KR100512019B1 - 사이클로스포린 ａ 또는 이의 유도체를 이용한 세포의노화를 억제하는 방법 및 배양배지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 이용하여 배양물에서 세포의 노화를 억제, 세포의 수명을 연장, 세포의 성장을 증대시키는 방법 및 배양배지에 관한 것이다.

Description

사이클로스포린 Ａ 또는 이의 유도체를 이용한 세포의 노화를 억제하는 방법 및 배양배지{Method And Culture Medium For Inhibiting Cell Aging Using Cyclosporin A Or Its Derivatives}

본 발명은 배양 세포의 노화를 억제하고/하거나 수명을 연장하는데 사용하기 위한 사이클로스포린 A (Cyclosporin A) 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 이용하여 배양물에서 세포의 노화를 억제, 세포의 수명을 연장, 세포의 성장을 증대, 세포의 생존력을 증대 및/또는 배양물에 세포를 적응시키는 방법 및 배양배지에 관한 것이다.

사람으로부터 분리한 세포를 체외 배양하면 일정한 회수의 세포분열을 한 후 더 이상 증식할 수 없는 상태가 되는데, 세포는 분열할 수 있는 한정된 능력을 가지고 있고, 일정한 회수의 세포분열 후 노화(senescence)라고 하는 비가역적인 비증식기(terminally non-dividing state)에 들어간다. 노화된 세포들은 더 이상의 성장을 멈추고 생리학적 세포성장 촉진물질(mitogen)의 자극이 있더라도 세포 주기의 S기(S phase)에 들어가지 않으며, 세포성장에 필요한 몇몇 유전자들의 발현이 억제된다. 그러나 노화된 세포들은 여전히 대사 활성을 유지하고 있으며, 일정 시기 동안은 단백질 또는 DNA 합성능력을 보유하고 있음이 보고되었다(Dimri G.D. et al., 9363-9367, 1995; Saunders N.A. et al., 46-54, 1993).

노화(organismic aging)의 근본적인 원인은 복제 노화(replicative senescence)의 현상에 있는 것으로 알려져 있다(Wantanabe Y. et al., 2025-2032, 1997). 복제 노화는 세포분열이 누적되어 일어나는 것으로, 이러한 현상은 단백질 및 RNA 합성과정에서 발생하는 불규칙적인 손상이나 변이의 축적 또는 유전적으로 프로그램화된 어떠한 과정에 의해 나타나는 것이라는 보고가 있다(Sugawara O. et al., 707-710, 1990). 이러한 보고는 증식이 '세포분열 시계' (Bodnor A.G. et al., 349-352, 1998)에 의해 제한된다는 것을 암시한다. 또한, 세포주기 조절 단백질(cell cycle regulatory proteins)과 항암 단백질(tumor repressors)이 상기 복제노화에 영향을 미친다는 보고가 있었는데, 정상(wild-type) p53 및 p21_WAF1/CIP1 단백질의 발현 수준의 증가가 몇몇 배양 세포의 증식 능력 상실을 유도하며 이로써 세포 노화의 원인이 됨이 확인된 바 있다(Brown J.P. et al., 831-834, 1997; Gallimore P.H.et al., ,763-771, 1997; Sugrue M. Mm. et al., 9648-9653, 1997).

노화된 세포들이 생체 내에 축적되고 이들 세포들로부터 발현되는 표현형이 변경됨으로써 여러 가지 노화와 관련된 병리의 원인이 된다고 추정되고 있다(Dimri G.D. et al., 9363-9367, 1995). 따라서, 세포의 노화를 억제하는 물질은 세포의 노화와 관련된 질환의 치료에 응용될 수 있을 뿐만 아니라 조직배양을 비롯하여 세포 이식과 같은 생물학, 의학 분야에서 다양하게 유용될 수 있음에 따라 최근에 많은 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명자들은 세포의 배양배지에 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 혼합하고 세포를 배양한 결과 세포의 성장 및 수명이 증대되고 또한 p53 유전자 발현에 의해 세포에 유도된 노화 진행 과정에서 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 세포의 노화를 억제한다는 사실을 발견하고, 이를 기초로 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 배양 배지에 혼합하여 배양물에서 세포의 노화를 억제하고, 세포의 수명을 연장하며, 세포의 성장을 증대시킴으로서 유용한 많은 세포를 확보할 수 있었다.

한 가지 관점으로서, 본 발명은 배양배지 중의 세포를, 세포 노화를 억제하기에 유효한 양의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에서 세포의 노화를 억제하는 방법을 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 배양배지 중의 세포를, 세포 수명을 연장시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에서 세포의 수명을 연장시키는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 배양배지 중의 세포를, 세포 성장을 증대시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에서 세포의 성장을 증대시키는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 배양배지 중의 세포를, 생존력을 증대시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에서 세포의 생존력을 증대시키는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 배양배지 중의 세포를, 배양물에 세포를 적응시키기에 유효한 양으로 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에 세포를 적응시키는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 세포의 노화를 억제하기에 유효한 양의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에서 세포의 노화를 억제하는데 유용한 세포 배양배지를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 세포 수명을 연장시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에서 세포의 수명을 연장시키는데 유용한 세포 배양배지를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 세포 성장을 증대시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에서 세포의 성장을 증대시키는데 유용한 세포 배양배지를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 세포 생존력을 증대시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에서 세포의 생존력을 연장시키는데 유용한 세포 배양배지를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 배양물에 세포를 적응시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에 세포를 적응시키는데 유용한 세포 배양배지를 제공한다.

본 발명은 배양물에서 세포의 노화를 억제, 세포의 수명을 연장, 세포의 성장을 증대, 세포의 생존력을 증대 및/또는 배양물에 세포를 적응시키는데 사용하기 위한 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체의 새로운 용도에 관한 것이다.

사이클로스포린 A는 생산 균주인 톨리포클라디움 인플라튬 (Tolypocladium inflatum)의 배양액으로부터 얻어지며, 11개의 아미노산으로 구성된, 분자량 1201, 조성식 C₆₂H₁₁₁N₁₁O₁₂의 환형 펩타이드이다. 사이클로스포린 A의 화학명은 사이클로[{(E)-(2S,3R,4R)-3-히드록시-4-메틸-2-(메틸아미노)-6-옥테노일)-L-2-아미노부티릴-N-메틸-글리실-N-메틸-L-로이실-L-발릴-N-메틸-L-로이실-L-알라닐-0-알라닐-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-로이실-N-메틸-L-발릴]로서 면역억제 능력이 매우 강하고 장기 이식시 거부반응 억제 및 자가 면역증 치료에 사용되고 있으며, 항 진균, 살충 및 소염 효과도 있는 것으로 알려져 있다[Borel J. F., Prog. Alergy, 38.9 (1986)]. 아래의 화학식은 여러 개의 N-메틸아미노산(N-methyl amino acid)과 8번 위치에 D-알라닌(D-alanine)을 갖는 11개의 아미노산으로 구성된 환형의 펩타이드인 사이클로스포린 A를 나타낸다:

사이클로스포린 A를 제조하는 방법에 관해서는 영국 특허 1,491,509와 미국특허 제4,117,118호 및 제4,215,199호에 곰팡이균의 종인 실린드로 카폰 루시둠 또는 톨리포클라디움 인플라튬의 발효에 의한 방법이 각각 기재되어 있다. 또한, 상기 특허에는 발효액으로부터 사이클로스포린 A를 회수하기 위한 여러 가지 방법이 포함되어 있다.

