KR100558770B1

KR100558770B1 - 다시마로부터 분리한 소장 내 포도당 흡수 저해물질 및 그정제방법

Info

Publication number: KR100558770B1
Application number: KR1020030059584A
Authority: KR
Inventors: 홍범식; 조홍연; 신동훈; 김혜경; 김지선; 전우진; 호진녕
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2003-08-27
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2006-03-10
Also published as: KR20050022951A

Abstract

본 발명은 다시마로부터 분리되어 당뇨 및 비만의 유발과 밀접한 관련이 있는 포도당 흡수 저해물질 및 그 정제방법에 관한 것으로 이러한 포도당 흡수 저해물질은 다시마의 메탄올 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획한 후 1차, 2차 소수성 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 및 HPLC 등 일련의 과정을 거쳐 정제되었으며 이러한 방법으로 얻어진 물질은 소장 내 포도당 흡수를 저해하게 되고 이로 인해 혈중 당의 농도가 저하됨으로써 비만 및 당뇨 예방용 기능성 식품이나 약물에 유용하게 사용될 수 있다.

다시마, 메탄올추출물, 항비만, 항당뇨, 포도당흡수저해

Description

다시마로부터 분리한 소장 내 포도당 흡수 저해물질 및 그 정제방법 {Intestinal glucose absorption inhibitor isolated from Laminaric japonia and its purification method}

도 1은 다시마로부터 메탄올 추출 및 메탄올 추출물의 유기용매 분획 단계를 나타내는 절차흐름도이다.

도 2는 각 유기용매 분획물의 포도당 흡수 저해활성을 나타내는 그래프이다.

도 3은 메탄올 분획물로부터 최종 활성물질을 정제하는 단계를 나타내는 절차흐름도이다.

도 4는 최종 분리된 활성물질의 정제도를 나타내는 그래프이다.

도 5는 다시마, 미역귀 및 톳의 메탄올 추출물을 투여한 생쥐로부터 얻은 BBMV의 SGLT1 합성 억제효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다시마로부터 분리한 소장에서의 포도당흡수저해물질 및 그 정제 방법에 관한 것이다.

세계적으로 당뇨병은 지역에 관계없이 발병하고 있으며 발병율 또한 증가 추세에 있을 뿐만 아니라 합병증에 의해 사망에 이르는 대표적인 성인병 중의 하나이다. 1998년 WHO(세계보건기구)의 보고서에 의하면 향후 25년 이내에 현 1억 4천만명의 당뇨병환자가 3억명으로 2배이상 증가할 것으로 예측됨으로써 당뇨병의 예방, 제어 및 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있다(참조 : Oku, A. et al., Diabete, 48 : 1794 (1994)).

당뇨병은 인슐린 의존성 당뇨(IDD, insulin-dependent diabetes)와 인슐린 비의존성 당뇨(NIDDM, non-insulin-dependent diabetes mellitus)로 구분되며 선진국에서는 NIDDM이 크게 증가하고 있다. 이 NIDDM은 에너지의 과잉섭취와 운동부족 등의 외부환경인자에 영향을 받고 있으며 실제로 이들 외부인자는 비만과도 관련되어 NIDDM 환자 중 여성의 70%와 남성의 50%가 비만으로 나타나 있다. 비만은 인슐린 저항성을 유도하기 때문에 비만치료에 사용되고 있는 식사제한, 과혈당개선, 적절한 에너지 유지 및 흡수저해제, 발열촉진제 등이 NIDDM의 처치에 효과적인 것으로 보고되고 있으나 실제 당뇨환자들에 있어 칼로리섭취와 식사량을 제한하는 일은 쉬운 일이 아니다.

