조합 백신은 유전자가 조작된 박테리아, 효모, 또는 포유류의 세포로부터 생산되며, 감염원의 구성요소 중 항원성을 갖는 부위를 암호화하는 유전자를 분리한 후, 이를 대장균이나 효모 등에서 발현시켜 감염원의 항원을 분리하여 백신으로 사용하는 것이다.

대장균의 LTB 단백질은 Heat labile enterotoxin (LT)의 B 소단위체로서 독성이 없으며, 점막면역반응에서 여러종류의 항원에 대하여 강력한 보조제로서 작용할 뿐만 아니라, cytokine의 생산과 B 세포를 활성화 시키는 물질의 발현등 면역 활성을 조절한다.

그리고, CSFV E2 단백질은 감염성 돼지콜레라를 일으키는 CSFV의 주된 항원단백질이다.

감염성 질병의 유발은 점막표면을 통한 병원성 물질의 침입으로부터 시작되며 이에 대한 면역계의 방어 또한, 점막표면상에서 병원성 물질에 대응하기 위한 기작을 포함하기 때문에, 혈관이나 근육에 주사된 백신은 점막면역과 관련된 일련의 반응들을 효과적으로 유도하지 못하는 단점을 가지고 있다.

경구용 백신은 백신을 입을 통하여 섭취하여 예방접종을 시행하는 백신접종 방법으로서 접종이 편리하고, 접종에 따른 통증이 없고, 경제적이고, 접종량 조절이 가능하며, 점막면역계를 자극함으로써 전신의 면역을 유발시키는 장점이 있어 현재 백신개발의 최종적인 추구방향으로 설정되어 있다.

경구용 백신의 여러 장점에도 불구하고, 근육이나 피하주사에 비하여 면역반응 유도 효율이 좋지 않은 것으로 알려져 있다. 이것은 소화관의 낮은 pH조건 및 단백질 분해효소에 의해 항원이 분해되거나 점막표면에서 항원이 충분히 흡수되지 못하기 때문으로, 경구백신 개발의 가장 큰 걸림돌로 작용하고 있다. 따라서 신뢰성이 있고 계속적으로 항원 단백질을 소화관에서 일반 순환계로 이동시킬 수 있는 약물 전달 체계가 요구되고 있다.

한국등록특허공보 10-0216337(유전자 재조합 기술을 이용한 경구용 B형 간염백신의 제조방법)에는, 소장 점막을 통한 침입경로를 가지는 소아마비 바이러스를 이용한 경구용 B형 간염백신의 제조방법이 공개되어 있다.

그러나 상기의 발명은 동물세포에 바이러스를 감염시켜 배양한 후 바이러스를 분리하는 과정을 거쳐야 하므로 비용이 많이 들고 조작상의 어려움이 따르는 단점이 있다.

또한, 한국공개특허공보 특2001-0031236(경구용 백신 및 치료제의 전신전달용 조성물 및 방법)에는, 소화관에서 일반 순환계로 이동할 수 있는 변형 보툴리눔 독소를 이용하여 항원을 경구투여하는 조성물 및 방법이 공개되어 있다.

그러나 상기의 발명은 경구투여시 백신이 소화관에서 일반 순환계로 이동하여 작용할 수 있게 한 것으로서, 점막면역반응을 효과적으로 유도하는 것에는 적합하지 않은 것이다.

또한, 한국공개특허공보 특2001-0032425(LTB 보강제를 갖는 백신)에는, 점막면역 보강제로 대장균의 열-불안정성 장독소의 B 소단위체(LTB)를 함유하는 백신에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나 상기의 발명은 LTB를 하나의 chimeric 단백질이 되도록 제조하여 백신으로 사용하고자 하는 것으로서, 다른 종류의 단백질을 각각 발현시켜 정제하여 제조해야 하는 번거로움이 있으며, 경구투여용으로는 적합하지 않다.

또한, 한국공개특허공보 특1999-008290(열에 불안정한 엔테로톡신과 콜레라톡신 B 유니트간의 혼성분자)에는, LTB와 CTB를 서로 혼합하여 장독소로 인한 질병을 예방 또는 치료하는 광범위한 스펙트럼을 가진 백신의 면역성분으로서 사용되는 혼성분자에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나 상기의 발명은, 단지 면역적 성숙 CTB 에 LTB 특이적 에피토프 특성을 부여하는 성숙 LTB의 해당 아미노산 잔기를 치환 또는 그 반대로 제조하는 것으로서, 돼지콜레라 질병에 대한 백신과 경구투여용 백신으로는 적합하지 않다.