사이클로스포린 A는 지금까지 의학적으로 많은 관심을 모아왔다. 사이클로스포린 A에 대한 임상 연구의 첫 번째 분야는 면역 억제제로서의 연구인데, 특히 장기(organ)이식, 예컨대, 심장, 폐, 결합한 심-폐, 간, 신장, 췌장, 골수, 피부 및 각막이식, 그리고 특히, 타성(allogenic) 장기 이식 등의 수용자에 대한 적용에 관한 것이다. 이 분야에서 사이클로스포린 A는 대단한 성과와 좋은 평가를 받았다. 동시에, 각종 자기면역 질환 및 염증 상태, 특히 관절염 (예컨대, 류머토이드 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형 관절염) 및 류머티스성 질병 같은 자기면역 성분을 비롯한 병인을 지니는 염증 상태에 대한 사이클로스포린 A의 적용성은 높았고, 시험관 내(in vitro), 동물 모델 및 임상시험에서의 보고와 결과는 문헌에 널리 기재되어 있다. 지금까지, 사이클로스포린 A는 자기면역 혈액 질환 (예를 들면, 용혈성 빈혈, 무형성 빈혈, 순수 적세포 빈혈 및 특발성 혈소판 감소증), 전신성 낭창홍반, 다연골염, 부종성 경화증(sclerodoma), 베게너 과립교합증(Wegener granulamatosis), 피부근염, 만성활성간염, 중증성근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루(sprue), 자기면역 염증성 장 질환(예로, 궤양성 대장염 및 크론병), 내분비계 안질환, 그레이브즈병(안구돌출성 갑상선종), 유육종증, 다발성경화증, 일차담즙성 간경변증, 약년성 당뇨(당뇨증형태 I), 포도막염(전부와 후부), 건성 각결막염과 춘계 각결막염, 간질성 폐섬유증,건선 관절염 및 사구체신염(신증을 수반하거나 수반하지 않음, 예컨대 특발성 신증 또는 미세 병변 신장병증) 등에 치료가 제안되거나 또는 적용되어 왔다. 또 다른 연구에서는, 사이클로스포린 A는 말라리아, 콕시디오이데스증 및 주혈흡충증의 치료를 비롯한 가능한 용도와, 더욱 최근에는 종양 등에 있어서 항신생물 약제 내성을 소멸시키는 제제로서의 용도와 더불어 항기생충, 특히 항원생동물제로서 유망하게 이용 가능한 것으로 밝혀지고 있다.

최근에 사이클로스포린 A는 여러 종류의 세포에서 유도된 아폽토시스(apoptosis)를 억제하는 작용이 있는 것으로 밝혀져 왔다. 예를 들면, 문헌[Walter D.H., et al., Circulation 1998 Sep 22;98(12):1153-7]에는 사이클로스포린 A가 미토콘드리아로부터 시토크롬 C의 분비를 억제함으로써 사람 내피세포의 아폽토시스를 억제한다고 개시되어 있다. 문헌[Sugano N. et al., FEBS Lett 1999 Mar 26; 447(2-3):274-6]에는 사이클로스포린 A가 H₂O₂에 의해 유도된 사람 섬유아세포의 아폽토시스를 억제한다고 기술되어 있다. 문헌[Yerushalmi B. et al., Hepatology 2001 Mar; 33(3):616-26]은 사이클로스포린 A가 담즙산에 의해 유도된 랫트의 간세포 아폽토시스를 억제한다고 기술하고 있다.

보다 최근에는 상기 작용과 대조적으로, 사이클로스포린 A가 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 촉진하는 작용이 있는 것으로도 밝혀졌다. 예를 들면, 문헌[Nomura T. et al., Urol Res 2002 May; 30(2):102-11]은 택솔에 의해 유도된 사람 방광 암 세포의 아폽토시스를 사이클로스포린 A가 촉진하였음을 밝히고 있다.

그러나, 지금까지 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 배양 세포의 노화를 억제하거나, 배양 세포의 성장을 촉진하거나, 배양 세포의 수명을 연장하거나, 배양 세포의 생존력을 증대시키거나, 배양물에 세포를 적응시키는데 적용한 사례는 없다.

본 발명에서는 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체의 노화 억제효과를 알아보기 위하여 세포의 노화를 인위적으로 유도하였다. 본 발명자들은 p53 유전자를 발현시켜 노화를 유도하는 실험 시스템에 대하여 보고 한 바 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 94, 9648-9653, 1997). 이 시스템이 본 발명에 적용되었으며, 간략히 설명하면, EJ 방광암세포에 p53 유전자를 발현하는 아데노바이러스를 감염시켜서 p53 유전자의 발현을 유도함으로써 EJ 방광암세포를 노화시키는 것이다. 본 발명에 따른 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체의 노화 억제에 관한 시험으로서, 세포에 p53-아데노바이러스를 감염시켜 사람의 방광암 세포주 EJ를 노화시키고, 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 첨가하여 배양한 후, 세포의 형태 및 노화의 생화학적인 지표인 SA-β-gal(갈락토시다제) 활성을 조사한 결과, 배양액에 첨가한 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체의 농도에 의존하여 p53에 의해 유도된 세포 노화가 억제되는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 세포의 분열에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 하였다. 즉, 세포의 연속 배양 시에 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 세포의 분열에 미치는 효과를 알아보는 실험을 하였는데, 이러한 실험은 동일한 종(토끼)의 다른 개체에서도 실시하였으며, 세포 분열이 왕성하게 일어나는 어린 토끼 및 세포 분열이 잘 일어나지 않는 늙은 토끼에서도 실시하였다. 이러한 실험결과들로부터 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체는 어린 동물의 세포에서 뿐 아니라 늙은 동물의 세포에서도 노화 억제 효과를 나타내는 것을 관찰하였다.

이와 같은 실험 결과들을 기초로 하여 본 발명자들은 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 세포의 노화를 방지하고, 세포의 수명을 연장하며, 세포의 성장을 증대시키는 것으로 결론을 내릴 수 있었다.

본 발명에 있어서, 세포노화는 세포가 정해진 수의 세포분열을 한 후 더 이상 분열하지 않고 비가역적으로 세포성장을 정지한 상태로 정의된다. 노화된 세포는 이 상태를 수개월에서 수년을 유지하며, DNA를 합성할 수 없으나 세포의 대사활동은 활발히 이루어진다. 노화된 세포는 세포 모양이 납작해지고 크기가 커지는 형태학적 특성을 나타낸다.

