KR100522371B1

KR100522371B1 - 레이저 유발 표면형광 검출 방법

Info

Publication number: KR100522371B1
Application number: KR10-2003-0004602A
Authority: KR
Inventors: 남기봉; 최의열; 정동석; 정진하; 문정대; 김영민; 이근우; 안재순; 정영의; 박상열; 김현미
Original assignee: 바디텍메드 주식회사
Priority date: 2002-01-23
Filing date: 2003-01-23
Publication date: 2005-10-18
Also published as: KR20030064321A

Abstract

본 발명은, 표면에 형광물질이 표지된 시료를 타원반사경의 제 1 초점의 위치에 위치시키는 단계와; 레이저로부터 조사된 빛을 여기필터 및 타원반사경에 형성된 구멍을 통하여 시료에 표지된 형광물질에 입사하여, 시료에 표지된 형광 물질로부터의 형광 및 입사광의 산란광을 타원반사경의 제 1 초점에 집속시키는 단계와; 형광 및 입사광의 산란광을 타원반사경으로 반사시켜 상기 타원반사경의 제 2 초점에 집속시키는 단계와; 제 2 초점에 위치된 공간 필터에 의하여 타원반사경에서 반사되는 형광 및 산란광으로부터 노이즈를 제거하는 단계와; 공간 필터에 의해 노이즈가 제거된 형광 및 입사광의 산란광을 평행광학계를 이용하여 평행 광으로 변환시키는 한편, 형광 필터를 이용하여 산란광을 제거하고 순수 형광성분만 광 검출기로 검출하는 단계를 포함하는 레이저 유발 형광 검출 방법에 관한 것이다.

Description

레이저 유발 표면형광 검출 방법{A Method for the Detection of Laser-induced Epifluorescence}

본 발명은 일반적으로 레이저-유도된 형광(fluorescence)의 검출 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 불투명 시료의 표면에 부착된 형광체에 레이저나 적절한 파장의 빛을 조사할 때 나오는 효과적으로 포집하여 검출하는 방법에 관한 것이다.

현재 DNA 칩 또는 멤브레인을 이용한 단백질 칩에 대해 형광을 검출하는 방법으로는 레이저 유발 형광 검출법(laser-induced fluorescing detection)이 대표적으로 이용되고 있다. 레이저 유발 형광 검출법은 형광물질이 흡수하는 파장의 들뜸 광원으로 레이저를 사용하여 형광물질을 여기 상태(excited state)로 만들고 다시 바닥 상태(ground state)로 이동되면서 나오는 형광의 세기를 측정하는 것이며 각 형광의 세기로부터 농도를 알 수 있다. 이러한 방법으로 DNA 또는 단백질 시료에 형광물질을 붙여 정량 분석을 할 수 있다.

레이저 유발 형광 검출법을 이용하여 형광을 검출하는 장치중에서 가장 많이 사용되는 것은 공초점 레이저 스캐닝 장치(confocal laser scanning system)이다. 이 장치는 레이저를 광원으로 이용하고 표본으로부터 발산된 형광 신호를 별도의 특수 검출기인 광전자증배기 튜브(photomultiplier tube)로 받아들인 후 디지털 영상으로 변환시키는 것이다. 즉, 레이저 광원을 사용하여 표본에 표지한 형광물질에 적합한 파장대의 빛만을 조사(excitation)하여 형광의 발광(emission)을 유도한다. 이때 빛살 가르개(beam splitter) 등 다양한 종류의 필터를 선택할 수 있으며, 최종적으로 공간필터(pinhole)를 검출기 앞에 위치시켜 초점이 맞는 상만을 받아 볼 수 있도록 구성되어 있다(도 1). 이러한 공초점 레이저 스캐닝 장치는 표본 제작시에 적당한 두께의 커버 글라스를 사용하고, 적합한 대물렌즈를 선택하며, 마운팅 매질(mounting medium)의 올바른 선택 등을 요구하는 한편 초점이 일치하지 않는 부분(out of focus)의 상을 제거할 수 있는 중대한 장점이 있다.

현재의 레이저 유발 형광 검출 장치 및 기술에 있어서, 형광 검출 장치의 감도(sensitivity)를 향상시키는 것은 중요하다. 형광 검출 장치의 감도를 향상시키는데 있어 주요 요소중 하나는 최대의 형광 복사선을 포집하는 한편 배경(background)(즉, 포집된 여기 광의 밝기)를 최소화하는 것이다.

따라서, 레이저 유발 형광 검출 장치에서 최적의 검출 한계를 얻기 위해서는 형광물질이 표지된 시료로부터 발생된 형광을 높은 효율로 포집해야하는 한편 검출 장치에 도달하는 여기 광(excitation light)의 분산을 최소화하여야 한다. 실제로, 고도의 조리개수 대물렌즈(high numerical aperture objectives) 또는 반사경(reflector)이 형광을 포집하기 위해 사용되고 있다. 렌즈에 의한 빛의 포집은 렌즈의 조리개수 및 주변 매질의 굴절계수와 관계가 있다. 이러한 관계는 아래 방정식으로 나타낼 수 있다:

상기식에서 F는 조리개수를 나타내고 NA는 수치구경을 나타낸다. 큰 조리개수는 작은 수치구경에 상응하며, 1의 포집 효율은 렌즈가 시료에 의해 발산된 빛 모두를 포집함을 내포한다.

보통, 광 포집 렌즈는 굴절계수가 1인 대기중에 내포되어 있다. 상기 방정식으로부터 고도의 포집 효율을 얻기 위해서는 아주 작은 조리개수의 렌즈가 필요하다는 것을 알 수 있다. 조리개수가 1인 렌즈는 시료에 의해 발산된 빛의 50%를 포집한다. 비록 액체 매질(오일, 물 등)에 침지된 렌즈가 1보다 작은 조리개수를 가질 수 있을 지라도 이러한 렌즈는 침지 유액의 굴절계수가 보통 렌즈 재질의 굴절계수보다 크기 때문에 발산된 빛의 50% 미만을 포집한다. 또한, 상기 방정식에 따르면, 0.5의 조리개수를 갖고 대기에 내포된 렌즈는 발산된 빛의 7%만을 포집하는데 불과할 뿐만 아니라 실제로 조리개수가 0.5인 경우는 불가능하다.

