CN104651480B - 一种检测样品中大肠杆菌活菌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测样品中大肠杆菌活菌体的方法，该方法包括：（1）将能够特异地与大肠杆菌活菌体结合的抗体偶联在磁球上，得到免疫磁球；所述能够特异地与大肠杆菌活菌体结合的抗体不能与死菌体结合；（2）将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合，得到混合后的物料；混合的条件使得当待测样品中存在大肠杆菌活菌体时，免疫磁球能够特异性地吸附大肠杆菌活菌体；（3）将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免疫磁球，并洗脱未吸附在免疫磁球上的物质，得到洗脱后的免疫磁球；（4）将吸附在免疫磁球上的物质进行提取DNA的操作，得到模板样品；（5）使用针对所述大肠杆菌活菌体的特异性引物对模板样品进行PCR扩增，并根据PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样品中的大肠杆菌活菌体的含量。

Description

一种检测样品中大肠杆菌活菌体的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种检测样品中大肠杆菌活菌体的方法。
背景技术
致病菌（Pathogenic bacteria)能引起疾病的微生物称为病原微生物或致病菌。病原微生物包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。细菌的致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病。条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。例如，金黄色葡萄球菌和链球菌也是正常菌群，常可以存在于体表皮肤，鼻腔而不引起疾病，但可以潜在引起皮肤感染，如肺炎（pneumonia），脑膜炎（meningitis）和败血症（sepsis)等。
大肠杆菌O157：H7血清型属肠出血性大肠杆菌，自1982年在美国首先发现以来，包括中国等许多国家都有报道，且日见增加。大肠杆菌O157：H7引起肠出血性腹泻，约2%-7%的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危及生命。
目前，检测致病菌的方法只能检测样品中的致病菌的总体数量，而不能区分样品中的大肠杆菌活菌体和死菌体的数量分别为多少。
发明内容
为了将待测样品中的死菌体数量和大肠杆菌活菌体数量区别开来，本发明提供了一种检测样品中大肠杆菌活菌体的方法，该方法包括：（1）将能够特异地与大肠杆菌活菌体结合的抗体偶联在磁球上，得到免疫磁球；所述能够特异地与大肠杆菌活菌体结合的抗体不能与死菌体结合；（2）将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合，得到混合后的物料；混合的条件使得当待测样品中存在大肠杆菌活菌体时，免疫磁球能够特异性地吸附大肠杆菌活菌体；（3）将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免疫磁球，并洗脱未吸附在免疫磁球上的物质，得到洗脱后的免疫磁球；（4）将吸附在免疫磁球上的物质进行提取DNA的操作，得到模板样品；（5）使用针对所述大肠杆菌活菌体的特异性引物对模板样品进行PCR扩增，并根据PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样品中的大肠杆菌活菌体的含量
通过上述技术方案，本发明能够有效地将待测样品中的死菌体数量和大肠杆菌活菌体数量区别开来。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“免疫磁球”是指通过偶联反应将抗体结合到磁性微球的表面上，形成的免疫磁性微球。术语“PCR”是指聚合酶链式反应。术语“引物”包括至少一个上游引物和至少一个下游引物。本发明中使用的液体体积均为20℃下的数值。
本发明提供了一种检测样品中大肠杆菌活菌体的方法，该方法包括：（1）将能够特异地与大肠杆菌活菌体结合的抗体偶联在磁球上，得到免疫磁球；所述能够特异地与大肠杆菌活菌体结合的抗体不能与死菌体结合；（2）将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合，得到混合后的物料；混合的条件使得当待测样品中存在大肠杆菌活菌体时，免疫磁球能够特异性地吸附大肠杆菌活菌体；（3）将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免疫磁球，并洗脱未吸附在免疫磁球上的物质，得到洗脱后的免疫磁球；（4）将吸附在免疫磁球上的物质进行提取DNA的操作，得到模板样品；（5）使用针对所述大肠杆菌活菌体的特异性引物对模板样品进行PCR扩增，并根据PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样品中的大肠杆菌活菌体的含量。
其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，所述大肠杆菌活菌体为大肠杆菌O157（Escherichia coli,O157:H7），所述能够特异地与大肠杆菌活菌体结合的抗体为编号为LS-C128841的LSBIO单克隆抗体，该抗体可以从LSBIO公司商购得到，商品号（Cat.#）为LS-C128841。
其中，相对于每毫克的磁球，所述抗体的用量可以为0.05-2mg。
其中，相对于每毫升的液体形式的待测样品，以磁球的重量计，所述免疫磁球的用量可以为10-25μg。
其中，步骤（3）中，洗脱所用的液体可以为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氢二钠和0.038-0.056mol/L的磷酸二氢钠。
其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，所述大肠杆菌活菌体为大肠杆菌O157（Escherichia coli,O157:H7），PCR扩增所用的引物包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物（5’-AATAGCCTGGTAGTCTTGT-3’）和如SEQ ID NO:2所示的反向引物（5’-GTTTGATAAATCGTGGTCT-3’）。
其中，所述磁球可以为表面修饰有氨基或羧基的超顺磁性Fe3O4聚苯乙烯复合微球。
根据本发明的方法，其中，待测样品可以为食品和/或药品。具体地，可以按照国家标准GB4789.1-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》中的方法取得待测样品。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，所述磷酸缓冲液为含有0.153mol/L的磷酸氢二钠和0.047mol/L的磷酸二氢钠的水溶液。将从LSBIO公司商购得到，商品号（Cat.#）为LS-C128841的抗体作为抗体1。
制备实施例1
本制备实施例1使用抗体1制备本发明的方法所用的免疫磁球。
将通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的表面修饰有羧基的超顺磁性Fe3O4聚苯乙烯复合微球（购自上海奥润微纳新材料科技有限公司，PM3-020型聚合物磁球，浓度为10mg/mL，粒径为180nm，表面修饰有羧基官能团）作为磁球使用，取2mg磁球，分散磷酸缓冲溶液中，分散液中磁球的浓度为2mg/mL。取0.2mg特异性抗体（溶于1mL的磷酸缓冲液中）与2mg磁球混合，室温下在摇床(200r/min)中保持3h，然后通过磁分离进行清洗，去除未偶联到磁球表面的特异性抗体。接着用浓度为1%（w/v）的牛血清白蛋白溶液（溶于磷酸缓冲液），在37℃下封闭30min，然后通过磁分离进行清洗，洗去多余的牛血清白蛋白溶液，即得到免疫磁球。
本制备实施例得到使用抗体1制备的免疫磁球1。
实施例1
将大肠杆菌O157（Escherichia coli,O157:H7）（购自ATCC，货号43895）在LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L）中培养至对数期，用LB培养基调整菌体浓度至103个/mL，作为含有大肠杆菌O157活菌体的阳性样品。
将上述阳性样品经过高压灭活（121℃，15min）后得到不含有大肠杆菌O157活菌体，但含有103个/mL死菌体的阴性样品。
将阳性样品与阴性样品进行等体积混合，即得到含有5×102个/mL的死菌体和5×102个/mL的活菌体的混合样品。
分别将1mL的阳性样品、阴性样品和混合样品与免疫磁球1（以磁球的重量计，15mg）混合，得到混合后的物料，在27℃下孵育30min，然后在分选磁场中固定免疫磁球，洗脱未吸附在免疫磁球上的物质，得到洗脱后的免疫磁球和洗脱下来的物料。
使用购自天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302），按照其说明书的操作方法，对洗脱后的免疫磁球和洗脱下来的物料分别进行提取DNA的操作，分别得到富集在免疫磁珠上的物料中的DNA样品和富集剩余的物料中的DNA样品，将它们作为模板样品。使用如SEQ ID NO:1所示的正向引物（5’-AATAGCCTGGTAGTCTTGT-3’）和如SEQ ID NO:2所示的反向引物（5’-GTTTGATAAATCGTGGTCT-3’）对模板样品进行PCR扩增（实时定量PCR，使用外参校正Ct值），结果如表1所示。
按照GB/T4789.36-2008中规定的方法（食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验第一法常规培养法），分别对在免疫磁珠上的物料和富集剩余的物料进行平板计数法的活菌体数目检测，结果如表1所示。
表1
根据表1的数据可见，PCR定量信号值与平板计数法得到的活菌体数目的变化完全一致。
通过实施例1中表1的结果可见，本发明能够有效地将待测样品中的大肠杆菌O157（Escherichia coli,O157:H7）的死菌体数量和活菌体数量区别开来，由于本发明的方法不需要对待测样品进行菌体培养，从而大大加速和简化了样品中的致病菌的检测。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (4)