세포노화를 설명하는 다양한 가설이 제기되어 왔으나 현재 학계에서 활발하게 연구되고 있는 것은 활성화산소설과 유전자 프로그램설이다. 대사과정에서 발생하는 활성화산소(free radical)를 제거하는 능력이 불충분하여 생기는 세포의 손상이 오랜 시간동안 축적되어 세포가 노화된다는 것과 유전자에 내재된 프로그램에 의하여 노화 과정이 진행된다는 가설이다. 유전자 프로그램성의 일부로서 텔로미이어 가설이 많이 연구되고 있다. 사람의 텔로미터(telometer)는 TTAGGG 염기서열이 반복된 구조로 되어있다. DNA 합성효소는 5'->3' 방향으로만 합성이 가능하며, DNA합성은 100∼200개 염기의 RNA로부터 시작하여 합성이 끝난 후 제거되므로, DNA는 복제할 때마다 DNA의 양쪽 끝의 RNA크기만큼 짧아지게 된다. 따라서, 텔로미터의 길이에 의하여 세포분열 횟수가 정해진다는 것이다. 세포노화 프로그램이 파괴되어있는 암세포의 약 80%는 텔로미어를 합성하는 텔로메라제라는 효소를 합성하는 것으로 알려져 있다. 노화에 따른 세포의 변화는 여러 가지로 나타나는 것으로 알려져 있는데 이러한 변화에 관하여 간략히 나열하여 설명하면 다음과 같다:

1. 게놈 구조의 변화

복제된 DNA는 딸세포에 똑같이 분리된다. 세포 분열 횟수가 증가됨에 따라 DNA의 양이 비대칭적으로 분배되는 세포가 점점 증가한다.

2. 게놈 안정성의 변화

염색체 이상은 세포분열의 유무에 관계없이 노화된 세포의 특징이다. 그 빈도는 수명에 반비례한다. 분열하지 않는 세포에서는 세포의 나이에 따라 DNA 염기의 메틸화, 하이드록실화, 가교, 본쇄 파열(strand break)이 증가한다. 염기 변형의 증가는 염기 변형이 나이에 따라 축적될 경우와 염기 변형의 생성이 나이에 따라 증가하는 경우의 두 가지로 생각할 수 있다.

3. DNA 수선기능의 변화

DNA의 손상은 자외선 조사와 같은 외부적인 요인이나, 체온이나 에너지 생산 과정에서 발생하는 자유 라디칼(free radical)과 같은 내부적인 요인에 의하여 끊임없이 이루어진다. DNA 손상을 수선하는 기능은 개체의 생존에 매우 중요하다.

4. 유전자 발현의 변화

단백질의 활성이 변화하고, 이에 따라 세포의 대사과정이 변화하며, 이에 따라 장기의 기능에 영향을 미친다. 단백질 활성의 변화는 결국 유전자 발현의 변화에서 기인한다. 노화에 따른 유전자 발현은 노화의 특성상 그 변화가 매우 천천히 나타나고, 개체에 따라 변화의 정도가 다르며, 또한 조직마다 변화되는 유전자의 종류와 시기가 다르다.

5. 미토콘드리아의 변화

미토콘드리아는 산화적 인산화 과정을 통하여 세포의 생명유지에 필요한 에너지를 공급한다. 산소가 최종 전자 전달체이므로 산소 유리 래디칼이 생성된다. 산소 유리 래디칼은 미토콘드리아막에 손상을 주어, 안과 밖의 농도 차이를 이용하는 산화적 인산화과정을 저해함으로서 에너지 생산을 감소시킬 뿐 아니라, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이, 소실을 유도하여, 미토콘드리아 유전자 발현을 저해하여 손상이 복구되지 않게 한다. 미토콘드리아는 세포가 분열할 때 재생된다. 노화에 따른 미토콘드리아의 변화는 분열하지 않는 세포에서 더욱 두드러지게 나타나는 변화이다. 일반적으로 늙은 세포의 미토콘드리아는 젊은 세포에 비하여 크고 길죽하다. 노화된 미토콘드리아는 결국 라이소좀의 효소에 의하여 분해되어 노화색소인 리포푸신(lipofuscin)으로 변환된다.

6. 세포막의 변화

세포막은 세포 안과 밖, 세포 내에서 세포 소기관 사이의 영양분, 대사물질, 이온의 이동을 조절하며, 세포와 세포사이의 신호전달에 중요한 역할을 한다. 노화에 따른 가장 큰 변화는 세포막의 주요 성분인 지질의 변화이다. 노화에 따라 콜레스테롤:인지질의 비율이 증가되며 이는 막의 유동성의 변화를 초래한다. 세포막 단백질의 기능 변화, 즉 칼슘이동에 필요한 Ca:Mg-ATPase 활성은 나이에 따라 변화가 없으며 오히려 노화된 세포에서 증가하는 반면 Na:K-ATPase 활성은 감소된다. 특히 세포막 특이 효소인 5'-뉴클레아제 활성은 나이에 따라 감소한다.

7. 단백질 합성의 변화

단백질 합성은 노화에 따라 저하된다. 유전자 발현의 감소, mRNA가 핵에서 세포질로의 이동 저하, 합성기구의 성능저하 때문이다.

8. 카르보닐 기에 의한 변화

핵산, 단백질, 지질의 카로보닐 기에 의한 변화는 노화된 세포나 퇴행성 질환에서 나타나는 가장 흔한 변화이다.

사이클로스포린 A는 이의 아미노산의 종류에 따라 25개의 유도체가 있는 것으로 알려져 있는 한편[Traber R., HELVETICA ACTA, 70, 13, 1987], 면역억제제로서 유용한 사이클로스포린 A의 유도체가 많이 공개되었다. 예를 들면, 국제특허출원 공개번호 WO 98/28328, WO 98/28329 및 WO 98/28330은 3번 위치의 아미노산 잔기 사르코신이 수식된 사이클로스포린 A 유도체를 개시하고 있다. 또한, 미국특허 제5,318,901호 및 EP 0 414 632 B1는 8번 위치의 아미노산 잔기가 수식된 사이클로스포린 A의 유도체를 개시하였다. 또한, 국제특허출원 공개번호 WO 93/17039는 1번 위치의 아미노산 잔기가 수식된 이소-사이클로스포린 산 부가염을 제시하고 있다. 그러나, 이들 사이클로스포린 A의 유도체 모두는 면역억제제로서의 용도로만 알려져 있으며 본 발명에 따라 세포의 노화 억제제로서 사용될 수 있다는 언급은 전혀 없다.

사이클로스포린 A는 사이클로필린(cyclophilin)으로 불리는 단백질과 결합함으로서 마이토콘드리아 외막의 수용성을 조절하기도하고 세포질의 칼시뉴린(calcineurin)으로 불리는 탈인산화 단백질의 활성을 조절하는 것으로 알려졌다(Satoshi Matsuda, et al., Immunopharmacology 47 (2000) 119-125). 이에 따라, 사이클로스포린 A의 유도체 또한 사이클로필린과 결합하여 작용할 것이기 때문에, 상기 특허에 개시된 사이클로스포린 A의 모든 유도체는 본 발명에 따라 세포의 노화 억제에 적용될 수 있음은 명백하다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 사이클로스포린 A의 유도체는 하기 화학식(I), (II) 및 (III)으로 표시되는 사이클로스포린 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:

(I)

(II)

(III)

상기식에서,

Alk는 C_2-6 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 또는 C_3-6 사이클로알킬렌을 나타내고;

R은 (i) OH, (ii) 카르복실, (iii) 알콕시카르보닐, (iii) -NR₁R₂ (여기서, R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이하고, 수소 원자; 알킬; C_2-4 알케닐; C_3-6 사이클로알킬; 할로겐 원자, 알콕시, 알콕시카르보닐, 아미노, 알킬아미노 또는 디알킬아미노에 의해 임의로 치환되는 페닐; 벤질; 또는 1 내지 3개의 헤테로원자를 갖고 5 또는 6원 환의 포화 또는 불포화 헤테로사이클릴을 나타내거나; R₁ 및 R₂는 이들이 결합된 질소 원자와 함께 4 내지 6원 환의 포화 또는 불포화 헤테로사이클을 형성하고, 이때 헤테로사이클은 질소, 산소 및 황 원자중에서 선택된 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하고 알킬, 페닐 또는 벤질에 의해 임의로 치환된다) 또는 (iv) 화학식 -NR₃-(CH₂)_n-NR₁R₂(여기서, R₁ 및 R₂는 상기 정의된 바와 같고, R₃은 수소 원자 또는 알킬을 나타내고, n은 2 내지 4의 정수를 나타낸다)을 나타내고;

상기의 알킬 부분 또는 라디칼은 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다.