통상적인 종래 기술로서, 발산된 형광 방사선을 포집하기 위해 광섬유를 갖거나 갖고 있지 않은 레이저 유발 형광 검출 장치에서 굴절 및/또는 반사 광학 포집기(refractive and/or reflective optical collector)가 사용된다. 그러나, 이들 포집기가 형광 빛을 포집하는 능력은 포집기의 최대 포집각(collection angle)에 의해 한계가 있다. 전형적인 고도의 포집기는 약 90°의 원뿔각을 갖는다. 이것은 레이저 유발 형광 검출 장치에서 수치구경 0.7 또는 14% 포집 효율에 상응한다.

Kaye 등에 1997년 3월 5일에 허여된 미국특허 제5,614,726호는 레이저 유발 형광 검출 장치를 기술하고 있다. 그러나, 이 장치에 의한 포집 효율은 6 내지 7%에 불과하다.

삭제

따라서, 본 발명의 목적은 측방 유동 검정 스트립 및 DNA 칩 또는 멤브레인을 이용한 단백질 칩과 같은 바이오칩의 표면형광에 대해서 보다 높은 형광 포집 효율을 갖고 증가된 형광 신호를 제공하는 개선된 새로운 레이저 유발 형광 검출 방법을 제공하는데 있다.

삭제

상기된 바와 같은 목적은, 표면에 형광물질이 표지된 시료를 타원반사경의 제 1 초점의 위치에 위치시키는 단계와; 레이저로부터 조사된 빛을 여기필터 및 상기 타원반사경에 형성된 구멍을 통하여 시료에 표지된 형광물질에 입사하여, 시료에 표지된 형광 물질로부터의 형광 및 입사광의 산란광을 상기 타원반사경의 제 1 초점에 집속시키는 단계와; 형광 및 입사광의 산란광을 상기 타원반사경으로 반사시켜 상기 타원반사경의 제 2 초점에 집속시키는 단계와; 상기 제 2 초점에 위치된 공간 필터에 의하여 타원반사경에서 반사되는 형광 및 산란광으로부터 노이즈를 제거하는 단계와; 상기 공간 필터에 의해 노이즈가 제거된 형광 및 입사광의 산란광을 평행광학계를 이용하여 평행 광으로 변환시키는 한편, 형광 필터를 이용하여 산란광을 제거하고 순수 형광성분만 광 검출기로 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 레이저 유발 표면형광 검출 방법에 의해 달성될 수 있다.이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 명세서에 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다.먼저, 본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 방법에 있어서, 표면형광(epifluorescence)은 크로마토그래피를 이용한 측방 유동 검정 스트립 (lateral flow assay strip)뿐만 아니라 DNA 칩 또는 멤브레인을 이용한 단백질 칩과 같은 바이오칩(biochip)에 고정되는 분석물로부터 발광되는 형광을 가리키며, 표면은 레이저 빛이 통과할 수 없는 불투과성이다.

통상적인 측방 유동 검정 스트립은 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항체-항원 반응이 일어나는 전개용 스트립(주로, 니트로셀룰로스), 그리고 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드(absorption pad)로 되어 있다. 구체적으로는, 측방 유동 검정 스트립은 지지대(support)상의 접착층을 매개로 하여 지지대의 한쪽 말단에 분석물을 함유한 액체 시료가 투입되는 시료 패드가 부착되어 있고 이어서 지지대의 반대쪽 말단 방향으로 결합체 방출 패드, 크로마토그래피 매질 및 흡수 패드가 부착되어 있다. 결합체 방출 패드상에는 액체 시료가 모세관 현상에 의해 크로마토그래피로 이동하면서 액체 시료중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성할 수 있는 형광물질-표지된 1차 탐지자가 비고정적으로 흡착되어 있다. 크로마토그래피 매질상에는 형광물질-표지된 1차 탐지자와 동일하거나 상이한 2차 포획자가 보통 한 선(시험선)으로 화학적 결합에 의해 매질상에 고정되도록 분주되어 있으며, 이러한 한 선의 2차 포획자는 액체 시료 및 상기 결합체 방출 패드에서 형성된 결합체가 크로마토그래피로 이동해 오면서 화학적으로 반응하여 그 결합체를 포획한다. 나머지 미반응된 물질 및 액체 시료는 계속해서 크로마토그래피로 이동하면서 지지대의 말단에 부착되어 있는 흡수 패드로 흡수된다. 분석물의 양은 결합체의 양으로서 결정되며, 이러한 결합체의 양은 크로마토그래피 매질상에 포획 고정된 결합체의 형광물질 세기를 사전에 1차 탐지자와 동일한 형광물질로 표지되고 1차 탐지자 및 2차 포획자와 상이한 3차 탐지자와 3차 탐지자와 상이하고 비표지된 4차 포획자가 반응하여 형성된 결합체에 대해 표준 형광물질 세기를 측정 정량화하고 이를 상대적인 값으로 산정함으로써 결정된다.

DNA 칩이란 기계 자동화와 전자 제어 등을 이용하여 적게는 수백 개부터 많게는 수십만 개의 DNA를 아주 작은 공간에 집어 넣을 수 있게 만든 것이다. 다시 말해 DNA 칩은 유리, 실리콘, 혹은 나일론 등의 재질로 된 작은 기판 위에 DNA를 결합시켜 유전자 발현 양상, 유전자 결합, 단백질 분포, 반응 양상 등을 분석해 낼 수 있는 생물학적 마이크로칩을 말한다. DNA 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA 칩과 올리고뉴클레오타이드 칩으로 나누어질 수 있다. cDNA 칩에는 최소한 500 bp 이상의 유전자(full-length open leading frame)가 붙여져 있고, 올리고뉴클레오타이드 칩에는 약 15 내지 25개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 붙여져 있다.

표적 DNA를 이용한 DNA 칩의 제작 기술은 크게 기판 위에 올리고뉴클레오타이드를 직접 합성하는 방식과 합성 또는 증폭된 표적 DNA를 기판 위에 심는 방식으로 나뉜다. 전자는 반도체 칩을 제작하는 방식에서 유래된 포토리소그래픽 (photolithographic) 방법을 이용한 것으로 고밀도 집적이 가능하지만 표적 DNA의 길이가 20개 뉴클레오타이드 내외로 제한된다. 질병의 진단 혹은 일염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)의 연구 등에 적합하다. 후자인 DNA 칩은 차등 유전자 발현(differential gene expression)의 연구에 많이 응용되며 폴리 L-라이신, 아민 혹은 알데하이드로 코팅된 슬라이드 위에 표적 DNA를 심는다.

