KR100508335B1

KR100508335B1 - 면역자기분리법(ｉｍｓ)과 리포좀면역분석법(ｌｉａ)을결합한 대장균 ｏ157:ｈ7의 신속한 검출방법

Info

Publication number: KR100508335B1
Application number: KR10-2003-0023478A
Authority: KR
Inventors: 김명희; 손동화; 차성관; 신원선
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2003-04-14
Filing date: 2003-04-14
Publication date: 2005-08-17
Also published as: KR20040089384A

Abstract

본 발명은 (a) 시험샘플과 항대장균 O157 IgG 항체가 코팅된 면역자기구슬을 혼합하는 단계; (b) 내부에 소정의 표지물질을 함유하고 표면에 항대장균 O157:H7 IgG 항체가 결합된 면역리포좀과 상기 단계 (a)의 결과물을 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 미결합 면역리포좀을 시험스트립상의 반응영역에 포획하는 단계를 포함하여 상기 표지물질에 의해 나타나는 외관변화를 관찰하여 대장균 O157:H7을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 의하면, 수십분이내에 대장균 O157:H7을 보다 간편하고, 신속하게 검출할 수 있다.

Description

면역자기분리법(ＩＭＳ)과 리포좀면역분석법(ＬＩＡ)을 결합한 대장균 Ｏ157:Ｈ7의 신속한 검출방법{Rapid Detection Method of Escherichia Coli O157:H7 Using a Combined IMS and LIA procedure}

본 발명은 대장균 O157:H7을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 면역자기분리법(IMS)과 리포좀면역분석법(LIA)을 결합하여 대장균 O157:H7을 보다 간편하고, 신속하게 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

대장균 혈청형 O157:H7은 출혈성 대장염, 용혈성 요독증 및 혈전성 전구 감소성 자반증 등의 심각한 질병을 야기한다. 대장균 O157:H7에 감염되는 수가 증가하고 있다는 점에서, 인간 감염의 주요 원인이 감염된 음식 및 물, 가축과의 직접 접촉 및 사람 대 사람에 의한 전염에 의한다는 것을 알 수 있다. 통상의 미생물학적 절차로 보면 대장균 O157:H7의 추정증후를 발견하는데는 대략 5∼7일이 요구된다. 따라서, 신속하고, 신뢰할 수 있으며, 손쉽게 테스트할 수 있는 선별법(screening method)의 개발이 요구되고 있다.

종래, 효소 표식 면역 정량법(ELISA)에 의해서도 충분히 신속하고 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수는 있으나, 동 방법은 여전히 효소반응을 위한 수세 및 배양 단계를 위한 긴 시간이 소모되는 문제가 있다.

친수성계를 둘러싸고 있는 인지질의 이중 층으로 구성된 구형의 소포인, 리포좀은 약물 전달 시스템 및 모델 생체막으로서 널리 사용되고 있다. 리포좀의 외부막은 다양한 리간드 분자에 의해 유도될 수 있다. 항원/합텐(hapten)에 감작되거나, 항체와 결합된 리포좀은 면역 정량법에서 분석시약으로서 사용되어진다[Frost, S. J., G. B. Firth, and J. Chakraborty. 1990. Antibody-coated liposomes as a particulate solid phase for immunoassays. J. Immunol. Methods 134: 207-213, Singh, A. K. and R. G. Carbonell. 1995. Handbook of nonmedical applications of liposomes (Lasic, D. D. and Y, Barenholz Eds.), pp. 209-228, CRC Press, Boca Raton, FL]. 리포좀은 내부 수상에 흡광물질, 형광물질, 전기화학물질, 또는 화학발광물질 등과 같은 다양한 분자들을 포집할 수 있다. 많은 수의 마커 분자를 포집하는 능력 및 리포좀의 다른 특성으로 인하여, 시간 의존성 효소반응에 의해 야기되는 색상보다는 증폭된 신호 및 순간적인 신호의 획득이 가능하다.