식이 탄수화물의 소장내 흡수는 아밀라아제(amylase)와 글루코시다아제 (glucosidase)에 의해 소화되어 포도당으로 분해된 후 소장 상피세포에서 흡수, 수송된다. 이 수송에 관여하는 운반체는 GLUT (sodium-independent glucose transporters) 계열과 SGLT (sodium-dependent glucose transporters) 계열로 대별 되며, 포도당은 SGLT1의 작용에 의해 소장내에서 흡수된다(참조 : Silverman, M. et al., Annu. Rev. Biochem. 60 : 757 (1991), Thorens, B, Annu. Rev. Physiol. 55 : 591 (1993)). SGLT1은 소장내 가장 함량이 높은 포도당 운반체로서 상피세포의 BBMV(brush border membrane vesicle)에 존재하기 때문에 포도당 과다 흡수에 의한 비만과 당뇨의 예방용 소재 개발에 있어 주목을 받아온 운반체 중의 하나이다(참조 : Bell, G.I. et al., Diabetes Care. 13 : 198 (1990)). 따라서 SGLT1의 생합성 억제 또는 활성저해에 의한 비만, 당뇨의 예방 및 치료제 개발 전략은 기존의 전분가수분해효소 저해제(참조 : Tsujihara, K. et al., J. Med. Chem. 42 : 5311 (1999), Vedavanam, K. et al., Phytother Res. 13 : 601 (1999), Murakami, N. et al., Chem. Pharm. Bull. 44 : 469 (1996), Welsch, C.A. et al., J . Nutr. 119 : 1698 (1989))에 의한 방법에 비해 음식물의 섭취량과 종류에 관계없이 포도당의 흡수를 직접적으로 제어할 수 있다는 관점에서 유효성이 높다.

기능성식품, 식품의약, 의약의 개발에 있어 요구되는 안전성을 확보하고, 물질의 임상에 대한 위험성을 감소시키기 위해 오랫동안 식품으로 이용해 온 해조류을 대상으로 포도당 흡수 저해물질을 검색하였다. 검색을 위한 에세이(assay)계는 분화시 소장의 상피세포와 기능 및 형태가 유사하고 SGLT1을 함유하고 있는 대장암세포주의 하나인 Caco-2와 비방사성물질이면서 취급이 용이한 2-NBDG(2-(N-(7-nitrobenz -2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose)를 사용하여 포도당의 소장내 흡수 저해활성을 측정하였다(참조 : Sokoloff. L. J. Neurochem. 28 : 897 (1997)).

Caco-2 세포주는 주로 금속과 지질의 흡수 연구에 이용되어 왔고 최근에 이르러 SGLT1이 밝혀짐에 따라 BBMV(brush border membrane vesicles)와 함께 포도당 흡수기작의 규명에 사용되었다(참조 : Yoshida, A. et al., Histochem. J. 27 : 42 (1995), Davidson, N.O. et al., Am. J. Physiol. 262 : c795 (1992), Dyer, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 230 : 624 (1997), Dyer, J. et al., Gut. 41 : 56 (1997), Ferraris, R.P. Biochem. J. 360 : 265 (2001)).

그러나 Caco-2를 이용한 소장내 포도당흡수저해물질에 관한 연구는 녹차 추출물인 T-1095 물질의 스트렙토조토신(streptozotocin) 유도 당뇨쥐의 과혈당 개선효과(참조 :　Adachi, T. et al., Metabolism, 49 : 990 (2000)), T-1095 물질의 C57BL/KSJ-db/db mice의 당뇨증상의 개선효과(참조 : Arokawa, K. et al., Br. J. Pharmacol. 132 : 578 (2001)), 녹차 카테킨에 의한 소장 포도당의 수송조절(참조 : Shimizu, M. et al., Biofactors, 13 : 61 (2000)), 녹차 폴리페놀(polyphenol)의 경쟁적 Na 의존성 포도당 수송저해(참조 : Kobayashi, Y. et al., J. Agric. Food Chem. 48 : 5618 (2000)) 등이 보고되어 있을 뿐 소장에서 포도당흡수저해제의 개발에 관한 연구는 미미하다.