DNA를 플로팅(plotting)하는 방법은 압전형(piezoelectric) 방법을 이용한 마이크로피펫팅법(micropipetting) 등이 있으며 스폿(spot)의 직경 크기는 100㎛ 내외가 되며 약 1000 spots/㎠ 정도가 심어진다.

DNA 칩에서 핵산을 표지 하는 방법은 여러 가지가 있으나 크게 직접 표지(direct labeling)와 간접 표지(indirect labeling)로 나눌 수 있다. 직접 표지는 DNA 칩에서 하이브리드화(hybridization)될 핵산의 탐침(probe) 혼합물에 형광물질(fluorescent tags)을 직접 끼워 넣는데, 이는 효소합성(enzyme synthesis)에 의해 이뤄진다. 직접 표지는 간단하면서도 강한 하이브리드화 신호를 제공하며, 비슷한 화학구조를 가지고 있으나 흡광과 발광 파장이 다른 여러 염료(dye)들을 사용할 수 있다. 이러한 사실은 특히 비교분석에서 중요한데, 구조가 많이 다른 형광물질은 차등 발현 실험에서 잘못된 결과를 생성할 수 있기 때문이다. 직접 표지는 정밀도(precision)를 최대화하기 위해 비교분석에서 여러 형광물질을 사용해야 하는데 DNA 칩에서는 시아닌(cyanine)과 알렉사 유사체(alexa analogs)처럼 화학적으로 관계 있는 염료들을 사용한다. 간접 표지는 핵산 탐침 혼합물에 에피토프를 끼어 넣는다. 에피토프로 꼬리 달린 핵산을 하이브리드화시킨 후에 DNA 칩은 에피토프에 결합되어 있는 단백질을 염색시킨다. 이 염색된 단백질 덕택으로 형광신호를 얻을 수 있게 된다. 간접표지의 일반적인 예는 바이오틴(biotin) 에피토프와 형광물질 스트렙타비딘-파이코에리쓰린(fluorescent streptavidin-phycoerythrin)의 결합을 이용하는 것이다. 간접 표지의 가장 큰 장점은 직접 표지보다 신호증폭이 10 내지 100배 정도 크게 된다는 것이다. 주된 단점은 수행하기가 어렵다는 점과 에피토프가 다른 표지 효율을 가지고 있고 단백질의 결합력 때문에 비교분석에서의 정밀도가 좀 떨어진다는 점이다.

가장 널리 사용되는 DNA 칩 포맷은 1×3 인치 현미경 슬라이드(microscope slide)이다. 표면적(거의 19 ㎠)이 넓어 마이크로스폿팅(microspotting)과 잉크-제팅(ink-jetting) 기술을 사용하여 만들 수 있는 어레이(array) 수가 100,000개 이상이고 유리 자체의 고유 형광의 세기가 작기 때문에 매우 유리하다. 또한, 아피메르틱스(Affymertix)의 카세트가 DNA 칩 포맷으로 널리 사용되고 있다. 아피메르틱스의 카세트는 유리 칩을 보호하기 위해 플라스틱 틀로 감싸여 있다.

본 발명에 따라 DNA 칩으로 상당히 많은 양의 데이터를 생산해 낼 수 있고, 이러한 데이터 산출은 생물정보학(bioinforamtics)의 기반으로 작용하게 된다. 데이터는 모델링(modeling)에 적용되어 전산생물학(computational biology)을 통한 여러 가지 정보를 얻게 한다. DNA 칩으로부터 정량화 되어 얻어지는 데이터들은 여러 방법에 의해 나타나게 되는데 가장 대표적인 예가 산점도(scatter plot)이다. 두 색깔(two-color) 실험으로 얻어지는 모든 데이터 점들이 비율(ratio)과 신호의 세기에 대한 함수로 표현되고, 이 비율이 1.0이 되는 대각선을 기준으로 이보다 크면 대각선 위에, 작으면 아래에 점이 찍히게 된다. 이 방법은 수천 개의 유전자 발현 프로 파일과 같은 커다란 데이터베이스를 보는 수단으로 사용된다. 보통은 컴퓨터 화면에서 마우스로 한 점을 클릭하면 DNA 칩에서 그 점에 해당하는 유전자 서열에 대한 정보를 보여준다.

본 발명의 다른 양태로서, 멤브레인을 이용한 단백질 칩으로부터 발산되는 표면형광을 검출한다. 이러한 단백질 칩은 제법 또는 응용에 있어서 당업자에게 잘 알려져 있음은 물론 많은 과학전문지 및 특허 문헌에 다양하게 기술되어 있다. 예를 들면, 단백질 칩은 소형의 기판 위에 여러 질환에 관계되는 단백질에 대한 항체를 집적하고, 환자의 체액으로부터 준비한 분석물을 생화학적 마커로 하여 그 질환의 존재여부 및 진행상태를 조기에 진단한다. 상기 소형의 기판은 통상의 유리판 위에 아비딘(avidin) 등을 이용하여 원하는 단백질을 고착할 수 있다. 다른 방도로서, 폴리스티렌(polystylene)을 기판 재질로 사용할 수 있으며 이러한 폴리스틸렌 기판은 단백질 부착이 용이하고 부착효율도 좋다. 이외에도 기판에 부착하는 단백질의 성질에 따라 폴리염화비닐(polyvinylchloride) 및 폴리프로필렌 (polypropylene)도 사용할 수 있다.

상술한 기판에 단백질을 집적하는 공정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면 폴리스티렌 기판을 사용하는 경우 가로 1.5cm, 세로 1.5cm 크기의 폴리스틸렌 기판에 가로 1mm, 세로 2mm, 깊이 1.5 mm의 홈(groove) 8개를 1mm 간격으로 나란히 형성한다. 분석하고자 하는 단백질을 각각의 홈에 대략 직경 400nm, 간격 500nm로 하여 집적할 경우, 1cm 길이에 10가지 종류의 단백질을 집적하는 것이 가능하다. 즉, 1개의 기판에 80여 종류의 단백질을 집적할 수가 있다.