이전의 연구에서 합텐에 감작된 리포좀이 단순한 일회용 면역이동 시스템에 의해 작은 분자를 신속하게 선별해 낼 수 있다는 사실이 밝혀졌다[Roberts, M. A. and R. A. Durst. 1995. Investigation of liposome based immunomigration sensors for the detection of polychlorinated biphenyls. Anal. Chem. 67: 482-491, Siebert, S. T. A., S. G. Reeves, and R. A. Durst. 1993. Liposome immunomigration field assay device for alachlor determination. Anal. Chim. Acta. 282: 297-305]. 이들 시스템에서, 모세관 작용은 샘플 합텐 분자들 및 합텐이 부착된 형광물질 포집 리포좀들을 니트로셀룰로오스 시험 스트립 상의 항 합텐 항체 부위를 통해 이동시키고, 여기서 경쟁적 결합을 야기한다.

염소의 항 대장균 O157:H7 IgG가 부착된 리포좀, 즉 면역 리포좀과 반응지역에 고정된 동일한 항체를 갖는 시험 스트립을 사용하여 대장균 O157:H7과 같은 거대 분석물을 검출하는 유사한 장치들은 개발되어 있다. 이러한 분석법은 통상의 효소 면역분석법에서 일반적으로 요구되는 수세 및 배양 단계 등을 요구하지 않는다.

통상의 배양법에 IMS를 첨가함으로서의 이점은 플라타미코 등[Fratamico, P. M., F. J. Schultz, and R. L. Buchanan. 1992. Rapid isolation of Escherichia coli O157:H7 from enrichment cultures of foods using an immunomagnetic separation method. Food Microbiol. 9: 105-113]에도 기재되어 있다. 이들 연구에서 IMS가 다양한 세균총(microflora)들로부터 적은 수의 목표 균주들이 함유된 배지로부터 대장균 O157:H7의 분리를 증진시키는 것으로 보고되어 있다. 이러한 점을 이용하여, 살모넬라의 검출을 위한 IMS와 ELISA를 결합한 최근 연구가 [ K., P. Rauch, G. M. Wyatt, and M. R. A. Morgan. 1998. Combined immunomagnetic separation and detection of Salmonella enteritidis in food samples. Food & Agric. Immunol. 10: 271-280, Mansfield, L. P. and S. J. Forsythe. 2000. The detection of Salmonella using a combined immunomagnetic separation and ELISA end-detection procedure. Lett. Appl. Microbiol. 31: 279-283.]보고되어 있다. 상기 살모넬라에 대한 IMS-ELISA 시스템은 24시간 이내의 검출시간(강화 단계 포함) 및 완전 분리능을 가지며, 이는 수일이 요구되는 통상의 기술보다 현저하게 단축된 시간이다.

하지만 이러한 다양한 방법들에도 불구하고, 여전히 대장균 O157:H7을 대상으로 시험샘플로부터 수십분 이내에 신속하고, 정확하게 그 존재를 검출하기 위한 기술은 보고되고 있지 않다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 면역자기분리법(IMS)과 리포좀면역분석법(LIA)을 결합하여 대장균 O157:H7을 보다 간편하고, 신속하게 검출할 수 있는 방법을 제공함에 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은,

(a) 시험샘플과 항대장균 O157 IgG 항체가 코팅된 면역자기구슬을 혼합하는 단계; (b) 내부에 소정의 표지물질을 함유하고 표면에 항대장균 O157:H7 IgG 항체가 결합된 면역리포좀과 상기 단계 (a)의 결과물을 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 미결합 면역리포좀을 시험스트립상의 반응영역에 포획하는 단계를 포함하여 상기 표지물질에 의해 나타나는 외관변화를 관찰하여 대장균 O157:H7을 검출하는 방법을 제공한다.

상기에서 '표지물질'은 검출하고자 하는 대상을 인식시켜주기 위한 물질로서 예를 들면, 흡광물질, 형광물질, 전기화학 물질 또는 화학발광 물질 등이 있다.

상기에서 '반응영역'은 분석물(analyte)을 포획하기 위해 스트립상에 고정된 포획시약(capture reagent)이 도포된 영역을 의미한다.

이하, 본 발명의 내용을 도면을 참조하여 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 면역자기분리법(IMS)과 리포좀면역분석법(LIA)을 결합한 검출방법으로서, 그 검출과정의 바람직한 예가 도 1에 도시되어 있다.

