KR100539451B1 - Oily paclitaxel composition for chemoembolization - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화학색전에 사용할 수 있도록 유성 조영제를 이용하여 파클리탁셀 (paclitaxel)을 가용화시킨 화학색전용 파클리탁셀 유성 조성물, 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 장기 보관할 수 있도록 파클리탁셀의 침전을 저해하는 물질을 추가적으로 함유하는 파클리탁셀 가용화용 유성 조성물, 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 파클리탁셀을 가용화시킨 것으로 화학색전시 혈관조영이 가능하므로 화학색전술을 시행할 때 항암제를 표적세포에 전달할 수 있는 장점이 있다. The present invention relates to a paclitaxel oil-based composition for chemical coloration, solubilizing paclitaxel using an oily contrast agent for use in chemical embolization, and a method for preparing the same. The present invention also relates to an oil-based composition for paclitaxel solubilization, and a method for preparing the same, further comprising a substance that inhibits paclitaxel precipitation for long-term storage. Since the composition of the present invention is solubilized paclitaxel, angiography can be performed during chemical embolization, the anticancer agent may be delivered to target cells when the chemical embolization is performed.
파클리탁셀, 유성조영제, 색전술Paclitaxel, oily contrast agent, embolization
Description
도1은 본 발명의 파클리탁셀/리피오돌 제형 0.3 CC를 간동맥색전술로 토끼의 간암조직에 선택적으로 투여하고 1주일 경과후의 CT 사진이다. 투여된 파클리탁셀의 양은 A)1 mg, B) 3 mg 및 C) 0 mg에 해당한다.1 is a CT photograph of one week after the paclitaxel / lipiodol formulation 0.3 CC of the present invention is selectively administered to liver cancer tissues of rabbits by hepatic artery embolization. The amount of paclitaxel administered corresponds to A) 1 mg,
도2는 본 발명의 파클리탁셀/리피오돌 제형 0.3 CC를 간동맥색전술로 토끼의 간암조직에 선택적으로 투여하고 1주일 경과 후 간암조직 및 주변의 정상조직에서의 파클리탁셀 농도를 HPLC로 정량하여 보여준다. 투여된 파클리탁셀의 양은 A)1 mg 및 B) 3 mg에 해당한다.Figure 2 is selectively administered paclitaxel / Lipiodol formulation of the present invention to liver cancer tissues of rabbits by hepatic artery embolization, and after one week, paclitaxel concentrations in liver cancer tissues and normal tissues are quantified and shown by HPLC. The amount of paclitaxel administered corresponds to A) 1 mg and B) 3 mg.
도3는 본 발명의 파클리탁셀/리피오돌 제형 0.3 CC (1 mg 군 및 3 mg 군) E는 0.4 CC (4 mg 군)를 간동맥색전술로 토끼의 간암조직에 선택적으로 투여하고 1주일 경과 후 전체간암조직중 살아있는 세포의 비율을 보여준다. 대조군의 경우 리피오돌만 0.3 cc 투여하였다.Figure 3 is a paclitaxel / Lipiodol formulation of the present invention 0.3 CC (1 mg group and 3 mg group) E is 0.4 CC (4 mg group) is selectively administered to liver liver tissue of rabbits by
도4는 본발명의 파클리탁셀/리피오돌 제형 0.4 CC (파클리탁셀 4 mg)를 간동맥색전술로 토끼의 간암조직에 선택적으로 투여하고 1주일 동안 간암조직, 좌엽, 우엽에서의 파클리탁셀농도를 보여준다. Figure 4 is selectively administered paclitaxel / Lipiodol formulation 0.4 CC (
- ● - ; 간암조직에서의 파클리탁셀의 농도,-●-; Paclitaxel concentration in liver cancer tissue,
- ○ - ; 좌엽에서의 파클리탁셀의 농도,-○-; Concentration of paclitaxel in the left lobe,
- ▲ - ; 우엽에서의 파클리탁셀의 농도.-▲-; Paclitaxel concentration in the right lobe.
도5는 본 발명의 파클리탁셀/리피오돌 제형과 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 제형을 실온에서 90일 보관한 후의 사진 또는 편광현미경 하의 사진이다.5 is a photograph after storage of the paclitaxel / lipiodol formulation and the paclitaxel / lipiodol / tricapryline formulation of the present invention at room temperature for 90 days or under a polarizing microscope.
A; 파클리탁셀/리피오돌 제형의 사진A; Picture of Paclitaxel / Lipiodol Formulation
B; 파클리탁셀/리피오돌 제형의 편광현미경 하의 사진B; Photos under polarized light microscope of paclitaxel / lipiodol formulation
C; 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 제형의 사진C; Photos of paclitaxel / lipiodol / tricapryline formulation
D; 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 제형의 편광현미경 하의 사진D; Photograph under polarized light microscope of paclitaxel / lipiodol / tricapryline formulation
도6은 멜라노마 세포를 접종하고 5일 경과 후 쥐의 발바닥에 본 발명의 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 제형 20 ㎕ (파클리탁셀 200 ㎍ )를 주입한 후 발바닥의 두께를 특정한 그래프이다. 대조군으로는 리피오돌/트리카프릴린 20 ㎕ 를 주입한 군과 아무 처리도 하지 않은 군을 사용하였다.Figure 6 is a specific graph of the thickness of the sole after inoculating
- ● - ; 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 제형 20 ㎕ (파클리탁셀 200 ㎍ )를 주입한 군,-●-; 20 μl of paclitaxel / lipiodol / tricapryline formulation (200 μg of paclitaxel),
- ○ - ; 리피오돌/트리카프릴린 제형 20 ㎕ 를 주입한 군,-○-; 20 μl of Lipiodol / Tricapryline formulations were injected,
- ▲ - ; 아무 처리도 하지 않은 군.-▲-; You haven't done anything.
도7은 멜라노마 세포를 접종하고 5일 경과 후 쥐의 발바닥에 본 발명의 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 제형 20 ㎕ (파클리탁셀 200 ㎍ )를 주입한 후 시간 경과에 따라 살아있는 쥐의 개체수를 도시한 그래프이다. 대조군으로는 아무 처 리도 하지 않은 군을 사용하였다.FIG. 7 shows the population of live mice over time after inoculating melanoma cells and injecting 20 μl of paclitaxel / lipiodol / tricapryline formulation of the present invention (200 μg of paclitaxel) into the paws of mice. One graph. As a control group, no treatment was used.
- ● - ; 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 제형 20 ㎕ (파클리탁셀 200 ㎍ )를 주입한 군,-●-; 20 μl of paclitaxel / lipiodol / tricapryline formulation (200 μg of paclitaxel),
- ○ - ; 아무 처리도 하지 않은 군.-○-; You haven't done anything.
본 발명은 파클리탁셀을 가용화하여 동맥색전술에 이용하기 위한 파클리탁셀의 가용화용 유성 조성물, 그의 제형 및 그들의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to an oil-based composition for solubilizing paclitaxel, solubilizing paclitaxel and using it for arterial embolization, a formulation thereof, and a method for preparing the same.
동맥색전술은 조영제를 이용하여 암부위로 가는 동맥을 찾아내서 항암제와 색전물질을 이용하여 암조직에 영양공급을 차단하여 암을 치료하는 시술법이다. Arterial embolization is a method of treating cancer by finding an artery that goes to the cancer site using a contrast agent and blocking nutrient supply to cancer tissues using anticancer agents and embolic materials.
대표적인 동맥색전술로서 간동맥색전술을 들 수 있는데 이 방법은 유성조영제 (oily contrast medium)에 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴, 카르보플라틴과 같은 여러 가지 항암제를 분산시켜 색전, 조영과 동시에 항암제를 투여하는 것이다. Representative arterial embolization is hepatic artery embolization. This method involves dispersing various anticancer drugs such as doxorubicin (Adriamycin), cisplatin, and carboplatin in an oily contrast medium, and simultaneously administering embolization and contrast. .
이와 같은 동맥색전술에 사용되는 대표적인 조영제는 리피오돌 (lipiodol)과 같은 요오드화 오일 (iodized oil)이다. 그러나, 리피오돌에 상기한 여러 가지 항암제를 분산시킨 분산계는 물리적으로 불안정하기 때문에 시술시 많은 한계점을 가지고 있다. Representative contrast agents used in such arterial embolizations are iodized oils such as lipiodol. However, the dispersion system in which the various anticancer agents are dispersed in Lipiodol has many limitations during the procedure because of physical instability.
