KR100540941B1

KR100540941B1 - 녹용으로부터 추출된 항진균 조성물 및 이의 제조 방법

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Publication number: KR100540941B1
Application number: KR1020050025199A
Authority: KR
Inventors: 전길자; 최원자; 한소엽; 이윤진; 김영아; 민주영
Original assignee: 전길자; 최원자; 한소엽
Priority date: 2005-03-25
Filing date: 2005-03-25
Publication date: 2006-01-10
Also published as: KR20050039790A

Abstract

본 발명은 녹용(매화록)의 에탄올 추출물 또는 그로부터 분리, 정제된 분획을 함유하는 항진균 조성물 및 이러한 녹용의 에탄올 추출물 및 그의 분획을 추출, 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 녹용의 에탄올 추출물에 함유된 항진균 성분으로서 하기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 및 이들을 활성성분으로 함유하는 항진균 조성물에 관한 것이다:

상기식에서

R 은 옥타데카노일(스테아릴), 헥사데카노일(팔미토일), 시스-9-옥타데세노일(올레오일) 또는 시스-9,12-옥타데카디에노일(리놀레오일)을 나타낸다.

Description

녹용으로부터 추출된 항진균 조성물 및 이의 제조 방법 {Fungicidal composition comprising the extract from Cornu cervi and method for preparing the same}

도 1은 녹용(매화록)의 70에탄올 추출물을 실시예 2 내지 4의 방법에 따라 추가로 분리, 정제하는 각 단계에서 수득된 분획의 박층 크로마토그램(TLC)을 나타낸 것이다[a,e: CN-Es-6s-F-d, b: CN-Es, c: CN-Es-6s, d: CN-Es-6s-F].

도 2는 녹용의 70에탄올 추출물(CN-E)의 실시예 2 내지 4의 과정에 따른 분획화 방법을 도시한 것이다.

도 3은 녹용 분획과 기존의 항진균제가 칸디다 알비칸스 균주의 효모형 생장에 미치는 영향을 비교하여 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 CN-Es-6s-F-d 분획의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 5는 본 발명에 따른 CN-Es-6s-F-d 분획의 ¹³C-¹³C COSY 스펙트럼이다.

도 6은 본 발명에 따른 CN-Es-6s-F-d 분획의 FAB-MS 스펙트럼이다.

도 7은 본 발명에 따른 신규 화합물 CHJ-1에 해당하는 m/z 546.07에 대한 탠덤 질량 스펙트럼(tandem mass spectrum; FAB-MS/MS)이다.

도 8은 본 발명에 따른 CN-Es-6s-F-d 분획을 니트(neat) 형태로 KBr 셀에 입혀서 Bio-Rad FTS 165를 사용하여 측정한 적외선 스펙트럼이다.

본 발명은 녹용(매화록)의 에탄올 추출물 또는 그로부터 분리, 정제된 분획을 함유하는 항진균 조성물 및 이러한 녹용의 에탄올 추출물 및 그의 분획을 추출, 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에서는 녹용의 에탄올 추출물에 균사체 형성을 억제하는 활성성분으로서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물들이 함유되어 있음을 확인하고, 이들을 활성성분으로 함유하는 항진균 조성물 및 화학식 1의 신규 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

상기식에서

R 은 옥타데카노일(스테아릴), 헥사데카노일(팔미토일), 시스-9-옥타데세노 일(올레오일) 또는 시스-9,12-옥타데카디에노일(리놀레오일)을 나타낸다.

녹용은 사슴과(Cornu cervi)에 속하는 사슴의 각화되지 않은 유각을 채취하여 건조한 것으로, 인삼과 더불어 우리나라 뿐아니라 동북아시아 지역에서 가장 널리 사용되고 있는 생약 중의 하나이다. 이중 우리나라에서 사용되고 있는 녹용의 기원동물로는 사슴과에 속하는 매화록(Cervus nippon Temminick var. mantchuricus Swinhoe) 및 마록(Cervus elaphus L. Cornu Ceriv Pavum) 등이 있다.

녹용은 크게 면역계, 조혈계, 간장계, 당대사, 심혈관계 등에 약리효능을 갖는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 녹용의 이러한 효능이 정확히 어떠한 기전에 의해 발휘되는지 밝히기 위하여 현대의 생리학, 생화학 및 약리학적 지식이 동원되었음에도 불구하고 아직까지 녹용의 유효성분이나 구체적인 약리작용 및 기전에 대해서는 거의 밝혀지지 않은 실정이다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 최근에 녹용에서 조혈모세포, 혈소판 전구세포 및 대식세포의 증식을 촉진하는 물질의 구조를 밝힘으로써 최초로 활성성분의 구조분석을 달성하는 개가를 이루었으나 그 활성성분의 작용기전에 대해서는 아직 밝히지 못한 상태이다.

한편, 녹용이 한방에서 강장제로 사용되고 있으며 녹용이 신체의 전반적인 면역기능을 증가시킨다는 보고에 따르면, 녹용추출물로 자연살해세포의 활성도를 측정한 연구결과를 토대로 녹용이 면역관련 질환의 치료에 활용될 수 있을 것으로 추정하고 있다. 그러나, 현재까지 녹용의 면역증진 혹은 병의 저항성 증가 활성이 숙주 세포를 활성화시킴에 의한 것인지 혹은 균의 생리 활성을 저하시킴에 따른 것인지에 대해서는 전혀 연구가 되어 있지 않다.