본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 방법에서 분석물 시료를 표지하는 형광물질은 흡수파장과 방출파장이 20 nm 이상의 차이가 나는 것을 사용할 수 있는데, 대표적인 형광물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 형광 입자, 퀀텀 도트(quantum dot), 란타니드 킬레이트(lanthanide chelate)(예, 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu) 및 테르븀(Tb)) 및 플루오레슨스(fluorescence)(예, FITC, 로다민 그린, 티아디카르보시아닌, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594 및 Alexa 647)가 포함된다. DNA를 검출하는데 사용되는 바람직한 형광물질은 Cy3와 Cy5이다. 일반적으로 형광의 세기는 여기 광(excitation light)의 세기에 직접 비례한다.

본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 방법에 사용되는 레이저는 대표적으로 He-Ne 레이저 및 다이오드 레이저가 포함된다. He-Ne 레이저의 예로는 National Research Laboratory of Metrology(NRLM), agency of Industrial Science and Technology(AIST), ministry of International Trade and Industry(MITI)에서 개발한 소형의 휴대용 정밀 요도드-안정화 He-Ne 레이저(Model NEO-92SI) 및 모델 05 LYR 173(캘리포니아 어어빈 소재 Melles Griot 제품)을 들 수 있다. 다이오드 레이저는 He-Ne 레이저보다 컴팩트하고 보다 정밀하며 적외선 또는 적색광 다이오드 레이저가 있다.

본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 장치는 레이저, 여기필터(exciter filter), 타원반사경 또는 구면경, 표면형광이 발광되는 시료 제어 수단, 공간필터, 평행광학계, 형광필터 및 광검출기로 구성되며 이러한 구성에 의한 표면형광의 포집 원리는 도 2 및 도 3을 참고로 하고 도 1에 도시된 종래의 형광 검출 장치를 비교하여 이하에서 구체적으로 설명될 것이다.

도 2는 본 발명에 따라 타원반사경의 제1초점 의 위치에 배치된 시료에 입사광선을 투사하여 형광을 발생시키고, 형광 및 입사광의 산란광이 제2초점에 집속된 후, 형광을 평행광으로 가공하여 표면형광을 검출하는 장치를 보여준다. 레이저는 특정 형광단의 여기 밴드 최대치와 일치하는 파장을 방출한다. 한 가지 양태로서, 레이저(21)은 형광물질 표지 Alexa의 흡수 최대치에 근접하는 파장 594 nm에서 방출하는 2 mW He-Ne 레이저이다. 예를 들면, He-Ne 레이저 모델 05 LYR 173(캘리포니아 어어빈 소재 Melles Griot 제품)을 레이저로 사용할 수 있다. 레이저(21)의 빛은 여기 필터(22)를 통과하고 여기 필터와 시료제어 수단(24)사이에 배치되어 있는 타원반사경(23)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 이때 레이저의 빛이 여기 필터(22)를 지나 타원반사경(23)의 중심에 형성된 구멍을 적절히 통과할 수 있도록 레이저, 여기 필터와 타원반사경은 일렬로 배치되는 것이 바람직하다. 타원반사경을 통과한 빛은 시료 제어수단(24)에 고정되어 있는 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩) 면에 적절한 크기로 집속된다. 시료는 빛이 최적으로 집속될 수 있도록 제어 수단에 의하여 위아래 혹은 전후(지면에 수직한 방향)로 이동하여 위치를 변경할 수 있다. 이 집속점은 타원반사경(23)의 제1초점에 위치하고 있다. 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경(23)에 의해 반사되어 타원거울의 제2초점으로서 공간필터(25)로 집속된다. 공간필터는 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈를 제거하는 작용을 한다. 그러나, 공간필터는 사용하지 않을 수 있다. 공간필터를 통과한 빛은 평행광학계(collimator)(26)에 의하여 평행광으로 변형된다. 만일 공간필터를 사용하지 않은 경우는 타원거울의 제2초점이 평행광학계가 되어 이곳으로 집속되고 바로 평행광으로 변형된다. 평행광학계를 지나면서 형성된 평행광은 형광필터(28)를 지나면서 산란광은 걸러지고 순수한 형광성분만이 광검출기(27)로 입사한다. 광검출기(27)로 입사된 형광은 이의 세기(fluorescence intensity)를 표시하는 신호로 컴퓨터(29)로 전송되어 분석 처리된다.

도 3은 본 발명에 따라 타원반사경 대신에 구면경을 사용하여 입사광이 집속된 시료의 형광을 구면경의 영상점에 집속시키고 이를 평행광으로 가공하여 표면형광을 검출하는 장치를 보여준다. 따라서, 도 3의 장치에 의해 시료의 표면형광을 검출하는 과정은 상기된 도 2의 장치와 동일하다. 레이저의 빛은 여기 필터 (32)를 통과하고 여기 필터와 시료제어 수단(34)사이에 배치되어 있는 구면경(33)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 이때 레이저의 빛이 여기 필터(32)를 지나 구면경(33)의 구멍을 적절히 통과할 수 있도록 레이저, 여기 필터와 타원반사경은 일렬로 나란히 배치되는 것이 바람직하다. 타원반사경을 통과한 빛은 시료 제어수단(34)에 고정되어 있는 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩) 면에 적절한 크기로 집속된다. 시료는 빛이 최적으로 집속될 수 있도록 제어 수단에 의하여 위아래 혹은 전후(지면에 수직한 방향)로 이동하여 위치를 변경할 수 있다. 이 집속점은 구면경(33)의 제1초점에 위치하고 있다. 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 구면경(33)에 의해 반사되어 타원거울의 제2초점으로서 공간필터(35)로 집속된다. 공간필터는 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈를 제거하는 작용을 한다. 이 장치 또한 공간필터는 사용하지 않을 수 있다. 공간필터를 통과한 빛은 평행광학계(36)에 의하여 평행광으로 변형된다. 만일 공간필터를 사용하지 않은 경우는 타원거울의 제2초점이 평행광학계가 되어 이곳으로 집속되고 바로 평행광으로 변형된다. 평행광학계를 지나면서 형성된 평행광은 형광필터(38)를 지나면서 산란광은 걸러지고 순수한 형광성분만이 광검출기(37)로 입사한다. 광검출기(37)로 입사된 형광은 이의 세기를 표시하는 신호로 컴퓨터(39)로 전송되어 분석 처리된다.