또한, 종래의 진단방사선과에서 시술하고 있는 간암 치료방법에 널리 사용되는 항암제로는 아드리아마이신, 에피루비신 등을 들 수 있는데, 이들 아드리아마이신을 비롯한 대부분의 항암제는 수용성이므로 리피오돌에는 직접 용해시킬 수가 없어 현탁액 (suspension)의 형태로 시술하는 방법이 이용되었다. (Yoshihiro Katagiri 외, Cancer Chemother. Pharmacol 1989, 23, 238-242). 그러나, 이러한 방법으로 만들어진 현탁액의 경우 아드리아마이신 입자가 뭉치거나 침전이 형성되기 때문에 장기 보관이 어려운 문제점이 있다. 따라서, 수성조영제에 항암제를 녹인 후, 유성조영제인 리피오돌에 분산시키는 방법을 이용하게 되었다. 즉, 환자에게 투여하기 직전에 항암제를 수성조영제에 녹이고 이를 유성조영제와 펌프법에 의해 혼합시킨다. 이 때, 에멀전의 안정성을 극대화하기 위하여 리피오돌의 비중 (1.275 내지 1.290)과 비슷한 정도의 비중을 가지는 수성조영제인 유로그래핀 (Urografin, 1.328 - 1.332) 또는 이오파미로 (Iopamiro)를 이용한다 (Takashi Kanematsu 외, Journal of surgical oncology 1984, 25, 218-226, Takafumi Ichida 외, Cancer Chemother. Pharmacol 1994, 33, 74-78). In addition, the anticancer agents widely used in the liver cancer treatment method which is conventionally treated in the diagnostic radiology department include adriamycin, epirubicin, and the like. Most of the anticancer drugs including adriamycin cannot be directly dissolved in Lipiodol. The procedure was used in the form of a suspension. (Yoshihiro Katagiri et al., Cancer Chemother. Pharmacol 1989, 23, 238-242). However, the suspension made by this method has a problem that long-term storage is difficult because adriamycin particles are aggregated or precipitates are formed. Therefore, a method of dissolving an anticancer agent in an aqueous contrast agent and dispersing it in Lipiodol, an oily contrast agent, has been used. That is, just before administration to the patient, the anticancer agent is dissolved in the aqueous contrast agent and mixed with the oily contrast agent by the pumping method. At this time, in order to maximize the stability of the emulsion, an aqueous contrast agent Eurographine (Urografin, 1.328-1.332) or Iopamiro, which has a specific gravity similar to that of Lipiodol (1.275 to 1.290), is used (Takashi Kanematsu Et al., Journal of surgical oncology 1984, 25, 218-226, Takafumi Ichida et al., Cancer Chemother.Pharmacol 1994, 33, 74-78).
그러나 이 방법에 의해서는 일시적인 에멀전이 형성될 뿐이어서 혼합상태가 불안정하여 수분 내에 다시 분리가 일어나 아드리아마이신 침전이 생기므로 체내에 잘 흡수되지 않게 된다. 실제로, 시술 시 환자의 혈관으로 주입되는 중에도 상분리가 일어나는 것을 관찰할 수 있다. 또한, 이 혼합액을 투여하였을 때, 아드리아마이신이 일시에 흡수되어 버리므로 지속적으로 항종양 효과를 기대할 수 없으며 여러 가지 부작용이 나타나게 된다. However, by this method, only a temporary emulsion is formed, and the mixed state is unstable, so that the separation occurs again in a few minutes, and thus adriamycin precipitates, so that it is hardly absorbed by the body. Indeed, it can be observed that phase separation occurs during injection into the patient's blood vessels during the procedure. In addition, when the mixed solution is administered, adriamycin is absorbed at once, so antitumor effects cannot be expected continuously, and various side effects appear.
현재까지 간암 시술에 가장 이상적이라 알려진 방법은 폴리(스티렌-코-말레산)-공액화된 네오카르지노스타틴 [poly(styrene-co-maleic acid)-conjugated neocarzinostatin (SMANCS)], 라는 합성 고분자 물질을 항암제로 이용하는 것인데 SMANCS는 친수성과 친유성의 성질을 함께 가지고 있어 리피오돌에 직접 용해시켜 시술하는 것이 가능하다 (Konno, T. and Maeda, H., Targetting chemotherapy of hepatocellular carcinoma. Neoplasms of the liver, Eds. Okuda, K., and Ishak, K. G., Springger-Verlag, Berlin, P343-352). 비록 SMANCS/리피오돌 제형은 아드리아마이신/리피오돌 제형이 갖는 문제점을 해결하였지만, 아드리아마이신/리피오돌 제형보다 10 배나 고가이며, 독성 또한 심하기 때문에 보편화되지 못하고 있는 실정이다. To date, the best known method for liver cancer treatment is a synthetic polymer called poly (styrene-co-maleic acid) -conjugated neocarzinostatin (SMANCS)], a poly (styrene-co-maleic acid) -conjugated neocarzinostatin. SMANCS has both hydrophilic and lipophilic properties and can be directly dissolved in Lipiodol (Konno, T. and Maeda, H., Targetting chemotherapy of hepatocellular carcinoma.Neoplasms of the liver, Eds) Okuda, K., and Ishak, KG, Springger-Verlag, Berlin, P343-352). Although the SMANCS / lipiodol formulation solves the problems of the adriamycin / lipiodol formulation, it is 10 times more expensive than the adriamycin / lipiodol formulation, and the toxicity is also severe.
한편, 항암제 파클리탁셀은 난소암, 유방암, 식도암, 흑색종, 백혈병 등 각종 암에 대해 현저한 세포독성을 나타내는 것으로 알려져 있으며 이제까지는 주로 브리스톨-마이어스 스퀴브사가 시판하는 Taxol 상표의 주사제로 이용되고 있다.Meanwhile, paclitaxel, an anticancer agent, is known to exhibit significant cytotoxicity against various cancers such as ovarian cancer, breast cancer, esophageal cancer, melanoma, and leukemia. Taxol, which is mainly marketed by Bristol-Myers Squibb It is used as a brand injection.
대표적인 난용성 약물인 파클리탁셀은 그의 낮은 용해도 때문에 개발 단계에서부터 가용화 기술의 개발이 동시에 진행되었다. 이러한 가용화 기술의 일례로 파클리탁셀을 정맥주사 등 전신투여 경로에 이용하기 위해 용해보조제를 사용하는 것을 들 수 있다. 상기한 Taxol 주사제 역시 크레모포어 EL (Cremophor EL: 폴리옥시에틸렌 35 캐스터오일)이라는 용해보조제를 사용하고 있다. 즉, 이 제형은 에멀전의 예비 농축제 (pre-concentrate) 형태로서 물에 분산시키면 자발적으로 마이크로에멀전 (microemulsion)이 형성된다 (미국특허 제 5438072호 참조). 그러나, 이와 같은 용해보조제의 사용은 또 다른 독성을 야기하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 여러 가지 암에 대한 항암효과가 우수한 파클리탁셀의 새로운 제형개발 필요성이 대두되고 있는 실정이다.Paclitaxel, a representative poorly soluble drug, has undergone simultaneous development of solubilization technology due to its low solubility. An example of such a solubilization technique is the use of a dissolution aid to use paclitaxel for systemic administration routes such as intravenous injection. Taxol mentioned above Injectables also use a dissolution aid called Cremophor EL (polyoxyethylene 35 castor oil). In other words, this formulation is spontaneously formed in microemulsion when dispersed in water as a pre-concentrate form of emulsion (see US Pat. No. 5438072). However, the use of such dissolution aids is known to cause further toxicity. Therefore, there is a need to develop a new formulation of paclitaxel excellent anti-cancer effect against various cancers.
본 발명자들은 이러한 요구에 부응하기 위해 파클리탁셀의 새로운 제형으로서, 동맥색전술에 이용가능한 파클리탁셀 제형을 연구하던 중, 예기치 않게도 파클 리탁셀이 유성조영제 (oily constrast medium)에 잘 용해되어 실온에서 단일상의 점도범위 40 ~180 cP (centipoises)의 고점성 기름 (oil)이 됨을 발견하였다. To meet this need, the inventors of the present invention have studied paclitaxel formulations that are available for arterial embolization as a new formulation of paclitaxel. Unexpectedly, paclitaxel dissolves well in oily constrast medium and the viscosity of the single phase at room temperature. It was found to be a highly viscous oil in the range 40-180 cP (centipoises).
또한 파클리탁셀/유성조영제 조성물은 화학적, 물리적으로 안정하여 조성의 변화가 없이 장기간 보존될 수 있음을 발견하였다. 이렇게 제조된 파클리탁셀/유성조영제 조성물은 독소루비신 등과 같은 수용성 항암제를 이용하는 종래의 리피오돌 제제에 비하여 월등히 향상된 물성을 보이며, SMANCS/리피오돌 제형과 유사한 제형적 특성을 보인다고 할 수 있다. 종래의 SMANCS/리피오돌 제형이 고가이며, 심한 독성 때문에 보편화되지 못하고 있는 것에 반하여, 본 발명의 파클리탁셀/유성조영제 조성물은 원료가 되는 두가지 물질의 원가가 저렴하여 생산경비가 저렴할 뿐만 아니라, 제조공정이 매우 간단하고, 얻어진 제형 역시 안정성과 저장성이 뛰어나다. It has also been found that the paclitaxel / oil preparation composition is chemically and physically stable and can be preserved for a long time without a change in composition. Thus prepared paclitaxel / oily contrast agent composition exhibits significantly improved physical properties compared to the conventional Lipiodol formulations using water-soluble anticancer agents such as doxorubicin, and can be said to have similar formulation properties as the SMANCS / Lipiodol formulation. While conventional SMANCS / lipiodol formulations are expensive and are not universalized due to their severe toxicity, the paclitaxel / oily contrast agent composition of the present invention has a low production cost due to the low cost of the two materials as raw materials and a very high manufacturing process. Simple and obtained formulations also have excellent stability and shelf life.