본 발명에서 표적으로 삼은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 기회 감염성 곰팡이 질환(opportunistic fungal infection)을 일으키는 균의 일종으로서 곰팡이 질환은 지난 20년동안 급속히 증가하여 높은 사망률을 기록하고 있다. 이와 같이 높은 사망률은 AIDS 환자의 증가와 더불어 암의 화학치료와 기관이식 등에 필요한 항생제 남용으로 인한 면역저하증 환자(immunocompromised patients)의 증가에 기인하는 것이다. 실제 1980년대 중반에 조사한 자료에 의하면 소위 2차 감염증(hospital acquired infection)으로 인한 사망의 40가 박테리아나 바이러스가 아닌 곰팡이에 의한 것이며, 이중 80가 칸디다속에 의한 것이라고 한다. 또한, 미국에서 발견되는 칸디다 질환 중 95가 칸디다 알비칸스 한가지 종에 의한 것임을 생각할 때, 칸디다 알비칸스종의 위력을 새삼 느낄 수 있으며, 이러한 자료들은 의학분야에서 병원성 곰팡이 질환의 빠른 진단과 효과적인 치료의 필요성을 실감케한다.

현재 대표적인 진균증 치료제로는 암포테리신 B(amphotericin B) 와 아졸계 화합물인 케토코나졸(ketoconazole), 플루코나졸(fluconazole) 및 클로트리마졸 (clotrimazole) 등이 알려져 있는데, 이들은 모두 천연물로부터 추출한 물질이 아닌 화학적 합성에 의해 제조된 물질들로서 그의 여러가지 부작용으로 인하여 진균증 치료에 이상적이지 못하다는 평가를 받고 있다. 특히, 가장 좋은 항진균제로 알려진 암포테리신 B의 경우 고열, 혈압강하, 두통, 구토, 혈관염증, 신장손상 등과 같은 심각한 부작용으로 인하여 '암포테리블'(amphoterrible)이라는 별명까지 가지고 있으며, 아졸계 화합물은 곰팡이를 죽이기보다는 더이상 번지지 못하게 하 는 정도의 활성을 가지고 있을 뿐아니라 병원균에 대한 선택적인 독성이 결핍되어 숙주에 많은 부작용을 야기시키기도 한다. 케토코나졸의 경우, 이런 이유로 3년 전부터 생산이 중단되고 있는 실정이다.

진균증 치료제의 숙주에 대한 부작용은 곰팡이 역시 진핵생명체로서 숙주 세포와 많은 생화학적 성질을 공유한다는 곰팡이의 생물학적 특성에 기인되는 문제이다. 인류가 항생제 개발에 성공할 수 있었던 것은, 표적인 박테리아 세포가 숙주세포와는 다른 원핵 생명체이므로 많은 생화학적 성질에서 상이하여 이에 대한 활발한 연구를 개발에 응용할 수 있었기 때문이다. 따라서 효과적인 항진균제 개발을 위해서는 곰팡이에서만 특이적으로 발현되는 표적에 대한 탐색이 필요하며, 요즈음 항진균제의 표적으로 새로이 대두되고 있는 곰팡이의 세포벽은 숙주세포인 진핵생명체에 결여된 성분으로서 선택적 독성을 나타내는 약품 개발에 좋은 표적으로 이용될 수 있다.

이러한 상황에서 본 발명자들은 녹용에서 곰팡이균의 생리 활성에 영향을 미치는 물질을 분리하여 그 구조를 밝힐 수 있다면 지금껏 화학적 합성방법에 의해 제조된 화합물에 의한 치료에 의존하고 있던 항진균제 분야에 획기적인 전기를 마련할 수 있음에 착안하고 본 연구에 돌입하였다. 그 결과, 곰팡이의 일종인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)가 발병하는데 관여하는 병원성 형태의 균사체 형성을 완전히 억제하는 물질을 녹용으로부터 분리하여 그 구조를 밝히는데 성공하였으 며, 이에 따라 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 녹용의 에탄올 추출물 또는 그로부터 분리, 정제된 분획들을 유효성분으로 함유하는 항진균 조성물을 제공하는 것을 첫번째 목적으로 한다.

본 발명자들에 의해 녹용으로부터 분리, 정제된 항진균 조성물은 병원성 곰팡이 질환의 80를 차지하는 칸디다 알비칸스의 병원성 형태로의 전환을 억제할 수 있다. 즉, 칸디다 알비칸스는 비병원성 형태인 효모형(yeast form)과 병원성 형태인 균사체형(hyphae form)으로 존재하며 효모형에서 균사체형으로 전환되었을 때 상피세포에 침투(epithelial invasion)하여 혈액을 타고 기관으로 침투 (hematogenously disseminated infection)하는 것이 발병 기작인 것으로 알려져 있다. 그런데, 본 발명자들에 의해 분리된 녹용 성분은 균의 효모형으로의 생장에 대한 다소의 저해도를 보임과 아울러 병원성 형태인 균사체형으로의 전환을 100완전히 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서 이 성분은 기존의 폴리엔(polyene) 또는 아졸계 화합물에 비해 부작용 없는 새로운 항진균제로서 개발될 수 있는 가능성이 매우 높다.

