KR100507399B1 - 진핵생물의 유전자 발현 카세트 및 그의 용도 - Google Patents

진핵생물의 유전자 발현 카세트 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

순차적으로 조작가능하게 연결된 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)의 잠복기-관련 전사체인 P2 영역, 프로모터 및 이형 유전자를 포함하는 발현 카세트. 전기 발현 카세트는 장기간 발현을 목적으로 이형 유전자를 포유동물의 세포로 전달하도록 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터와 연결된다.

Description

진핵생물의 유전자 발현 카세트 및 그의 용도{Eukaryotic Gene Expression Cassette and Uses Thereof}
본 발명은 유전자 발현 카세트에 관한 것이다. 발현 카세트는 진핵생물의 세포에서 이형 유전자의 장기간 발현을 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 유전자 치료, 백신 생산 및 유전자 기능 분석에 사용되는 전기 유전자 발현 카세트에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 전기의 발현 카세트를 포함하는 바이러스 주 및 벡터에 관한 것이다.
헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus, HSV)는 신경영양성 (neurotrophic) 생활방식과 일생동안 신경세포 내에 잠복하여 남아있을 수 있는 능력 때문에 신경계에 적합한 유전자 전달 벡터로 빈번하게 제시되어 왔다. 이러한 특징적 능력이 적절히 개발됨으로써, 뇌에서 타이로신 하이드록실라아제(tyrosine hydroxylase) 또는 GDNF를 발현시켜 효과를 얻은 파킨슨씨병(Parkinson's disease)과 같이, 단 일회의 적용으로 일정 조건에서 일생동안 지속되는 치료 효과를 얻도록 제시하여 왔다.
그러나, 무능력해진 헤르페스 바이러스가 생체 내에서 유전자를 신경계 또는 다른 조직들로 효과적으로 전달할 수 있더라도, 헤르페스의 게놈(genome)으로부터 발현되는 이형 유전자의 전사는 일정하게 단기간(<1 주일) 밖에 지속되지 않는 것으로 나타났다. 헤르페스의 게놈이 바이러스 잠복기 동안 유지되는 전사적 비활성 상태를 택함에 따라 전사가 중단된다. 따라서, 헤르페스 벡터 DNA가 치료될 세포의 일생 동안 세포 내에 유지되더라도, 이형 유전자가 그 당시에 발현되지 않기 때문에 치료의 효과는 단기간에만 나타날 수 있는 것이다.
이것은 곧 바이러스의 전체 잠복기 동안 헤르페스 바이러스 벡터의 잠재력이 치료 효과로 실현되도록 잠복기 내내 활동적으로 유지되는 프로모터 시스템이 개발될 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 프로모터의 바람직한 특성은 처리될 세포, 즉 신경세포, 신경세포의 작은 집합 또는 그 외의 특정 세포형에서만 활성을 제공하여, 잠재적으로 위해할 수도 있는 치료 유전자의 부적절한 발현을 방지할 수도 있다. 따라서, '유전자 치료'는 치료 될 목적 세포에 한정된다.
입가의 발진(HSV-1) 또는 성병(HSV-2)을 일으키는 헤르페스 심플렉스 바이러스는, 피부의 상처 또는 점막의 표면을 통해 감각 신경세포의 신경말단으로 감염되고, 그 후에 세포체의 핵 속으로 이주하여 잠복기를 겪거나 또는 세포 용혈 복제시기를 겪는다. 잠복기 또는 용혈 복제시기의 결정에 영향을 미치는 요인은 잘 알려져 있지 않지만, 비활성 바이러스 벡터의 경우엔 오직 잠복기 경로만이 가능하다.
잠복기 동안 헤르페스의 게놈은 전반적으로 전사적 불활성을 나타낸다. 반면, 게놈 상에 길게 반복되는 영역 안에 포함된 작은 영역이 전사되어 잠복 연관 전사체(latency associated transcripts, "LATs")를 생산해 내는데, 하기에서는 HSV-2도 유사하나, HSV-1에 대하여 보다 구체적으로 설명한다. LATs는 두 가지로 분류되는데, 그 하나는 거대한 약 8kb의 전사체로서, TATA를 포함하는 프로모터로부터 낮은 빈도로 전사되며(참조: Coffin, R. S. and Latchman, D. S., Genetic manipulation of the nervous system, Academic Press: London, 99-114, 1996) 이하 'LAT P1'로 명명한다. 다른 하나는 더 작은 약 2kb 및 1.5kb에 해당하는 다량의 전사체로, 더 큰 전사체로부터 스플라이스 되도록 안정화된 내포 인트론으로 여겨진다. 1.5kb의 전사체는 신경세포 내에서만 발견되고 잠복기 동안 그 발현빈도가 높아진다. 약한 프로모터 활성을 나타내는 두 번째 영역(참조: Goins, W. F. et al., J. Virol., 68:2239-2252, 1994)은 이하 'LAT 2'로 명명되며, 이는 LAT P2 및 2kb LAT의 시작지점 사이에 위치하는 것으로 밝혀졌고, 이것은 특정한 조건에서 개별적인 전사체로 발현될 수 있다는 것을 제시한다.
바이러스의 게놈으로 삽입된 이형 유전자의 장기간 발현을 이끌기 위해 LAT 프로모터 영역이 사용되었고, 이것은 어느 정도 성과를 거두었다. LAT P1 프로모터의 사용은 단기간에 높은 발현을 이끌지만 몇 일 후에는 곧 전사가 불활성화 되었다. 내인성 LAT P2 프로모터의 다양한 위치에 삽입된 이형 유전자는 장기간 동안 활성을 제공하나, 이 활성은 매우 약하다(참조: Coffin, R. S. and Latchman, D. S., Genetic manipulation of the nervous system, Academic Press: London, 99-114, 1996). 이와 유사하게, lacZ의 코딩 부분에 연결된 LAT P2 프로모터로 구성된 LAT 영역을 포함하지 않는 장소에 삽입되어진 구조(당단백질 C 영역)는 생체 외의 후근 신경절에서 장기간의 활성도를 제공하는 것으로 보고되었으나, 그 활성도는 매우 약하였다(참조: Goins, W. F. et al., J. Virol., 68:2239-2252, 1994).
발명의 요약
본 발명은 순차적으로 조작가능하게 연결된 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus)의 LAT P2 영역, 프로모터 및 이형 유전자를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 본 발명은 LAT P2 영역이 연접한 프로모터에 장기간의 활성을 제공하는 놀라운 발견을 근거로 하고 있다. 중요한 것은, LAT P2 영역과 이형 유전자의 발현을 촉진시키는 연접 프로모터를 사용함으로써 이형 유전자의 장기간 발현 뿐 아니라 높은 발현량의 결과를 이끌어내는 것이다. 또한, 하나의 LAT P2 요소는 한 쌍의 프로모터로부터 장기간 발현을 촉진하도록 사용될 수 있다. 여기에서, 가운데에 위치한 하나의 LAT P2 요소의 측면에 서로 역방향으로 마주보도록 두 개의 프로모터를 위치시켜 그와 연결된 두 개의 이형 유전자를 장기간 발현시킬 수 있다.
LAT P2(참조: Coffin, R. S. and Latchman, D. S., Genetic manipulation of the nervous system, Academic Press: London, 99-114, 1996) 또는 LAP 2 프로모터(참조: Goins, W. F. et al., J. Virol., 68:2239-2252, 1994) 라고 명명된 HSV의 게놈 상의 일부분 자체는 잠복기에 프로모터의 활성을 제공하지 않는다고 가정되었다. 이에 대신하여, 인접한 프로모터로부터, 전사적으로 불활성적인 잠복기의 게놈에 지속적인 전사를 허용하는 주변지역에, 변형된 DNA구조를 제공한다.