다시마(Laminaric japonia)는 갈조류에 속하는 해조류로 칼슘, 인, 철, 마그네슘 등의 알카리성 금속이온과 4,000 ppm 이상의 요오드를 함유하고 있는 훌륭한 무기질의 공급원이며, 정미성분이 풍부하여 각종 국물을 우려내는 조미재료로서 이용되고 있다. 다시마의 주성분인 알긴산(20 ∼ 30 %)은 난소화성 식이섬유로서 동맥경화 예방, 변비 예방, 중금속 제거 및 항균작용 등의 생리활성효과를, 수용성 함유 황다당류인 푸코이단(fucoidan)은 항혈액응고 작용과 항암작용을, 라미닌 (laminine)은 고혈압 완화작용을 각각 나타내는 것으로 알려져 있다. 다시마를 섭취시킨 당뇨동물과 당뇨병 환자에게서 혈당 및 혈청지질의 저하가 관찰되어 당뇨환자관리에 우수한 식품임이 입증된 바는 있으나 소장에서 포도당 흡수를 저해하는 효과가 있음이 보고되어진 바는 없다.

따라서 본 발명자들은 상기와 같이 소장에서 포도당 흡수 저해제로 사용할 수 있도록 식품신소재를 개발하기 위해 해조류을 대상으로 검색을 수행하던 중 국내에서 오랫동안 상식해 온 다시마의 메탄올 추출물에서 높은 포도당 흡수 저해활성을 확인하고 메탄올 추출물로부터 상기 활성을 갖는 저분자 물질을 정제함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 종래의 문제점을 해소하기 위한 것으로, 특히 소장내에서 포도당 흡수를 저해하는 포도당 흡수 저해물질을 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 다시마로부터 포도당 흡수 저해물질을 분리하는 방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다시마가 함유하고 있는 포도당 흡수 저해물질을 다시마로부터 분리함을 특징으로 한다.

또한, 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명 다시마로부터 분리한 소 장 내 포도당흡수저해물질 및 그 정제방법은 다시마를 분쇄한 후, 실온에서 메탄올로 추출하여 그 농축물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, HPLC 등 일련의 정제공정을 수행함으로써 다시마로부터 분리함을 특징으로 한다.

본 발명은 다시마의 메탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올로 분획하는 단계; 상기 단계에서 획득한 메탄올 분획물을 실리카겔 60G 컬럼에 주입한 다음 클로로포롬 : 메탄올 = 70 : 30으로 용출분획하여 활성분획을 얻는 단계; 상기 단계에서 수득한 활성분획물을 ODS 겔 플레이트와 메탄올 : 물 = 3 : 2의 전개용매로 분획하여 활성분획을 얻는 단계; 상기 단계에서 수득한 활성 분획물을 HPLC를 사용하여 물과 메탄올의 기울기(gradient) 용출분획함으로써 최종 활성물질을 분리하는 단계; 및 상기 단계에서 얻어진 최종 활성물질에 대한 급성독성실험 및 SGLT1 합성 억제 실험을 실시함으로써 상기 물질의 포도당 흡수 저해활성을 검정하는 단계로 구성된다.

본 발명 다시마로부터 분리한 소장에서의 포도당흡수저해물질 및 그 정제방법의 기술적 사항을 첨부된 도면을 참고로 하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.

우선, 본 발명자들은 해조류에서 추출한 추출물 중에서 다시마의 메탄올 추출물이 비교적 높은 포도당 흡수 저해활성을 가지고 있음을 발견하였다. 이에 다시마에 포함된 포도당 흡수 저해활성물질을 분리하고자 실온에서 100% 메탄올로 추출 한 후 이 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획을 실시한 다음, 포도당 흡수 저해활성이 높았던 메탄올 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하였다. 그 결과 포도당 흡수 저해활성이 높은 분획을 모아 ODS 겔 플레이트(gel plate)로 Prep-TLC를 실시한 후 높은 활성의 분획을 HPLC를 실시하여 정제분획을 얻었다.