또한, 미국등록특허공보 5993820(Chimeric LTB 백신)은, LTB의 3차 구조를 변화시키지 않는 염기서열부위에 8-30개 아미노산의 항원 펩타이드 서열을 삽입하여 제조하는 백신에 관한 것이다.

하지만, 상기의 발명은 상대적으로 크기가 큰 항원에 대하여서도 LTB 구조가 변하지 않고 유효할 수 있는 것인지는 불분명하며, 또한 경구투여용으로도 적합한 것은 아니다.

상기한 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명은 경구투여로 점막면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 신규한 재조합 경구용 백신과 그 유전자 및 아미노산 서열과 그 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 재조합 경구용 백신은 열-불안정성 장독소 B 소단위체 (LTB)와 돼지콜레라 바이러스 (CSFV, Classical Swine Fever Virus)의 E2 에피토프 유전자를 chimeric으로 재조합하여 발현시킨 다음, 분리 및 정제하여 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명의 재조합 경구용 백신은 경구투여로 점막면역반응을 효과적으로 유도할 수 있다.

점막면역용 백신을 개발하기 위한 다양한 방법 중 하나는 대장균의 열-불안정성 장독소(heat labile enterotoxin ; LT)나 콜레라 독소(cholera toxin ; CT)같은 세균성 외피독소(enterotoxin)들을 이용하는 것으로써 LT는 CT와 비슷한 생화학적 특성을 나타내며 강력한 점막항원 또는 점막 보조제(adjuvant)로 알려져 있다.

또한 이 두 분자는 무관한 항원에 대한 전신적 항체반응 뿐만 아니라 점막 분비성 면역글로불린 A(secretory immunoglobuilin A ; S-IgA)가 생성되도록 하는 운반체의 역할을 한다 (Snider et al., 1995).

LT는 CT와 마찬가지로 하나의 A 소단위체와 오각형(pentamer) 형태의 동일한 B 소단위체로 구성되어 있다. A 소단위체는 감염된 세포 내부에 존재하는 아데닐레이트 사이클레이즈 시스템(adenylate cyclase system)의 조절단백질의 일종인 Gsx의 ADP-라이보실레이션(ADP-ribosylation)을 통하여 cAMP의 지속적인 합성을 유도하여 장내 세포 독성을 나타내고, B 소단위체는 강글리오사이드(ganglioside) GM1이라 불리는 상피세포의 수용체 분자에 특이적으로 결합함으로써 A 소단위체의 내부유입을 촉진시키는 것으로 알려져 있다 (Spangler et al., 1992).

LT와 CT는 여러 종류의 항원에 대하여 강력한 보조제로써의 역할을 하는 것으로 보고된 바 있으며 (Katz et al., 1997), 항원의 전시(presentation)나 사이토카인(cytokine) 생산 그리고 B 세포의 스위칭(switching)과 같은 다양한 면역 작용 을 조절하는 것으로 알려져 있지만 (Bromander et al., 1991, Lycke et al., 1998) 점막면역용 백신으로써의 이용은 A 소단위체의 독성 때문에 제한적일 수 밖에 없었다.

따라서, 이러한 문제점를 해결하고자 비독성 LTB를 보조제로 사용하기 위한 여러 연구들이 수행되었으며, 항원의 단독투여시보다 LTB와 항원이 동시에 비강 투여된 경우에, LTB는 점막관련 임파조직(Mucose-associated lymphocyte tissue ; MALT)의 유도부위로 전달되는 항원의 양을 증가시키고, 그 결과 보다 많은 항원이 항원특이적인 B 세포와 T 세포의 자극을 유도한다고 보고된 바 있다 (Nashar et al., 1993).

LTB는 이러한 보조제로서의 효과 이외에도 사이토카인(cytokine) 생산 (Nashar et al., 1996), 임파구 세포자살(lymphocyte apoptosis) (Truitt et al., 1998) 그리고 B 세포를 활성화시키는 물질의 발현과 같은 면역활성을 조절하는 것으로 알려져 있다.