먼저, 대장균 O157:H7이 의심되는 식품 등의 시험샘플을 항대장균 O157(혈청형 H7을 포함할 수 있다) IgG 항체가 코팅된 면역자기구슬과 혼합하여 시험샘플로부터 대장균 O157을 분리해낸다. 만일 시험샘플내에 대장균 O157:H7이 존재하는 경우에는 상기 면역자기구슬과 대장균 O157이 복합체를 형성하게 된다. 이때 결합되지 못한 대장균 O157은 씻어 제거하는 것이 바람직하다.

다음으로, 상기 단계를 거쳐 얻어진 복합체에 면역리포좀을 혼합한다. 면역리포좀은 내부에는 소정의 표지물질을 함유하며, 표면에는 대장균 O157:H7에 결합할 수 있는 항체가 결합되어 있다 (항체의 결합과정은 후술하는 실시예를 통해 상세히 설명될 것이다). 이러한 면역리포좀은 상기 복합체에 대장균 O157:H7이 존재하는 경우 이에 결합하여 면역자기구슬/대장균 O157:H7/면역리포좀 복합체를 형성한다. 이때 결합되지 못한 면역리포좀의 농도는 시험샘플내에 존재하는 대장균 O157:H7의 농도에 반비례하게 된다.

상기 반응 결과물은 면역리포좀을 포획(capture)하기 위한 소정의 시약(바람직하게는 항대장균 O157:H7 IgG 항체와 결합가능한 항체)이 반응영역에 고정된 시험스트립에 로딩되어 크로마토그래프된다.

반응영역에 나타나는 외관변화는 사용되는 표지물질에 따라 상이하며, 통상적으로 대장균 O157:H7이 존재하지 않는 샘플의 외관변화정도를 참조하여, 시험샘플내의 대장균 O157:H7의 농도를 결정할 수 있다. (도 2참조)

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 설명하기 위해 예시하는 취지일 뿐 권리범위가 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니될 것이다.

<실시예>

1. 재료 및 방법

재료

디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 및 디팔미토일 포스파티딜글리세롤(DPPG)은 아반티 폴러 리피드(알라바스터, AL)으로부터 구입하였다. 콜레스테롤, 트리에틸아민, 클로로포름, 메탄올, 이소프로필에테르, 카제인, 폴리비닐피롤리돈, 세파덱스 G50-150 및 세파로우스 CL-4B는 시그마(세인트루이스, MO)로부터 구입하였다. 술포로다민 B(SRB)는 몰레큘러 프로브(유진, OR)으로부터 모공 사이즈가 0.2, 0.4 및 3㎛인 폴리카르보네이트 주사기 필터는 포레틱스(리버모어, CA)로부터 구입하였다. 친화 정제된 염소의 다클론 항대장균 O157:H7(Affinity-purified polyclonal goat anti-E-coli O157:H7)은 Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.(KPL, Gaithersburg, MD)로부터 모공의 평균 직경이 8㎛인 니트로셀룰로오스 막은 사토리우스(괴팅겐, 독일)로부터 구매하였다. 숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA), N-[카파-말레이미도운데카노일록시]-술포숙신이미드 에스테르(술포-KMUS), 및 히드록시아민 히드로클로라이드는 피어스(록포드, IL)로부터 얻었다. 트립티케이스 소이 브로스(TSB)는 디프코(디트로이트, MI)로부터 구매하였다. 토끼에서 생성된 다클론 항염소 면역글로블린(IgG)는 로크랜드(길버츠바일, PA)로부터 구입하였다. 다이나비드 항 대장균 O157(면역자기구슬) 및 자기 입자 농축기(MPC)는 다이날(레이크석세스, NY)로부터 구매하였다. 대장균 O157:H7(ATCC 43895)는 아메리카타입컬쳐콜렉션(ATCC, rockville, MD)으로부터 구매하였다.

DPPE-ATA의 준비

리포좀의 이중층으로 혼입하기 전에 먼저 DPPE를 SATA와 반응시켜 DPPE-ATA를 형성하였다 [Siebert, S. T. A., S. G. Reeves, and R. A. Durst. 1993. Liposome immunomigration field assay device for alachlor determination. Anal. Chim. Acta. 282: 297-305]. 클로로포름으로 녹인 0.7% 트리에틸아민(v/v) 1㎖를 원통형의 플라스크 내에서 DPPE(7.2 μmol) 5mg와 SATA(14.3 μmol) 3.5mg의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 질소가스하에서 45℃의 수조에서 1분 동안 초음파처리하였다. 상기의 반응 플라스크를 뚜껑을 덮고 실온의 교반기에 20분간 두었다. 클로로포름 3㎖를 상기 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 교반한 다음, 용액을 진공하의 45℃에서 증발시켜 트리에틸아민을 제거하였다. 이 단계를 2번 이상 반복하였다. 마지막으로, 클로로포름 1.0㎖를 상기 산물에 첨가하였다.