다른 양태로서, 본 발명에 따른 사이클로스포린 A의 유도체는 하기 화학식(IV)로 표시되는 사이클로스포린 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:

(IV)

상기식에서,

R은 (ⅰ) C_1-6알킬 또는 할로 치환된 C_1-6알킬; (ⅱ) 하이드록시-(C_1-6알킬);

(ⅲ) 티오-(C_1-6알킬); (ⅳ) 아미노-(C_1-6알킬); (ⅴ) (C_2-5-알콕시카르보닐아미노)-(C_1-4알킬); (ⅵ)니트로-(C_1-6알킬) 또는 시아노-(C_1-5알킬); (ⅶ) (C_1-6 알콕시)-(C_1-6알킬) 또는 (C_1-6알킬티오)-(C_1-6알킬); (ⅷ) (C_2-7알카노일옥시)-(C_1-6 알킬); (ⅸ) (C_2-7디아조알카노일옥시)-(C_1-6알킬); (ⅹ) 카르복시-(C_1-6알킬) 또는 (C_2-7 알콕시카르보닐)-(C_1-6알킬); (xi) 아미노카르보닐-(C_1-4알킬); (xii) 아미노카르보닐옥시-(C_1-4 알킬) 또는 아미노-(C_2-9알카노일옥시)-(C_1-4알킬); (xiii) 아미노-(C_2-9알콕시카르보닐)-(C_1-4알킬); (xiv) C_2-7알킬카르보닐; (xv) C_2-7 알콕시카르보닐; (xvi) C_1-6알킬티오 또는 하이드록시-(C_1-6알킬티오); (xvii) (C_1-6알콕시)-(C_1-6알킬티오); (xviii) (C_2-11알카노일옥시)-(C_2-4알킬티오); (xix) (C _2-11알카노일옥시)-(C_2-4알킬술피닐) 또는 -(C_2-4알킬술포닐); (xx) 아미노카르보닐옥시-(C_2-4 알킬티오) 또는 (C_2-11아미노알카노일옥시)-(C_2-4알킬티오); (xxi) 아미노카르보닐옥시-(C _2-4알킬술피닐) 또는 -(C_2-4알킬술포닐) 또는 (C_2-11아미노알카노일옥시)-(C_2-4 알킬-술피닐) 또는 -(C_2-4알킬-술포닐) (xxii) 아미노카르보닐; (xxiii) C_3-6알케닐, C_3-6 알키닐 또는 할로 치환된 C_3-6알케닐 또는 C_3-6알키닐; (xxiv) 하이드록시-(C_3-6알케닐); (xxv) 아릴-(C_1-6알킬) 또는 하이드록시 치환된 아릴-(C_1-6알킬); (xxvi) 아릴-(C_3-6 알케닐), 아릴-(C_3-6알키닐) 또는 하이드록시 치환된 아릴-(C_3-6알케닐)또는 아릴-(C _3-6알키닐); (xxvii) 아릴티오; (xxviii) 헤테로아릴티오; (xxix) 아릴-(C_2-5알콕시카르보닐아미노)-(C_1-4알킬); (xxx) 할로겐; (xxxi) 시아노; 또는 (xxxii) X-(CH₂-CH₂ -O)_n-CO-O-CH₂-(여기서, n은 1, 2 또는 3이고 X는 아미노이다)이고;

(xxiii), (xxiv) 및 (xxvi)으로 지정된 그룹에서 다중 결합은 완성된 잔기의 β탄소원자에 위치하지 않을 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명에 따른 사이클로스포린 A의 유도체는 사이클로스포린 A의 8번 위치 아미노산 잔기가 3-플루오로-D-알라닌 또는 2-듀테로-3-플루오로-D-알라닌이거나, 8번 위치 아미노산 잔기가 화학식 (여기서, R은 수소 또는 아실 잔기이다)로 표시되는 아미노산 잔기인 사이클로스포린 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.

본 발명에서 사이클로스포린 화합물은 무기 또는 유기 염기 부가 염 또는 무기 또는 유기 산 부가 염으로 전환될 수 있으며 이의 염 전환 방법은 유기 합성 및 제약 분야에 잘 알려져 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 17thed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p1418). 일반적으로, 염은 물이나 유기 용매 또는 이들 두 용매의 혼합물 중에서 적절한 염기 또는 산의 화학량론을 반응시켜 제조하는 것이다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용되는 염으로는 무기 염기와의 염, 유기 염기와의 염, 무기 산과의 염, 유기 산과의 염 및 염기성 또는 산성 아미노산과의 염이 포함된다. 무기 염기와의 염은 예를 들면 나트륨 염 및 칼륨 염과 같은 알카리 금속 염, 칼슘 염 및 마그네슘 염과 같은 알카리 토금속 염, 알루미늄 염 및 암모늄 염이 포함된다. 유기 염기와의 염으로는 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실아민 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민과의 염을 예로 들 수 있다. 무기 산과의 염의 예로는 염산, 붕산, 질산, 황산 및 인산과의 염을 들 수 있다. 유기 산과의 염을 예로 들면 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 석신산, 말산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산 또는 p-톨루엔설폰산과의 염이 포함된다. 염기성 아미노산과의 염은 예를 들면 아르기닌, 라이신 및 오르니틴이 포함된다. 산성 아미노산과의 염의 예로는 아스파트산 및 글루탐산과의 염을 들 수 있다.

한 양태로서, 사이클로스포린 염으로는 국제특허출원 공개번호 WO93/17039에 개시된 이소-사이클로스포린 산 부가염이 포함한다. 이의 산 부가염은 1번 위치의 아미노산 잔기가 하기 화학식(V)의 잔기로 표시된다:

(V)

상기식에서,

-x-y는 -CH=CH- (트랜스) 또는 -CH₂-CH₂-이고;

질소 원자의 양전하는 약제학적으로 허용되는 음이온 종과 반응하여 염을 형성한다.