전기 발현 카세트를 포함하는 바이러스 주, 특히 HSV 주를 구성하는 핵산 구조는 파킨슨씨병(Parkinson's disease), 척수의 손상 또는 뇌졸중 등의 신경계 질병 또는 안구, 심장 또는 골 근육의 질병 또는 악성종양 등의 질병 또는 부상을 치료하는 방법에서 치료 유전자를 전달하는 것, 또는 백신의 목적으로 특정 항원을 코딩하는 유전자를 전달하는 실례에 사용되어 질 수 있다.
또한, 본 발명은 진핵세포, 특히 포유동물의 세포에서 유전자의 기능을 연구하는 방법, 즉, 세포의 기능부전을 보완하는 유전자의 확인 또는 야생형 또는 변이형 세포에서 변이 유전자를 발현시켜 그 효과를 연구하는 것과 관련이 있다. 특히, 본 발명의 방법은 질병과 관련된 유전자의 기능을 연구하도록 사용될 수 있다.
본 발명은 순차적으로 조작가능하게 연결된 HSV 잠복기 연관 전사체인 P2 영역, 프로모터 및 이형 유전자를 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 전기 프로모터는 바람직하게는 비잠복기 연관 전사체의 프로모터이며, 보다 바람직하게는, 바이러스의 프로모터 또는 동물의 프로모터이다. 전기 프로모터는 바람직하게는 중추 또는 말초 신경계에서 유래한 동물세포 또는 눈, 심장 또는 골 근육 등의 동물세포, 보다 바람직하게는 중추 또는 말초 신경계에서 유래한 동물세포에서 이형 유전자의 발현을 가능하게 하는 바이러스의 프로모터 또는 동물세포의 프로모터라는 이점이 있다. 프로모터는 유도될 수 있고 또는 조직 특이적(tissue specific)일 수 있다.
본 발명의 발현 카세트를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터, 바람직하게는 바이러스 주, 보다 바람직하게는 HSV 주 등은 그것이 발현될 동물세포에 전달되도록 사용될 수 있다. 이러한 발현 카세트 및 벡터들은 매우 다양한 용도, 예를 들면, 유전자 치료, 백신, 세포 내/외의 분석 방법 또는 유전자 기능의 연구 등에 유용하다.
'이형 유전자'는 HSV 게놈 상에서 발견되지 않는 모든 유전자를 포함한다. 이형 유전자는 야생형 유전자의 어느 형질 변형체 또는 변이 유전자일 수 있다. 이형 유전자는 바람직하게는 세포 독성물, 또는 프로드럭의 전구체를 세포 독성물로 전환시킬 수 있는 치료용 폴리펩타이드를 코딩한다.
유전자 치료 및 다른 치료의 용도에서 다수의 유전자의 삽입을 필요로 할 경우가 있다. 다수의 유전자 발현은 다수의 신경 영양 인자를 사용하는 것처럼, 다양한 조건을 처리할 수 있다는 이점이 있다. HSV는 특히 다른 바이러스 벡터계처럼 제한된 팩키징 능력을 가지지 않기 때문에 적합하다. 따라서, 다수의 이형 유전자가 HSV의 게놈 안에 수용될 수 있다. 이를 실행하기 위해 적어도 두 가지의 방법을 예로 들 수 있다. 우선, 본 발명의 하나 이상의 발현 카세트가 특정한 HSV 주로 도입될 수 있으며, 각각의 발현 카세트는 하나의 이형 유전자를 포함할 수 있다. 이와 다른 방법은, 서로 역방향으로 위치한 한 쌍의 프로모터(서로 동일 또는 상이한 프로모터) 사이에 LAT P2 인자가 삽입된 것인데, 이들 프로모터들은 각각 하나의 이형 유전자(서로 동일 또는 상이한 유전자)의 발현을 촉진할 수 있다.
이에, 본 발명은 순차적으로 조작가능하게 연결된 HSV LAT P2 영역, 두 번째 프로모터 및 두 번째 이형 유전자의 역방향에 첫 번째 프로모터 및 첫 번째 이형 유전자를 포함하는 발현 카세트를 또한 제공한다. 두 번째 프로모터는 첫 번째 프로모터와 서로 동일 또는 상이할 수 있다. 두 번째 이형 유전자는 첫 번째 이형 유전자와 서로 동일 또는 상이할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 첫 번째 프로모터로서 LAT 프로모터를, 두 번째 프로모터로서 P1 프로모터를 사용할 수 있다.
요약하면, 전기 배열은 LAT P2 영역의 측면에 서로 역방향을 향하고 있는 한 쌍의 프로모터/이형 유전자 구조를 제공하고, 그 한 쌍의 유전자의 장기간 발현을 가능하게 하는데, 서로 동일 또는 상이한 프로모터에 의해 발현이 촉진되는 두 유전자는 서로 동일 또는 상이할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 첫 번째 발현 카세트의 종류는 하나 또는 그 이상의 두 번째 발현 카세트의 종류와 함께 HSV 주의 게놈에 삽입되도록 하는 조합적인 접근이 사용될 수 있다. 결과적으로, "발현 카세트"는 여러 종류의 다수의 발현 카세트로 구성된 적절한 참고 그룹에서 선택되어져야 한다.
본 발명은 사람과 동물의 치료 용도로 사용되는 발현 카세트를 포함하는, 발현 카세트 및 벡터, 특히 HSV 주의 사용을 추가로 제공한다. 예를 들면, 발현 카세트를 포함하는 HSV 주는 파킨슨씨병, 척수의 손상 또는 뇌졸중과 같은 신경계 질병 또는 안구, 심장 또는 골 근육의 질병 또는 손상 또는 악성종양의 치료법으로 사용되어 질 수 있다. 이러한 HSV 주는 사람 또는 동물 세포 내에서 용혈 사이클(lytic cycle)을 겪는 것이 불가능하도록 약독화 될 것이다.
본 발명의 발현 카세트는 또한 진핵세포, 특히 포유동물세포에서 유전자의 기능을 연구하는 방법, 예를 들면 세포의 기능부전을 보완하는 유전자의 확인, 또는 야생형 또는 변이형 동물세포에서 변이 유전자를 발현시켜 그 효과를 연구하는 용도로 쓰일 수 있다. 본 발명의 방법은 특히 질병과 관련된 유전자의 기능 연구에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 바이러스 주, 바람직하게는 HSV 주를 제공하는 방법을 제공하고, 이는 본 발명의 발현 카세트를 바람직하게 상동 재조합으로 바이러스 주의 게놈에 삽입하는 방법을 포함한다.
A. 발현 카세트 - LAT P2 영역, 프로모터(들), 이형 유전자(들)
본 발명의 발현 카세트는 순차적으로 조작가능하게 연결된(operably linked) LAT P2영역, 프로모터 및 이형 유전자를 반드시 포함한다. "조작가능하게 연결된(operably linked)"것은 그 구성 요소들이 의도된 바에 따라 기능하도록 연결된 삽입기복판위치(juxtaposition)를 의미한다. 보다 구체적으로, 이형 유전자 배열에 조작가능하게 연결된 프로모터는 이형 유전자가 프로모터로부터 발현이 유도되는 조건하에서 그 유전자의 발현이 이루어지는 방법으로 연결된 것이다.
또한, 발현 카세트는 순차적으로 조작가능하게 연결된 HSV LAT P2 영역, 두 번째 프로모터 및 두 번째 이형 유전자의 그 역방향에 전기 두 번째 프로모터 및 이형 유전자와, 서로 동일 또는 상이할 수 있는 프로모터 및 이형 유전자를 포함하는 첫 번째 프로모터 및 첫 번째 이형 유전자로 구성된 발현 카세트를 추가로 포함한다. 따라서, LAT P2 영역의 양 측면에 서로 역방향을 향하고 있는 한 쌍의 프로모터/이형 유전자 구조는, 서로 동일 또는 상이한 프로모터에 의해 발현이 촉진되는, 서로 동일 또는 상이한 이형 유전자의 장기간 발현을 가능하게 한다. 아울러, 적절한 일정 생리적 조건에서 첫 번째 이형 유전자의 산물은 두 번째 이형 유전자의(또는 그 역으로) 발현을 조절할 수 있다.