한편, E2 단백질은 CSFV의 주된 항원단백질(antigenic protein)로서 외피 당단백질(envelope glycoprotein)이다. (Wensvoort et al., 1989)

CSFV brescia 계통의 E2 유전자를 발현시키는 재조합 pseudorabies virus (PRV)를 돼지에 접종한 경우 (van Zijl et al., 1996)와 곤충세포에서 발현시킨 후 이를 immunoaffinity법으로 정제한 E2 단백질을 돼지에 접종한 경우 (Hulst et al., 1993)에서 CSFV에 대하여 저항성을 나타냄으로써 E2 단백질 단독으로도 보호(protection)에 충분한 면역반응을 보여주는 것으로 보고 되었다.

또한, 여러종의 CSFV로부터 분리한 envelope glycoprotein E2 (gp51-54)의 에피토프에 대한 다양한 단일클론항체(Mab)들이 분리되었으며 (Wensvoort et al., 1986, Weiland et al., 1992), CSFV brescia 계통의 E2 단백질에 대한 13종의 Mab들을 이용하여 길항적 결합연구(competitive binding study)와 antigen capture assay를 수행한 결과 E2 단백질에는 4개의 antigenic domain (A, B, C, and D)이 존재하는 것으로 보고 되었다 (Wensvoort et al., 1989).

이 중 domain A, B 그리고 C는 Mab에 의해 중화(neutralize)되는 에피토프를 포함하는 것으로 알려져 있으며, 이들 antigenic domain들은 아미노산 서열상의 N 말단 쪽의 절반정도에 위치하고 두개의 독립적인 구조적 단위을 이루고 있는 것으로 보고 되고 있다 (van Rijn et al., 1994).

첫 번째 구조적 항원 단위(structural antigenic unit)는 에피토프 B와 C로 이루어져 있고 (unit B+C) 다른 하나는 highly conserved 된 에피토프 A를 포함하는 unit A 이며, unit A는 모든 pestivirus에서 highly conserve 되어있는 소수성 부위(hydrophobic region)을 포함하고 있으며, 특히 이들 두개의 구조적인 antigenic unit중 B+C 에피토프나 A 에피토프가 각각 결손된 E2 단백질 돌연변이를 돼지에 접종한 후 면역 능력을 조사한 결과 완전한 E2 단백질을 접종했을 경우와 비교하여 대등한 중화 역가(neutralizing titre)와 바이러스성 CSFV에 대하여 강한 저항성을 보이는 것으로 보아 E2 단백질의 두개의 antigenic unit중 하나만 가지고도 CSFV에 저항할 수 있는 충분한 면역반응을 보여주는 것으로 보고 되고 있다 (van Rijn et al., 1996).

이하, 실시예와 실험예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이들이 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> CSFV E2 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석

중앙가축전염병연구소로부터 롬(LOM) 계통의 돼지콜레라바이러스(CSFV)를 분양받아 사용하였다.

CSFV를 배양하고 전체 RNA를 분리한 후, E2 유전자를 클로닝하기 위해 두개의 디옥시올리고뉴클레오티드(Deoxyoligonucleotides)를 합성하였다.

두 개의 디옥시올리고뉴클레오티드(Deoxyoligonucleotide)염기 서열은

antisense 5'-TACTGCAGAAATATACTACGACCTCGATGT-3'

sense 5'-GTCGGATCCCTAGCCTGCAAGGAAGAT-3' 이다.

상기 antisense 프라이머를 사용하여 역전사 반응을 실시한 다음, E2 유전자를 증폭하기 위해 상기 두 개의 프라이머를 사용하여 95 ℃ denaturation 30초, 45 ℃ annealing 1분, 72 ℃ extention 1분 30초의 반응조건으로 45 cycle의 Polymerase Chain Reaction(PCR)반응을 수행한 후, PCR 산물을 pCR-TOPO 클로닝 벡터에 넣어 재조합하였다.

클로닝한 E2 유전자 서열에 대해 유전자 서열 자동분석기를 이용하여 서열을 분석한 결과, 본 발명의 E2 유전자는 1191 개의 염기쌍으로 되어 있으며, 이로부터 유추한 E2 단백질의 아미노산 서열은 표 1과 같다.

본 발명의 CSFV LOM계통 E2 아미노산 서열과 CSFV 바이러스성 균주들의 E2 단백질 서열과의 상동성을 비교하여 그 결과를 표 1에 나타냈다.