본 발명에 따라 배양물에서 세포의 생활사를 정상화하기 위해, 즉 노화와 관련하여 세포의 성장 및 성숙을 최적화하고 배양에 대해 내성을 나타내는 세포를 적응시키기 위해, 세포는 노화가 개시되기 이전에 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 노출시키는 것이 바람직하다. 세포 노화는 점진적인 과정이기 때문에, 노화는 특정 세포 종류, 배양 조건 및 기타 요인에 따라 세포 생활사의 후기에 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 노출되더라도 저지될 수 있다. 그러나, 노화 세포는 의미상 생존력과 생산성이 떨어지는 것이므로 세포의 생활사에서 후기에 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 노출시키는 것은 바람직하다고 할 수 없으며, 최적의 결과를 얻기 위해서는 세포를 생활사의 초기에 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 노출시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라, 체외 배양 조건하에서 짧은 수명을 나타내는 세포, 예를 들면 2주 이하의 수명을 보이거나 적은 수의 세포분열을 한 후 노화되는 세포 또는 정상적인 생물학적 기능을 발휘하지 못하는 세포, 예를 들면 호르몬, 효소 또는 다른 생물학적 물질의 정상적인 생성이 생체내에서 억제된 세포는 이의 배양물을 적응량의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 초기에 노출시킴으로써, 바람직하게는 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 배양 배지와 혼합한 후 세포를 접종함으로써 배양물에 적응되도록 할 수 있다. 배양에 대해 내성을 나타내는 세포의 예로는 포유동물의 림프세포, 간세포, 췌장세포, 신경세포, 갑상선세포 및 흉선세포를 들 수 있다.

사이클로스포린 A 또는 이의 유도체는 임의로 혈청(예, 태아 또는 신생 송아지 혈청)과 같은 단백질 성분을 보충한 어떠한 공지된 배양 배지에도 첨가될 수 있다. 배지의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이글 기본 배지(Eagle's Basal Medium), 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimal Essential Medium), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), F10 배지 또는 F12 배지와 같은 햄스 배지(Ham's Medium), 푹스 N15 배지(Fuck's N15 Medium), 푹스 N16 배지, 웨이모쓰 MB 5421 배지(Waymoth's MB 5421 Medium), 맥코이스 5A 배지(McCoy's 5A Medium); RPMI 배지 1603, 1534 또는 1640, 레이보지츠 L15 배지(Leibovitz's L15 Medium), ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) CRCM 30, MCDB 배지 101, 102, 103 또는 104, CMRL 배지 1066 또는 1415 및 행크스 또는 얼스 평형 염 용액(Hank's or Earl's Balanced Salt Solution)을 들 수 있다. 본 분야에 알려진 바와 같이 사용되는 기본 배지는 공통적으로 필수 아미노산, 지방산 및 탄수화물을 포함하여 배양시 세포의 성장을 지지하는데 필수적인 영양분을 함유한다. 전형적으로 배지는 비타민, 보조인자, 미량원소 및 염과 같은 추가의 필수 성분을 동화가능한 양으로 함유한다. 또한, 세포의 생존, 기능, 생산 및/또는 증식에 필요한 화합물 및 인자를 포함하여 세포의 성장 및 유지를 촉진하는 기타 인자, 예를 들면 펩타이드성 호르몬 또는 스테로이드성 호르몬, 성장인자 및 항생물질이 포함된다. 배지는 또한 일반적으로 완충액, pH 조정제, pH 표지제 등을 포함한다.

본 발명에 따라 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 함유한 배지는 다양한 세포, 특히 진핵 세포에 적용할 수 있다. 본 발명의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체-함유 배지는 동물, 특히 사람 세포를 포함한 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 미생물(예, 박테리아, 진균, 원생동물) 및 기타 항생물질-생성 세포를 배양하는데 적합하다. 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체는 상기 세포의 배양을 위해 적응되는 다양한 조직 배양물중의 살아있는 세포의 생존력을 증대시키는데 유용하다. 배양물의 예로는 하이브리도마 세포주와 같은 클로닝된 세포의 배양물; 세포 산물, 특히 단백질 및 펩타이드(예, 호르몬, 효소 및 면역인자)의 생성을 위한 포유동물 세포, 특히 사람 세포의 배양물; 백신의 생성을 위한 바이러스 감염된 세포의 배양물; 식물 세포의 배양물, 예를 들면 분열조직 또는 유합조직의 배양물; 상처 치유를 위한 조직을 제공하는 상피 세포의 배양물; 및 치료 및 예방 용도로서의 내성 세포의 배양물이 포함된다. 또한 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체는 생물학적 기관 및 이식 조직의 생성 및 보존을 위해 적응된 배지에 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 배양에 유용한 특정 세포 종류로는 포유동물 조직, 기관 및 선(예, 뇌, 심장, 폐, 위, 장, 갑상선, 부신, 흉선, 부갑상선, 고환, 간, 신장, 방광, 비장, 췌장, 쓸개, 난소, 자궁, 전립선 및 피부); 생식세포(정자 및 난자); 림프절, 골, 연골 및 간질 세포; 및 면역세포, 대식세포, 림프구, 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 혈액세포가 포함된다. 추가의 세포 종류로는 식물의 줄기, 잎, 화분 및 씨장 세포; 상기된 미생물 및 바이러스; 및 곤충 조직, 기관 및 선으로부터 유래된 세포가 포함된다.

본 발명에 따라 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 적용되는 배양 기술은 예를 들면 단층 또는 현탁배양에서 정박-의존 세포를 위한 고체 지지체의 사용을 포함한다. 고체 지지체로는 유리, 탄소, 셀룰로즈, 공동 섬유막 및 고체 기질 형태, 예를 들면 아가로즈 겔이 포함된다. 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체는 비드내에 속박되거나, 매트릭스에 포획되거나, 공유 결합될 수 있다. 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체는 일차 배양물, 연속 배양물, 이차 배양물, 동결 또는 건조 또는 동결건조 배양물과 같은 보존 배양물 및 캡슐화 세포에 유용하다. 배양물은 또한 통상적인 배지로부터 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 함유한 배지로 알려진 이전 기술에 의해 옮길 수 있다.

본 발명에 따라, 세포는 이들의 체외 배양을 촉진하는데 유효한 양으로, 예를 들면 비처리된 세포와 비교하여 측정했을 때 세포의 생존력 또는 수명을 유의적으로 증대시키거나, 세포의 생물량을 유의적으로 증가시키거나, 세포의 생물생산성을 유의적으로 증가시키는 양으로, 사이클로스포린 A로 처리한다. 시험관내 적용시, 세포 배양물(약 10⁵ 내지 약 10⁷개 세포/ml의 밀도를 기준으로 하여) ml당 약 1 내지 100 pg이 사용될 수 있다. 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체는 배양물에 필요에 따라, 일반적으로 2일 내지 4일에 한번 보충한다. 그러나, 목적하는 결과에 따라 보충 기간을 다양하게 바꿀 수 있으며 경우에 따라서는 주단위로 보충할 수 있다.

본 발명의 주요 과정에 대하여 좀더 구체적으로 설명한다.

A. 세포의 노화 유도 및 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 세포에 미치는 효과 측정

본 발명에서 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체에 의한 세포 노화의 억제, 세포의 수명의 연장, 세포의 성장을 증대, 세포 생존력의 증대 및/또는 배양물에 세포를 적응시키는 정도를 알아보기 위하여 실험 대상이 되는 세포로 각종 노화된 세포 또는 배양에 대해 내성을 나타내는 세포를 사용할 수 있다. 또한, 세포의 노화를 유도하여 사용할 수 있다.

본 발명의 세포의 노화는 p53유전자를 발현하는 아데노바이러스로 세포를 감염시키는 방법으로 수행한다. 이 방법은 본 발명자의 노화 유도 실험계를 따라 수행할 수 있다(Proc. Natl. Sci. USA. vol 94, 9648-9653). 구체적으로 설명하면, EJ 방광암 세포를 10% 소 태아 혈청이 함유된 DMEM의 배양액과 함께 배양 용기에서 배양한다. EJ 방광암 세포를 배양시킨 후에 p53-아데노바이러스를 첨가하여 세포를 감염시킨다.