즉, 본 발명의 조성물은 수 시간에 이르는 동맥색전 시술기간 내내 안정하게 최초의 조성을 유지할 수 있으므로, 기존의 리피오돌/이오파미로/아드리아마이신 제제가 혼합직후 상분리를 일으키는 것과 비교할 때, 동맥색전술에 적용시 항암제를 안정적으로, 장기간 체내로 전달할 수 있는 효과는 물론, 제제 자체가 안정하여 저장 수명성 또한 우수하다. 뿐만 아니라, 후술하는 바와 같이, 동물모델을 이용하여 간동맥색전술을 시행한 결과 색전효과가 뛰어나고 항암작용을 하는 것으로 나타나므로 동맥색전술에 널리 이용될 수 있을 것으로 예상된다. That is, the composition of the present invention can maintain the original composition stably over several hours of arterial embolization, so that the application of arterial embolization when compared with the conventional Lipiodol / Iopamiro / Adriamycin preparations cause phase separation immediately after mixing When the anticancer agent is stably delivered to the body for a long time, as well as the shelf life of the formulation itself is excellent. In addition, as described below, as a result of performing hepatic artery embolization using an animal model, it is expected to be widely used for arterial embolization because it shows excellent embolism effect and anticancer action.
동맥색전술은 간동맥색전술이 대표적이기는 하지만, 간동맥색전술 외에도, 다양한 종류의 고형암에 적용될 수 있다. 예를 들어 SMNACS/리피오돌 제형은 직장 동맥 (renal artery)을 통해 직장 세포 암종을 치료하는 방법 등 암세포로만 표적화하는 암치료를 수행하는데 이용될 수 있다 (K. Tsuchiya, Tumor-targeted chemotherapy with SMANCS in lipiodol for renal cell carcinoma: longer survival with larger size tumors. Urology. 2000 Apr;55(4):495-500). Although arterial embolization is typical of hepatic artery embolization, it can be applied to various types of solid cancers in addition to hepatic artery embolization. For example, SMNACS / lipiodol formulations can be used to perform cancer therapy that targets only cancer cells, such as the treatment of rectal cell carcinoma through the renal artery (K. Tsuchiya, Tumor-targeted chemotherapy with SMANCS in lipiodol). for renal cell carcinoma: longer survival with larger size tumors.Urology. 2000 Apr; 55 (4): 495-500).
현재까지 파클리탁셀을 혈관 색전이나 조영시 함께 사용되는 항암제로 사용한 예는 없다. 이에 따라 본 발명에서는 파클리탁셀을 유성조영제에 용해시켜 동맥색전술에 이용하고자 한다. To date, there has been no use of paclitaxel as an anticancer agent used in vascular embolization or contrast. Accordingly, the present invention intends to dissolve paclitaxel in an oily contrast agent and use it for arterial embolization.
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 파클리탁셀이 가용화된, 유성조영제를 포함하는 신규한 파클리탁셀 유성 조성물을 제공하는데 있다.Accordingly, one object of the present invention is to provide a novel paclitaxel oily composition comprising an oily contrast agent, in which paclitaxel is solubilized.
본 발명의 또 다른 목적은 고형암 치료를 위한 동맥색전술에 사용되기 위한 유성 파클리탁셀의 제제를 제공하는 데 있다. 즉, 수 시간에 이르는 동맥색전술 시술기간을 통해 최초의 조성을 유지할 수 있는 안정한 유성 파클리탁셀 제제를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a preparation of oily paclitaxel for use in arterial embolization for the treatment of solid cancer. In other words, to provide a stable oil-based paclitaxel formulation that can maintain the original composition through the arterial embolization procedure for several hours.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 파클리탁셀 유성 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention to provide a method for producing the paclitaxel oil composition described above.
본 발명은 화학색전에 사용할 수 있도록 유성조영제를 이용하여 파클리탁셀 (paclitaxel)을 가용화시킨 화학색전용 파클리탁셀 유성 조성물, 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 장기 보관할 수 있도록 파클리탁셀의 침전을 저 해하는 물질을 추가적으로 함유하는 화학색전용 파클리탁셀 유성 조성물, 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 파클리탁셀을 가용화시킨 것으로 화학색전시 혈관조영이 가능하므로 화학색전술을 시행할 때 항암제를 표적세포에 전달할 수 있는 장점이 있다.BACKGROUND OF THE
본 발명의 파클리탁셀 유성조성물에 사용가능한 유성조영제의 예로는 요오드화 오일을 들 수 있다. 요오드화 오일로는 대표적으로 리피오돌 (Lipiodol Laboratoire Guerbet, France), 에티오돌 (ethiodol: Savage Laboratories, Melville, NY)와 같은 요오드화 양귀비씨 기름 (iodized poppy seed oil) 또는 요오드화 대두유 (iodized soybean oil)를 들 수 있다. 요오드화 대두유에 대한 상세한 설명은 Ma Tai. The effect of oral iodized oil on prevention and treatment of endemic goiter. Chienese Med. J. 61 (9):533, 1981을 참고할 수 있다.An example of an oily contrast agent usable in the paclitaxel oil composition of the present invention is iodide oil. Typical iodide oils include iodide poppy seed oil or iodide soybean oil, such as Lipiodol Laboratoire Guerbet, France, ethiodol (Savage Laboratories, Melville, NY). Can be. For more information on iodide soybean oil, see Ma Tai. The effect of oral iodized oil on prevention and treatment of endemic goiter. Chienese Med. J. 61 (9): 533, 1981.
본 발명에서 유성조영제로서 사용가능한 요오드화 오일의 요오드 함량은 30 ~ 50 중량%인 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 요오드 함량이 35 ~ 45 중량%인 것이 좋다. 가장 바람직하게는, 유성조영제로서 리피오돌을 사용하는 것이 좋다.In the present invention, the iodine content of the iodide oil which can be used as an oily contrast agent is preferably 30 to 50% by weight. More preferably, the iodine content is 35 to 45% by weight. Most preferably, Lipiodol is preferably used as an oily contrast agent.
본 발명의 화학색전용 파클리탁셀 유성 조성물은 유성조영제와 유성조영제 1 ml에 대하여 파클리탁셀을 0.0001 mg 내지 10 mg의 양으로 포함한다. 이 때, 유성조영제 1 mg에 대한 파클리탁셀의 양이 10 mg을 초과하면 유성조영제에 더 이상 녹지 않고 침전이 생기게 되고, 파클리탁셀의 양이 0.0001 mg 이하이면 소망하는 항암효과를 거둘 수 없기 때문에 바람직하지 못하다.The paclitaxel oil-based composition for chemical coloration of the present invention contains paclitaxel in an amount of 0.0001 mg to 10 mg per 1 ml of an oily contrast agent and an oily contrast agent. At this time, if the amount of paclitaxel to 1 mg of the oily contrast agent is more than 10 mg, it is not dissolved in the oily contrast agent any more, and precipitation occurs, and if the amount of paclitaxel is 0.0001 mg or less, it is not preferable because the desired anticancer effect cannot be achieved. .
또한, 본 발명의 파클리탁셀 유성 조성물에는 임의로 스쿠알렌과 같은 동물 성 기름 또는 대두유와 같은 식물성 기름을 부가적으로 첨가할 수도 있다. 즉, 유성조영제의 일부를 이러한 동물성 기름이나 식물성 기름, 또는 이들의 혼합물로 대체함으로써, 소망되는 약효나 안정성을 저하시키지 아니하고 생체적합성을 유지시키면서, 제조경비를 절감할 수 있는 효과를 거둘 수 있다. 이러한 동물성 기름이나 식물성 기름의 사용량은 부피비로 유성조영제 : 동물성 기름 및/또는 식물성 기름 = 1:0.01 ~ 1의 비율로 한다. 바람직하게는 상기 비율이 1:0.01~0.5인 것이 좋다. In addition, the paclitaxel oil-based composition of the present invention may optionally additionally be added an animal oil such as squalene or a vegetable oil such as soybean oil. That is, by replacing a part of the oily contrast agent with such animal oil, vegetable oil, or a mixture thereof, it is possible to reduce the manufacturing cost while maintaining biocompatibility without reducing the desired drug efficacy or stability. The amount of the animal oil or vegetable oil is used in a ratio of oily contrast agent: animal oil and / or vegetable oil = 1: 0.01 to 1 by volume. Preferably the ratio is 1: 0.01 to 0.5.