"장기간 발현(long-term expression)"은 본 발명의 헤르페스 심플렉스 바이러스에 감염된 세포 안에서 헤르페스 심플렉스가 잠복기에 들어간 이후에 이형 유전자가 발현되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 감염 후 적어도 2 주, 보다 바람직하게는 1 달 또는 2 달 이상, 가장 바람직하게는 세포의 일생 동안 지속될 수 있다.
발현 카세트는 이전의 숙련된 연구자들에 의해 일반화된 클로닝 기술(참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)에 의해 조작되어 질 수 있다.
1. LAT P2 영역
LAT P2 영역은 여기에서 HSV-1 핵산 118,866-120,219(참조: GenBank HE1CG: PstI-BstXI 사이트), HSV-2의 상동지역을 포함한 이 영역의 절편 또는 유도체들로 정의되고, 본 발명의 발현 카세트에서 이형 유전자의 장기간 발현을 가능하게 한다.
2. 프로모터(promoter)
본 발명의 프로모터(promoter)는 HSV의 LAT P2 영역으로 부터 유래되지 않은 전사적 촉진제를 의미한다. "프로모터"는 일반적으로 이전의 실험을 통해 잘 알려져 있으며 최소한의 프로모터에서 상위 요소들과 증폭제까지 포함하는 프로모터에 이르기까지, 그 크기 및 복잡성에서 다양한 핵산 영역을 포함한다. 프로모터는 LAT P2 영역 및 그 하위에 조작가능하게 연결될 수 있다. 또한, LAT P2 영역의 상위에 프로모터를 역방향으로 삽입하여, 두 프로모터의 장기간 활성이 가능하도록 조작가능하게 연결할 수도 있다.
프로모터는 포유동물, 바람직하게는 인간의 세포에 작용하는 프로모터로부터 선택된다. 프로모터는 바이러스 또는 진핵세포의 유전자의 프로모터 염기서열에서 유래될 수 있다. 즉, 이형 유전자의 발현이 일어나는 세포, 바람직하게는 동물의 중추 또는 말초 신경계를 구성하는 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터를 예로 들 수 있다. 진핵세포의 프로모터는 알파 액틴(α-actin), 베타 액틴(β-actin), 튜불린(tubulin) 유전자 등의 프로모터와 같이 어느 세포에서나 편재되어 작용하거나, 아니면, 피루브산 키나아제(pyruvate kinase) 유전자의 프로모터와 같이 조직 특이적으로 작용할 수 있다. 타이로신 하드록시화 효소(tyrosine hydroxylase, TH), L7 또는 신경세포 특이적 에놀라아제(neuron specific enolase, NSE)의 프로모터들과 같은 특정한 신경세포형에서만 활성을 나타내는 프로모터들이 특히 바람직하며, 이들은 스테로이드성 호르몬의 수용체(steroid hormone receptor)에 결합하는 프로모터 처럼 특정한 자극에 대해 반응할 수 있다. 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, MMLV)의 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR) 프로모터, HSV-1 또는 HSV-2 의 LAT P2 프로모터, 라우스육종바이러스(Rous sarcoma virus, RSV)의 LTR 프로모터 또는 인체 거대세포바이러스(cytomegalovirus, CMV)의 IE 프로모터와 같은 바이러스의 프로모터 또한 사용될 수 있다.
또한, 프로모터는 세포의 일생 동안 이형 유전자의 발현정도가 조절될 수 있도록 유도가능(inducible)하므로 유리하다. '유도가능'이라는 의미는 프로모터를 사용하여 얻어지는 발현의 정도가 조절된다는 것이다. 예를 들어, 바람직한 실시태양에 있어서, 하나의 LAT P2 영역의 양 측면에 두 개의 프로모터가 역방향으로 위치하고 있으며, 그 중의 한 프로모터는 기보고된 바(참조: Gossen, M. and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:5547-5551, 1992; Gossen, M. et al., Science, 268:1766-1769, 1995)와 같이, tet 리프레서/VP16 전사 촉진인자의 융합단백질을 관리하는 프로모터를 포함하고, 조절될 이형 유전자의 발현을 촉진한다. 또 다른 프로모터는 CMV의 IE 프로모터와 같이 tet 리프레서/VP16 융합단백질의 발현을 촉진하는 보다 강한 프로모터를 포함한다. 이 경우에서는 첫 번째 이형 유전자의 발현이 테트라사이클린(tetracycline)의 존재 유무에 따라 검정된다.
또한, 이러한 프로모터들은 증폭제 염기서열과 같은 조절인자를 추가로 첨가하여 변형시킬 수 있다. 앞에서 제시한 상이한 두 가지 이상의 프로모터들의 염기서열 요소를 포함하는 잡종 프로모터 또한 사용될 수 있다.
3. 이형 유전자
"핵산(nucleic acid)"은 리보핵산, 디옥시리보핵산 및 그로부터 유래된 유사체를 포함한다. "이형 유전자"는 HSV 게놈에 존재하는 유전자 이외의 모든 유전자를 포함한다. 이형 유전자는 야생형 유전자의 형질 변이형 또는 변이형 유전자일 수 있다. "유전자(gene)"는 적어도 전사될 수 있는 핵산의 염기서열을 의미한다. 따라서 염기서열은 이 의미 안에서 mRNA, tRNA 및 rRNA를 코딩하는 유전자를 포함한다. 안티센스의 제조는 잘 알려진 방법에 따라 세포 안의 어떤 유전자 발현을 억제하도록 사용될 수 있다. mRNA를 코딩하는 염기서열은 전사되지만 해독되지 않는 측면이거나, 해독되는 코딩 염기서열과 연결된 5' 및/또는 3' 의 일부 또는 전체를 선택적으로 포함할 수 있다. 추가로, 전사 중단신호, 폴리아데닐화 장소 및 증폭요소의 하위부분과 같이, 전사되는 염기서열에 원래 연결되어 있던 전사 조절 염기서열을 선택적으로 포함할 수 있다.
이형 유전자는 세포 분열의 조절에 관여하는 단백질, 신경영양성요인(뇌인 신경영양성요인(brain-derived neurotrophic factor), 신경교세포유래 신경영양성요인(glial cell derived neurotrophic factor), NGF, NT3, NT4 및 NT5), 사이토카인(α-, β- 또는 γ-인터페론, IL-1, IL-2와 같은 인터류킨, 종양괴사인자 또는 인슐린 유사 성장인자 Ⅰ 또는 Ⅱ), 단백질 키나아제(MAP 키나아제), 단백질 탈인산화제 및 그러한 요소들을 위한 세포 수용체 등과 같은 성장인자들을 코딩할 수 있다. 이형 유전자는 아미노산 생합성 또는 분해 관여 효소(타이로신 하이드록실라아제), 퓨린 또는 피리미딘 생합성 또는 분해 및 도파민과 같은 신경전달체의 생합성과 분해 등의 세포 대사 과정에 관여하는 효소들, 또는 단백질 키나아제 및 탈인산화제같이 상기한 작용의 조절에 관여하는 단백질도 코딩할 수 있다. 그 밖에도, 이형 유전자는 Bm3 단백질 군, Rb 또는 p107과 같은 Rb 단백질 군의 포켓 단백질, 로돕신과 같은 막 단백질, 디스트로핀과 같은 구조 단백질, 또는 hsp70과 같은 열쇼크 단백질 등과 같이 전사 인자 또는 전사인자의 조절에 관여하는 단백질을 코딩할 수 있다.