일반적으로, 세포가 노화되면 형태학적으로 넓고 편편한 형태로 변하게 된다. 그 외에도 게놈 구조의 변화, 게놈 안정성의 변화, DNA 수선기능의 변화, 유전자 발현의 변화, 미토콘드리아의 변화, 세포막의 변화, 단백질 합성의 변화 또는 카르보닐기에 의한 변화 등이 일어나게 된다.

p53-아데노바이러스에 감염시킴과 동시에 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 첨가하여 배양한다. 일정 기간의 경과 후에 세포의 형태 및 노화의 생화학적인 지표인 SA-β-gal(갈락토시디아제)를 조사하여 세포의 노화 양상을 판단한다.

B. 세포의 분리 및 배양

사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 노화된 세포 또는 배양에 대해 내성을 나타내는 세포에 대한 작용을 알아보기 위하여, 실험 대상이 되는 세포가 분리되어 배양된다. 세포의 분리는 다양한 방법으로 생체 내(in vivo) 또는 배양배지(in vitro)로부터 분리될 수 있다. 체내 또는 배양배지에서 분리된 세포는 5% 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 넣어 인큐베이터에서 배양된다. 그 후 배양된 세포들을 원심분리하고, 10% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM 배지로 세척하고, 스트렙토마이신 또는 페니실린이 포함된 DMEM 배지에서 배양된다. 배양액은 3일에 한번씩 교체하고, 세포가 배양 용기의 바닥에 붙어서 성장하기 시작한 1일 후의 시점에 트립신-EDTA 용액으로 세포를 배양용기에서 분리하고, 세포 총수를 계산한다.

일정수의 세포를 새로운 배양용기에 넣고 배양한 후 배양 용기 바닥의 약 90% 정도의 컨플런스(confluence)를 나타내면 다시 트립신-EDTA 용액으로 세포를 분리한 후 세포 수를 측정하고, 다시 일정 수의 세포만을 배양 용기를 옮겨 계속 배양한다. 이 과정을 반복하면서 세포의 성장 곡선을 작성한다.

C. 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 첨가된 배양배지에서의 세포의 배양회수 및 세포의 수 측정

사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 노화된 세포 또는 배양에 대해 내성을 나타내는 세포에 대한 작용을 알아보기 위하여, 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체가 첨가된 배양배지에서의 세포의 수와 세포분열 횟수를 측정하여 세포의 수명과 노화의 변화를 알아본다.

먼저, 세포의 분리는 다양한 방법으로, 생체 내(in vivo) 또는 배양배지(in vitro)로부터 분리될 수 있다. 체내 또는 배양배지에서 분리된 세포는 5% 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 넣어 인큐베이터에서 배양된다. 그 후 배양된 세포들을 원심분리하고, 10% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM 배지로 세척하고, 스트렙토마이신 또는 페니실린이 포함된 DMEM 배지에서 배양된다. 배양액은 3일에 한번씩 교체하고, 세포가 배양 용기의 바닥에 붙어서 성장하기 시작하는 시점에 트립신-EDTA 용액으로 세포를 배양용기에서 분리하고, 세포 총수를 계산한다. 일정 수의 세포를 배양 용기에 넣고, 각각 다른 양의 0.01 내지 1 mM의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 첨가하고 배양액과 함께 배양한다.

일정 수의 세포가 성장하여 배양 용기의 약 90% 정도의 컨플런스(confluence)를 나타내면 다시 트립신-EDTA 용액으로 세포를 분리한 후 세포 수를 측정하고, 다시 일정 수의 세포만을 배양 용기를 옮겨 각각 다른 양의 0.01 내지 1 mM의 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체를 첨가하고 배양액과 함께 계속 배양한다. 이 과정을 반복하면서 각 배양용기에서의 배양전과 후의 세포수를 통하여 세포 성장 곡선을 작성하고 세포분열 횟수를 계산한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 예시하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것으로 이해되서는 안될 것이다.

<실시예 1>

p53 유전자 발현으로 유도된 세포노화에 대한 사이클로스포린 A의 세포 노화 억제 효능

사이클로스포린 A의 처리가 p53 유전자에 의해 유발된 노화를 억제하는지를 조사하였다.

먼저, 암 세포에 p53 유전자를 발현하는 아데노바이러스를 감염시켜 세포를 노화시키는 방법은 본 발명자의 노화 유도 실험계에 따랐다 (Proc. Natl. Sci. USA, vol 94, 9648-9653; oncogene Vol 20, 5818-5825). 즉, EJ 방광암 세포에 p53 유전자를 발현하는 아데노바이러스를 감염시켜 p53 유전자 발현을 유도하여 EJ 방광암세포를 4일 내지 6일 내에 급속히 노화시켰다. 500,000개의 EJ 세포를 10㎖의 배양액 (10%의 fetal bovine serum을 포함한 DMEM)과 함께 100mm의 배양 용기에 2일간 배양한 후, 약 5,000,000개의 p53-아데노바이러스를 감염시키고, 동시에 1μM의 사이클로스포린 A를 첨가하고 6일간 배양한 후 세포의 형태를 조사하고 또한 노화의 생화학적인 지표인 SA-β-갈락토시다제 활성을 조사하였다.

실험 결과, 사이클로스포린 A를 첨가하지 않고 배양한 세포는 p53 발현으로 노화세포에 특징적으로 나타나는 형태 즉, 넓고 편편한 형태로 변하였으나, 사이클로스포린 A를 첨가하여 배양한 세포의 형태는 큰 변화가 없었다 (도 1).

또한, 사이클로스포린 A를 첨가하지 않은 배양액에서 배양한 세포의 경우 55%의 세포가 SA-β-갈락토시다제 활성을 보이는 반면, 0.1, 0.5, 1.0μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 배양액에서 배양한 EJ 세포는 각각 50%, 18%, 10%의 세포만이 SA-β-갈락토시다제 활성을 나타내었다 (도 2).

이상과 같이, 세포의 형태 및 노화의 생화학적인 지표인 SA-β-갈락토시다제 활성을 측정한 결과, 배양액에 첨가한 사이클로스포린 A의 농도에 의존하여 p53에 의하여 유도된 세포 노화가 억제되는 것을 알 수 있었다.

<실시예 2>

사이클로스포린 A가 연골세포의 성장에 미치는 영향

사이클로스포린 A가 노화를 억제하여 정상 세포의 수명을 연장시키고, 체외 배양계에서 세포의 분열 회수를 증가시키는지를 조사하였다.

2주령의 어린 뉴질랜드 흰 토끼(New Zealand white rabbit)의 연골 조각(cartilage slices)을 효소분해 반응시켜 관절 연골 세포(articular chondrocyte)를 얻었다. 효소 분해반응은 멸균상태의 연골 조각(cartilage slices)을 0.2% 콜라게나제 타입 Ⅱ(collagenase type II) (381 U/μg)을 포함한 5% 혈청 포함-DMEM(serum contained DMEM)배지에 넣고, 37℃, 이산화탄소(CO₂₎ 인큐베이터(incubator)에서 6-7 시간 동안 수행하였으며, 이 반응에 의해 분리된 단일 세포(single cell)들은 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻었다. 얻어진 세포들을 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM 배지로 한번 세척 후, 50μg/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 50 units/㎖ 페니실린(penicilin) (Gibco-BRL)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양액은 3일에 한번씩 교체하였다. 세포가 완전히 배양 용기의 바닥에 붙어서 성장하기 시작하는 시점(약 3일에서 6일 후)에, 1 ㎖의 트립신(trypsin)-EDTA 용액으로 세포를 배양 용기에서 분리하고, 세포의 총수를 계산하였다.