상기와 같이 구성된 본 발명에 대해 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서는 자명할 것이다.

실시예 1 : 다시마로부터 소장내 포도당흡수저해물질 분리를 위한 추출조건 선정과 저해능 확인

여러 가지 해조류에서 냉수, 열수, 메탄올로 추출한 추출물을 검색하던 중 다시마의 메탄올 추출물이 포도당흡수저해능을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 다시마에 포함된 포도당 흡수 저해물질을 분리하고자 다시마를 100℃에서 5분간 브랜칭(blanching)하여 생체세포 내 효소를 불활성화시키고 분쇄한 후, 실온에서 100% 메탄올로 추출하고, 그 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획하고 남은 것을 메탄올에 녹여 각각을 여과포로 여과하고 잔사를 감압 농축한 후 건조하여 추출물을 얻었다(도 1 참조).

각 분획물에 대한 포도당흡수저해 실험을 하기 위해 Caco-2(human colonic cancer cell)을 6 x 104 cells/well의 농도로 24 웰 플레이트(well-plate)로 37℃, CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 13 ∼ 14일 동안 배양한 후 저해활성 측정 전날 원배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 배지내 세럼(serum) 성분을 제거시킨 다음 새로운 세럼이 제거된 DMEM(serum free DMEM)에 시료를 0.1 mg/ml의 농도로 첨가하여 37℃, CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 20시간 배양시켰다. 배양이 끝나면 배지를 제거하고 PBS로 2회 셀(cell)을 세척 후 반응의 종료를 위해 반응액을 제거하고, 차가운(ice-cold) PBS로 3회 수세한 다음 2-NBDG의 형광세기를 스펙트로포토플루오로미터(spectrophotofluorometer, 여기 : 485 nm, 발광 : 535 nm)로 측정하였다.

시료에 의한 포도당 흡수 저해활성(inhibitory effect)은 아래 식에 따라 환산하였다.

저해활성 (%) = [Fc - (Fs / Fc)] x 100

Fs : 시료를 처리한 실험구의 형광세기

Fc : 시료를 처리하지 않은 실험구의 형광세기

상기와 같이 분획에 따른 포도당 흡수 저해활성을 측정한 결과, 메탄올 분획에서 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 2 참조).

클로로포름으로 활성화된 실리카겔 60 컬럼에 시료인 메탄올 분획을 로딩(loading)하고 클로로포름과 메탄올(CHCl₃ : MeOH = 100 : 0 ∼ 0 : 100) 혼합용액으로 5 bed volume씩 전개한 후, 포도당 흡수 저해활성을 검토하여 클로로포름과 메탄올 70 : 30에서 포도당 흡수 저해활성을 갖는 소분획을 분리하고 이 분획물 을 동일한 컬럼을 사용하여 클로로포름과 메탄올(CHCl₃ : MeOH = 85 : 15 ∼ 65 : 35) 혼합용액으로 5 bed volume씩 전개한 후 포도당 흡수 저해활성이 가장 높은 클로로포름과 메탄올 78 : 22 용출획분을 분리하였다. 고활성의 상기 분획물을 ODS 겔 플레이트 (20 x 10 cm), 메탄올 : 물 = 3 : 2의 전개용매와 에탄올에 녹인 5% H₂SO₄를 발색제로 사용하여 Prep-TLC를 실시하여 활성분획을 분리하였다(도 3 참조).

분리된 소분획을 HPLC(u-Bondapak C₁₈, 3.9 x 150 mm)에 주입하고 물과 메탄올 gradient(H₂O : MeOH = 100 : 0 ∼ 0 : 100) 조건에서 1 ml/min의 유속으로 용출하여, 활성획분만을 농축한 후 활성획분을 동일한 조건에서 HPLC를 실시한 결과 좌우 대칭성이 높은 단일 피크(peak)를 얻음으로써 비교적 정제도 높게 물질을 정제할 수 있었다(도 4 참조).