내부표지와 DPPE-ATA가 혼입된 리포좀의 준비

역상 증발법을 사용하여 리포좀을 제조하였다.[Siebert, S. T. A., S. G. Reeves, and R. A. Durst. 1993. Liposome immunomigration field assay device for alachlor determination. Anal. Chim. Acta. 282: 297-305, Szoka, F., F. Olson, T. Heath, W. Vail, and E. Mayhew. 1980. Preparation of unilamella liposomes of intermediate size (0.1-0.2 ㎛) by a combination of reverse phase evaporation and extrusions through polycarbonate membranes. Biochim. Biophys. Acta 601: 559-571]. 원통형 플라스크 내의 DPPC(40.3 μmol) 59.2mg, DPPG(4.2 μmol) 6mg와 콜레스테롤(40.9 μmol) 31.6mg의 혼합물에 클로로포름 3㎖ 및 메탄올 5㎖을 첨가하였다. 상기 부유물을 45℃의 수조에서 1분간 초음파처리 하여 지질을 용해하였다. 수득된 혼합물에 DPPE-ATA(3.6 μmol) 0.5㎖를 첨가하여 리포좀상의 4몰% 태그인 ATA를 얻었다. 상기 부유물을 이소프로필 에테르 3㎖와 혼합하고 질소가스의 낮은 기류하에서 45℃로 1분간 초음파처리 하였다. 플라스크를 질소가스하에서 45℃로 초음파처리하면서, 따뜻한 포집 용액, 즉 pH 7.0인 0.02M Tris의 150mM SRB 2㎖를 첨가하였다. 플라스크를 가끔 교반하면서 3분간 초음파처리를 계속한 다음, 진공 증발기를 사용하여 45℃에서 유기용매를 증발시켰다. 또 다른 150mM SRB 2㎖를 45℃에서 초음파처리하에서 첨가하였다. 초음파처리 및 증발은 균일한 용액이 될 때까지 선택적으로 반복되었다. 상기 리포좀 준비용액을 3㎛의 필터를 통해 압출한 다음, 일회용 주사기에 차례로 부착된 0.4 및 0.2㎛의 필터를 통해 압출하였다. 포집되지 않은 SRB를 제거하기 위하여, 리포좀 준비용액을 세파덱스 G-50-150 컬럼(1.5 ×25 ㎝)에 통과시켰다. 상기 세파덱스 G-50-150 컬럼(1.5 ×25 ㎝)은 pH 7.5, 0.15M의 NaCl, 0.01%의 NaN₃, 및 0.1M의 수크로스를 함유하는 0.02M HEPES 버퍼로 밸런스를 맞춘 것이었다. 상기 리포좀 분획은 틈새부피(void volume) 바로 다음에 분리되었다. 이는 pH는 7.5이고, 0.15M의 NaCl, 0.01%의 NaN₃, 및 0.1M의 수크로스를 함유하는 0.02M HEPES 버퍼를 이용하여 밤새 투석되었다. 상기 리포좀의 직경은 LS 입자크기분석기(베크만 콜터, 마이에미, FL)의 레이져 분산(Laser scattering)에 의해 측정하였다.

리포좀 표면위 SH기의 탈보호과정

구성성분으로 DPPE-ATA가 혼입된 리포좀에 25mM EDTA를 함유하고, pH가 7.5인 0.1M HEPES 버퍼에 용해시킨 0.5M 히드록실아민 히드로클로라이드를 10:1의 비율(리포좀 용액 1㎖: 히드록실아민 히드로클로라이드 용액 0.1㎖)로 첨가하였다. 상기 용액 플라스크에 1분간 질소를 분사하였고, 탈아세틸화 반응을 어두운 실온의 교반기에서 2시간 동안 진행하였다.