대조적으로, 도 1에 도시된 종래의 형광 검출 장치에 따르면, 레이저의 빛이 조리개(13)을 통과하여 빛살 가르개(16)에 의해 반사되어 렌즈(15)를 통해 시료 면에 집속된다. 시료(14) 면에서 발산된 형광은 다시 렌즈(15)를 통해 검출기의 조리개(12)로 집속되어 광검출기(17)로 입사한다. 이 경우에 있어서, 시료(14) 면에서 발산된 형광은 대기로 노출되어 있으므로 다량의 형광이 렌즈를 통과하지 않고 대기로 발산되어 소실될 수 있다. 반면에, 본 발명에 따른 형광 검출 장치는 시료(24, 34) 면이 타원반사경(23) 또는 구면경(33)의 오목 부분내에 위치함으로써 형광이 거의 전부 대기로 발산되지 않고 타원반사경(23) 또는 구면경(33)에 반사되므로 소실될 확률이 극히 낮다. 게다가, 도 1에 도시된 종래의 형광 검출 장치에서는 발산된 형광이 검출기 조리개(12)를 통해 광검출기(17)로 직접 입사되므로 일부 형광이 소실된 가능성이 있다. 그러나, 본 발명에 따른 형광 검출 장치는 평행광학계(26, 36)를 사용하기 때문에 타원반사경(23) 또는 구면경(33)을 통해 반사되는 형광이 평형광학계(26, 36)를 통해 평행광으로 변형되기 때문에 형광이 광검출기(27, 37)로 입사하는 과정에서 소실될 가능성은 매우 적다.

요컨대, 본 발명에 따른 레이저 유발 표면형광 검출 장치는 표면형광 포집시 렌즈 대신에 시료의 전방 표면을 완전히 덮는 반사경계를 사용하기 때문에 방출된 형광의 97% 이상이 반사경에서 검출기 쪽으로 반사된다(입사광이 들어오는 구멍에 의한 손실 제외). 이중 시료 및 시료 제어수단이 일부 반사광을 차폐하기 때문에 이로 인한 손실을 제외한 나머지는 모두 검출광학계에 도달한다. 반사경의 직경이 10cm, 시료 제어수단의 크기가 2 x 10cm인 경우 제어수단에 의한 손실율은 20% 수준이다(이 손실에는 입사광 인입구에 의한 반사형광 손실분도 포함된다). 따라서, 본 발명에서는 기존 렌즈식 형광 포집 장치가 가진 10% 미만의 형광 포집 효율을 80% 이상으로 향상시키는 효과를 기대할 수 있다. 당업자는 본 발명으로부터 시료 제어수단이 작을수록 형광 포집 효율이 높아질 수 있음을 이해할 것이다.

도 7은 본 발명의 한 양태로서의 시료 제어수단의 구성도를 도시한 것이다. 시료 받침대(41)는 이의 상부에서 시료(44)(스트립 또는 칩상에 마운팅된 상태)의 한쪽 면을 삽입하여 고정할 수 있도록 되어 있고 하부에는 톱니바퀴가 구비되어 이송수단(42)과 맞물려 있어 이송수단(42)이 모터의 구동에 의해 회전함에 따라 이송수단과 나란히 설치되어 있는 가이드를 따라 전후로 이동할 수 있다.

일반적으로 측정하고자 하는 물질의 혈액 중(마이크로시스틴은 환경물질이므로 혈액이 아니라 수질 내에 존재함) 컷오프는 다음의 표 1에 수록된 바와 같다.

표 1

마커	단위	컷오프
CEA	ng/ml	〈5
AFP	ng/ml	〈15
PSA	ng/ml	〈4
B2M	ng/ml	〈2
NSE	ng/ml	〈15
CYFRA21-1	ng/ml	〈3.5
마이오글로빈	ng/ml	〈70
CK-MB	ng/ml	〈3
cTnI	ng/ml	〈1
cTnT	pg/ml	〈60
BNP	pg/ml	〈100
마이크로시스틴	pg/ml	〈300

본 발명에 따른 레이저 유발 표면형광 검출 장치는 분석물의 최저 검출 한계 농도가 pg/ml까지 측정되는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

<실시예 1>

분석물을 검출하는데 사용하기 위한 모노클로날 항체의 제조 방법

(1) 배양액의 준비

둘베코 변형 이글 배지(Dulecco's Modified Eagle's Media, DMEM) 분말을 900ml의 DDW(deionized distilled water)에 녹이고 형성된 용액에 3.7g의 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)을 가한 다음 pH를 6.9로 조정하였다. 이 배양액을 0.45㎛ 크기의 필터를 사용하여 무균화시키고 이 용액을 불완전(incomplete) DMEM이라 하며 450ml의 불완전 DMEM에 10%가 되도록 송아지 혈청(Bovine Calf Serum)과 항생제 페니실린과 스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가하여 완전 (complete) DMEM으로 만들었다. 이 완전 DMEM에 5ml의 100X HT을 첨가하여 HT(하이포크산틴 + 티미딘) 배양액, 5ml의 100X HAT(하이포크산틴 + 아미노프테린 + 티미딘)을 첨가하여 HAT 배양액을 준비하였다.

(2) 항원 준비와 주사

처음 주사할 경우 정제된 효소 단백질 용액(50㎍)에 같은 부피(주로 0.3ml)의 완전 프로인드 보조제(Complete Freund's Adjuvant)를 넣고 30초 동안 음파처리(sonication)한 후 이 용액을 BALB/c 생쥐에 각각 0.4ml씩 주사하였다. 첫 번째 주사 후 3주 경과하여 단백질 용액을 불완전 프로인드 보조제(Incomplete Freund's Adjuvant)와 섞은 후 주사하는 데 이 추가접종(booster injection)을 2 또는 3차례 반복하고 최종 면역시에는 세포 융합 실험 3 내지 4일 전에 보조제 없이 단백질만 주사하였다. 실험에 사용되는 생쥐는 암수 구별 없이 모두 생후 6 내지 8주정도 되는 BALB/c를 사용하였다.

(3) 지지세포(Feeder Cell)의 준비

지지세포는 융합 실험하기 하루나 이틀 전에 준비하는 데 생후 10주 이상 된 생쥐를 치사시킨 후 복부 껍질을 아주 조심스럽게 벗기고 5ml의 11.6% 설탕용액을 복강 속으로 주사하였다. 1 내지 2분 후 주사기를 사용하여 복강 내의 주사된 설탕용액 3ml 이상을 회수하여 원심분리(2,000rpm, 3분)한 후 지지세포를 30ml의 HAT 배양액에 녹인 다음 5개의 96웰 평판에 한 방울씩 분주하였다. 만약 생쥐가 작으면 두 마리로부터 복강 세포를 채취하였고, 만약 적혈구가 들어있을 경우 다시 준비하였다.