본 발명에 따르는 조성물에서 유효성분으로 사용되는 녹용의 에탄올 추출물 또는 그로부터 분리, 정제된 분획들은 다음과 같은 방법에 의해 추출되는 물질이다. 본 발명에서는 또한 이러한 추출, 분리방법을 제공하는 것을 또다른 목적으로 한다.

본 발명에 따르면 우선, 녹용을 헥산으로 추출하고, 그 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출한 다음, 그 추출잔사를 다시 에탄올로 추출하여 수득된 추출액을 감압증류하여 녹용의 에탄올 추출물(이하에서는 엑기스 CN-E라 한다)을 수득한다.

상기한 바와 같은 추출방법에서 사용되는 추출용매인 헥산, 클로로포름 및 에탄올의 양은 각각 사용된 녹용이 잠길 정도의 양이면 충분하며, 일반적으로는 녹용 1㎏에 대하여 각각의 용매를 약 4 내지 5ℓ 비율로 사용한다.

이러한 방법에 의해 수득되는 녹용의 에탄올 추출물인 엑기스 CN-E는 계속해서 일련의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 TLC 방법에 의해 더 분획화시키고 정제한다. 즉, 녹용의 에탄올 추출물인 엑기스 CN-E의 후속 처리단계는

a) 엑기스 CN-E를 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2, v/v/v) 혼합용액으로 처리하여 녹는 부분(엑기스 CN-Es)과 녹지않는 부분(엑기스 CN-Ei)으로 분획화하는 단계;

b) 엑기스 CN-Es를 용리액으로 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2, v/v/v) 혼합용액을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하고, 수득되는 분획을 TLC에 전개시켜 Rf치에 따라 엑기스 CN-Es-1 내지 CN-Es-9 까지의 9가지 엑기스를 얻는 단계;

c) 상기 단계 b)에서 수득한 엑기스 중 Rf치가 0.30인 엑기스 CN-Es-6을 클로로포름/메탄올(2:1, v/v) 혼합용액으로 처리하여 녹는 부분(엑기스 CN-Es-6s)과 녹지 않는 부분(엑기스 CN-Es-6i)으로 분획하하는 단계;

d) 엑기스 CN-Es-6s를 클로로포름/메탄올(2:1, 1:1, 1:1.5, v/v), 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2, v/v/v)의 혼합용액으로 바꿔주면서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하고, 수득되는 분획을 TLC에 전개시켜 Rf치에 따라 엑기스 CN-Es-6s-A 내지 CN-Es-6s-G 까지의 7가지 엑기스를 얻는 단계;

e) 상기 단계 d)에서 수득한 엑기스 중 Rf치가 0.30인 엑기스 CN-Es-6s-F를 클로로포름/메탄올(50:1, 2:1, 1:1, v/v), 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2, v/v/v)의 혼합용액으로 바꿔주면서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하고, 수득되는 분획을 TLC에 전개시켜 Rf치에 따라 엑기스 CN-Es-6s-F-a 내지 CN-Es-6s-F-d 까지의 4가지 엑기스를 얻는 단계로 구성된다.

이와 같은 녹용의 에탄올 추출물 CN-E의 분획화 및 정제공정은 예를들어 도 2에 간단히 도시하였다.

상기한 바와 같은 일련의 정제과정에서 수득되는 엑기스 CN-Es, CN-Es-6(Rf=0.30), CN-Es-6s, CN-Es-6s-F(Rf=0.30) 및 CN-Es-6s-F-d(Rf=0.30)도 각각 후술하는 실시예에 의해 입증되는 바와 같이 균사체 형성 억제활성을 가지고 있기 때문에 엑기스 CN-E 에 대신하여 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 녹용의 에탄올 추출물 CN-E 중에 함유된 활성성분을 규명하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 최종적으로 수득된 분획 CN-Es-6s-F-d 에 대하여 핵자기 공명 분석, 질량 분석 및 적외선 분석을 수행함과 아울러 유도체 형성반응을 수행하였으며, 그 결과 상기 분획에는 화학식 1로 표시되는 화합물이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.

[화학식 1]

상기식에서

본 발명에 따라 녹용의 에탄올 추출물 및 그의 분획들에 함유되어 있는 것으로 확인된 활성성분인 화학식 1의 화합물로는 구체적으로 다음과 같은 4가지 화합물이 언급될 수 있다.