말레이미드기를 가지는 IgG 유도체 생성과정

술포-KMUS 2㎎을 DMSO와 MeOH(2:1, v/v)를 함유하는 혼합용액 0.1㎖에 용해하였다. 몰비율을 15:1로 하여, 상기 술포-KMUS 용액을 1mM의 EDTA 및 0.01%의 NaN₃를 함유하는 pH 7.8의 0.05M 인산 나트륨 버퍼에 투석된 염소 항대장균 O157:H7 IgG 용액에 첨가하였다. 상기 반응을 실온의 교반기에서 2시간 동안 진행하였다. 상기 반응 혼합물을 0.15M NaCl 및 0.01%의 NaN₃를 함유하는 0.02M PBS에 투석시켰다.

SH기가 태그된 리포좀과 멜레이미드기가 유도된 IgG의 결합과정

이형교차링커, 즉 술포-KMUS를 사용하여 IgG가 태그된 리포좀을 형성하는 개략도는 도 3에 도시하였다. SH가 태그된 리포좀의 pH는 0.5M의 KH₂PO₄를 첨가하여 7로 조절하였다. 상기 SH가 태그된 리포좀을 말레이미드가 유도된 IgG를 함유한 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크에 1분간 질소를 주입하였고, 뚜껑을 덮어 실온의 교반기에서 4시간 동안 반응 시켰다. 상기 플라스크를 4℃의 냉장실로 이동시키고, 밤새 교반기 내에서 결합 반응을 계속하였다. 반응하지 않은 SH기를 불활성화하기 위해, ATA-DPPE 1몰당 에틸말레이미드 10몰 씩을 반응 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온의 교반기에서 30분간 교반하였다. IgG가 태그된 리포좀들은 0.15M의 NaCl 및 0.01%의 NaN₃를 함유하고 pH 7.0인 0.02M TBS로 평형화된 세파로우스 CL-4B 컬럼(1.5×18 ㎝) 상에서 태그되지 않은 말레이미드가 유도된 IgG로부터 분리되었다. 틈새부피 후에 바로 분리되는 분획들을 수득하여 pH 7.0, 0.15M NaCl 및 0.01%의 NaN₃및 0.11M의 수크로스를 함유하는 0.02M TBS를 이용하여 밤새 4℃에서 투석하였다. IgG가 태그된 리포좀을 수득하여 필요로 될 때까지 4℃로 보관하였다.

시험스트립의 준비

시험스트립은 시버트 등[Siebert, S. T. A., S. G. Reeves, and R. A. Durst. 1993. Liposome immunomigration field assay device for alachlor determination. Anal. Chim. Acta. 282: 297-305]에 따라 제조하였다. 토끼 항염소 IgG(0.6㎎/㎖ in 0.01M PBS, pH 7.0)를 마이크로프로세서로 제어되는 리노매트 IV TLC 샘플 적용기에(Camag Scientific, Wrightsville Beach, NC)의해 니트로셀룰로오스 시트의 한쪽 끝에서 0.4㎝ 떨어진 곳부터 좁은선을 따라 도포하였다. 이들 항체가 코팅된 니트로셀룰로오스 시트를 pH 7.0인 0.02M TBS 내에서 0.5%의 폴리비닐피롤리돈(M.W. 10,000) 및 0.02%의 카세인을 함유하는 블록킹 용액에 1시간 동안 담궈둔 후, 실온의 진공하에서 밤새 건조시켰다. 그 후, 상기 니트로셀룰로오스 시트를 너비 5mm 길이 8㎝로 잘라내어 시험스트립으로 하였다.

IMS-LIA 분석과정

IMS

면역자기분리법의 절차는 제조자의 지시를 기본으로 약간 변형되었다. TSB내의 대장균 O157:H7의 순수배지를 시험용으로 사용하였다. 면역자기구슬을 강력한 교반기로 교반하여 면역자기구슬 부유물(6.6×10⁶ 비드) 20㎕를 1.5㎖의 미세원심분리튜브에 분배하였다. 다양한 농도의 대장균 O157:H7 배지의 1㎖ 샘플을 상기 튜브에 첨가하였다. 상기 튜브를 부드럽게 계속해서 교반하면서 30분간 실온에서 배양하였다. 면역자기구슬/대장균 O157:H7 복합체는 MPC로 농축하여, 상청액은 버렸다. 면역자기구슬/대장균 O157:H7복합체를 0.05%의 트윈 및 0.15M의 NaCl과 pH 7.0의 0.01M PBS로 구성된 수세버퍼 1㎖로 3회 수세하였다. 마지막 수세에서는, 트윈을 함유하지 않은 수세버퍼를 사용하였다. 상기 면역자기구슬/대장균 O157:H7 복합체를 0.15M NaCl, 0.01% NaN₃, 및 0.11M 수크로스를 함유하는 pH 7.0의 0.02M의 TBS 100㎕에 재부유하였다.