본 발명의 파클리탁셀 유성 조성물은, 먼저 유성조영제에 상기 조성범위가 되도록 적량의 파클리탁셀을 첨가하여 상온에서 교반, 용해시킴으로써 간편하게 제조할 수 있다. 이 때, 신속한 용해를 위하여, 약 35 ~ 45 ℃ 의 온도로 가온하거나 배쓰형 소니케이터 (bath type sonicator)를 이용하여 초음파처리해도 무방하다. 이렇게 제조된 파클리탁셀 유성 조성물 조성물을 멸균 후 보관한다. 상기 멸균법으로서 처음부터 멸균된 원료를 사용하여 멸균 조건하에서 혼합하거나 파클리탁셀 유성 조성물을 시린지 필터(포어 사이즈 200 ㎛, PVDF 멸균 필터)를 이용하여 멸균하는 방법을 이용할 수 있다. 또 다른 멸균법으로서, 요오드화 양귀비씨 기름 (Iodized poppy seed oi)과 파클리탁셀을 감마선 (gamma-ray)으로 소독하거나, EO 가스 멸균을 통하여 소독한 후 혼합하거나, 혼합 후 조성물을 감마선으로 소독하거나 EO 가스 멸균방법을 통해 소독할 수도 있다. The paclitaxel oily composition of the present invention can be easily prepared by first adding an appropriate amount of paclitaxel to the oily contrast agent so as to be in the above composition range, stirring and dissolving at room temperature. At this time, for rapid dissolution, it may be heated to a temperature of about 35 ~ 45 ℃ or sonication using a bath type sonicator (bath type sonicator). The paclitaxel oily composition thus prepared is stored after sterilization. As the sterilization method, a method of sterilization using a raw material sterilized from the beginning or mixed under sterilization conditions or using a syringe filter (pore size 200 μm, PVDF sterilization filter) may be used. As another sterilization method, iodized poppy seed oi and paclitaxel are sterilized with gamma-ray, sterile via EO gas sterilization or mixed, or after mixing the composition is gamma-ray sterilized or EO gas sterilized It can also be disinfected by the method.
이와 같이 제조된 본 발명의 파클리탁셀 유성 조성물은 상온에서 60일 이상 안정한 보관안정성을 나타내었다. The paclitaxel oil composition of the present invention thus prepared showed stable storage stability at room temperature for at least 60 days.
상기 유성 조성물에 있어서, 파클리탁셀은 유성조영제에 잘 용해되어 약 2 달간은 안정하게 보관되지만 시간이 경과함에 따라 파클리탁셀이 침전되어 석출되는 단점이 있다. 이러한 현상은 파클리탁셀 분자내의 히드록시 그룹 간에 분자내 또는 분자간 수소결합을 형성하기 때문이다. 이러한 현상은 파크리탁셀과 수소결합을 형성하는 물질 또는 파클리탁셀의 분자간 수소결합 형성을 방해하는 물질을 소량 첨가함으로써 막을 수 있다. 따라서, 유성 조성물에 사용되는 유성 조영제가 파클리탁셀과 수소결합을 형성 할 수 있는 경우에는 2 달이 경과하여도 파클리탁셀의 침전이 발생하지 않는다. In the oily composition, paclitaxel is well dissolved in an oily contrast agent, and thus is stably stored for about two months, but paclitaxel is precipitated and precipitated over time. This phenomenon is due to the formation of intramolecular or intermolecular hydrogen bonds between hydroxy groups in the paclitaxel molecule. This phenomenon can be prevented by adding a small amount of a substance that forms hydrogen bonds with paclitaxel or a substance that prevents intermolecular hydrogen bond formation of paclitaxel. Therefore, if the oily contrast agent used in the oily composition can form hydrogen bonds with paclitaxel, precipitation of paclitaxel does not occur even after two months.
그러나, 본 발명에서 사용가능한 유성조영제 중 리피오돌의 경우 분자구조상 수소결합을 형성하지 못하기 때문에, 시간이 경과함에 따라 파클리탁셀 분자간의 수소결합을 막을 수 없다. 이러한 경우에는, 리피오돌에 잘 녹으면서도 수소결합을 잘 형성하는 물질, 예컨대, 트리카프릴린을 소량 첨가하면 파클리탁셀-파클리탁셀 간의 수소결합 대신 파클리탁셀-트리카프릴린 간의 수소결합이 형성되므로 파클리탁셀의 침전을 막을 수 있다. However, Lipiodol among the oily contrast agents usable in the present invention cannot form hydrogen bonds due to its molecular structure, and thus, hydrogen bonds between paclitaxel molecules cannot be prevented with time. In such a case, the addition of a small amount of a substance that forms a hydrogen bond well while soluble in Lipiodol, such as tricapryline, forms a hydrogen bond between paclitaxel-tricapryline instead of the hydrogen bond between paclitaxel and paclitaxel. You can stop it.
본 발명의 파클리탁셀의 유성 조성물의 경우, 파클리탁셀 및 유성조영제의 장기보관 시 함량은 제조과정에 의해 결정된다. 제조과정 중 습기나 산소와의 접촉이 없고, 가열할 필요가 없다면 구성성분이 산화되는 것을 막을 수 있으므로 보다 오래 안정하게 보관할 수 있다. 그러나, 본 발명의 파클리탁셀 유성 조성물로부터 파클리탁셀의 침전이 형성되는 것은 열역학적으로 안정한 형태로 변하는 것이므로, 제조 시 주의를 기울이는 것의 여부를 떠나서 장기보관시 발생하는 문제이다. 파클리탁셀 유성 조성물 중 파클리탁셀의 농도에 따라 침전 형성 속도는 다르지만, 10 mg/ml 의 경우 60일, 5 mg/ml의 경우 120일이 경과하면서 실온에서 침전이 형성되는 것을 볼 수 있었다. 그러므로, 실제적으로 유효기간을 1년 이상으로 하기 위해서는 파클리탁셀의 침전 형성을 저해하는 물질을 첨가해야만 열역학적으로 안정한 상태를 장기간 유지할 수 있다.In the case of the oily composition of paclitaxel of the present invention, the content of long-term storage of paclitaxel and the oily contrast agent is determined by the manufacturing process. If there is no contact with moisture or oxygen during the manufacturing process and need not be heated, the components can be prevented from being oxidized, thus allowing for longer storage. However, the formation of paclitaxel precipitation from the paclitaxel oily composition of the present invention is a change in thermodynamically stable form, and thus a problem that occurs during long-term storage regardless of whether or not care is taken in preparation. Precipitation formation rate was different depending on the concentration of paclitaxel in the paclitaxel oil composition, but it was found that precipitation was formed at room temperature over 60 days for 10 mg / ml and 120 days for 5 mg / ml. Therefore, in order to make the shelf life more than 1 year practical, it is only possible to maintain a thermodynamically stable state for a long time only by adding a substance that inhibits the formation of paclitaxel.
따라서, 본 발명의 파클리탁셀 유성 조성물은 파클리탁셀의 침전 형성을 저해하는 물질을 추가적으로 함유할 수 있다. 이 때, 유성조영제에 대한 파클리탁셀의 용해도가 13 mg/ml로 증가하게 된다. Therefore, the paclitaxel oily composition of the present invention may further contain a substance that inhibits the precipitation formation of paclitaxel. At this time, the solubility of paclitaxel in the oily contrast agent is increased to 13 mg / ml.
즉, 본 발명의 파클리탁셀 유성조성물은 유성조영제와 유성조영제 1 ml에 대하여 0.0001 내지 13 mg의 파클리탁셀 및 0.01 내지 1 ml의 파클리탁셀의 침전 형성 저해 물질을 함유할 수 있다.That is, the paclitaxel oil composition of the present invention may contain a substance for inhibiting precipitation formation of 0.0001 to 13 mg of paclitaxel and 0.01 to 1 ml of paclitaxel relative to 1 ml of the oily contrast agent and the oily contrast agent.
이 때 사용되는 유성조영제는 상기한 바와 같다.The oily contrast agent used at this time is as described above.
상기 파클리탁셀의 침전 형성을 저해하는 물질로는 파클리탁셀 분자와 수소결합을 할 수 있는 물질 또는 파클리탁셀 분자간의 수소결합 형성을 방해하는 물질 (chaotropic agent)을 사용할 수 있다.As a material for inhibiting the formation of paclitaxel, a substance capable of hydrogen bonding with the paclitaxel molecule or a substance that prevents hydrogen bond formation between the paclitaxel molecules may be used.
상기 파클리탁셀 분자와 수소결합을 할 수 있는 물질로는 알코올, 폴리올, 기름, 지질, 고분자 또는 펩타이드 등이 있다. 상기 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 또는 부탄올 등이 있다. 폴리올로는 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등이 있다. 상기 기름으로는 트리글리세라이드, 디글리세라이드, 모노글리세라이드, 토코페롤 또는 이들의 혼합물인 자연적으로 추출되는 동물성 또는 식물성 기름이 있다. 상기 지질로는 인지질, 중성지질, 양이온성지질 또는 음이온성지질 등이 있다. 상기 고분자로는 폴리 락타이드-코-글리콜릭 산 (poly lactide-co-glycolic acid, PLGA) 등이 있다.Substances capable of hydrogen bonding with the paclitaxel molecules include alcohols, polyols, oils, lipids, polymers or peptides. The alcohol includes methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol and the like. Polyols include ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, and the like. Such oils include naturally occurring animal or vegetable oils that are triglycerides, diglycerides, monoglycerides, tocopherols or mixtures thereof. The lipids include phospholipids, neutral lipids, cationic lipids or anionic lipids. The polymer is poly lactide-co-glycolic acid (PLGA).