1) 화합물 CHJ-1 (C₂₆H₅₅N₂O₆P; R=옥타데카노일)

2) 화합물 CHJ-2 (C₂₄H₅₁N₂O₆P; R=헥사데카노일)

3) 화합물 CHJ-3 (C₂₆H₅₃N₂O₆P; R=시스-9-옥타데세노일)

4) 화합물 CHJ-4 (C₂₆H₅₁N₂O₆P; R=시스-9,12-옥타데카디에노일)

상기한 바와 같이 본 발명에 따라 녹용 추출물로부터 활성성분으로서 분리되어 구조가 확인된 화학식 1의 화합물이 녹용에 존재한다는 보고는 이전에 전혀 없었다. 특히, 상기 화학식 1의 화합물은 본 발명 이전에 알려지지 않았던 신규의 화합물이므로, 본 발명에서는 화학식 1로 표시되는 신규화합물 CHJ-1 내지 CHJ-4를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

도 1에 나타낸 TLC 결과에 따르면 상기한 화합물 CHJ-1 내지 CHJ-4 의 4가지 화합물들은 녹용의 에탄올 추출물인 CN-E 에서부터 최종 정제단계에서 수득된 분획 CN-Es-6s-F-d 에 이르기까지 모두 동일한 밴드를 나타내어 물질이 변성없이 유지됨을 알 수 있으며 정제단계가 진행됨에 따라 그 밴드가 더욱 명확해짐을 알 수 있다.

이들 화학식 1의 화합물은 공지되었거나 공지된 방법과 유사한 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 예를들어, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 화합물을 출발물질로 하여 에스테르화 반응(esterification), 아미드결합 반응(amide bond formation), 환원 반응(reduction) 및 포스포콜린화 반응(phosphorylcholine preparation)의 과정을 통해 제조할 수 있다(하기 반응식 1 참조):

반응식 1에서 R 은 앞에서 정의한 바와 같다.

상기 반응식 1의 제조방법은 공지의 반응을 이용하는 것으로서 구체적인 반응조건에 있어서는 당업계에 관용화된 통상적인 기술을 적용할 수 있다.

상기 설명한 바와 같이 녹용 추출물에서 균사체 형성 억제활성, 즉 항진균 활성을 나타내는 성분을 경제적으로 화학적 합성방법에 의해 제조할 수도 있기 때문에 값이 비싸고 입수가 어려운 녹용을 원료로 이용하는 대신에 화학적으로 합성된 이들 4가지 물질중의 어느 하나 또는 이들 중의 두가지 이상의 혼합물을 이용함으로써 녹용 추출물과 동등한 놀랄만한 효과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 상기 화학식 1의 화합물을 하나 또는 그 이상 유효성분으로 함유하는 항진균 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명에 따른 녹용의 에탄올 추출물 또는 그의 분획 또는 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항진균 조성물은 임상적인 목적으로 투여할 경우에 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제로 투여 할 수 있다. 주사용 제제, 예를 들면 멸균주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁매질로서 사용한다. 모노-, 디글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용한다.

경구투여용 고체투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제 등의 형태일 수 있으며, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 고체투여 형태는 본 발명에 따른 고분자 다당류 분획을 수크로즈, 락토즈, 전분 등과 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 마그네슘스테아레이트와 같은 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명에 따르는 조성물의 특정환자에 대한 투여용량 수준은 유효성분으로 사용되는 추출물, 분획 또는 화합물의 종류, 조성물이 투여될 개개 환자의 체중, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 그 밖에 본 발명의 조성물을 사용하고자 하는 환자의 조건에 따라 전문가에 의해 다양하게 변화될 수 있을 것이다. 예를들어, 녹용분획 CN-Es-6s-F-d 을 이용할 경우, 성인 1인당 1일 투여량을 약 600 내지 1500㎎ 범위로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

녹용(매화록) 3kg을 잘게 부숴 비이커에 넣고 녹용이 잠길 정도(대략 12ℓ)로 헥산을 가하고, 2시간동안 80℃에서 가열하여 2회 추출하고 여과하였다(이 여과액을 추출액 1이라고 함). 추출액 1을 감압하에 증류시키고 건조시켜 엑기스 CN-H 27.07g을 수득하였다.

추출액을 분리하고 남은 잔사에 클로로포름을 잠길 정도(대략 12ℓ)로 가하고, 2시간동안 70℃에서 가열하여 2회 추출하고 여과하였다(이 여과액을 추출액 2라고 함). 추출액 2를 감압하에 증류시켜 엑기스 CN-C 23.55g을 수득하였다.

다시 추출액 2를 분리하고 남은 잔사에 70에탄올(대략 12ℓ)를 가하고 2 내지 3일동안 냉침하여 3회 추출하고 여과하였다(이 여과액을 추출액 3이라고 함). 추출액 3을 감압하에 증류시켜 녹용의 에탄올 추출물인 엑기스 CN-E 66.99g을 수득하였다.

상기에서 수득된 엑기스 CN-H, CN-C 및 CN-E 각각에 대하여 후술하는 실시예 5에 기재된 바와 같이 균사체 형성 억제활성을 지표로 하여 효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-E를 이하의 정제과정에 사용하였다.

실시예 2

실시예 1에서 수득한 엑기스 CN-E 66.99g을 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2, v/v/v) 혼합용액에 가하고 원심분리하여 녹는부분 51.02g(엑기스 CN-Es)과 녹지않는 부분 14.37g(엑기스 CN-Ei)을 수득하였다. 이중, 녹는 부분을 절반(25.51g 씩)으로 나누어 각각에 대해 아래의 방법을 실시하였다.