LIA

적절히 희석된 30㎕의 면역리포좀 용액(10⁹ 면역리포좀 함유)을 보로실리케이트 튜브로 이동시켰다. IMS 방법에 의해 준비된 면역자기구슬/대장균 O157:H7 부유물 40㎕를 상기의 면역리포좀 용액을 함유하고 있는 각각의 보로실리케이트 튜브에 첨가하고, 이를 부드럽게 15분간 교반하였다. 상기 튜브를 MPC 내에 3분간 두어 결합되지 않은 자유면역리포좀으로부터 면역자기구슬/박테리아/면역자기리포좀 복합체를 분리하였다. 토끼 항염소 IgG로 고정화된 시험스트립을 상기 튜브 속에 넣고 자유면역리포좀을 모세관 이동시켰다. 상기 모세관 이동의 단계는 약 10분 간 수행하였다.

검출/정량

시험스트립의 반응 영역의 색의 강도는 먼저 시각에 의해 감지한 후, 덴시토미트리로 평가하여 객관적인 값(수치)을 얻었다. 상기 시험스트립을 휴렛패커드 데스크 스케너로 스캔하였다. 스캔은 붉은 착색을 흑백의 기록으로 전환시킨다. 상기 흑백 기록은 매킨토시 컴퓨터를 사용하여 스캔분석 소프트웨어(바이오소프트, 캠브리지, UK)로 판정하였고, 이는 측정부위 상의 고정영역에 대한 평균 흑백값으로 나타낸 것이다.

2. 실험결과

본 실험에 사용된 리포좀의 특징들을 하기 표 1에 정리하였다.

<표 1>

평균직경(nm)	370
내부부피(㎕)	2.6×10^-11
SRB 농도(mM)	150
SRB 함량(분자수/리포좀)	2.3×10⁶
리포좀 농도(리포좀의 수/㎖)	1.5×10¹²
항체표면밀도(분자수/리포좀)(계산치)
0.05몰% IgG 부착 리포좀	78
0.2몰% IgG 부착 리포좀	312
0.4몰% IgG 부착 리포좀	624

상기 크기 측정 결과로부터, 단일 리포좀의 평균 부피가 2.6 ×10^-11㎕인 것을 계산할 수 있었다. 포집된 형광물질은 사용된 형광물질 용액의 농도와 동일한 농도라고 가정하고, 표준 SRB 용액의 것과 리포좀을 파괴해서 방출되는 형광물질의 형광성을 비교함으로서, 1㎖의 리포좀 용액에 1.5 ×10¹² 리포좀이 있고, 각 리포좀은 SRB 2.3 ×10⁶ 분자를 포집하고 있다는 것을 계산할 수 있었다. DPPC 분자의 평균 표면적을 71Å² 이고, 혼합된 이중 층에의 콜레스테롤 분자의 평균 표면적은 19Å² 이며, 결합된 항체는 DPPE-ATA에 대하여 0.05, 0.2 및 0.4몰%이라는 조건에서, 단일 리포좀의 외면에 각각 항체의 분자가 약 78, 312 및 624로 존재한다고 추정하였다.