500,000개의 세포를 60mm의 배양 용기에 넣고, 0.1, 0.5, 1 μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 6 ㎖의 배양액과 함께 배양하였다. 세포가 성장하여 60 mm의 배양 용기에 약 90%정도의 컨플런스(confluence)를 나타내면 다시 1 ㎖의 트립신(trypsin)-EDTA용액으로 세포를 분리한 후, 세포 수를 측정하고 다시 500,000개의 세포를 60mm의 배양 용기 (사이클로스포린 A 첨가 5 ㎖의 배양액)에 넣고 배양하였다. 이 과정을 반복하여 연골 세포의 성장 곡선을 작성하였다 (도 3).

실험 결과, 도 3 및 도 4에서 보여주는 것처럼 사이클로스포린 A를 첨가하지 않는 배지의 연골세포(대조군)는 약 8번의 세포분열을 거친 후 더 이상 증식하지 않았다. 세포의 총수는 1.44 X 10⁸이었다. 그러나, 0.5μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 배양액에서 성장한 연골세포는 약 14번의 세포분열을 하였으며, 세포의 총수는 9.0268 X 10⁹ (대조군의 62.7배)이었다. 또한, 0.1μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 배양액에서 성장한 연골세포는 약 13.3번의 세포분열을 하였으며, 세포의 총수는 4.9049 X 10⁹ (대조군의 34.1배)이었으며, 1.0μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 배양액에서 성장한 연골세포는 약 8.6번의 세포분열을 하였으며, 세포의 총수는 1.967 X 10⁸ (대조군의 1.4배)이었다.

한편, 도 5 및 6은 2 주령된 다른 토끼의 관절에서 분리한 연골세포를 이용하여 상기와 동일한 실험을 독립적으로 수행하여 얻어진 결과를 나타낸 것이다. 그 결과는 도 3 및 4의 결과와 유사한 양상을 보였다. 즉, 사이클로스포린 A를 첨가하지 않는 배지의 연골 세포(대조군)는 약 8번의 세포분열을 거친 후 더 이상 증식하지 않았다. 세포의 총수는 1.298 X 10⁷이었다. 그러나, 0.1μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 배양액에서 성장한 연골세포는 약 13번의 세포분열을 하였으며, 세포의 총수는 3.9891 X 10⁸ (대조군의 30.7배)이었다. 또한, 0.5μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 배양액에서 성장한 연골세포는 약 11.7번의 세포분열을 하였으며, 세포의 총수는 1.64 X 10⁸ (대조군의 12.7배)이었으며, 1.0μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 배양액에서 성장한 연골세포는 약 8.3번의 세포분열을 하였으며, 세포의 총수는 1.45 X 10⁷ (대조군의 1.1배)이었다.

상기의 도 3, 4 및 5, 6에서 나타난 결과들은 첨가된 사이클로스포린 A에 의하여 세포의 분열 회수와 세포 수의 증가, 즉 세포의 수명이 증가한다는 것을 보여주었다.

<실시예 3>

사이클로스포린 A의 늙은 토끼에서 유래한 연골세포 성장에 미치는 영향

사이클로스포린 A의 노화억제 효과가 어린 토기에서 유래한 연골세포 뿐만 아니라, 늙은 토끼의 관절에서 분리한 연골세포의 성장 및 수명에 영향을 끼치는지를 조사하였다.

먼저, 18개월 이상 된 토끼의 관절에서 연골세포를 분리하였다. 분리된 연골세포의 효소분해반응은 실시예 2에서와 같이 수행하였다. 약 6일간의 적응기를 거친 후 50,000개의 세포를 24-웰 배양 용기에 넣고 0.1, 0.5, 1μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 1㎖의 배양액과 함께 배양하였다. 세포가 성장하여 24-웰의 배양 용기에 약 90%정도의 컨플런스(confluence)를 나타내면, 다시 200 μl의 트립신-EDTA용액으로 세포를 분리한 후 세포 수를 측정하고, 다시 50,000개의 세포를 24-웰의 배양 용기 (사이클로스포린 A 첨가 1 ml의 배양액)에 넣고 배양하였다. 이 과정을 3마리의 각각 다른 늙은 토끼에서 추출한 노화된 연골세포를 대상으로 세포의 성장곡선을 작성하였다.

실험 결과, 도 7 및 8에서, 사이클로스포린 A를 첨가하지 않는 배지의 연골세포(대조군)는 약 1.6번의 세포분열 후 더 이상 성장하지 않았으며, 세포의 총수는 1.47 X 10⁵이었다. 그러나 가장 효능이 뛰어난 0.1μM 사이클로스포린 A의 경우 5.7번의 PD(population doubling)를 거치며 성장하였고, 배양을 통해 얻어진 세포의 총수는 2.6 X 10⁶ (대조군의 17.8배)이었다. 0.5 μM의 사이클로스포린 A를 첨가한 배양액에서 성장한 연골세포는 약 4.3번의 세포분열을 하였으며, 세포의 총수는 9.85 X 10⁵ (대조군의 6.7배)이었으며, 1.0 μM의 CSA를 첨가한 배양액에서 성장한 연골세포는 약 3.1번의 세포분열을 하였으며, 세포의 총수는 4.4 X 10⁵(대조군의 2.99배)이었다.

한편, 도 9 및 도 10에서, 약 2년령, 3.0kg의 다른 토끼에서 분리한 연골세포를 이용하여 상기와 같은 동일한 실험을 독립적으로 수행하였다. 그 결과, 사이클로스포린 A를 첨가하지 않은 배양액의 연골세포는 1.8회 분열하고, 세포의 총수는 1.7 X 10⁵이는데 비해서, 0.1 μM 사이클로스포린 A의 경우 약 9회의 세포분열을 하였으며, 세포의 총수는 4.25 X 10⁶ (대조군의 25배)이었다. 0.5 μM의 사이클로스포린 A의 경우 약 6.8회의 세포분열을 통하여 1.39 X 10⁶(대조군의 8.2배)의 세포가 얻어졌으며, 1.0 μM의 사이클로스포린 A의 경우 약 4.9회의 세포 분열을 통해 8.0 X 10⁵ (대조군의 4.7배)의 세포가 얻어졌다.

또한, 도 11 및 12에서, 또 약 2년령, 3.0kg의 다른 토끼에서 분리한 연골세포를 이용하여 상기와 같은 동일한 실험을 독립적으로 수행하였다. 그 결과, 사이클로스포린 A를 첨가하지 않은 배양액의 연골세포는 2.2회 분열하고, 세포의 총수는 2.3 X10⁵의 세포 총수를 기록하였다. 이에 반해서, 0.1 μM 사이클로스포린 A의 경우 약 6.5회의 세포분열을 하였으며, 4.49 X 10⁶ (대조군의 19.6배)의 세포 총수를 나타내었다. 0.5 μM의 사이클로스포린 A의 경우 약 5.4회 분열을 통하여 2.14 X 10⁶ (대조군의 9.3배)의 세포 총수를 나타내었으며, 1.0 μM의 사이클로스포린 A의 경우 4.3회 세포분열을 통하여 9.51 X 10⁵ (대조군의 4.8배)의 세포 총수를 나타내었다.