분말 실리카겔 1200g에 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2, v/v/v) 혼합용액 4000㎖를 가하여 팽윤시킨 후, 열린 칼럼[베드 체적(bed volume)=2850㎖]에 충진시켰다. 상기 수득한 엑기스 CN-Es 25.51g을 최소량(엑기스를 녹일 수 있는 최소량)의 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2, v/v/v) 혼합용액에 용 해시킨 후, 실리카겔이 충진된 칼럼에 적용시켰다. 칼럼에 용리액으로서 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2, v/v/v) 혼합용액을 마르지 않게 넣어주면서 1초에 한방울씩, 100㎖씩의 용출분획을 받은 다음(이때, 공체적(void volume)은 950㎖이다), 이것을 TLC(클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수=20:10:2, v/v/v)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 분리하였다. 이렇게 하여 모두 9개의 주요 분획을 분리하고, 감압증류 및 건조시켜 각각 엑기스 CN-Es-1 내지 CN-Es-9로 명명하였다. 이들 9가지의 엑기스에 대하여 후술하는 실시예 5에서와 같이 균사체 형성 억제활성을 검색한 결과 효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-Es-6[Rf=0.30]을 분리하여 이하의 정제과정에 사용하였다.

실시예 3

실시예 2에서 수득한 엑기스 CN-Es-6 3.82g을 클로로포름/메탄올(2:1, v/v) 혼합용액에 가하고 원심분리하여 녹는부분 3.03g(엑기스 CN-Es-6s)과 녹지않는 부분 0.74g(엑기스 CN-Es-6i)을 수득하였다.

분말 실리카겔 276g에 클로로포름/메탄올(2:1, v/v) 혼합용액 1000㎖를 가하여 팽윤시킨 후, 열린 칼럼(베드 체적=600㎖)에 충진시켰다. 상기 수득한 엑기스 CN-Es-6s 3.03g을 최소량(엑기스를 녹일 수 있는 최소량)의 클로로포름/메탄올 (2:1, v/v) 혼합용액에 용해시킨 후, 실리카겔이 충진된 칼럼에 적용시켰다. 칼럼에 용리액을 클로로포름/메탄올(2:1, v/v) 1850㎖, (1:1, v/v) 500㎖, (1:1.5, v/v) 100㎖, 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2, v/v/v) 혼합용액 250㎖ 로 바꿔주면서 3초에 한방울씩 50㎖씩의 용출분획을 받은 다음(이때, 공체적은 200㎖이다), 이것을 TLC(클로로포름/메탄올 =2:1, v/v)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 분리하였다. 이렇게 하여 모두 7개의 주요 분획을 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압증류하여 건조시켜 엑기스 CN-Es-6s-A 내지 CN-Es-6s-G를 수득하였다. 이들 7가지의 엑기스에 대하여 후술하는 실시예 5에서와 같이 균사체 형성 억제활성을 검색한 결과 효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-Es-6s-F[Rf=0.30]를 분리하여 이하의 정제과정에 사용하였다.

실시예 4

분말 실리카겔 50g에 클로로포름/메탄올(50:1, v/v) 혼합용액 200㎖를 가하여 팽윤시킨 후, 열린 칼럼(베드 체적=106㎖)에 충진시켰다. 실시예 3에서 수득한 엑기스 CN-Es-6s-F 334㎎을 최소량(엑기스를 녹일 수 있는 최소량)의 클로로포름/메탄올(50:1, v/v) 혼합용액에 용해시킨 후, 실리카겔이 충진된 칼럼에 적용시켰다. 실시예 3에서와 같이 칼럼에 용리액을 클로로포름/메탄올(50:1, v/v) 200㎖, (2:1, v/v) 200㎖, (1:1, v/v) 40㎖, 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수 (20:10:2, v/v/v) 혼합용액 200㎖로 바꿔주면서 5초에 한방울씩 15㎖씩의 용출분획을 받은 다음(이때, 공체적(void volume)은 35㎖이다), 이것을 TLC(클로로포름/메탄올=50:1, v/v)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 분리하였다. 이렇게 하여 모두 4개의 주요 분획을 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압증류하여 건조시켜 엑기스 CN-Es-6s-F-a 내지 CN-Es-6s-F-d를 수득하였다. 이들 4가지 의 엑기스에 대하여 후술하는 실시예 5에서와 같이 균사체 형성 억제활성을 검색한 결과 효과가 있는 것으로 판단되는 엑기스 CN-Es-6s-F-d[Rf=0.30]를 220㎎ 분리하였다.

실시예 1 내지 4에서 수득된 각각의 활성분획들에 대한 TLC 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 것과 같이 엑기스 CN-Es에서 나타나는 밴드(line b)가 정제되어 가는 과정에서도 동일하게 나타남을 알 수 있다. 따라서 활성을 나타내는 부분이 정제되어 가는 과정에서 변성되거나 없어진 것이 아님을 알 수 있다. 처음에는 다른 부분 때문에 가려졌던 밴드가 정제되어 감에 따라 진하게 발색되었다.