<표 1> CSFV E2 단백질 아미노산 서열과의 상동성 비교결과

LOM	1 LACKEDYRYALSSTNEIGLLGAGGLTTTWEEYNHDLQLNDGTVKAICVAGSFKITALNVV
Alfort	********I**************K*******************V****
Shiemen	********I**************KS******************V****
Bresica	****HIT****HE****KND*****M*V****
	61 SRRYLASLHKEALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLN
	************************************************************
	********GL**********************************************
	********D************SL************Y**************
	121 GSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCK
	************************************************************
	**********************************E*********************
	**********************************E*********************
	181 LGGNWTCVKGEPVVYAGGLVKQCRWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDC
	*************T******************************************
	*************TQ**K**********************************
	W**********TTP**************************************
	241 NRDGVVISTKGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKETVSSEGPVRKTSCTFNYAKT
	*******E**************************I*****************
	******AE**V*******************IA**************
	*******E************L*********IA**************
	301 LKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDRHSDYFAEFVVLVVVALLGGRYVLWLIV
	****************************************************I***
	************************************************************
	RR***********************************I****************
	361 TYIVLTEQPAAGLPLSQGEVVLIGNLITHTVIEVVVY
	**********AG************D****
	******L**G**********D****
	******LQG***********D****

* 91 ~ 97% identity in 397 residues overlap

표 1의 결과와 같이 본 발명의 CSFV LOM계통 E2 단백질의 아미노산 서열은 알포트(Alfort), 쉬멘(Shiemen)및 브레시카(Bresica)와 같은 CSFV 바이러스 계통의 E2 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 매우 높았다.

<실시예 2> 대장균의 LTB 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석

열-불안정성 장독소(Heat labile enterotoxin) 단백질을 발현하는 대장균주 H10407은 ATCC(American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다.

H10407을 배양하고 전체 DNA를 분리한 후, LTB 유전자를 클로닝하기 위해 두 개의 디옥시올리고뉴클레오티드(Deoxyoligonucleotides)를 합성하였다.

두 개의 디옥시올리고뉴클레오티드(Deoxyoligonucleotides)염기 서열은

sense 5'-TGGAAGCTTGCTCCCCAGACTATTACAGA-3'

antisense 5'-TACTGCAGTTTTTCATACTGATTG-3' 이다.

이 두 개의 서열을 프라이머로 사용하여 LTB 유전자를 클로닝한 다음, 클로닝한 유전자 서열을 유전자 서열 자동분석기를 이용하여 서열을 분석해 본 결과, 본 발명의 LTB 유전자는 312 개의 염기쌍으로 되어 있으며, 이로부터 유추한 LTB 단백질의 아미노산 서열은 표 2와 같다.

본 발명의 LTB 단백질의 아미노산 서열은 Genebank에 명시된 LTB 단백질의 아미노산 서열과 100% 일치하였다.

본 발명의 LTB 유전자와 아미노산 서열을 표 2에 나타냈다.

<표 2> LTB 유전자와 아미노산 서열

<실시예 3> LTB 와 E2 chimeric 유전자 재조합 및 발현벡터 제조

LTB 와 E2 chimeric 유전자의 재조합 및 발현벡터 제조과정을 도 1에 나타내었다.

실시예 1의 E2 에피토프 유전자에서 막통과 (transmembrane)부위가 제거된 E2 유전자(A+B+C+D, 588 염기쌍), A+D 에피토프를 포함하는 E2 유전자(210 염기쌍), B+C 에피토프를 포함하는 E2 유전자(351 염기쌍)을 PCR 방법으로 대량 증폭하기 위해 7개의 디옥시올리고뉴클레오티드를 합성하였다.

7 개의 디옥시올리고뉴클레오티드 염기 서열은

sense 5'-GTCGGATCCCTAGCCTGCAAGGAAGAT-3'

antisense 5'-ATAAAGCTTCGCGTAGACCACTGGTTCACC-3'

antisense 5'-GCGAAGCTTCTTATGCAATGATGCCAAAT-3'

antisense 5'-TACGGATCCGAGCTCCTGTTCGACGGG-3'

antisense 5'-ACCAAGCTTCTAGCCTGCAAGGAAGAT-3'

antisense 5'-ATACAGCTGCTACGCGTAGACCACTGGTTCACC-3'

antisense 5'-ATACAGCTGCTACTTATGCAATGATGCCAAAT-3' 이다.