(4) 지라세포의 준비

항원을 면역시킨 쥐를 치사시킨 후 지라를 무균 상태에서 취한 다음 10ml의 불완전 DMEM이 들어있는 배양접시에 옮긴 후 가는 핀셋을 사용하여 조직을 파쇄하고 지라 세포를 배양액내로 방출시켰다. 이 세포들을 15ml 튜브로 옮겨 큰 조직이나 파쇄되지 않은 세포들을 2분 동안 가라앉힌 후 상층 부분에서 5ml을 다시 채취하였다. 이를 원심 분리하여 모은 다음 상등액을 제거하고 준비된 골수종 세포 (myeloma)와 합치기 위해 3ml의 불완전 DMEM에 녹여 놓았다. 한번 세포융합 실험을 하기 위해 3×10⁷ 개의 지라세포를 준비하였다.

(5) 골수종 세포의 준비

세포융합 실험 5일전 질소탱크에 얼려져 있던 SP2/O Ag14 골수종 세포를 꺼내어 녹인 후 완전 DMEM을 매우 천천히 첨가하여 회복시켰다. 이를 원심분리하여 가라앉은 세포를 다시 10ml의 완전 DMEM에 녹여 37℃ CO₂ 배양기에서 이틀 간격으로 계대배양하였다. 세포융합 실험 때까지 5×10⁷개의 골수종 세포를 준비하여 이를 사용하였다.

(6) 세포융합

준비된 지라세포와 골수종 세포를 섞고 원심분리(2,000rpm, 3분)하여 얻은 세포에 20ml의 불완전 DME을 첨가하여 한번 씻고 상등액을 완전히 제거하였다. 이후의 세포융합 반응은 손으로 감싸 37℃를 유지해주면서 실시하는데 밑 부분에 가라앉은 세포들은 손가락으로 튜브를 치면서 완전히 부수고 1ml의 50% PEG(폴리에틸렌글리콜)용액을 한 방울씩 천천히 1분동안 가하고 90초 동안 흔들어 세포융합 과정을 실시하였다. 정확하게 첫 PEG용액 방울을 넣기 시작한 후 2분 30초 후에 불완전 DME를 첨가하면서 정지시키는데 PEG용액에 의해 세포막이 입을 수 있는 삼투압 충격을 막기 위해서 처음 1ml의 불완전 DME는 1분 동안에, 다음 2ml을 1분 그리고 다음 3ml을 1분 등의 방법으로 전체 20ml의 불완전 DME를 서서히 튜브에 첨가하였다. 이런 방식으로 융합된 세포들을 원심분리시키고 20ml의 HAT 배양액을 가해 남아있는 PEG를 씻어준 후 얻은 세포들을 65ml의 HAT배양액에 녹여 한 방울씩 지지세포가 들어있는 96웰 평판에 두 방울씩 분주하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포융합 후 3일째에 세 방울의 HT 배양액을 각 웰에 새로 첨가하고 다시 3일 간격으로 새로운 HT 배양액으로 갈아주면서 세포의 성장을 현미경으로 확인하였다. 대개 융합 4일 후면 하이브로도마 콜로니(hybridoma colony)가 보이기 시작하고 7일경부터 하이브리도마 스크리닝을 시작하였다. 배양 상등액 200㎕를 400㎕의 PBS가 담긴 24웰 평판으로 옮긴 다음 ELISA 방법에서 양성 반응을 보이는 웰의 세포를 1ml의 HT 배양액이 들어있는 새로운 24웰 평판으로 옮겨 3 내지 4일 더 배양하였다. 이 배양액 500㎕를 2ml의 PBS가 들어 있는 15ml 튜브에 넣어 웨스턴 블롯 분석(western blotting)을 통해 다시 양성 반응을 보이는 세포를 5ml의 HT 배양액이 담긴 6웰 평판으로 옮겨 성장시킨 후 신속하게 얼리고 하이브리도마 세포주를 클로닝하는 방법으로 제한 희석(limiting dilution)을 실시하였다.

(7) 하이브리도마 세포의 동결 방법

10ml의 배양 플라스크에서 단층으로(confluent) 자란 세포를 원심분리하여 얻은 후 가라앉은 세포들을 1ml의 동결 배지(Freezing Media)(90% 송아지 혈청, 10% DMSO)에 녹인 후 동결 바이알에 넣고 스티로폼(styrofoam) 상자에 담아 -70℃에서 서서히 온도가 떨어지게 하였다. 2시간이 지난 후 빠르게 액체질소 탱크로 옮겨 보관하는데 이곳에서 거의 영구적으로 보관할 수 있다.

(8) 하이브리도마 세포의 제한 희석

하나의 에피토프에 반응하는 항체를 만들어 내는 세포를 골라내기 위해 제한 희석 방법을 수행하였다. 먼저 로그 단계(log phase)에서 자라고 있는 하이브리도마 세포의 숫자를 너이바우어 세포 계수기(Neubauer Cell Counter)로 계산한 다음 연속 희석으로 1ml당 15개 세포가 포함될 수 있게, 즉 한 방울에 하나의 세포가 들어가게 한 다음 하루나 이틀 전에 준비된 지지세포가 담긴 96웰 평판에 한 방울씩 옮겼다. 3일 마다 배양액을 계속 갈아주고 5일째 역상 현미경(inverted microscope)으로 관찰하여 단일 콜로니가 보이는 웰을 표시하였다. 이후, 14일째 24웰로 옮겨 계속 배양한 다음 ELISA를 통해 탐색한 후 원하는 항체를 만들어내는 하이브리도마 세포를 취해 얼려 보관한다.

(9) 복수액(Ascites Fluid)의 생성

다량의 단일 클론항체가 필요할 경우 500㎕의 프리스탄(pristane)을 미리 주사한 BALB/c 생쥐에 9일이 경과한 후 원하는 항체를 만들어내는 하이브리도마 세포를 1×10⁷개 정도 주사하였다. 이후 10 내지 15일 후 적당하게 복부가 비대해진 생쥐를 마취시키거나 치사시킨 후 주사기를 사용하여 복수를 채취하고 원심분리(4℃, 15,000rpm, 10분)하여 세포와 조직을 제거하고 이 상등액을 나누어 -70℃에서 얼려 보관하고 이후 프로테인 A 컬럼(Protein A column)을 이용하여 복수에 포함되어 있는 IgG를 분리하였다.