분석 성능

IMS-LIA의 분석 포맷은 대장균 O157:H7의 면역자기 분리, 면역자기구슬/대장균 O157:H7 복합체와 면역리포좀과의 상호반응, 시험스트립에서 결합되지 않은 면역리포좀의 모세관 이동 및 포획 지역에서 결합되지 않은 면역리포좀의 검출을 기초로 한다.(도 1) IMS-LIA 시험스트립의 전형적인 예는 도 2에 도시한 바와 같다. 상기 포맷으로 하여 결합되지 않은 리포좀의 신호를 측정하면, 신호 강도가 상기 샘플에 있는 대장균 O157:H7의 수에 반비례한다. 상기 포획 지역에서의 가장 강한 신호는 샘플이 대장균 O157:H7을 함유하지 않았을 때 나타난다. 반응곡선을 얻기 위하여, 대장균 O157:H7의 농도를 다양하게하여 IMS-LIA를 행한 후 포획 지역의 주사분석을 하였다. 포획 지역의 신호 강도는 흑백값으로 표시하였다 (도 4). 반응곡선은 대장균 O157:H7의 수와 신호의 강도 사이에 반비례 관계를 보여준다. 10⁵ CFU/㎖의 수준으로 대장균 O157:H7을 함유하는 샘플은 50% 이상의 저해능이 선명하게 나타났으며, 이는 네가티브 컨트롤로부터 쉽게 식별할 수 있는 신호차이이다. 분리 및 감별의 단계를 포함하는 IMS-LIA의 총 절차는 약 90분이 걸린다. 이는 수일이 걸리는 통상의 평판법은 말할 것도 없고, 수세 및 효소 배양 단계에서 3~5시간이 요구되는 IMS-ELISA의 유사한 포맷에 비해 현저하게 신속해진 것이다.

또한, 면역자기비드/대장균 O157:H7 복합체에 결합된 면역리포좀으로부터 신호를 측정하는 것도 가능할 것이다. 이때에는 대장균 O157:H7의 수와 신호강도 사이에 직접적 관계를 보여주는 양성반응 커브를 생성시킨다. 그러나, 상기 튜브 분석 포맷은 형광물질을 방출하기 위해 리포좀을 용해하고 신호 발생을 측정하기 위해 형광검출기가 요구된다. 본 발명에서와 같은 시험스트립 분석법의 이점은 추가적인 용해 단계가 요구되지 않으며, 검출을 위해 정교한 실험 기기가 요구되지 않는다는 점이다.

교반시간의 영향

37℃의 TSB에서 배양된 대장균 O157:H7의 순수배양액을 100℃에서 30분간 열처리한 후, 수득된 배양액 1㎖를 면역자기구슬 20㎕와 혼합하였다. 상기 혼합물을 완만하게 10∼90분 동안 교반하였다. 이외의 절차들은 상기 '재료 및 방법'에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 도 5의 결과에서, 교반시간이 경과함에 따라 면역자기구슬 표면에 결합된 대장균 O157:H7의 수가 90분까지 증가하고 있음을 명확하게 알 수 있다. 일정 수의 면역리포솜을 첨가하였을 때, 면역자기구슬 표면에 결합된 대장균 O157:H7이 많을수록, 유리상태의 면역리포좀의 수는 줄어든다. 따라서, 신호저해는 도 5에서 보여지는 바와 같이 교반시간에 비례한다는 것을 알 수 있다. 교반시간이 길어져서 민감성이 향상되었을지라도, 민감성과 분석에 소요되는 시간의 상쇄로 인해 이후 부터 수반되는 실험에서의 교반시간은 30분으로 고정하였다.

IgG의 표면 밀도의 영향

0.05, 0.2 및 0.4몰%의 IgG 공유결합형 면역리포좀 3종류가 분석 성능을 위해 제조 및 시험되었다. 면역자기구슬/대장균 O157:H7 복합체 및 면역리포좀의 교반시간은 15분으로 하였다. 도 6에 도시된 결과는 신호저해가 리포좀 상의 IgG의 표면밀도가 증가함에 따라 증가되고 있음을 보여주고 있다. 이 결과는 IgG의 더 높은 몰%를 갖는 면역리포좀이 면역자기구슬/대장균 O157:H7 복합체와 주어진 시간동안 더욱 효과적으로 결합하므로, 결합되지 않은 면역리포좀의 수가 적어진다는 것을 설명하고 있다.