상기 파클리탁셀 분자간의 수소결합의 형성을 방해하는 물질 (chaotropic agent)로서 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide, DMSO) 또는 아미드가 사용될 수 있다. Dimethylsulfoxide (DMSO) or an amide may be used as a chaotropic agent to prevent the formation of hydrogen bonds between the paclitaxel molecules.
이와 같이 파클리탁셀의 침전형성을 저해하는 물질을 함유하는 파클리탁셀 유성 조성물은 상온에서 200일 이상 안정한 보관안정성을 나타내었다. Thus, paclitaxel oil-based composition containing a substance that inhibits the formation of paclitaxel showed stable storage stability at room temperature for more than 200 days.
본 발명의 파크리탁셀 유성조성물은 고형암 치료를 위한 화학색전용 조성물로서 유용하며, 45 내지 180 cP의 화학색전술에 적합한 점도를 나타낸다. 화학색전술에 사용되는 본 발명의 파클리탁셀 유성 조성물의 투여량 및 투여방법은 환자의 연령, 성별, 체중, 증상의 위중도 등 환자 개인의 차에 따라 담당의사의 재량에 따라 가변시킬 수 있으나, 대략 1 ~ 4 개월에 1회씩 여러 번 반복시술이 가능하며, 1 회에 2 ~ 15 ml를 사용하여 고형암으로 혈액을 공급하는 동맥, 즉 간암의 경우 간동맥을 따라 주입한다.The paclitaxel oily composition of the present invention is useful as a composition for chemoembolization for the treatment of solid cancer, and has a viscosity suitable for chemoembolization of 45 to 180 cP. The dosage and administration method of the paclitaxel oil-based composition of the present invention used for chemoembolization may be varied at the discretion of the attending physician according to the individual's individual differences such as the patient's age, sex, weight, and severity of symptoms. The procedure can be repeated several times, once every four months, and infusions of 2-15 ml at a time are injected into the artery that supplies solid cancer, ie liver cancer, along the hepatic artery.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 아래에 제시되는 실시예는 어디까지나 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것이지 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the examples set forth below are provided to aid the understanding of the present invention, but the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. Example 1.
파클라탁셀/리피오돌 유성 조성물의 제조Preparation of Paclitaxel / Lipiodol Oil Composition
유성조영제로서 1 ml의 리피오돌 (Lipiodol Ultra-fluid, Laboratoire Guerbet, France, 요오드 함량 38 중량%)에 파클리탁셀 (삼양사) 2,4,6,8,10,11 mg을 첨가하여 시험관 (안전잠금장치가 구비된 마이크로 시험관, 폴리에틸렌 1.5 ml, Eppendorf AG, Germany)속에 넣고 상온에서 교반하여 용해시켰다. 신속한 용해를 위해 약 40 ℃ 정도로 가온하거나 배쓰형 소니케이터에서 초음파처리해도 무방하다. 파클리탁셀의 농도가 2 ~ 10 mg/1 ml 리피오돌일 경우 단일액상이 형성되므로 파클리탁셀이 리피오돌에 용해됨을 알 수 있었다. 그러나 파클리탁셀의 농도가 11 mg/1 ml 리피오돌일 경우 처음에는 파클리탁셀은 리피오돌에 용해되어 단일 액상을 형성하나 하루 방치하면 용액의 탁도가 증가하며 현미경으로 관찰시 파클리탁셀의 침전이 형성되는 것으로 보아 리피오돌 내의 파클리탁셀의 용해도는 상온(24 ~ 28 ℃)에서 약 10 mg/ml인 것을 확인하였다. 키네마틱 점도계 (Cannon-Fenske Type, Calibrated, Cat. No. 13-617E, Size 200, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에 얻어진 파클리탁셀/리피오돌 10 ml를 넣은 후 낙하시간을 측정하는 방식으로 점성을 측정하였다. 측정된 점도는 67 cP로서, 점도가 45 cP 이상일 때 색전효과가 있으므로 제조된 파클리탁셀/리피오돌 조성물은 색전효과가 클것으로 보인다. As an oily contrast agent, 2,4,6,8,10,11 mg of paclitaxel (Samyang) was added to 1 ml of Lipiodol (38% by weight of iodine) (Lipiodol Ultra-fluid, Laboratoire Guerbet, France). Into a micro test tube, polyethylene 1.5 ml, Eppendorf AG, Germany) and dissolved by stirring at room temperature. For rapid dissolution, it may be heated to about 40 ° C. or sonicated in a bath sonicator. When the concentration of paclitaxel was 2 to 10 mg / 1 ml Lipiodol, paclitaxel was dissolved in Lipiodol because a single liquid phase was formed. However, if the paclitaxel concentration is 11 mg / 1 ml Lipiodol, paclitaxel initially dissolves in Lipiodol to form a single liquid phase, but if left for one day, the turbidity of the solution increases, and the paclitaxel in the Lipiodol is observed due to the formation of a precipitate of paclitaxel under a microscope. It was confirmed that the solubility of about 10 mg / ml at room temperature (24 ~ 28 ℃). Viscosity was measured by adding 10 ml of paclitaxel / lipiodol obtained in a kinematic viscometer (Cannon-Fenske Type, Calibrated, Cat.No. 13-617E, Size 200, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) and measuring the drop time. . The measured viscosity is 67 cP, and the paclitaxel / lipiodol composition is expected to have a high embolic effect when the viscosity is 45 cP or more.
실시예 2. Example 2.
파클리탁셀/리피오돌 조성물의 물리적 안정성Physical Stability of Paclitaxel / Lipiodol Composition
유성조영제로서 1 ml의 리피오돌 (Lipiodol Ultra-fluid, Laboratoire Guerbet, France, 요오드 함량 38 중량%)에 10 mg의 파클리탁셀을 첨가하여 시험관 속에 넣고 상온에서 교반하여 용해시킨다. 용해를 빠르게 하기 위하여 약 40 ??℃정도로 가온하였다. 제조후 단일액상이 형성되므로 파클리탁셀이 리피오돌에 용해 됨을 알 수 있다. 제조된 조성을 시린지 필터(200 ㎛ 포어 사이즈, PVDF 필터)를 연결한 주사기를 통과시켜 멸균한 후 60일 간 실온 및 4 ℃에서 보관하며 물리적 안정성 및 파클리탁셀의 화학적 분해여부를 관찰하였다. 액상의 색상변화, 냄새, 상분리 현상 등은 발생하지 않았다. HPLC를 이용하여 성분을 분석한 결과, 파클리탁셀은 전혀 분해되지 않음을 알 수 있었다. HPLC 조건은 아래와 같았다.As an oily contrast agent, 10 mg of paclitaxel is added to 1 ml of Lipiodol (38% by weight of Lipoiodol Ultra-fluid, Laboratoire Guerbet, France, Iodine), and the solution is stirred at room temperature and dissolved. Warmed to about 40 ° C. to accelerate dissolution. It can be seen that paclitaxel is dissolved in Lipiodol because a single liquid phase is formed after preparation. The prepared composition was sterilized by a syringe connected to a syringe filter (200 μm pore size, PVDF filter), and then stored at room temperature and 4 ° C. for 60 days to observe physical stability and chemical degradation of paclitaxel. Color change, odor, and phase separation of the liquid phase did not occur. Analysis of the components using HPLC showed that paclitaxel did not degrade at all. HPLC conditions were as follows.
- 펌프:SP8810 precision isocratic pump (Spectra-Physics Inc., San Jose, CA)SP8810 precision isocratic pump (Spectra-Physics Inc., San Jose, CA)
- 컬럼: Waters Bondpack C18 Column (3.9 mm x 300 mm, Waters Corp., Milford, MA)Column: Waters Bondpack C18 Column (3.9 mm x 300 mm, Waters Corp., Milford, MA)
- 이동상: 아세토니트릴 및 물 각각 50 %(w/w) Mobile phase: 50% (w / w) each of acetonitrile and water
- 유속:1 ml/minFlow rate: 1 ml / min
- 검출기: Spectra 100 가변파장 검출기 (variable wavelength detector) (Spectra-Physics)Detector:
실시예 3. Example 3.
에티오돌/파클리탁셀 조성물의 제조 및 물리적 안정성Preparation and Physical Stability of Ethiodol / Paclitaxel Compositions
유성조영제로서 리피오돌 대신 에티오돌(Savage Laboratories, Melville, NY)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 파클리탁셀 유성 조성물을 제조하였다. 혼합물이 단일액상을 형성하므로 파클리탁셀이 에티오돌에 잘 용해됨을 알 수 있다.Paclitaxel oil-based composition was prepared in the same manner as in Example 1 except that thiodol (Savage Laboratories, Melville, NY) was used instead of Lipiodol as an oily contrast agent. It can be seen that paclitaxel is well soluble in thiodol because the mixture forms a single liquid phase.