이형 유전자는 바람직하게는 치료용 또는 질병과 관련된 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 전기 단백질의 예로, 타이로신 하이드록실라아제(tyrosine hydroxylase) 및 신경교세포유래 신경영양성요인(glial cell derived neurotrophic factor)은 파킨슨씨병(Parkinson's disease)의 치료 용도로 사용될 수 있고, 로돕신(rhodopsin)은 안구장애의 치료 용도로 사용될 수 있고, 디스트로핀(dystrophin)은 근육 영양장애의 치료 용도로 사용될 수 있으며, 열쇼크단백질(heat-shock protein)은 심장질환 및 국소빈혈과 연관된 뇌 기능장애의 치료 용도로 사용될 수 있다. 치료용의 폴리펩타이드는 리신(ricin)과 같은 세포 독성의 폴리펩타이드 또는 프로드럭의 전구체를 세포 독성물로 전환시킬 수 있는 효소를 포함하며, 그 예로써, 바이러스 통제 효소 프로드럭 치료법 또는 유전자 통제 효소 프로드럭 치료법이 있다. 후자의 경우, 효소가 세포 표면으로 향하게 하도록, 바람직하게는 효소를 세포막에 정박한 채로 세포 표면의 바깥쪽으로 노출시키도록 하는 신호 염기서열을 가지고 있음을 확인할 수 있기 때문에 적합하다. 적절한 효소로, WO93/08288에서 밝혀진 E.coli의 질소환원효소(nitroreductase)와 같은 미생물의 질소환원효소 또는 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase), 특히 WO88/07378에서 밝혀진 카르복시펩티다아제 CPG2가 있다. 적절한 프로드럭으로는 질소머스터드 프로드럭(nitrogen mustard prodrug) 및 WO88/07378, WO89/10140, WO90/02729 및 문헌으로 채택된 WO93/08288 등에서 보고된 화합물들을 들 수가 있다.
또한, 이형 유전자는 백신 용도의 항원성 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 이러한 항원성 폴리펩타이드는 바람직하게는 미생물 또는 바이러스와 같은 병원체 또는 종양으로부터 유래된다.
또한, 이형 유전자는 표지 유전자(β-갈락토시다제(galactosidase) 또는 녹형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)) 또는 다른 유전자의 발현을 조절하는 단백질(상기한 tet 리프레서(repressor)/VP16 전사 촉진인자의 융합 단백질과 같은 전사 조절 인자)을 생산하는 유전자를 포함할 수 있다.
B. 벡터
발현 카세트는 핵산 구조체 자체의 형태로 사용될 수 있으며, 그 외에, 다양한 핵산 벡터에 삽입될 수도 있다. 이러한 벡터로서, 바이러스 벡터, 바람직하게는 HSV 벡터를 들 수 있다. 벡터는 발현 카세트의 양 말단에 진핵세포의 게놈, 바람직하게는 동물세포의 게놈 또는 바이러스의 게놈의 염기서열과 상동인 염기서열을 추가로 포함한다. 이것은 상동 재조합으로 진핵세포 또는 바이러스의 게놈 안에 발현 카세트가 삽입되게 한다. 바이러스의 염기서열, 바람직하게는 HSV-1 또는 HSV-2와 같은 바이러스의 염기서열을 양 말단에 가지는 발현 카세트로 조작된 플라스미드 벡터는 포유동물의 세포에 전달하기 위한 바이러스 벡터, 바람직하게는 HSV 벡터로 적합하게 사용될 수 있다. 이 사실은 하기 헤르페스 심플렉스 바이러스 부분에서 자세히 설명된다. 그러나, 사용된 기술은 자명하고, 아데노바이러스(adenovirus)와 같은 다른 바이러스에도 적합할 것이다. 자신의 게놈을 숙주 세포의 게놈 안으로 삽입할 수 있는 바이러스 벡터와 같이 적절한 그 이외의 바이러스 벡터로써, 렌티바이러스(lentiviruses), 아데노 연합 바이러스(adeno-associated virus) 등과 같은 레트로바이러스(retroviruses)를 예로 들 수 있다.
C. 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터
1. 바이러스 주
본 발명의 발현 카세트를 포함하는 HSV 주는 HSV-1 또는 HSV-2 주, 또는 그들의 유도체들, 바람직하게는 HSV-1로 부터 유래될 수 있다. 유도체에는 HSV-1 또는 HSV-2 주의 DNA를 포함하는 인터형 재조합(inter-type recombinants)이 해당된다. 유도체는 HSV-1 또는 HSV-2의 게놈과 바람직하게는 적어도 70%의 상동 염기서열을 가지고, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%의 상동 염기서열을 가질 수 있다.
치료 과정에서 HSV 주를 사용할 때는 바이러스가 용혈 사이클로 들어가지 않도록 약독화하는 과정이 요구된다. 특히, HSV 벡터가 사람의 유전자 치료 용도로 사용될 때에는 발현 카세트는 바람직하게는 반드시 필수 유전자 사이로 삽입되어야 한다. 이는 벡터 바이러스와 야생형의 바이러스가 만날 경우, 이형 유전자는 야생형 바이러스로 재조합되어 전달될 수 있기 때문이다. 하지만 이형 유전자가 필수 유전자 사이로 삽입되는 한, 이러한 재조합 전달은 수용한 바이러스 안에서 필수 유전자를 삭제할 뿐 아니라, 이형 유전자의 복제를 이끄는 야생형 바이러스 군으로 "이탈(escape)"하는 이형 유전자를 예방할 수 있다.
약독화 된 바이러스 주들은 본 발명의 HSV 주를 생산하도록 사용되어졌고 그 예로, ICP34.5 또는 ICP27의 변이를 가진 주를 포함하는데, 특히 1716 주(참조: MacLean, A. R. et al., J. Gen. Virol., 72:632-639, 1991), R3616 및 R4009 주(참조: Chou, J. and Roizman, B., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:3266-3270, 1992) 및 R930(참조: Chou, J. et al., J. Virol., 68:8304-8311, 1994) 등이 있고, 이들은 모두 ICP34.5 및 ICP27 부분이 삭제된 d27-1에 변이를 가진다. 본 발명의 HSV 주를 생산하기 위해 ICP4, ICP0, ICP22, ICP6, ICP47, vhs 또는 gH가 삭제되고 VMW 65의 비활성 변이를 가지는 주 또는 이들의 조합도 사용될 수 있다.
다양한 HSV 유전자를 설명하는 용어는 코핀(Coffin) 및 래치만(Latchman)의 문헌(참조: Coffin, R. S. and Latchman, D. S., Genetic manipulation of the nervous system, Academic Press: London, 99-114, 1996)을 참조할 수 있다.
2. 상보적인 세포주(complementary cell lines)
ICP27에 결함을 가진 HSV는 ICP27을 발현하는 V27 세포(참조: Rice, S. A. and Knipe, D. M., J. Virol., 64:1704-1715, 1990), 2-2(참조: Smith, I. L. et al., Virology, 186:74-86, 1992) 또는 B130/2(예로 들어진)와 같은 세포주, 특히 B130/2 세포에서 증식된다.
동물세포, 바람직하게는 Vero 또는 BHK 세포에 전기 세포에서 발현될 수 있는 기능성의 HSV의 ICP27 유전자를 포함한 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터 및 네오마이신 저항성과 같이 선택가능한 표지를 코딩하는 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터를 공동 트랜스펙션하여 ICP27 발현 세포주가 생산될 수 있다. 선택가능한 표지를 가지고 있는 클론은, 여러 숙련자들이 수행한 방법(참조: Rice, S. A. and Knipe, D. M., J. Virol., 64:1704-1715, 1990)을 사용하여, ICP27 돌연변이형 HSV 주의 성장을 보조할 수 있는지의 여부에 따라 기능적인 ICP27을 가지고 있는지 검정하기 위해 계속 스크린(screening)된다.
기능적인 ICP27 유전자를 포함한 벡터가 ICP27 변이형 바이러스에 남아있는 염기서열과 즉, 상동인 염기서열을 포함하지 않도록 확인하여, 앞서 설명된 바와 같이, ICP27 변이형 HSV 주가 기능적인 ICP27을 가지는 바이러스 주로 전이되지 않는 세포주가 생산된다.