실시예 5

녹용 분획이 균의 생장에 미치는 효능 검색

상기 실시예 1 내지 4 에서 수득된 녹용 추출물 및 그의 정제된 엑기스가 균의 생장에 미치는 효능을 검색하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

5-1. 칸디다 알비칸스가 효모형으로 생장하는데 미치는 영향

칸디다 알비칸스의 효모형 생장배지인 사부로-덱스트로스(Sabouraud-dextrose) 배지(1펩톤, 2덱스트로스)에 균주를 접종한 후, 비교물질로서 암포테리신 B, 케토코나졸, 플루코나졸 및 클로트리마졸, 시험물질로서 정제된 엑기스 CN-Es-6s-F-d 를 각각 120μM의 농도로 첨가하였다. 이때, 대조군에는 아무런 항진균제도 첨가하지 않았다. 균주를 30℃에서 키우면서 2시간 간격으로 660㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 균의 생장을 조사하였다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 녹용 분획은 비병원성 형태인 효모형으로의 생장을 약 25저해함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 녹용분획은 균의 효모형으로의 생장까지 강력하게 억제하는 암포테리신 B 또는 케토코나졸에 비해서는 뒤떨어지지만 현재 시판되고 있는 플루코나졸과는 비슷한 저해도를 나타냄을 확인하였다.

5-2. 칸디다 알비칸스가 균사체형으로 생장하는데 미치는 영향

균사체 형성 배지인 RPMI-1640(GIBCO BRL) 배지에 칸디다 알비칸스 균주를 접종한 후 실시예 1 내지 4에 따른 각 정제단계의 녹용 분획을 첨가하여 생리 조건인 37℃에서 7시간 동안 배양하여 균사체 형성을 유도하였다. 대조군으로는 녹용 분획을 첨가하지 않은 것으로 하였다. 배양 후, 세포 수를 측정하여 전체 세포수 당 균사체 세포의 비율을 조사한 다음 아무것도 첨가하지 않은 대조군의 균사체 형성 정도를 100으로 환산하여 각 녹용분획의 효과를 로 나타내었다. 그 결과는 하기 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같다.

엑기스 CN-Es를 배지에 250㎍/㎖의 농도로 첨가한 결과 전체 세포중 약 50의 균사체 형성비율을 나타냈다. 또한, CN-Es 분획을 실시예 2의 방법에 따라 정제하여 얻은 CN-Es-4 에서부터 9 까지의 6개 분획에 대해 활성도를 조사한 결과 CN-Es-6 분획이 가장 활성도가 높은 것으로 나타났다. 또한, CN-Es-6s 분획으로부터 추출한 7개 분획(A-G)중 가장 활성도가 높은 CN-Es-6s-F 분획으로부터 최종적으로 CN-Es-6s-F-d 분획을 추출하였다. 표 1의 결과로부터 알 수 있듯이, 최종적으로 수득된 CN-Es-6s-F-d 분획은 칸디다 알비칸스 균주의 균사체 형성을 거의 완전히 억제하고 있다.

각 녹용 분획의 균사체 형성 비율

녹용분획	균사체 형성비율()
대조군	100
CN-Es	51.28
CN-Es-6	17.65
CN-Es-6s-F	4.67
CN-Es-6s-F-d	0.43

5-3. 녹용 분획과 기존 항진균제의 병원성 균사체 형성 억제 활성도 비교

상기 5-2에서와 동일한 방법에 따라, 본 발명에 따른 녹용 분획의 균사체 형성 억제활성을 기존의 항진균제인 암포테리신 B, 케토코나졸, 플루코나졸 및 클로트리마졸과 비교하였으며, 또한 녹용 분획중의 활성성분인 화학식 1의 화합물과 유사한 구조를 갖는 스핑고마이엘린(sphingomyelin) 및 포스파티딜 콜린과 비교하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다(단, 표 2의 수치는 항진균제를 첨가하지 않은 대조군의 균사체 형성도를 100으로 하고 이에 대한 비율로 환산한 것이다). 표 2의 결과로 부터 알 수 있듯이, 기존의 항진균제는 60μM 이상의 농도에서 균사체 형성을 거의 100억제하였고, 녹용 분획의 유사물질인 포스포리피드 계열의 스핑고마이엘린과 포스파티딜 콜린은 녹용 분획과는 달리 균사체로의 전환 및 형성에 아무런 저해활성을 나타내지 않았다. 한편, 본 발명에 따라 정제된 녹용 분획 CN-Es-6s-F-d의 경우에는 400μM의 농도에서 거의 100저해도를 나타내었다. 즉, 녹용분획은 균사체 형성을 100억제하기 위해서는 기존의 항진균제에 비해 높은 농도를 요구하였으나, 대신에 기존 항진균제의 문제점인 여러가지 부작용이 없으므로 항진균제로서 보다 바람직하게 사용될 수 있을 것이라 생각된다.