(10) 각 분석물에 대한 모노클로날 항체의 비교

	PSA	Free PSA	AFP	CEA
항원원	정액^(a)	정액^(a)	양수^(b)	사람 체액^(c)
포획항체	32c5(IgG2a)	83c1(IgG1)	15c3(IgG2a)	34(IgG1)
탐지항체	1c1(IgG2a)	1c1(IgG2a)	20c4(IgG1)	17(IgG2a)
피복완충액	인산염 완충액(0.1M, pH 7.4)	트리스 완충액(0.15M, pH8.0)	보락스(Borax) 완충액(0.2M. pH 8.3)	탄산염 완충액(0.5M, pH 9.5)
표지완충액	PBS	PBS	PBS	PBS

(a) Scripps로부터 입수

(b) RDI로부터 입수

(c) Biodesign으로부터 입수

<실시예 2>

(1) 단백질-형광물질 결합체 제조

측정하고자 하는 물질이나 또는 그 물질에 대한 마우스 단일클론 항체에 신호 발생원인 형광물질을 다음과 같은 방법으로 중합하여 시험에 사용하였다. 형광물질 결합에 사용될 단백질은 95% 이상의 고순도로 정제된 것을 사용하였으며, 농도는 1mg/ml 이상의 농도가 좋은 결합비율을 보여 주었다. 형광물질과의 반응을 용이하게 하기 위하여 정제된 단백질을 암모니아와 아민 이온이 들어 있지 않은 완충용액으로(0.1M 중탄산나트륨, pH 8.5) 4℃ 냉장실에서 12-24시간 동안 투석하였다. 투석된 단백질은 사용하기 전까지 -20℃이하 냉동고에 보관하였다. 완충용액에서 투석된 단백질에 분말로 된 Alexa 647 형광물질(Molecular Probes, USA)을 직접 첨가하여 천천히 섞어 준 후 4℃ 냉장고에서 1-2시간 동안 교반기를 사용하여 반응시켰다.

(2) 단백질-형광물질 결합체의 정제

세파덱스(Sephadex) G-25를 충전한 분배 컬럼을 사용하여 단백질-형광물질 중합체와 반응하지 않고 남아있는 여분의 형광물질을 제거하였으며, 정제 완충용액은 0.1M 중탄산나트륨(pH 8.5)를 사용하였다. 정제된 단백질-형광물질 중합체는 사용하기 전까지 냉장 또는 -20℃이하 냉동고에 보관하였다.

(3) 니트로셀룰로스 막의 단백질 고정화

주사기 펌프에 연결된 미세 분주기(GESIME, Biodot Dispenser)를 이용하여 단백질을 가는 선 또는 점의 형태로 농도와 분주량을 달리하여 니트로셀룰로스 막 위에 분주하였다. 분주한 이후에 온도는 25℃, 습도는 35~50%로 유지되는 제습 장치 안에서 분주된 단백질을 고정화하였다. 이어 단백질의 안정화와 반응물 사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% Tween 20, 1% 수크로즈, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다. 위의 안정액 성분 중 BSA는 젤라틴으로 트윈 20은 트리톤 X-100으로 수크로즈는 트레할로즈 (trehalose)로 PVA(polyvinylalcohol)는 PEG(polyethyleneglycol) 또는 PVP (polyvinylpyrrolidone)로 각각 대체하여 사용하기도 하였다. 처리된 막 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 건조된 막은 마찬가지로 25℃, RH 35 내지 50%가 유지되는 보관용기 안에서 사용 전까지 보관하였다.

(4) 샘플패드의 전처리

니트로셀룰로스 막을 통한 용액 성분들의 이동을 용이하게 하며, 또한 반응의 민감도를 유지하고 단백질-형광물질 중합체와 시료 사이의 비특이적 반응에 의한 시험결과의 오류를 막기 위하여 샘플패드를 전처리 하였다.

샘플패드(2.5 X 30 cm)를 전처리 용액(20mM 트리스-Cl, 0.1% 트리톤 X-100, 0.05% NaN_3,pH 8.5)에 충분히 적셔 10분간 평형화 시켰다. 전혈을 시료로 사용할 경우에는 다른 전처리 용액( PBS, 10mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.05% NaN₃, pH 7.4)을 사용하였다. 이어 샘플패드의 과도한 용액을 제거하고 열에 의한 샘플패드의 변형을 막기 위해 50℃ 내지 60℃의 적절한 온도에서 진공 건조하였다. 단백질-형광물질 결합체의 변성을 최소화하기 위하여 동결건조방법을 택하였다. 준비된 패드는 위의 막과 동일한 조건의 보관용기에서 사용하기 전까지 보관하였다.

(5) 단백질-형광물질 결합체 패드 제조

검출하고자 하는 물질의 탐지자인 단백질-형광물질 결합체를 유리섬유질의 패드에 고정화하여 검출과정을 원스텝으로 단순화하였다. 단백질-형광물질 결합체를 희석용 완충용액(PBS, 0.1% 젤라틴, 0.1% 트윈 20, pH 7.4)에 1/1000, 1/500, 1/100의 비율로 각각 희석하였다. 일반적으로, 위의 혼합물은 유리섬유에 충분히 적셔 5분 동안 상온에서 평형화시켰다. 다른 방법으로는 혼합물이 유리섬유의 표면에서 불균등하게 재분배되는 현상을 막고 소요되는 혼합물의 양을 줄이기 위해, 적시는 방법 대신 미세 분주기를 사용하여 10, 15, 20ul/cm의 양으로 각각 분주하였다. 단백질-형광물질 결합체 패드는 세 가지 방법으로 건조하였다. 첫째, 단백질 성분의 안정성을 고려하여 40℃ 이하의 온도로 진공 건조 시켰고, 둘째, 제습 장치안에서 실온 건조하였다. 세 번째는 첫 번째 방법보다는 다소 시간이 걸리지만, 단백질 성분의 변성을 최소화하기 위해 동결건조기를 사용하였다. 준비된 결합체 패드는 위의 막과 동일한 조건의 보관용기에서 사용하기 전까지 보관하였다.