이상과 같이, 세 번의 실험에서 사이클로스포린 A가 노화된 연골세포의 성장을 촉진하는 효능을 보여주었다. 실시예 2에서는 증식 활성이 뛰어난 어린 토끼의 연골세포의 성장능력을 증가시키는 것으로 나타난 데 반하여, 본 실시예에서는 이미 노화에 도달한 늙은 개체 유래 세포의 성장능력을 촉진시키는 것으로 나타났다.

본 발명에 따라 사이클로스포린 A 또는 이의 유도체는 배양 세포의 노화를 억제하고 배양 세포의 수명을 연장시키는데 효과적이다.

도1은 사이클로스포린 A(Cyclosporin A, CsA)가 p53유전자에 의해 유도된 사람 방광암 세포의 노화를 억제하는 효능을 보여주는 도이다. 여기서 (A) 및 (C)는ΔE1 발현 아데노바이러스(Ad-ΔE1)로 감염되었고, (B) 및 (D)은 p53을 발현시키는 아데노바이러스(Ad-p53)로 감염되었다. 또한, (A) 및 (B)은 1μM의 CSA를 처리하였고(with CsA), (C) 및 (D)는 CsA를 처리하지 않았다(w/o CsA).

도2는 사이클로스포린 A(CsA)가 P53유전자에 의해 유도된 세포의 노화를 억제하는 효능을 보여주는 도이다. 도1의 노화 억제 효능을 SA-β-gal 활성(%)을 표시한 그래프로 나타내었다. 여기서, 사람의 방광암 세포주 EJ세포에 ΔE1 발현 아데노바이러스(Ad-ΔE1) 또는 p53 유전자를 발현하는 아데노바이러스(10 M.O.I.)(Ad-p53)를 감염시키고 3시간 후 각각 0.1, 0.5, 1μM의 사이클로스포린 A를 첨가하고 6일간 배양한 후, SA-β-gal 활성을 조사하여 SA-β-gal 활성을 나타내는 세포를 백분율(%)로 나타낸 것이다.

도3은 연골세포의 성장 및 노화에 대한 사이클로스포린 A(CsA)의 효능을 보여준다. 2 주령의 어린 토끼의 관절에서 분리한 연골 세포를 연속 배양하면서 사이클로스포린 A가 연골세포의 성장 및 노화에 미치는 영향을 나타내었다. X축은 일(day) 수를, Y축은 전체 세포 수(total cell number)를 나타낸다.

도4는 사이클로스포린 A(CsA)의 어린 토끼의 연골세포의 세포분열 회수를 연장시키는 효능을 보여준다. X축은 처리한 사이클로스포린 A의 용량을 나타내고, Y축은 세포분열 횟수를 나타낸다.

도5는 어린 토끼에서 추출한 연골세포의 성장 및 노화에 대한 사이클로스포린 A(CsA)의 효능을 보여준다. X축은 일(day) 수를, Y축은 전체 세포 수를 나타낸다.

도6은 사이클로스포린 A(CsA)의 어린 토끼에서 추출한 연골세포의 세포 분열의 회수를 연장시키는 효능을 보여준다. X축은 처리한 사이클로스포린 A의 용량(μM)을 나타내고, Y축은 세포분열 횟수를 나타낸다.

도7은 늙은 토끼의 관절에서 추출한 연골세포의 성장에 미치는 사이클로스포린 A(CsA)의 효능을 보여준다. X축은 일(day) 수를, Y축은 전체 세포 수를 나타낸다.

도8은 사이클로스포린 A(CsA)의 늙은 토끼의 관절에서 추출한 연골세포의 세포분열 회수를 연장시키는 효능을 보여준다. X축은 처리한 사이클로스포린 A의 용량(μM)을 나타내고, Y축은 세포분열 횟수를 나타낸다.

도9는 늙은 토끼의 관절에서 추출한 연골세포의 성장에 미치는 사이클로스포린 A(CsA)의 효능을 보여준다. X축은 일(day) 수를, Y축은 전체 세포 수를 나타낸다.

도10은 사이클로스포린 A(CsA)의 늙은 토끼의 관절에서 추출한 연골세포의 세포분열의 회수를 연장시키는 효능을 보여준다. X축은 처리한 사이클로스포린 A의 용량(μM)을 나타내고, Y축은 세포분열 횟수를 나타낸다.

도11은 늙은 토끼의 관절에서 추출한 연골세포의 성장에 미치는 사이클로스포린 A(CsA)의 효능에 미치는 효능을 보여준다. X축은 일(day) 수를, Y축은 전체 세포 수를 나타낸다.

도12는 사이클로스포린 A(CsA)의 늙은 토끼의 관절에서 추출한 연골 세포의 세포분열의 회수를 연장시키는 효능을 보여준다. X축은 처리한 사이클로스포린 A의 용량(μM)을 나타내고, Y축은 세포분열 횟수를 나타낸다.

Claims (22)

1. 배양 배지 중의 세포를, 세포 노화를 억제하기에 유효한 양의 사이클로스포린 A에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에서 세포의 노화를 억제하는 방법.
2. 배양 배지 중의 세포를, 세포 수명을 연장시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에서 세포의 수명을 연장시키는 방법.
3. 배양 배지 중의 세포를, 세포 성장을 증대시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에서 세포의 성장을 증대시키는 방법.
4. 배양 배지 중의 세포를, 생존력을 증대시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에서 세포의 생존력을 증대시키는 방법.
5. 배양 배지 중의 세포를, 배양물에 세포를 적응시키기에 유효한 양으로 사이클로스포린 A에 노출시킴을 특징으로 하여, 배양물에 세포를 적응시키는 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물의 방광암 세포 또는 연골 세포인 방법.
11. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 사이클로스포린 A의 유효한 양이 10 ⁵ 내지 10 ⁷ 개 세포/ml의 밀도를 기준으로 하여 세포 배양물 ml당 1 pg 내지 100 pg인 방법.
12. 세포의 노화를 억제하기에 유효한 양의 사이클로스포린 A를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에서 세포의 노화를 억제하는데 유용한 세포 배양 배지.
13. 세포 수명을 연장시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에서 세포의 수명을 연장시키는데 유용한 세포 배양 배지.
14. 세포 성장을 증대시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에서 세포의 성장을 증대시키는데 유용한 세포 배양 배지.
15. 세포 생존력을 증대시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에서 세포의 생존력을 연장시키는데 유용한 세포 배양 배지.
16. 배양물에 세포를 적응시키기에 유효한 양의 사이클로스포린 A를 포함함을 특징으로 하는, 배양물에 세포를 적응시키는데 유용한 세포 배양 배지.
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물의 방광암 세포 또는 연골 세포인 배양 배지.
22. 제12항 내지 16항중 어느 한 항에 있어서, 사이클로스포린 A의 유효한 양이 10⁵ 내지 10⁷개 세포/ml의 밀도를 기준으로 하여 세포 배양물 ml당 1 pg 내지 100 pg인 배양배지.