농도변화에 따른 각 약물의 균사체 형성 억제비율()

농도(μM) 항진균제	0	30	60	90	120	150	400
암포테리신 B	100	0	0	0	0	-	-
클로트리마졸	100	4.7	0	0	0	-	-
플루코나졸	100	2.3	0	0	0	-	-
케토코나졸	100	0.65	2.75	3.75	0.42	-	-
CN-Es-6s-F-d	100	32.92	10.67	7.41	5.41	1.33	0.43
스핑고마이엘린	100	100	100	100	100	100	100
포스파티딜 콜린	100	100	100	100	100	100	100

실시예 6

녹용분획중 균사체 형성 억제물질의 구조 분석

녹용으로부터 최종적으로 분리, 정제된 엑기스 CN-Es-6s-F-d 중에서 실제 활성을 나타내는 물질의 구조를 분석하기 위하여 핵자기 공명 스펙트럼, 질량 분석 및 적외선 스펙트럼을 이용하였다. 또한, 아세틸화 반응 및 메틸화 반응을 통하여 CN-Es-6s-F-d의 유도체를 형성하므로서 녹용분획이 다음과 같은 4가지 화합물로 구성되어 있음을 확인하였다.

1) 화합물 CHJ-1 (C₂₆H₅₅N₂O₆P; R=옥타데카노일)

2) 화합물 CHJ-2 (C₂₄H₅₁N₂O₆P; R=헥사데카노일)

3) 화합물 CHJ-3 (C₂₆H₅₃N₂O₆P; R=시스-9-옥타데세노일)

새로이 발견된 상기 4가지 화합물은 현재까지 문헌에 보고된 바 없는 포스포리피드계의 신기능성 신물질이다.

6-1. 핵자기 공명 스펙트럼

브룩커(Bruker) DPX 250 FT NMR을 사용하여 ¹H, ¹³C 스펙트럼을 비롯한 2차원적인 ¹H-¹H, ¹³C-¹³C COSY 스펙트럼으로 CN-Es-6s-F-d 분획을 조사하였다. 이때, 용매로는 CDCl₃을 사용하였고, CDCl₃에 포함된 CHCl₃를 내부 표준 물질로 삼았다. 활성성분과 유사한 구조를 갖는 것으로 추정되는 스핑고마이엘린, 세라마이드, 1-올레일-2-팔미토일-3-포스파티딜콜린의 각 스펙트럼과 비교함으로써 분석하였다. ¹H, ¹³C 스펙트럼 데이타를 하기 표 3 및 4에 나타내었는데, 여기서 H-4, H-5, H-6 피크는 포스포콜린(phosphocoline)에 해당하며 이 피크들은 1-올레일-2-팔미토일-3-포스파티딜콜린에서도 동일하게 보여진다. ¹H 스펙트럼에서 H-2 피크는 스핑고마이엘린, 세라마이드와 유사하며, 따라서 본 발명에 따른 활성성분이 아미드 구조를 지니고 있음을 확인할 수 있다. 한편, 지방산에서 특징적으로 보여지는 -CH₂- 피크를 볼 수 있으며, H-9, H-10 피크로 인해 포화지방산인 스테아르산(stearic acid), 팔미트산(palmitic acid) 이외에도 불포화지방산인 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid)이 구조의 일부분을 이루고 있음을 알 수 있다. 리놀레산의 특징적인 피크는 2.74ppm에서 나타난다. ¹H-¹H, ¹³C-¹³C COSY 스펙트럼은 도 4 및 5에 나타내었다.

¹H NMR (250MHz) 스펙트럼 분석

H#	δ
1	3.81-3.87, 3.76-3.81	m, 2H
2	3.88-3.96	m, 1H
3	4.01-4.05	m, 2H
4	3.69-3.75	m, 2H
5	4.25-4.33	m, 2H
6	3.29	s, 9H
-CH₂-	1.22-1.26	m, 20H
7	2.24-2.30	t, 2H
8	1.50-1.58	m, 2H
9	1.97-2.03	m, 2H
10	5.29-5.33	m, 2H
11	0.82-0.87	m, 3H
NH, OH	5.02-5.27	m, 2H

¹³C NMR (250MHz) 스펙트럼 분석

C#	δ
1	67.07
2	68.66
3	65.23
4	66.19
5	59.42
6	54.26
7	34.14
8	24.92
9	27.20
10	129.97, 129.66
11	14.09
CO	173.85
-CH₂-	31.90, 29.72, 29.31, 22.66

6-2. 질량 분석 스펙트럼

질량분석시 이온화 방법은 FAB(fast atom bombardment)으로 매트릭스는 NBA(Na)를 사용하였다. 도 6는 FAB-MS 스펙트럼으로서 [M+H+Na]⁺에 해당하는 각 피크들을 볼 수 있다. 또한, 녹용 추출물 중에 존재하는 활성 화합물 CHJ-1, 2, 3 및 4 에 대한 질량 분석결과를 요약하여 하기 표 5에 나타내었다.