이 7개의 서열을 프라이머로 사용하여 PCR 방법에 의해 E2 유전자(A+B+C+D, 588 염기쌍), A+D 에피토프(210 염기쌍), B+C 에피토프(351 염기쌍)를 포함하는 클론들을 pE5,pE6,pE7 로 명명하였고, 이들 각각에 대해 종료 코돈을 가진 클론들은 pE11,pE12,pE13 으로 명명하였다 .

또한, 실시예 2의 LTB 유전자에 대해 대장균에서 발현 가능한 클론을 만들기 위해 3개의 디옥시올리고뉴클레오티드를 합성하였다.

3 개의 디옥시올리고뉴클레오티드(Deoxyoligonucleotides)염기 서열은

sense 5'-TGGAAGCTTGCTCCCCAGACTATTACAGA-3'

antisense 5'-GGCCAGCTGCTAGTTTTTCATACTGAT-3'

antisense 5'-GTAAAGCTTGTTTTTCATACTGATTG-3' 이다.

이 3개의 서열을 프라이머로 사용하여 PCR 방법에 의해 종료 코돈을 포함하는 LTB 유전자 절편(pL3)과 종료 코돈을 포함하지 않는 LTB 유전자 절편(pL2)을 클로닝하였다.

클로닝된 E2 및 LTB 유전자의 염기서열 분석결과 의도적인 염기의 삽입(종료 코돈, 제한효소 부위) 이외에는 상기 실시예 1,2에서의 서열과 100% 일치하였다.

Chimeric 단백질 발현을 위한 재조합은 pL2와 pL3로부터 순수분리한 LTB 유전자 절편과 6종의 E2 에피토프 유전자가 포함된 클론으로부터 분리한 유전자 절편을 다시 chimeric으로 재조합하였으며, 이를 각각 pEL1,pEL2,pEL3,pLE1,pLE2.pLE3라 명명하였다. EL로 표기된 클론은 5'쪽이 E2 유래의 에피토프 유전자, 3'쪽이 LTB 유전자를 나타내는 것이고, LE의 경우는 그 반대의 방향성을 나타낸다.

또한 3종의 E2 클론들(pE11,pE12,pE13)과 LTB 클론인 pL3, 그리고 chimeric 유전자클론인 pEL1,pEL2,pEL3,pLE1,pLE2.pLE3를 대장균 발현 벡터 pET28a에 재조합하였다. 이들 재조합 클론들에 대하여 pET-L3, pET-E11, pET-E13, pET-EL1, pET-EL2, pET-EL3, pET-LE1, pET-LE2, pET-LE3라 각각 명명하였다.

<실시예 4> LTB와 E2 chimeric 유전자의 발현 및 분리정제

발현벡터에 재조합된 각 플라스미드(plasmid)들을 대장균 BL21(DE3)에 형질전환(trasnsformation)하였다.

발현벡터를 갖는 클론을 1 mM 이소프로필-베타-디-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하여 발현을 유도하였다.

발현시킨 세포 추출물을 13% SDS-PAGE에 의해 분석하고 Western blot으로 확인하여, 그 결과를 도 2에 나타냈다.

발현이 유도된 세포를 파쇄시키고 세포 파쇄액을 히스트랩 킬레이팅 (HisTrap chelating) HP 컬럼에 로딩(loading)하였다.

컬럼을 결합 완충용액으로 세척한 후, 완충용액 중의 이미다졸(imidazole) 농도를 20 mM에서 500 mM로 순차적으로 증가시키면서 분취하였다.

<실험예 1> 생쥐에 대한 경구투여

13% SDS-PAGE와 Western blot 분석 결과를 바탕으로 고순도의 분취용액만을 얻어, 그 결과를 도 3에 나타냈다.

LTB 단백질, E2 에피토프 단백질 및 이들의 chimeric 단백질을 생쥐에 경구투여하였다.

마취시키지 않은 생쥐에 재조합 단백질 5 ㎍씩을 200 ㎕의 PSB 용액에 희석한 것을 투여하였다.

모든 생쥐에 대한 면역 스케쥴은 최초 투여시점으로부터 매 7일 단위로 실시하였으며, 4주동안 총 4차례에 걸쳐 경구투여를 실시하였다.

혈액과 변(feces)은 1차와 2차 경구투여 후 3일이 경과한 다음 채취하였고 마지막 경구투여 후에는 6일이 경과한 다음 채취하였다.