1.一种非诊断目的的检测样品中大肠杆菌活菌体的方法，该方法包括：
(1)将能够特异地与大肠杆菌活菌体结合的抗体偶联在磁球上，得到免疫磁球；所述能够特异地与大肠杆菌活菌体结合的抗体不能与死菌体结合且为编号为LS-C128841的LSBIO单克隆抗体，所述大肠杆菌活菌体为大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)，相对于每毫克的磁球，所述抗体的用量为0.05-2mg；
(2)将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合，得到混合后的物料；混合的条件使得当待测样品中存在大肠杆菌活菌体时，免疫磁球能够特异性地吸附大肠杆菌活菌体；
(3)将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免疫磁球，并洗脱未吸附在免疫磁球上的物质，得到洗脱后的免疫磁球；
(4)将吸附在免疫磁球上的物质进行提取DNA的操作，得到模板样品；
(5)使用针对所述大肠杆菌活菌体的特异性引物对模板样品进行PCR扩增，并根据PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样品中的大肠杆菌活菌体的含量，PCR扩增所用的引物包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于每毫升的液体形式的待测样品，以磁球的重量计，所述免疫磁球的用量为10-25μg。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，洗脱所用的液体为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氢二钠和0.038-0.056mol/L的磷酸二氢钠。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述磁球为表面修饰有氨基或羧基的超顺磁性Fe3O4聚苯乙烯复合微球。
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