(6) 이중 선의 분주

고정하고자 하는 각각의 단백질을 PBS 완충액에 1, 2mg/ml로 희석하고 분주기 (Bio Dot Dispenser)를 사용하여 0.8 내지 1mm 폭으로 NC 막 위에 분주하였다. 위의 방법대로 NC 막을 안정액으로 처리하고 건조시켜서 시료 패드와 흡수 패드 등을 포개어 붙인 후 4mm 폭으로 잘랐다. 최종 스트립의 크기는 4×75mm이며, 각 단백질은 분주량을 0.75, 0.88 ul/cm의 두 가지 경우로 나누어 분주 되었다.

(7) 형광 측정에 의한 분석물의 정량 분석

도 2에 도시된 바와 같이 제작된 본 발명의 레이저 유발 형광 검출장치를 이용하여 상기 제조된 측방 유동 검정 스트립에 대해 측정하여 PSA를 정량 분석하였다. 최저 검출 한계 농도는 분석물의 농도가 pg/ml까지 측정되는 것으로 관찰되었다. 이의 결과는 도 4에 기록되어 있다.

<실시예 3>

도 2에 도시된 바와 같이 작제된 본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치와 대조를 위해 종래의 레이저 유발 형광 검출 스캐너 Scan Life(GSI 제품)를 사용하여 형광을 측정하고 형광 세기를 서로 비교하였다.

분석물 PSA(전립선특이항원, prostate specific antigen)를 각각의 농도 별로 준비하여 단백질 형광물질과 혼합하여 섞은 후 실시예 2에서와 같이 측방 유동 검정 스트립에 적용하여 상기 종래의 스캐너로 이미지화하였다. 동일한 방법 및 조건으로 제조된 측방 유동 검정 스트립을 본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치로 이미지화하였다. 이미지화된 데이터는 관련된 프로그램을 사용하여 수치화 하였다. 이의 결과는 도 5에 기록되어 있다. 도 5의 기록으로부터, 본 발명에 따른 레이저 유발 형광 검출 장치와 종래의 형광 검출 스캐너 모두 분석물의 농도에 따라서 증가된 형광 세기를 보였으나, 같은 분석물에 대해 본 발명에 따른 레이저 유발 형광 검출 장치를 이용하여 측정된 형광 세기는 종래의 형광 검출 스캐너를 이용하여 측정된 형광 세기에 비하여 현저히 높음을 알 수 있다.

<실시예 4>

기판으로 폴리스티렌을 사용하여 단백질 칩을 제작하였다. 실시예 1에서 제조된 각각의 항체 단백질을 중탄산나트륨 50mM (pH9.6), 트리스-Cl 20mM (pH8.5), 인산염 완충액 10mM (pH7.2)과 혼합하여 상기 기판에 분주하고, 실온에서 2시간동안 반응시켜 고착시켰다. 반응을 마친 기판은 2회 이상 증류수로 세척한 후에, 차단 완충액(blocking buffer)(0.1% 소혈장알부민(BSA), 0.05% 트윈 20을 포함한 인산염완충액)을 분주하고, 실온에서 10분간 반응시켜 단백질 칩을 제작하였다.

도 2에 도시된 바와 같이 제작된 본 발명의 레이저 유발 형광 검출 장치를 이용하여 상기 제조된 항체 단백질이 일차원으로 배열된 단백질 칩에 의한 형광을 검출하였다. 이의 결과는 도 6에 기록되어 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따른 레이저 유발 표면형광 검출 방법에 의하면 80% 이상의 형광 포집 효율이 제공됨으로써 분석물의 최저 검출 한계 농도가 pg/ml까지 측정 가능하다.

도 1은 종래 기술에 따른 레이저 유발 형광 검출 장치의 구성도이다.

도 2는 본 발명에 따른 타원반사경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도이다.

도 3은 본 발명에 따른 구면경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도이다.

도 4는 본 발명에 따른 타원반사경 레이저 유발 형광 검출 장치를 이용하여 분석물의 표면항원에 대해 측정한 최저 검출 한계 농도를 보여주는 그래프이다(A: 4ng/ml, B:400pg/ml, C:40pg/ml).

도 5는 본 발명에 따른 타원반사경 레이저 유발 형광 검출 장치(A)와 종래의 형광 검출 스캐너(B)를 이용하여 측정된 PSA(전립선특이항원, prostate specific antigen) 표면형광 세기의 결과를 비교하는 그래프이다.

도 6은 본 발명에 따른 타원반사경 레이저 유발 형광 검출 장치를 이용하여 일차원으로 배열된 단백질 칩에 의한 형광을 검출한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 7은 본 발명에 따른 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성 요소인 시료의 제어 수단의 구성도이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

장치(10, 20, 30) 레이저(11, 21, 31)

검출기 조리개(12) 광원 조리개(13)

대물렌즈(15) 시료(14, 24, 34, 44)

빛살 가르개(16) 광검출기(17, 27, 37)

여기필터(22, 32) 타원반사경(23)

구면경(33) 공간필터(25, 35)

평행광학계(26, 36) 형광필터(28, 38)

컴퓨터(29, 39) 시료제어수단(40)

시료받침대(41) 이송수단(42)

가이드(43) 모터(45)

Claims

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표면에 형광물질이 표지된 시료를 타원반사경의 제 1 초점의 위치에 위치시키는 단계와;

레이저로부터 조사된 빛을 여기필터 및 상기 타원반사경에 형성된 구멍을 통하여 시료에 표지된 형광물질에 입사하여, 시료에 표지된 형광 물질로부터의 형광 및 입사광의 산란광을 상기 타원반사경의 제 1 초점에 집속시키는 단계와;

형광 및 입사광의 산란광을 상기 타원반사경으로 반사시켜 상기 타원반사경의 제 2 초점에 집속시키는 단계와;

상기 제 2 초점에 위치된 공간 필터에 의하여 타원반사경에서 반사되는 형광 및 산란광으로부터 노이즈를 제거하는 단계와;

상기 공간 필터에 의해 노이즈가 제거된 형광 및 입사광의 산란광을 평행광학계를 이용하여 평행 광으로 변환시키는 한편, 형광 필터를 이용하여 산란광을 제거하고 순수 형광성분만 광 검출기로 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 레이저 유발 표면형광 검출 방법.
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