제조된 조성의 물리적 안정성을 실시예 2와 동일한 방법으로 시험하였다. 멸 균한 후 60일 간 실온 및 4 ℃에서 보관하며 물리적 안정성 및 파클리탁셀의 화학적 분해여부를 관찰하였다. 액상의 색상변화, 냄새, 상분리 현상 등은 발생하지 않았다. HPLC를 이용하여 성분을 분석한 결과, 파클리탁셀은 전혀 분해되지 않음을 알 수 있었다. Physical stability of the prepared composition was tested in the same manner as in Example 2. After sterilization it was stored at room temperature and 4 ℃ for 60 days and the physical stability and the chemical degradation of paclitaxel was observed. Color change, odor, and phase separation of the liquid phase did not occur. Analysis of the components using HPLC showed that paclitaxel did not degrade at all.
실험예 1. Experimental Example 1.
간암동물모델의 제작Production of Liver Cancer Animal Model
독일의 Deutsches Krebsforschungszentrum Tumorbank로부터 제공받은 VX2 암종을 토끼 (Newzealand White)의 대퇴부에 이식한 후 약 2주일이 경과하여 직경이 1-2cm인 종양을 가진 가토 (VX-2 토끼 간암종 동물모델명)를 10ml의 펜토탈 소듐 (pentothal sodium) 용액(62.5mg/kg)을 정맥 주사하여 희생시킨 후 종양 주변의 털을 제거하고 요오드 용액과 알코올로 피부를 소독하고 수술칼로 종양 부위의 피부를 절개하여 종양을 주위 조직과 박리하여 적출하였다. 적출된 종양을 절개하여 중심부의 괴사를 제거하고 종양 주변부의 얇은 층을 모아 calcium and magnesium-free Hank's balanced salt solution(Grand Island Biological Co., Grand Island, New York)과 혼합한 후 종양조직을 죽 상태가 될 때까지 가위 및 수술칼로 아주 잘게 잘라 5ml의 RMPI-1640(Rosewell Park Memorial Institute, Rosewell Park, New York) 배양액에 넣고 잘 섞은 후 종양세포의 농도가 1x106 개/ml 되게 희석하였다. 10ml of rabbit (VX-2 animal model of rabbit liver carcinoma) with a tumor of 1-2cm diameter after about 2 weeks after transplantation of VX2 carcinoma from Deutsches Krebsforschungszentrum Tumorbank, Germany into the femur of rabbit (Newzealand White) Was injected intravenously with pentotal sodium solution (62.5mg / kg) to remove the hair around the tumor, disinfect the skin with iodine solution and alcohol, and cut the skin around the tumor with a surgical knife It peeled off with tissue and extracted. Excision of the tumor was removed to remove necrosis in the center, and a thin layer around the tumor was collected and mixed with calcium and magnesium-free Hank's balanced salt solution (Grand Island Biological Co., Grand Island, New York) to kill tumor tissue. Cut into fine pieces with scissors and surgical knives until 5ml RMPI-1640 (Rosewell Park Memorial Institute, Rosewell Park, New York) culture medium and mixed well and diluted to a concentration of 1x10 6 / ml tumor cells.
종양세포 용액의 가토 간내 주입 및 이식: 가토를 마취하기 위하여 귀 정맥에 23G 주사침으로 정맥 주사하여 500ml의 생리식염수와 연결하여 정맥을 확보한 뒤 500mg의 펜토탈 소듐을 40ml 생리식염수에 희석하여 이 혼합액(1.5ml/kg)을 분 당 1ml의 속도로 귀 정맥에 주사하였다. 이후 복부의 털을 제거하고 요오드 용액과 알코올로 소독한 뒤 초음파 유도 하에서 22G 바늘을 이용하여 간의 좌엽을 천자한 뒤 종양조직 용액 0.1ml를 22G 침이 부착된 1ml 주사기로 간의 실질 (parenchyma) 내로 주입하였다. 종양조직 용액의 주입은 가토 간의 5개의 엽(lobe) 중 초음파 관찰이 가장 용이한 전 좌엽에 시행하였다 (도 2). 이차 감염을 방지하기 위하여 항생제(PenbrexR, 250mg)를 정맥 주사하였다. 종양조직 용액의 주입이 끝난 가토들은 가토장에서 정상적인 사료로 사육하였다. 종양 세포 이식후 2주 째부터 초음파 및 CT에서 종양을 발견할 수 있었으며 성장 곡선을 이용하여 향후 성장 속도를 어느 정도 예측할 수 있었다. 종양세포 이식 후, 2 주 째부터 3일 간격으로 초음파를, 1주 간격으로 CT를 시행하여 종양의 위치와 크기를 추적하였다. Intrahepatic Injection and Transplantation of Tumor Cell Solution: To anesthetize rabbits, intravenous injection of 23G needle into the vein of the ear to connect with 500ml saline solution to secure the vein, and then dilute 500mg of pentotal sodium in 40ml saline solution. (1.5 ml / kg) was injected into the ear vein at a rate of 1 ml per minute. The abdominal hair is then removed, sterilized with iodine solution and alcohol, punctured the left lobe of liver using 22G needle under ultrasound guidance, and 0.1ml of tumor tissue solution is injected into parenchyma of liver with 1ml syringe with 22G needle. It was. Tumor tissue was injected into the front lobe of the five lobes of the liver, where ultrasound was most easily observed (FIG. 2). Antibiotics (PenbrexR, 250 mg) were injected intravenously to prevent secondary infection. Rabbits that had been injected with tumor tissue solutions were raised in normal feed in rabbits. Two weeks after tumor cell transplantation, tumors were detected by ultrasound and CT, and the growth curve was used to predict the future growth rate to some extent. After tumor cell transplantation, ultrasound was performed at 3 days intervals from 2 weeks and CT at 1 week intervals to track the location and size of tumors.
실시예 4. Example 4.
파클리탁셀/리피오돌 조성물을 이용한 간암동물모델에서의 경동맥색전술Carotid Embolization in Liver Cancer Animal Model Using Paclitaxel / Lipiodol Composition
유성조영제로서 1 ml의 리피오돌에 10 mg 또는 3.33 mg의 파클리탁셀을 각각 첨가하여 시험관 속에 넣고 상온에서 교반하여 용해시켰다. 용해를 빠르게 하기 위하여 약 40 ℃ 정도로 가온하거나 배쓰형 소니케이터에서 초음파처리해도 무방하다. 제조후 균일한 단일액상이 형성되므로 파클리탁셀이 리피오돌에 용해됨을 알 수 있었다. 제조된 리피오돌/파클리탁셀 제형을 시린지 필터 (200 ㎛ 포어 사이즈, PVDF 필터)를 연결한 주사기를 통과시켜 멸균하였다. 실험예 1에서 준비된 간암동물모델에 본 발명의 파클리탁셀/리피오돌 제형 0.3 ml를 미세도관을 이용하여 종양 을 공급하고 있는 동맥을 선택하여 경동맥 색전술을 시행하였다. 따라서 각 실험군에서의 파클리탁셀 투여량은 각각 1 mg 또는 3 mg에 해당한다. 이때 대조군으로 간암동물모델에 리피오돌만을 0.3 cc 주입하여 비교하였다. 수술 일 주일 후, CT 촬영을 한 결과 도 1에서 볼 수 있듯이, 간암조직에만 선택적으로 리피오돌이 관찰되었다.As an oily contrast agent, 10 mg or 3.33 mg of paclitaxel was added to 1 ml of Lipiodol, respectively, and placed in a test tube, followed by dissolution at room temperature. In order to accelerate the dissolution, it may be heated to about 40 ° C. or sonicated in a bath sonicator. It was found that paclitaxel was dissolved in Lipiodol because a uniform single liquid phase was formed after preparation. The prepared Lipiodol / Paclitaxel formulation was sterilized by passing a syringe connected to a syringe filter (200 μm pore size, PVDF filter). Carotid artery embolization was performed by selecting the artery supplying the tumor to the liver cancer animal model prepared in
실시예 5. Example 5.