직접 LIA vs. IMS-LIA

IMS-LIA의 감수성이 개선되었는지를 알아보기 위하여, IMS-LIA와 직접 LIA의 비교실험을 0.2 및 0.4몰%의 IgG가 부착된 리포좀을 사용하여 0, 10⁵및 10⁷대장균O157:H7 CFU/㎖의 수준으로 행하였다. 직접 LIA의 경우, 다양한 농도의 순수배지 60㎕를 튜브 내에서 7㎕의 면역리포좀과 혼합하였다. 완만한 교반과 함께 15분간 배양한 후, 시험스트립을 상기 튜브에 넣었다. 최종 용액에서 면역리포좀의 수는 직접 LIA 와 IMS-LIA 모두 약 10⁹ 이었다. 도 7의 결과는, 상기 분석 민감성(assay sensitivity)이 면역리포좀의 두가지 형태 모두에 대해서 IMS-LIA에 의해 향상되었음을 보여준다. 이는 면역리포좀과 대장균 O157:H7간의 상호작용이 배양 배지의 매트릭스 효과에 의해 직접 LIA에서 간섭받을 수도 있음을 나타낸다. 매트릭스 효과가 IMS-LIA에서는 면역리포좀의 첨가 이전에 3회의 수세 단계에 의해 감소되었을 수도 있다. 또한, 면역자기구슬 주위에 증가된 농도의 대장균 O157:H7 미생물은 IMS-LIA의 민감도를 강화시키는데 기여할 수도 있다.

면역자기구슬/대장균 O157:H7 복합체에 결합된 면역리포좀으로부터 형광 강도를 측정한 결과, 시가독소(shiga toxin) 생산 대장균 O157:NM(ATCC 700376, ATCC 700377, 및 ATCC 700378)가 대장균 O157:H7(ATCC 43895)의 신호와 동일한 신호를 발생한다는 것을 보여준다. 그러나, 대장균 O19:H21(ATCC 51435), 대장균 O32:K.:H19(ATCC 23522) 및 야생형 대장균 K-12(ATCC 25404)는 감지할 만한 신호를 발생하진 않았다.

결론적으로, IMS-LIA에서 90분이 소요되는 본 발명의 분석 시스템은 시간에 좌우되는 효소 반응에 비해 면역리포좀으로부터 신호가 즉시 일어나기 때문에 3∼6시간이 소요되는 ELISA 와 IMS를 조합한 유사한 포맷과 비교할 때 훨씬 신속한 것으로 나타났다. 이 결과는 대장균 O157:H7를 신속하게 감별해내기 위해 IMS와 LIA를 조합하는 것에 대한 가능성을 성공적으로 설명하고 있다.

본 발명에 의하면, 면역자기분리법(IMS)과 리포좀면역분석법(LIA)을 결합하여 대장균 O157:H7을 보다 간편하고, 신속하게 검출할 수 있다. 또한 스트립상의 반응영역에서 나타나는 외관변화의 강도를 통해 시험샘플내의 대장균 O157:H7의 농도를 구할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 IMS-LIA 절차의 개략도

도 2는 본 발명에 따른 IMS-LIA 시험 스트립의 예시도[화살표는 반응영역을 표시함. 왼쪽은 대조구(네가티브), 오른쪽은 샘플(포지티브)]

도 3은 리포좀에 말레이미드가 유도된 IgG를 결합시키는 과정을 도시한 절차도

도 4는 본 발명에 따른 IMS-LIA에 의한 대장균 O157:H7 순수배양의 반응곡선

도 5는 본 발명에 따른 IMS-LIA에서 면역자기구슬 혼합시간에 따른 영향을 보여주는 곡선

도 6은 본 발명에 따른 IMS-LIA에서 IgG 표면밀도의 영향을 보여주는 곡선

도 7은 직접 LIA와 IMS-LIA의 비교결과[A: 0.2몰% IgG 부착 리포좀, B: 0.4몰% IgG 부착 리포좀. Y축은 멸균된 배지로서 음성 대조구에 대한 시험샘플의 상대적 그레이 스케일을 나타낸다)

Claims

(a) 시험샘플과 항대장균 O157 IgG 항체가 코팅된 면역자기구슬을 혼합하는 단계;

(b) 내부에 소정의 표지물질을 함유하고 표면에 항대장균 O157:H7 IgG 항체가 결합된 면역리포좀과 상기 단계 (a)의 결과물을 혼합하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 미결합 면역리포좀을 시험스트립상의 반응영역에 포획하는 단계를 포함하여 상기 표지물질에 의해 나타나는 외관변화를 관찰하여 대장균O157:H7을 검출하는 방법
제 1항에 있어서,

표지물질은 흡광물질, 형광물질, 전기화학 물질 또는 화학발광 물질로 하여 대장균O157의 검출방법