본 발명의 HSV 주는 ICP4와 같은 필수 유전자에 대한 불활성적 변화를 가지고 있고, 상보적인 세포주는 ICP27의 경우에서 설명된 것과 같은 방법으로 변화된 필수 유전자를 보완하는 기능적인 HSV 유전자를 포함한다.
3. 돌연변이의 제작방법
HSV 유전자는 잘 알려진 몇 가지의 실험 기술에 의해 기능적으로 불활성화 될 수 있다. 예를 들면, 이들은 삭제, 치환 또는 삽입, 바람직하게는 삭제하여 기능적으로 불활성화 될 수 있다. 삭제는 유전자 전체 또는 일부가 제거 될 수 있다. 삽입되는 염기서열은 상기한 발현 카세트를 포함할 수 있다.
HSV 주의 돌연변이는 이전 실험에서 숙련자들에게 잘 알려진 바와 같이 상동 재조합으로 만들어진다. 예를 들면, HSV 게놈의 DNA가, HSV와 상동인 염기서열을 양쪽 말단에 가지는 돌연변이 염기서열을 포함한 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터와 함께 트랜스펙션된다. 변이된 염기서열은 삭제, 삽입 또는 치환된 것으로, 이 모든 변형은 일반적인 실험방법을 따른다. 삽입에는 β-갈락토시다제의 활성을 스크린하기 위해 lacZ를 포함시키는 것처럼 재조합 바이러스를 스크린 하기 위해 선택가능한 표지 유전자(selectable marker genes)를 포함시킨다.
돌연변이는 또 다른 HSV의 유전자인 ICP0, ICP4, ICP6, ICP22, ICP47, VMW65, gH 또는 vhs에도 만들어 질 수 있다. VMW65 유전자의 경우엔 필수적인 구조 유전자를 코딩하므로 유전자 전체가 삭제되지 않으나, IE 유전자를 전사적으로 활성화시키는 VMW65의 능력이 불활성화 되도록 작은 삽입으로 돌연변이가 만들어진다(참조: Ace, C. et al., J. Virol., 63:2260-2269, 1989).
4. 발현 카세트를 포함하는 HSV 주
발현 카세트가 HSV의 어느 위치에 삽입이 되면 바이러스는 계속 증폭되는 것으로 가정되고, 만약 이형 유전자가 필수 유전자에 삽입되었을 경우엔 다른 HSV의 필수 유전자를 전달하는 세포주(2에 설명된 바와 같음)를 필요로 한다. 예를 들면, 만약 이형 유전자가 HSV 주의 ICP27 유전자로 삽입될 경우엔 ICP27을 발현하는 세포주가 필요하게 된다. ICP27이 변이된 영역으로 발현 카세트가 바람직하게 삽입되는 현상은 돌연변이가 야생형 바이러스와의 재조합에 의해 복구되는 것만큼 드물게 나타나는 현상으로, 복구작업을 통해 삽입된 발현 카세트를 제거할 수 있다.
상기 돌연변이 제작과정에서 언급한 바와 같이, HSV 주 및 HSV 염기서열을 말단에 포함한 발현 카세트로 구성된 플라스미드 벡터를 상동 재조합하여 HSV에 발현 카세트를 삽입할 수 있다. 발현 카세트는 이전의 잘 알려진 클로닝 기술을 사용하여 HSV 염기서열을 포함하는 적절한 플라스미드 벡터 안에 삽입될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 하나 이상의 발현 카세트를 바이러스 게놈으로 삽입하여 바이러스 벡터가 하나 이상의 발현 카세트로 조작될 수 있다.
내인성의 LAT P2 영역의 하위에 이형 유전자가 순차적으로 조작가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 클로닝 조작 방법으로 내인성의 LAT P2 영역을 이용하는 것도 또한 가능하다. 그 외에, LAT P2영역의 상위에 그의 역방향으로 클론되는 것도 가능하다. 결과적으로, 바이러스는 본 발명의 발현 카세트를 포함하게 되나, 위에서 설명된 것과는 약간 다른 방법으로 생산된다.
D. 투여
따라서, 본 발명의 발현 카세트는 치료를 필요로 하는 사람 또는 동물에게 치료 유전자를 전달하는 용도이다. 특히, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 신경영양적 특성은, 파킨슨씨병(Parkinson's disease), 신경계 장애, 척수 손상, 뇌졸중 또는 교종 같은 종양 등의 치료법에 이상적으로 적합한 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 약독화 된 HSV 주의 사용을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 발현 카세트는 백신의 목적으로 사용하기 위해 잠재적인 면역원의 폴리펩타이드를 코딩하는 전달 유전자로 쓰일 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는 핵산 구조 그대로 직접 적용될 수 있고, 바람직하게는 숙주 세포의 게놈에 상동인 염기서열을 추가로 양쪽 말단에 포함한다. 동물 세포가 핵산 구조 그대로 흡수하는 것은 리포펙틴(lipofection) 및 바이오리스틱(biolistic) 형질전환과 같은 몇 가지의 알려진 기술에 의해 강화된다.
그 외에도, 발현 카세트는 플라스미드 벡터 또는 바이러스, 바람직하게는 HSV 벡터와 같은 핵산 벡터의 한 부분으로 삽입될 수 있다.
전달 운송체계(즉, 발현 벡터를 포함하는 핵산구조 그 자체 또는 바이러스 벡터)는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 약제학적 구성요소를 생산해 내는 부형제와 함께 바람직하게 화합된다. 적절한 담체 및 부형제로서 인산완충식염수와 같은 등장 식염수가 있다. 그 조성물은 구체적으로 비경구적, 근육 내, 정맥 내, 두개골 내, 피하, 안구 내 또는 경피적으로 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 위와 같은 방법으로 투여되어 유전자 치료를 위한 치료 유전자를 함유하고 있는 발현 카세트가 세포의 적합한 장소에 삽입될 수 있도록 한다. 예를 들면, 유전자 치료의 표적이 중추 또는 말초 신경계이고, 발현 카세트가 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터에 의해 전달될 때, 그 조성물은 시냅틱 말단에 위치하여 바이러스가 말단으로 흡수된 후, 축색돌기의 역행적 수송을 통해 축색에서 세포체에 도달하는 역행적인 방법으로 운송되게 한다. 약제학적 조성물은 전형적인 정뇌위 접종법으로 뇌에 투여된다. 약제학적 조성물이 안구에 투여될 경우, 전형적으로 망막 내 주사 방법이 사용된다.
발현 카세트가 바이러스 벡터에 의해 세포에 전달될 때, 바이러스의 양은 103 내지 1010, 바람직하게는 105 내지 108, 보다 바람직하게는 106 내지 107 pfu의 범위에서 투여되고 이 때, 보통 1 내지 10㎕의 바이러스가 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 투여된다.
발현 카세트가 핵산 구조체 만으로 투여될 때에, 투여되는 핵산의 양은 보통 1 ㎍내지 10㎎, 바람직하게는 100㎍ 내지 1㎎ 범위이다.
이형 유전자가 유도 가능한 프로모터의 조절 하에 있는 조건에서는, 치료되는 동안에만 유전자 발현이 유도되어야 한다. 일단 이러한 조건에서는, 유도제가 제거됨에 따라 이형 유전자의 발현이 멈추어진다. 이것은 명백한 임상적인 장점을 가질 것이다. 예를 들면, 이러한 시스템은 앞에서 설명한 바와 같이 tet 리프레서/VP16 융합단백질의 유전자 발현을 활성화 시키기 위해 테트라사이클린을 투여하는 방법을 포함할 수 있다.
조직 특이적인 프로모터의 사용은 본 발명의 발현 카세트를 이용하여 질병을 치료하는 데에 도움이 될 것이다. 예를 들면, 몇 가지의 신경 장애는 오직 한 세포의 작은 부분에서 비정상적으로 발현되는 특정 유전자의 산물에 기인한다. 이와 관련하여, 다른 세포형에서 발현될 경우 독성을 나타내는 치료 유전자를 영향을 받는 세포형에서만 발현시키는 것이 이로울 것이다.