파클리탁셀/리피오돌 조성물로 경동맥색전술 실시후 간암조직에서의 파클리탁셀 농도 분석Analysis of Paclitaxel Levels in Liver Cancer Tissues after Carotid Embolization with Paclitaxel / Lipiodol Composition
실시예 4에서 색전술을 수행한 간암 동물들을 수행 일 주일 후 희생시켜 간을 적출하였다. 간조직을 리피오돌이 육안으로 확인되는 조직, 리피오돌이 육안으로 확인되지 않는 조직 및 간암주변에 위치한 정상조직으로 구분하여 조직내의 파클리탁셀 농도를 정량하였다. 구분된 간조직을 용해 완충용액 [62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% 소듐 도데실 설페이트, 5% β- 머캅토에탄올, 10% 글리세롤]을 넣은 후 분쇄하여 조직을 파괴하였다. 이것을 원심분리하여 상층액속에서 파클리탁셀의 농도를 HPLC를 이용하여 정량하였다. 이때 HPLC의 조건은 실시예 2에서와 같다. 실시예 4에서 설명한 대로 1 mg 및 3 mg의 파클리탁셀을 투여한 토끼에서의 파클리탁셀의 정량결과를 각각 도 2A 및 도 2B에 나타내었다. 리피오돌이 육안으로 확인되는 간암조직에서 가장 높은 농도의 파클리탁셀이 있음을 확인하였으며, 리피오돌이 보이지 않은 간암조직에서도 비교적 높은 농도의 파클리탁셀이 검출되었다. 반면에 간암조직근처의 정상간조직에서는 파클리탁셀의 농도가 거의 검출되지 않아서 투여 한지 일 주일이 지나도 파클리탁셀은 간암조직에만 선택적으로 분포함을 알 수 있다. Liver cancer animals embolized in Example 4 were sacrificed one week after the liver was removed. The liver tissues were divided into tissues identified with the naked eye of lipidodol, tissues not identified with the naked eye, and normal tissues located around liver cancer. The separated liver tissue was added to lysis buffer [62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% sodium dodecyl sulfate, 5% β-mercaptoethanol, 10% glycerol] and then ground to destroy the tissue. This was centrifuged to determine the concentration of paclitaxel in the supernatant using HPLC. At this time, the conditions of HPLC are the same as in Example 2. As described in Example 4, quantitative results of paclitaxel in rabbits administered with 1 mg and 3 mg of paclitaxel are shown in FIGS. 2A and 2B, respectively. It was confirmed that the highest concentration of paclitaxel was found in liver cancer tissues in which Lipiodol was visible to the naked eye, and relatively high concentrations of paclitaxel were detected in liver cancer tissues in which Lipiodol was not visible. On the other hand, paclitaxel was selectively distributed only in liver cancer tissues even after one week of administration because paclitaxel concentration was hardly detected in normal liver tissues near liver cancer tissues.
실시예 6. Example 6.
리피오돌/파클리탁셀 조성으로 경동맥색전술 실시후 간암조직의 괴사율 측정Necrosis rate of liver cancer tissue after carotid embolization with Lipiodol / Paclitaxel composition
유성조영제로서 1 ml의 리피오돌에 10 mg 또는 3.33 mg의 파클리탁셀을 각각 첨가하여 시험관 속에 넣고 상온에서 교반하여 용해시켰다. 용해를 빠르게 하기 위하여 배쓰형 소니케이터에서 초음파 처리하였다. 제조 후 균일한 단일액상이 형성되므로 파클리탁셀이 리피오돌에 용해됨을 알 수 있었다. 제조된 리피오돌/파클리탁셀 제형을 시린지 필터 (200 ㎛ 포어 사이즈, PVDF 필터)를 연결한 주사기를 통과시켜 멸균하였다. 실험예 1에서 준비된 간암동물모델에 본 발명의 파클리탁셀/리피오돌 제형 0.3 ml (10 또는 3.33 mg/ml 농도의 제형) 또는 0.4 ml (10 mg/ml 농도의 제형)를 미세도관을 이용하여 종양을 공급하고 있는 동맥을 선택하여 경동맥 색전술을 시행하였다. 따라서, 각 실험군에서의 파클리탁셀 투여량은 각각 1 mg, 3 mg 또는 4 mg에 해당한다. 이때 대조군으로 간암동물모델에 리피오돌만을 0.3 cc 주입하여 비교하였다. 수술 일 주일 후, CT 촬영을 한 결과 도 1에서 볼 수 있듯이 간암조직에만 선택적으로 리피오돌이 관찰되었다. 색전술을 수행한 간암동물들을 수행 일 주일 후 희생시켜 간을 적출하였다. 적출한 간암의 크기는 파클리탁셀/리피오돌 제형을 투여한 실험군의 경우 대조군인 리피오돌 투여군과 지름이 약 32 ±5 mm 정도로 거의 동일하였다. 간암조직 중에서 괴사성 종양 (necrotic tumor)과 살아있는 종양 (viable tumor)를 구분하기 위하여 병리학적 검사를 수행하였다. 전체 간암조직 중 살아있는 종양의 백분율을 도 3에 나타내었다. 리피오돌만 투여한 대조군의 경우에는 30 % 이상의 살아있는 종양이 확인되나 파클리탁셀/리피오돌 제형을 투여한 실험군에서는 파클리탁셀 투여량 1mg, 3 mg 및 4 mg의 경우 각각 13.2 %, 10.4 % 및 0.6 %로 살아있는 암세포가 약 20 % 이상 감소한 것을 알 수 있다. 이와 같은 실험결과는 파클리탁셀/리피오돌 제형속에 있는 파클리탁셀이 효율적으로 암세포를 죽이는 작용을 함을 보여준다. As an oily contrast agent, 10 mg or 3.33 mg of paclitaxel was added to 1 ml of Lipiodol, respectively, and placed in a test tube, followed by dissolution at room temperature. Sonication was performed in a bath sonicator to speed up dissolution. It was found that paclitaxel was dissolved in Lipiodol because a uniform single liquid phase was formed after preparation. The prepared Lipiodol / Paclitaxel formulation was sterilized by passing a syringe connected to a syringe filter (200 μm pore size, PVDF filter). The liver cancer animal model prepared in
실시예 7. Example 7.
리피오돌/대두유/파클리탁셀 조성물의 제조Preparation of Lipiodol / Soybean Oil / Paclitaxel Compositions
1 ml의 리피오돌과 0.2 ml의 대두유 (soybean oil)에 파클리탁셀 10 mg을 첨가하여 시험관 속에 넣고 상온에서 교반하여 용해시켰다. 용해를 빠르게 하기 위하여 배쓰형 소니케이터에서 초음파 처리하였다. 혼합물은 단일액상을 형성하므로 파클리탁셀이 혼합기름인 리피오돌/대두유에 용해됨을 알 수 있다.10 mg of paclitaxel was added to 1 ml of Lipiodol and 0.2 ml of soybean oil, and the mixture was added to a test tube and stirred at room temperature to dissolve. Sonication was performed in a bath sonicator to speed up dissolution. Since the mixture forms a single liquid phase, it can be seen that paclitaxel is dissolved in Lipiodol / soybean oil, which is a mixed oil.
실시예 8. Example 8.
리피오돌/스쿠알렌/파클리탁셀 조성물의 제조Preparation of Lipiodol / Squalene / Paclitaxel Compositions
대두유 대신 스쿠알렌 (squlane)을 사용하고 용해를 빠르게 하기 위해 40 ℃에서 가온한 것을 제외하고 실시예 6과 동일한 방법으로 리피오돌/스쿠알렌/파클리탁셀 조성을 제조하였다. 혼합물은 단일액상을 형성하므로 파클리탁셀이 혼합기름인 리피오돌/스쿠알렌에 용해됨을 알 수 있다.Lipiodol / squalene / paclitaxel compositions were prepared in the same manner as in Example 6 except that squalane (squlane) was used instead of soybean oil and warmed at 40 ° C. to accelerate dissolution. Since the mixture forms a single liquid phase, it can be seen that paclitaxel is dissolved in Lipiodol / Squalene, the mixed oil.
실시예 9. Example 9.
파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 조성물의 제조 및 물리적 안정성Preparation and Physical Stability of Paclitaxel / Lipiodol / Tricapryline Compositions
1 ml의 리피오돌과 0.01 ml의 트리카프릴린에 파클리탁셀 10 mg을 첨가하여 시험관 속에 넣고 상온에서 교반하여 용해시켰다. 용해를 빠르게 하기 위하여 배쓰형 소니케이터에서 초음파 처리하였다. 혼합물은 단일액상을 형성하므로 파클리탁셀이 혼합기름인 리피오돌/트리카프릴린에 용해됨을 알 수 있다. 제조된 조성을 시린지 필터(200 ㎛ 포어 사이즈, PVDF 필터)를 연결한 주사기를 통과시켜 멸균한 후, 200 일 간 실온 및 4 ℃에서 보관하며 물리적 안정성 및 파클리탁셀의 화학적 분해 여부를 관찰하였다. 액상의 색상변화, 냄새, 상분리 현상 등은 발생하지 않았다. 실시예 2 와 동일한 방법으로 HPLC를 이용하여 성분을 분석한 결과, 파클리탁셀은 전혀 분해되지 않음을 알 수 있었다. 이 때, 대조군으로 실시예 1에서 제조한 파클리탁셀/리피오돌 조성물을 이용한 결과 실시예 1의 조성물은 상온에서 파클리탁셀의 침전으로 인해 유성 조성물이 탁해지며 (도 5A), 편광현미경 하에서도 파클리탁셀의 침전이 관찰되나 (도 5B), 실시예 9의 조성물의 경우 유성 조성물이 투명하게 유지되며 (도 5C), 편광현미경 하에서도 침전이 관찰되지 않아, 파클리탁셀의 침전형성을 저해하는 물질인 트리카프릴린을 첨가하여 조성물을 오랜기간 보관할 수 있게 됨을 알 수 있다.10 mg of paclitaxel was added to 1 ml of Lipiodol and 0.01 ml of Tricapryline, and placed in a test tube, and stirred at room temperature to dissolve. Sonication was performed in a bath sonicator to speed up dissolution. Since the mixture forms a single liquid phase, it can be seen that paclitaxel is dissolved in Lipiodol / tricapryline, which is a mixed oil. The prepared composition was sterilized by a syringe connected to a syringe filter (200 μm pore size, PVDF filter), and then stored at room temperature and 4 ° C. for 200 days to observe physical stability and chemical degradation of paclitaxel. Color change, odor, and phase separation of the liquid phase did not occur. As a result of analyzing the components using HPLC in the same manner as in Example 2, it was found that paclitaxel was not decomposed at all. At this time, the result of using the paclitaxel / lipiodol composition prepared in Example 1 as a control resulted in turbidity of the oily composition due to the precipitation of paclitaxel at room temperature (FIG. 5A), and precipitation of paclitaxel was observed even under a polarizing microscope. However, in the case of the composition of Example 9 (Fig. 5B), the oily composition remains transparent (Fig. 5C), and no precipitation is observed even under a polarizing microscope, thereby adding tricapryline, a substance that inhibits the formation of paclitaxel. It can be seen that the composition can be stored for a long time.