각 정제단계 별 수율과 IC₅₀ 값을 종합하면 표 1과 같으며 정제물질의 IC₅₀이 매우 낮은 값을 나타냄으로써 실용화 가능성을 보였다.

다시마로부터 포도당흡수저해활성물질의 정제표

	수율 (%)	^a)IC₅₀ (㎍/mL)
메탄올 추출물(CM)	40.7	250.0
메탄올 분획물 (M-M)	25.3	166.7
1차 실리카겔 컬럼(M-Ma)	7.12	140.4
2차 실리카겔 컬럼(M-Mb)	8.46	130.9
Prep. TLC(LJ-3)	4.38	98.1
HPLC(LJ-3a)	0.41	72.7
^a) IC₅₀ = 포도당 흡수를 50% 저해시키는데 필요한 농도

실시예 2 : 다시마로부터 분리한 포도당흡수저해물질의 급성독성 실험

다시마에 함유된 포도당흡수저해물질의 급성독성을 조사하기 위해 생쥐를 사용하여 경구투여한 결과 표 2에 나타난 바와 같이 시료랑 0 ∼ 4,000 mg/kg 농도의 모든 실험군에서 경구투여에 의한 독성은 나타나지 않았으며 따라서 LD₅₀이 4,000 mg/kg 이상에 존재할 것으로 추정되었다.

경구투여를 이용한 포도당흡수저해성 메탄올 추출물의 급성독성실험

	마우스 마리수	초기 체중 (kg)	최종 체중 (kg)	생존 마리수	생존율 (%)
대조군	7	30.7±1.0	38.0±0.6	7	100
2,000 mg/kg	7	33.1±1.3	35.0±0.9	7	100
4,000 mg/kg	7	32.9±1.1	38.7±0.8	7	100

실시예 3 : 다시마, 미역귀 및 톳의 메탄올추출물 투여 생쥐로부터 얻은 BBMV(brush border membrane vesicle)의 SGLT1 합성억제효과

상기 실시예 1의 시험관내 실험(in vitro assay)계에서 높은 포도당 흡수 저해활성을 보인 다시마의 생체내(in vivo) 저해활성을 검토하기 위해 미역귀, 톳과 함께 메탄올추출물을 생쥐에 2,000 mg/kg과 4,000 mg/kg의 농도로 4주간 경구투여한 후 소장으로부터 BBMV를 분리하여 BBMV내 포도당운반체의 하나인 SGLT1의 생합성량을 다음과 같이 ELISA 방법을 사용하여 정량하였다.

조제한 BBMV(100 ㎕/well)를 글루타랄데하이드(glutaraldehyde) 처리한 웰 플레이트(well plate)에 넣고 37℃에서 2시간 정치한 후 블로킹(blocking) 용액으로 0.5 % 카제인(casein) 200㎕를 가하여 동일온도에서 1시간 정치한 다음 5,000 배 희석한 SGLT1 다클론항체(polyclonal antibody) 100 ㎕를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 호스라디시 페록시다아제(Horseradish peroxidase)가 결합된 항-토끼 (anti-rabbit) IgG 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 정치하고 페록시다아제(peroxidase) 반응액 200 ㎕를 넣은 후 15분간 반응시킨 다음 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 다시마 메탄올추출물은 2,000 mg/kg의 투여농도에서 다른 추출물보다 약 1.5 ∼ 2배의 SGLT1 생합성 저해활성을 나타냄으로써 비만 및 당뇨의 예방을 위한 기능성 신소재로 실용화될 가능성을 시사하였다(도 5 참조).

상기한 바와 같이, 본 발명 다시마로부터 추출·정제한 물질은 탁월한 소장 내 포도당 흡수 저해 효과를 나타냄으로써 당뇨 및 비만 예방용 기능성 식품이나 약물에 사용될 수 있으므로 이는 식품.의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

SGLT1(sodium-independent glucose transporters 1) 생합성 저해활성을 갖는 다시마 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방용 조성물.
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