숙련된 실험자일 경우, 특정 환자 및 조건에 적합한 투여 경로 및 투약량 결정이 용이하므로, 상기한 투여 경로 및 투약량은 단지 참고로 하기 위한 것이다.
E. 분석 방법
본 발명의 발현 카세트는 과학적인 연구의 방법에도 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 진핵세포, 바람직하게는 동물세포 안 또는 밖에서의 유전자 기능을 분석하는 방법에 관한 것이다. 이형 유전자의 기능은,
(a) 전기 이형 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 카세트를 진핵세포에 주 입; 및,
(b) 전기 이형 유전자 발현의 영향을 전기 세포에서 검정하는 단계를 통해 분석이 가능하다.
세포 분열 시에 온도 감수성(temperature-sensitive)의 결함을 가지는 세포를 예로 들 수 있다. 본 발명에 의한 이형 유전자를 포함하는 발현 카세트가, 결함을 가지는 세포로 도입된 후 제한된 온도에서 세포가 성장될 경우에, 숙련자라면 그 이형 유전자가 세포 분열 시에 나타나는 결함을 보완할 수 있는지의 여부를 쉽게 검정할 수 있을 것이다. 이와 비슷하게, 세포 안에서 발견되는 돌연변이의 표현형을 바로 잡을 수 있는 이형 유전자가 발현되는 지의 여부를 검정하기 위해, 그 외의 알려진 기술이 적용될 수 있다.
상기 방법은, 이형 유전자의 체계적인 돌연변이를 유발하여 그 유전자의 어느 부분이 돌연변이 표현형의 복구에 관련된 단백질의 일부를 코딩하는 지를 확인하는 데에도 이용될 수 있다.
또한, 상기 방법은 소위 "유전자 넉아웃(gene knock-outs)"이 된 마우스와 같은 동물에 사용될 수 있다. 야생형의 이형 유전자는 본 발명의 발현 카세트를 이용하여 동물에 도입될 수 있고, 이전 기술에서 알려진 다양한 행동, 조직화학 및 생화학적인 방법으로 동물에 대한 효과가 검정될 수 있다. 또 다른 방법으로, 질병 관련 병원체가 유도되는 지의 여부를 판단하기 위해 돌연변이의 이형 유전자가 야생형 또는 "유전자 넉아웃" 동물에 도입될 수 있다. 즉, 설치류의 중추 신경계에서 크로이츠펠트야콥병(Creutzfeld-Jacob) 및 다른 프리온형(prion-type) 질병을 유도하기 위해 프리온을 코딩하는 유전자를 사용하는 것을 그 예로 들 수 있다. 그 외의 질병 모델로, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 운동신경세포 질병 또는 파킨슨씨병(Parkinson's disease)를 예로 들 수 있다.
적어도 두 가지의 상이한 이형 유전자를 하나 이상의 발현 카세트를 이용하여 한 세포 내에 도입하는 것이 가능하기 때문에, 두 가지 이상의 유전자 산물 사이의 상호작용도 연구될 수 있다.
즉, 본 발명에서 제공하는 방법은 특히 질병과 관련된 유전자의 기능 연구를 위한 용도로 쓰일 수 있다. 유전자의 기능을 연구하기 위하여 본 발명에서 제공하는 방법을 이용함으로써 특정한 유전자의 일시적인 발현을 조절할 수 있고, 어느 시기의 세포 발생단계에서 조절 가능한지를 확인할 수 있으며 발현되어야 할 유전자를 복구할 수 있다는 이점을 가진다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 내지 8에서는, 장기간 발현을 제공하는 LAT P2 영역의 사용이 다음과 같은 조작을 기반으로 하여 설명된다.
1. ICP34.5가 삭제되고 VMW65 교차 활성적(trans-activating) 활성도가 제거된 바이러스(바이러스 주 1764/pR14)의 LAT 영역으로 부터 lacZ의 장기간 발현을 촉진하는 MMLV LTR 프로모터. 이 때, MMLV LTR/LacZ 카세트는 LTR 영역에서 LAT P2의 바로 후위에 삽입된다.
2. ICP27이 삭제된 바이러스(바이러스 주 17+/D27/pR19lacZ)의 LAT 영역으로 부터 lacZ의 발현을 촉진하는 CMV 프로모터. 이 때, CMV IE 프로모터 lacZ 카세트는 LAT 영역의 LAT P2 바로 후위에 삽입된다.
3. ICP27 유전자좌, 즉 ICP27이 재삭제된 바이러스(바이러스 주 17+/D27/pR20)로 부터 lacZ 발현을 촉진하는 LAT P2/CMV 프로모터. 이 때, 비-LAT 프로모터(non-LAT promoter)에 장기간 발현을 제공하는 LAT P2 프로모터 영역은 다른 LAT 염기서열로 부터 추출되어 사용된다.
4. 측면에 MMLV LTR 프로모터/GFP 카세트 및 LAT P1 프로모터/lacZ 카세트가 각각 하위 및 상위에 역방향으로 위치하며, ICP34.5가 삭제되고 VMW65에 불활성 돌연변이를 가지는 바이러스(바이러스 주 1764/pR20.9)의 UL43 유전자에 삽입된 LAT P2 영역(pR20.9 카세트).
재료 및 방법
바이러스 및 세포주
모든 바이러스는 lacZ의 활성을 위한 X-gal 염색, 용균 정제 및 재조합 바이러스의 올바른 게놈 구조확인을 위한 써던블롯 후에 상동 재조합 하는 표준 방법(예를 들면, Coffin, R. S. and Latchman, D. S., Genetic manipulation of the nervous system, Academic Press: London, 99-114, 1996; Coffin, R. S. et al., Gene Therapy, 3:886-891, 1996)의 절차를 따랐다.
(a) 모 바이러스(parent virus) 및 ICP27-상보적인 세포주:
17+/D27w
표지 유전자를 포함하지 않는 ICP27 삭제 돌연변이는, lacZ가 ICP27의 유전자좌로 삽입되어 X-gal 염색 후 선택된 하얀색 용균으로 미리 생산되었던 ICP27 삭제 바이러스로부터, lacZ 유전자를 제거하기 위한 상동 재조합으로 첫 번째 생산되었으며, 이 모든 과정은 표준 방법을 따랐다. 이 바이러스는 17+/D27w로 명명되었고, ICP27을 코딩하는 염기서열(UL54)을 제거하는 뉴클레오타이드 113,273-117,854 및 비필수적 유전자인 UL55 및 UL56을 삭제하여 ICP27-발현 세포주에서만 자랄 수 있도록 한 부분을 제외하고는 야생형이다. 뉴클레오타이드의 숫자는 HSV-1 주의 17+ 염기서열을 따른다(참조: GenBank no. HE1CG).
ICP27 삭제 바이러스가 생성되었고, 이 바이러스의 원종은 플라스미드 pSG130BS(참조: Sekulovich, R. E. et al., J. Virol., 64:3916-3926, 1988)의 DNA 및 네오마이신 저항성을 코딩하는 플라스미드 pMamNeo(Invitrogen, U.S.A.)를 BHK세포에 공동 트랜스펙션하여, 네오마이신에 대한 저항성으로 선택된 ICP27 상보적인 BHK 세포주 B130/2에서 자라게 하여 마련되었다. 바이러스의 성장을 위해 HSV-1의 ICP27 삭제 돌연변이가 활발하게 성장되는 클론(B130/2)이 선택되었다. pSG130BS는 완전한 ICP27 코딩 염기서열 및 UL55의 일부를 코딩하는 HSV-1의 BamHI/SacI 조각(뉴클레오타이드 113,322-115,743)을 전달한다.