혈액은 원심분리하여 혈청을 분리하였고, feces는 PBS로 부유시킨 후 원심분리하여 상등액을 취한 다음, 다시 원심분리하여 상등액을 취하였다.

<실험예 2> Chimeric 항원단백질에 대한 점막면역성 조사

경구투여한 각 chimeric 항원단백질에 대한 총혈청 면역글로불린(total serum immunoglobulin, Ig)에 대한 역가는 엘라이저(enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA)를 이용하여 조사하였다.

총혈청 면역글로불린을 조사한 결과 도 4와 같이 재조합 LTB가 E2 에피토프 유전자의 5'쪽에 재조합된 chimeric 항원인 LE1, LE2 그리고 LE3에 대한 역가(titre)가 대조군보다 매우 높게 나타났다.

반면에 LTB가 3'쪽에 재조합된 키메라 항원인 EL1, EL2 그리고 EL3에 대한 역가는 대조군과 비교시 차이가 없었다.

이들 결과는 chimeric 항원의 발현에 있어 LTB의 재조합 위치가 매우 중요함을 의미한다.

경구투여한 각 키메라 항원에 대한 분비성 면역글로불린 A(secretory IgA ; S-IgA)에 대한 분석을 위하여 최종 경구투여 후 1주일 후에 변(feces) 추출액을 얻어 엘라이저를 이용하여 조사하였다.

도 5와 같이 LE1, LE2 및 LE3에 대한 S-IgA의 역가가 대조군에 비해 증가함을 알 수 있었다. 특히 LE1의 경우 현저히 높은 S-IgA의 역가를 확인하였다.

<실험예 3> Chimeric 항원단백질에 의한 점막면역반응 양상 조사

전체 혈청으로부터 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA 및 IgM에 대한 이소타이핑(isotyping)과 분변 내 면역글로불린A(fecal IgA)에 대한 역가조사는 이뮤노퓨어 단일클론 항체 이소타이핑 키트(ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping kit I) (Pierce, USA)를 사용하였으며, 제조사의 설명서에 따라 실험을 하였다.

도 6과 같이 LE1에서 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgM의 역가가 높게 증가 하였다.

이러한 결과는 키메라 항원 내의 LTB는 경구를 통한 면역시 조력 T세포 2(Helper T cell 2 ; Th2) 반응의 활성화에 중요한 역할을 하는 것임을 의미한다.

전체 혈청과 분변(fecal) 용액에 대한 IgE의 역가 조사는 OptEIA Mouse IgE set (Pharmingen, USA)를 사용하였으며, 제조사의 설명서에 따라 실험을 하였다.

IgE의 역가를 조사한 결과 도 7과 같이 대조군에 비해 LE1의 IgE의 레벨이 크게 증가함을 볼 수 있었다.

이것은 Th2 세포로부터 분비되는 인터루킨-4(interleukin-4 ; IL-4)에 의한 자극으로 LE1의 경구투여결과 Th1 세포의 활성화와 IgE 생성이 유도되는 것임을 의미한다.

Chimeric 항원단백질을 경구투여한 생쥐의 소장으로부터 임파구를 분리하였고, 플로우 사이토메트리(Flow Cytometry)에 의해 IgA+ B 세포를 분석하였다.

분석결과 도 8과 같이 LE1이 경구투여된 세포에서의 IgA 발현이 매우 증가하였다.

이것은 chimeric 항원단백질 내에 존재하는 LTB의 보조제 효과에 의해 IgA의 생성이 증가되었음을 의미하며, IgA 발현을 위한 B 세포의 분화가 유도됨을 의미한다.

Chimeric 항원단백질을 경구투여한 생쥐의 소장, 림프선(lymph node), 흉선(thymus)로부터 분리된 임파구를 대상으로 Flow Cytometry법에 의해 T 세포 활성도를 분석하였다.

도 9와 같이 활성화된 T 세포군이 증가함을 확인함으로써 chimeric 항원단백질에 대한 점막면역반응 결과로 T 세포의 조절이 이루어짐을 확인하였다.

경구투여된 chimeric 항원단백질에 의한 사이토카인(cytokine)의 조절 기작을 알아보고자 점막면역반응을 담당하는 주요 기관으로부터 전체 RNA를 분리하고 Real time RT PCR을 이용해 대표적인 사이토카인들의 발현 양상을 조사하였다.