실시예 10. Example 10.
파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 조성물의 제조 및 물리적 안정성Preparation and Physical Stability of Paclitaxel / Lipiodol / Tricapryline Compositions
1 ml의 리피오돌과 0.01 ml의 트리카프릴린에 파클리탁셀 12 mg을 첨가하여 시험관 속에 넣고 상온에서 교반하여 용해시켰다. 용해를 빠르게 하기 위하여 배쓰 형 소니케이터에서 초음파 처리하였다. 혼합물은 단일액상을 형성하므로 트리카프릴린을 첨가한 결과 파클리탁셀의 용해도는 리피오돌에서보다 리피오돌/트리카프릴린 혼합용매에서 더 높음을 알 수 있었다.12 mg of paclitaxel was added to 1 ml of Lipiodol and 0.01 ml of Tricapryline, and placed in a test tube, and dissolved by stirring at room temperature. Sonication was performed in a bath sonicator to speed up dissolution. Since the mixture forms a single liquid phase, the addition of tricapryline showed that the solubility of paclitaxel was higher in the Lipiodol / Tricapryline mixed solvent than in Lipiodol.
실험예 2. Experimental Example 2.
흑색종 동물모델의 제작Creation of melanoma animal models
C57BL/6J 쥐에서 자발적으로 발생한 흑색종 세포주인 B16-F10 세포를 비국 세포주은행으로 부터 얻은후, 10 % fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL/Life Technologies, New York, NY) 와 1 % Penicillin/Streptomycin (Gibco)이 첨가된 Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco)에서 배양하였다. 1 x 106 개의 세포를 100 ㎕의 DMEM에 분산하여 8 주령 C57BL/J 쥐 (한국 셈타코, Samtaco) 왼쪽 발바닥에 접종하여 흑색종 동물모델을 제작하였다.B16-F10 cells, a melanoma cell line that spontaneously developed in C57BL / 6J mice, were obtained from a non-US cell line bank, followed by 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL / Life Technologies, New York, NY) and 1% Penicillin / Streptomycin. (Gibco) was added to Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco). Melanoma animal models were prepared by inoculating 1 x 10 6 cells in 100 μl of DMEM and inoculating the left foot of 8-week-old C57BL / J mice (Shimtaco, Korea).
실시예 11. Example 11.
파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 조성 주입 후 흑색종의 크기변화율 측정Size change rate of melanoma after injection of paclitaxel / lipiodol / tricapryline composition
실시예 9에서 제조한 후 시린지 필터 (200 ㎛ 포어 사이즈, PVDF 필터)를 연결한 주사기를 통과시켜 멸균한 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 20 ㎕ (파클리탁셀 200 ㎍)를 실험예 2에서 흑색종을 접종한 후 5일 경과한 쥐의 왼쪽 발바닥 접종부위에 주사하였다. 이때 대조군으로 흑색종 동물모델에 리피오돌/트리카프릴린 (100:1 부피비)만을 20 ㎕ 주입한 군과 아무 처리도 하지 않은 군을 이용하여 비교하였다. 흑색종의 크기변화를 측정하고 그 결과를 도 6에서 보여준다. 아무 처리도 하지 않은 군에서는 흑색종이 접종후 18일 경과 후부터 커지기 시작하고, 리피오돌/트리카프릴린 만을 처리한 군의 겨우 22일 경과 후부터 커지기 시작한 반면, 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린을 처리한 군에서는 흑색종이 전혀 자라지 않으므로 본 발명의 조성물이 항암효과가 있음을 보여준다. 20 μl of sterile paclitaxel / lipiodol / tricapryline (200 μg of paclitaxel) after passing through a syringe connected to a syringe filter (200 μm pore size, PVDF filter) prepared in Example 9 Five days after the inoculation, the rats were injected into the left plantar inoculation site. At this time, 20 μl of Lipiodol / Tricapryline (100: 1 volume ratio) was injected into the melanoma animal model as a control group and no treatment group was used. The size change of melanoma is measured and the result is shown in FIG. In the no-treated group, melanoma began to increase after 18 days of inoculation, and started to increase after only 22 days of the group treated with Lipiodol / Tricaprilin, whereas Paclitaxel / Lipiodol / Tricaprilin was treated. In the group melanoma does not grow at all shows that the composition of the present invention has an anticancer effect.
실시예 12. Example 12.
파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 조성 주입 후 흑색종의 크기변화율 측정Size change rate of melanoma after injection of paclitaxel / lipiodol / tricapryline composition
실시예 9에서 제조한 후 시린지 필터 (200 ㎛ 포어 사이즈, PVDF 필터)를 연결한 주사기를 통과시켜 멸균한 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린 20 ㎕ (파클리탁셀 200 ㎍)를 실험예 2에서 흑색종을 접종한 후 5일 경과한 쥐의 왼쪽 발바닥 접종부위에 주사하였다. 이때 대조군으로 아무 처리도 하지 않은 군을 이용하여 비교하였다. 살아있는 개체수를 측정하고 그 결과를 도 7에서 보여준다. 아무 처리도 하지 않은 군에서는 접종후 약 20일 경과 후부터 쥐가 죽기시작하여 48일 경과시 모든 개체가 죽은 반면 (n=6), 파클리탁셀/리피오돌/트리카프릴린을 처리한 군에서는 모든 개체가 건강하게 생존해 있으므로 본 발명의 조성물이 항암효과가 있음을 보여준다. 20 μl of sterile paclitaxel / lipiodol / tricapryline (200 μg of paclitaxel) after passing through a syringe connected to a syringe filter (200 μm pore size, PVDF filter) prepared in Example 9 Five days after the inoculation, the rats were injected into the left plantar inoculation site. At this time, the comparison was made using the group not treated with any control. The live population is measured and the results are shown in FIG. In the untreated group, mice began to die about 20 days after inoculation and all individuals died at 48 days (n = 6), whereas in the group treated with paclitaxel / lipiodol / tricapryline, all individuals It shows that the composition of the present invention has an anticancer effect because it survives healthy.
본 발명의 파클리탁셀 유성조성물은 균일한 단일계의 점성이 높은 액상으로서 이제까지 정맥주사제로만 사용되어온 파클리탁셀의 이용 형태를 고형암의 동맥색전술 등에도 이용할 수 있도록 확장시킨 새로운 투여 제형을 제시하는 것이다. 본 발명의 파클리탁셀/유성조영제 조성물은 제조 및 멸균이 용이하고 기존의 아드리아마이신/리피오돌 제형보다 구성성분 및 조성자체가 물리화학적으로 안정하므로, 실제 고형암에 대한 동맥색전술에 이용시, 안정한 조성을 시술후까지 유지함은 물론 상온에서 적어도 60일간 안정성을 유지할 수 있다. 또한 파클리탁셀의 침전형성을 저해하는 물질을 추가적으로 첨가하여 파클리탁셀의 용해도를 높이고 적어도 200일 이상 안정성을 유지할 수 있다. The paclitaxel oil composition of the present invention is to propose a new dosage form in which the use of paclitaxel, which has been used only as an intravenous injection, is extended to be used for arterial embolization of solid cancer. The paclitaxel / oil-based contrast composition of the present invention is easy to manufacture and sterilize, and its components and composition are physicochemically stable than conventional adriamycin / lipiodol formulations, and thus, when used in arterial embolization for solid cancers, a stable composition is maintained until after surgery. Of course, it can maintain stability for at least 60 days at room temperature. In addition, it is possible to increase the solubility of paclitaxel and maintain stability for at least 200 days by additionally adding a substance that inhibits the formation of paclitaxel.
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