화합물	화학식 (M)	[M+H+Na]⁺	[M+H+Na-59(NMe₃)]⁺
CHJ-1	C₂₆H₅₅N₂O₆P (522.38)	546.07	487.03
CHJ-2	C₂₄H₅₁N₂O₆P (494.35)	518.04	458.90
CHJ-3	C₂₆H₅₃N₂O₆P (520.36)	544.06	484.99
CHJ-4	C₂₆H₅₁N₂O₆P (518.35)	542.05

도 7은 화합물 CHJ-1에 해당하는 m/z 546.07에 대한 탠덤 질량 스펙트럼 (tandem mass spectrum; FAB-MS/MS)으로, m/z 487.6은 [M+H+Na-NMe₃]⁺, m/z 334.3은 [M+Na-C₁₅H₃₁]⁺, m/z 278.2는 [M+H+Na-C₁₇H₃₅CO]⁺, m/z 275.2는 [M+Na-C₁₅H₃₁-NMe₃]⁺ 에 의한 피크들이다. 또한, 지방산의 아실기에서 특징적으로 보여지는 형태인 m/z 334.3, 348.4, 362.4, 376.4, 390.4, 404.4, 418.4, 432.5, 446.5, 460.5, 474.5, 487.6, 502.6, 516.6, 530.6에 의해 스테아르산이 구조의 일부분을 이루고 있음을 확인할 수 있다. 아울러, 포스포콜린 단위체에 해당하는 m/z 206.1도 보인다.

6-3. 적외선 스펙트럼

적외선 스펙트럼은 Bio-Rad FTS 165를 사용하여 ( ) 화합물을 니트(neat) 형태로 KBr 셀에 입혀서 측정하였고, 측정 결과를 도 8에 나타내었다. 스펙트럼에서 주파수 3363cm^-1근처의 넓은 범위에 걸쳐 나타나는 밴드는 화합물의 분자구조중의 히드록시기, 1728cm^-1위치의 밴드는 아미드의 카르보닐기, 3020-2853cm^-1 위치의 밴드는 포화, 불포화 탄소 결합의 존재를 확인시켜준다.

6-4. 유도체 합성에 의한 구조분석

엑기스 CN-Es-6s-F-d를 메틸요오드를 사용하여 메틸화 반응시킨 후, 형성된 화합물을 핵자기 공명 스펙트럼으로 조사하였다. 그 결과, 메틸기에 해당하는 특징적인 피크(¹H NMR: 3.39ppm, ¹³C NMR: 58.50ppm)를 확인할 수 있었다. 마찬가지로 아세트산무수물을 사용하여 아세틸화 반응시킨 경우에는, 아세틸기에 해당하는 특징적인 피크(¹H NMR: 2.03ppm, ¹³C NMR: 21.52ppm)를 볼 수 있었다. 또한, 엑기스 CN-Es-6s-F-d는 히드록시기를 확인하는데 이용되는 과망간산 발색 시약에도 반응하였으므로, 히드록시기의 함유를 확인하였다.

상기 실시예의 실험결과로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 녹용의 에탄올 추출물, 그로부터 단계적으로 분리, 정제된 분획 및 화학식 1의 화합물은 칸디다 알비칸스와 같은 병원성 곰팡이의 균사체로의 형성을 억제하는 활성을 보유 할 뿐아니라 생약성분으로부터 추출된 물질이어서 기존의 항진균제에 비해 부작용이 현저히 감소된 것이므로 항진균제로서 매우 효과적으로 사용될 수 있으리라 기대된다.

Claims

녹용을 헥산으로 추출하고, 결과 얻어진 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출하며, 결과 얻어진 추출잔사를 다시 에탄올로 추출하여 수득된 녹용의 에탄올 추출물(엑기스 CN-E)을 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2,v/v/v) 혼합용액에 용해시켜 가용성 분획 CN-Es를 분리하고, 유효성분으로서 CN-Es를 상기 혼합 용액을 용리액으로 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 TLC로 전개하여 Rf치가 0.30인 분획 CN-Es-6을 함유하는 항진균 조성물.
제1항에 있어서, 유효성분으로서 엑기스 CN-Es-6을 클로로포름/메탄올(2:1, v/v) 혼합용액에 용해시켜 분리한 가용성 분획 CN-Es-6s를 함유하는 조성물.
제2항에 있어서, 유효성분으로서 엑기스 CN-Es-6s를 클로로포름/메탄올(2:1,1:1,1;1.5,v/v), 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2,v/v/v)의 혼합용액으로 바꿔주면서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 TLC로 전개하여 Rf치가 0.30인 분획 CN-Es-6s-F를 함유하는 항진균 조성물.
제3항에 있어서, 유효성분으로서 엑기스 CN-Es-6s-F를 클로로포름/메탄올(50:1, 2:1, 1:1, v/v), 클로로포름/메탄올/2.5M 암모니아수(20:10:2,v/v/v)의 혼합용액으로 바꿔주면서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 TLC로 전개하여 Rf치가 0.30인 분획 CN-Es-6s-F-d를 함유하는 항진균 조성물.
녹용을 헥산으로 추출하고, 추출잔사를 클로로포름으로 추출하고, 추출잔사를 다시 에탄올 추출하여 녹용의 에탄올 추출물을 수득하는 방법에 있어서, 수득된 녹용의 에탄올 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 더욱 분리, 정제함을 특징으로 하는, 제1항 내지 제4항중의 어느 한 항에 기술된 녹용의 에탄올 추출물로부터 분리, 정제된 분획을 제조하는 방법.