점막면역계의 대표적인 유도 부위인 페이어스 패치(Payer's patch)의 경우, 도 10과 같이 키메라 항원투여군이 대조군보다 인터페론 감마(INF-gamma) 및 티지에프-베타(TGF-beta)의 발현률이 매우 높게 나타났다.

도 11과 같이 점막면역계의 대표적인 효능 부위인 소장에서는 인터루킨-4, 인터루킨-2의 발현률은 높았지만 티지에프-베타(TGF-beta)의 발현률은 오히려 억제되었다.

이러한 결과는 재조합된 항원의 특성에 따라 각 조직에서의 T 세포의 조절에 차이를 보이는 것을 의미한다.

본 발명에 의해 경구투여로 점막면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 신규한 재조합 경구용 백신과 그 유전자 및 아미노산 서열과 그 제조방법이 제공된다.

<110> KT&G Co.,LTD. <120> EDIBLE VACCINE USING E.coli HEAT-LABILE TOXIN B AND CSFV E2 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 909 <212> DNA <213> Escherichia coli, Classical swine fever virus <400> 1 atggctcccc agactattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg 60 ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc 120 attacattta agagcggcga aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac 180 tcccagaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag 240 accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc 300 agtatgaaaa acaagcttct agcctgcaag gaagattaca ggtacgcact atcatcaacc 360 aatgagatag ggctactcgg ggccggaggt ctcaccacca cctgggaaga atacaaccac 420 gatttgcaac tgaatgacgg gaccgttaag gccatttgcg tggcaggttc ctttaaaatc 480 acagcactta atgtggtcag taggaggtat ttggcatcat tgcataagga ggctttaccc 540 acttccgtga cattcgagct cctgttcgac gggaccaacc catcaactga ggaaatggga 600 gatgacttcg ggttcgggct gtgcccgttt gatacgagtc ctgttgtcaa gggaaagtac 660 aatacaacct tgttgaacgg tagtgctttc tatcttgtct gtccaatagg gtggacgggt 720 gttatagagt gcacagcagt gagcccaaca actctgagaa cagaagtggt aaagaccttc 780 aggagggaca agccctttcc gcacagaatg gattgtgtga ccacaacagt ggaaaatgaa 840 gatttattct actgtaagtt ggggggcaac tggacatgtg tgaaaggtga accagtggtc 900 tacgcgtag 909 <210> 2 <211> 302 <212> PRT <213> Escherichia coli, Classical swine fever virus <400> 2 Met Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr 1 5 10 15 Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met 20 25 30 Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr 35 40 45 Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys 50 55 60 Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu 65 70 75 80 Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser 85 90 95 Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn Lys Leu Leu Ala Cys Lys Glu Asp 100 105 110 Tyr Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala 115 120 125 Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Glu Glu Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu 130 135 140 Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Ile 145 150 155 160 Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys 165 170 175 Glu Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr 180 185 190 Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys 195 200 205 Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu 210 215 220 Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly 225 230 235 240 Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val 245 250 255 Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asp Cys 260 265 270 Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly 275 280 285 Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu Pro Val Val Tyr Ala 290 295 300

Claims

서열번호 1의 염기서열을 가지는, 대장균의 LTB와 돼지콜레라바이러스의 E2 에피토프의 재조합 유전자.
서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는, 대장균의 LTB와 돼지콜레라바이러스의 E2 에피토프의 재조합 유전자로부터 발현되는 폴리펩타이드.
제 1항의 재조합 유전자를 포함하는 발현벡터.
제 1항의 재조합 유전자를 포함하는 발현벡터 pET-LE1.
백신의 제조방법에 있어서,

대장균의 LTB 유전자와 돼지콜레라바이러스의 E2 에피토프 유전자를 재조합하여 대장균 발현벡터에 삽입한 다음, 재조합 발현벡터를 대장균에 형질 전환하여 발현시킨 후, 발현된 단백질을 정제하여 제조하는 것으로 구성된,

경구용 백신의 제조방법.
제 5항에 있어서,

돼지콜레라 E2 에피토프 유전자는, E2 외피단백질의 유전자에서 막통과 부위가 제거된 것이 특징인,

경구용 백신의 제조방법.
제 5항 또는 제 6항에 있어서,

LTB 유전자는 5'쪽에, E2 에피토프 유전자는 3'쪽에 재조합 되어지는 것이

특징인,

경구용 백신의 제조방법.
제 5항 또는 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된,

대장균의 열-불안정성 장독소 B 소단위체와 CSFV E2 를 이용한 경구용 백신.