1764
HSV 주 1764는 앞서 보고되었다(참조: Coffin, R. S. et al., Gene Therapy, 3:886-891, 1996). 이 바이러스 주는 ICP34.5를 코딩하는 유전자가 삭제되었고(참조: MacLean, A. R. et al., J. Gen. Virol., 72:632-639, 1991) 비리온 교차활성 단백질인 VMW65를 코딩하는 유전자에 불활성 돌연변이를 가진다(참조: Ace, C. et al., J. Virol., 63:2260-2269, 1989). ICP34.5는 생체 외에서 바이러스 성장에 불필요하고 VMW65는 배지에 헥사메틸렌-비스아세타마이드(hexmethylene- bisacetamide)의 포유물이 보충될 경우(참조: McFarlane, M. et al., J. Gen. Virol., 73:285-292, 1992) BHK 세포에서 자랄 수 있다.
실시예 1: 1764/pR14의 조작
바이러스 주 1764/pR14는, 정제된 1764 게놈의 DNA 및 pR14 플라스미드를 BHK 세포에 공동 트랜스펙션하여 X-gal 염색 후 선택된 푸른색 용균으로부터 생산되었다. pR14은 MMLV-LTR/lacZ의 염기서열을 pNot 3.5에 삽입하여 생산되었다. pNot 3.5는 HSV-1의 LAT 영역(뉴클레오타이드 118429-122025)에서 유래하여 pGEM5 (Promega, U.S.A.)의 NotI 사이트에 클론된 3.5kb의 NotI 절편을 포함한다. MMLV LTR/lacZ의 삽입은 두 단계로 이루어진다.
1: pCH110(Promega, U.S.A.)의 lacZ유전자(HindIII-BamHI)는 pJ4(MMLV LTR프로모터/다중연결체(polylinker)/SV40폴리A염기서열을 포함; 참조: Morgenstern, J. P. and Land, H. A., NAR, 18:1068, 1990))의 HindIII사이트에 삽입되어, pJ4lacZb가 작제된다.
2: pJ4lacZ를 NheI 및 PstI으로 절단하여 얻어낸 MMLV LTR/lacZ폴리A는 pNot 3.5의 BbsI 사이트(LAT P2의 후위)에 삽입되어, pR14가 작제된다. 정위(orientation): LAT P1/LAT P2/LTR/lacZ.
실시예 2: 17+/D27/pR19lacZ의 조작
바이러스 주 17+/D27/pR19lacZ는 정제된 17+/D27w 게놈의 DNA 및 pR19lacZ 플라스미드를 B130/2세포에 공동 트랜스펙션하여, X-gal 염색 후 선택된 푸른색 용균으로부터 생산되었다. pR19lacZ는 CMV IE 프로모터/lacZ/폴리A카세트를 pNot 3.5의 BstXI 사이트, 즉 LAT P2의 후위에 삽입되어 생산되었다. 우선, pCH110 (Pharmacia, Sweden)의 lacZ 유전자(HindIII-BamHI)가 pcDNA3(Invitrogen, U.S.A.; CMV IE 프로모터/lacZ/폴리A염기서열을 포함)의 BamHI 및 HindIII 사이트 사이에 클론되었다. 그 후, CMV IE 프로모터/lacZ/폴리A카세트는 NruI 및 BbsI으로 절단되어 pNot 3.5의 BstXI 사이트에 삽입되었다. 정위(orientation): LAT P1/LAT P2/CMV/ lacZ/폴리A.
실시예 3: 17+/D27/pR20의 조작
바이러스 주 17+/D27/pR20는 정제된 17+/D27w 게놈의 DNA 및 pR20 플라스미드를 B130/2세포에 공동 트랜스펙션하여, X-gal 염색 후 선택된 푸른색 용균으로 부터 생산되었다. pR20은 LAT P2/CMV IE 프로모터/LacZ/폴리A카세트(pR19lacZ의 PstI-SrfI. pNot 3.5에서 SrfI 사이트는 BstXI의 바로 후위에 위치한다.)를 pDMN에 삽입하여 생산되었다. pDMN은 HSV-I 게놈의 EcoRI 절편을 pACYC184(NBL)에 삽입한 후 NotI/XmnI 절편을 제거하여 생산되었고, 결과적으로 이 절편은 ICP27 및 측면의 염기서열(HSV-1 주 17+ 뉴클레오타이드 11095-118439)을 포함한다. ICP27 전사 염기서열 전체 및 불필요한 UL55 및 56 유전자(뉴클레오타이드 113273-116869)를 코딩하는 한 쌍의 MluI 절편은 MluI으로 절단되어 제거되었고, 다시 연결되었다. 그 후에, MluI 사이트에 LAT P2/CMV IE 프로모터/LacZ/폴리A카세트가 삽입되었다.
실시예 4: 1764/pR20.9의 조작
바이러스 주 1764-pR20.9는 정제된 1764 게놈의 DNA 및 pR20.9/43 플라스미드를 공동 트랜스펙션하여 생산되었고, 결과적으로 pR20.9 카세트를 1764 바이러스 주의 UL43 유전자로 삽입되었다. 이 조작은 두 가지의 이형 유전자를 포함한다. 그 첫 번째인 녹형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)은 MMLV LTR 프로모터의 조절을 받는 반면, 두 번째 유전자인 lacZ는 LAT P2프로모터의 조절을 받는다. 이러한 LAT P2 영역의 측면에 역방향을 항하고 있는 상관유전자(lacZ 및 GFP)들은 가운데의 LAT P2유전자로부터 시작되어 역방향으로 전사가 진행된다.
pR20.9/43 플라스미드는 다음과 같이 조작되었다:
(ⅰ) pEGFP-N1(Clontech, U.S.A.)의 플라스미드를 AgeI 및 NotI으로 절단하여 GFP유전자를 얻어내고, pcDNA 3의 EcoRI 및 NotI 사이트에 삽입하는 방법으로 GFP가 pcDNA3(Invitrogen, U.S.A.)에 삽입된 pcDNA3GFP 플라스미드의 작제. 이 때, GFP 유전자의 시작은 CMV 프로모터의 바로 후위에 놓인다.
(ⅱ) pJ4(NheI-HindIII)의 유래한 MMLV 프로모터를 pcDNA3GFP의 BamHI 사이트로 삽입하여, pJ4의 MheI 사이트가 CMV 프로모터 바로 후위에 위치하도록 pcMMLVGFP를 작제.
(ⅲ) pcMMLVGFP를 HindIII 및 BbsI으로 절단하여 얻어낸 MMLV/GFP/pA카세트를 pNot 3.5의 BstXI 사이트의 사이, 즉 LAT P2 영역의 바로 후위에 MMLV 프로모터가 위치하도록 삽입된 p3.5MG 플라스미드의 작제.
(ⅳ) DdeI-StyI으로부터 유래한 LAT P1프로모터(뉴클레오타이드 118,179-118,877)를 pGEM5(Promega, U.S.A.)의 EcoRV 및 SpeI사이트 사이, 즉 StyI은 EcoRV에, DdeI은 SpeI에 연결되도록 삽입된 pGem5PI의 작제.
(ⅴ) HindIII가 LAT P2 염기서열 바로 후위에 위치하도록 pGEM5PI의 NcoI 사이트 사이에 pCH(Pharmacia)의 lacZ(HindIII-BamHI)가 삽입된 pGEM5PI을 작제.
(ⅵ) SrfI 사이트(5' - GCCCGGGCCATG)를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 pP1/lacZ의 SphI 사이트로 삽입된 pP1/lacZSrf의 작제.
(ⅶ) p3.5MG의 LAT P2 영역이 pP1/lacZSrf의 LAT P1 영역 바로 다음에 위치하도록 p3.5MG의 LAT P2/MMLV/GFP/pA카세트(PstI 절편)가 P1/lacZSrf 의 NstI 사이트에 삽입된 pR20.9 플라스미드의 작제.
(ⅷ) pR20.9 카세트를 SrfI으로 절단하여 p35의 독특한 NstI 사이로 삽입됨으로써 UL43 측면의 영역에 삽입된 pR20.9/43를 작제. 이 때, p35는 pGemI(Promega, U.S.A.)에 클론된 HSV-1 뉴클레오타이드 91,610-96,751(BamHI-EcoRI)를 포함한다.
실시예 5: 마우스/래트를 1764/pR14/TH 로 접종
말초 신경계
마우스를 희생시키고 요추후근신경절(lumbar dorsal root ganglia)을 해부 한 다음, 마우스에 풋패드 접종(footpad inoculation, 1×107 pfu)하여 1754/pR14가 검사되었다. 고정 및 표준 방법에 따른 X-gal 염색 후(참조: Coffin, R. S. and Latchman, D. S., Genetic manipulation of the nervous system, Academic Press: London, 99-114, 1996), 파란색 염색이 요추 신경절인 L4 및 L5에서 2일, 2주, 1달 및 2달 (검사된 최장 시간)까지 나타났고, 이것은 장기간 프로모터 활성을 나타낸다.
중추 신경계
래트(200 내지 220ｇ의 루이스 래트)의 선조체(striatum)에 1764/pR14을 정위 접종(2㎕, 5×105 pfu)을 한 후에, 고정 및 X-gal 염색을 하였을 때, 2일, 2주, 1달 및 2달(검사된 최장 시간)까지 파란색 염색이 강하게 나타났다. 이것은 역시 장기간 프로모터 활성을 나타낸다.
실시예 6: 래트에 17+/D27/pR19을 접종
래트(200 내지 220ｇ의 루이스 래트)의 선조체에 17+/D27/pR19를 정위 접종(2㎕, 5×106 pfu) 하여, 고정 및 염색을 하였을 경우, 2일, 2주, 1달 및 2달(검사된 최장 시간)동안 파란색 염색이 강하게 나타났다. 이것은 CMV IE 프로모터가 LAT P2 후위에 위치할 때 MMLV LTR과 마찬가지로 장시간 활성을 나타낼 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 7: 래트에 17+/D27/pR20을 접종
중추 신경계
래트의 선조체에 17+/D27/pR20를 정위 접종(2㎕, 5×106 pfu)하여 고정 및 X-gal 염색을 하였을 경우, 2일, 2주 및 1달(검사된 최장 시간)까지 파란색 염색이 강하게 나타났다. 중요한 것은, 이것이 다른 부분의 헤르페스의 게놈, 즉 LAT 영역이 아닌 부분에 삽입되었을 때, LAT P2가 그에 가까운 프로모터에게 우선적으로 활성을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 마우스에 1764/pR20.9를 접종
말초 신경계
마우스를 희생시켜 요추후근신경절(dorsal root ganglia, DRG)을 해부한 다음 마우스의 풋패드 접종(1×107 pfu)으로 1764/pR20.9가 검사되었다. 고정 후, 강한 녹색형광이 형광 현미경(플루오레시인(fluorecein) 광학) 하에서 관찰되었고, X-gal 염색 후 파란색 염색이 같은 세포에서 2일, 2주, 1달 및 2달(검사된 최장 시간)까지 요추 신경절인 L4 및 L5에서 관찰되었으며, 다른 요추후근신경절에서는 더 짧은 시기 동안 지속되었다. 이것은 두 프로모터 모두 장기간 활성을 나타낸다는 것을 의미하며, 본 발명의 카세트를 사용한 한 쌍의 유전자가 효율적으로 발현된다는 것을 의미한다.

Claims (42)

  1. 순차적으로 조작이 가능하도록 연결된,
    (i) 뉴클레오타이드 118,866 내지 120,219로 정의된 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 1 주(strain) 17+의 영역에 상응하는 HSV 1 또는 HSV 2의 잠복기-관련 전사체(LAT) P2 영역 또는 전기 LAT P2 영역의 단편;
    (ii) 비-LAT 프로모터(non-LAT promoter); 및,
    (iii) 이형 유전자를 포함하는 발현 카세트로서, 전기 발현 카세트를 포함하는 HSV 주로 감염된 세포가 감염 후 적어도 한 달 후에 전기 이형유전자를 발현하도록 하는 발현 카세트.
  2. 제 1항에 있어서,
    LAT P2 영역은 HSV 1 LAT P2영역인 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  3. 제 2항에 있어서,
    LAT P2 영역은 HSV 1 주 17+ 뉴클레오타이드 118,866 내지 120,219로 구성되는 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  4. 제 1항에 있어서,
    LAT P2 영역은 HSV 2 LAT P2 영역인 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  5. 제 1항에 있어서,
    프로모터는 바이러스의 프로모터인 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  6. 제 1항에 있어서,
    프로모터는 포유세포에서 이형 유전자의 발현을 허용하는 포유동물의 프로모터인 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  7. 제 6항에 있어서,
    포유동물의 프로모터는 조직-특이적 프로모터인 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  8. 제 6항에 있어서,
    포유세포는 포유동물의 중추 또는 말초신경계의 세포인 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  9. 제 6항에 있어서,
    포유세포는 포유동물의 눈, 심장 또는 골 근육의 세포인 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  10. 제 1항에 있어서,
    이형 유전자는 치료 용도의 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  11. 제 10항에 있어서,
    유전자는 세포독성의 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  12. 제 10항에 있어서,
    유전자는 프로드럭(prodrug)의 전구체를 세포독성의 화합물로 전환시 킬 수 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  13. 제 1항에 있어서,
    이형 유전자는 세포분열의 조절에 관련된 단백질, 세포대사경로에 관 련된 효소, 전사인자 및 열충격 단백질을 코딩하는 유전자로부터 선 택되는
    발현 카세트.
  14. 제 1항에 있어서,
    첫 번째 프로모터와 첫 번째 이형 유전자와 역방향으로 HSV LAT P2 영 역에 순차적으로 조작가능하게 연결된 두 번째 프로모터 및 두 번째 이형 유전자를 추가로 포함하고, 전기 두 번째 프로모터는 첫 번째 프 로모터와 서로 동일 또는 상이하고, 전기 두 번째 이형 유전자는 첫 번째 이형 유전자와 서로 동일 또는 상이한 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  15. 제 14항에 있어서,
    두 번째 프로모터 및 두 번째 이형 유전자는 제 1항 내지 9항 및 제 10항 내지 13항의 어느 한 항에 각각 정의되어 있는 것을 특징으로 하 는
    발현 카세트.
  16. 제 14항에 있어서,
    첫 번째 이형 유전자의 산물은 적절한 생리적 조건하에서 두 번째 이 형 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  17. 순차적으로 조작이 가능하도록 연결된,
    (i) 뉴클레오타이드 118,866 내지 120,219로 정의된 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 1 주(strain) 17+의 영역에 상응하는 HSV 1 또는 HSV 2의 잠복기-관련 전사체(LAT) P2 영역 또는 전기 LAT P2 영역의 단편;
    (ii) 비-LAT 프로모터(non-LAT promoter); 및,
    (iii) 이형 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 HSV 주로 감염된 세포가 감염 후 적어도 한 달 후에 전기 이형유전자를 발현하도록 하는 발현 카세트를 포함하는 핵산벡터.
  18. 제 17항에 있어서,
    발현 카세트의 측면에 포유동물의 게놈 염기서열(genomic sequence)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    핵산벡터.
  19. 제 17항에 있어서,
    발현 카세트의 측면에 HSV 게놈 염기서열을 추가로 포함하는 것을 특 징으로 하는
    핵산벡터.
  20. 순차적으로 조작이 가능하도록 연결된,
    (i) 뉴클레오타이드 118,866 내지 120,219로 정의된 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 1 주(strain) 17+의 영역에 상응하는 HSV 1 또는 HSV 2의 잠복기-관련 전사체(LAT) P2 영역 또는 전기 LAT P2 영역의 단편;
    (ii) 비-LAT 프로모터(non-LAT promoter); 및,
    (iii) 이형 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 HSV 주로 감염된 세포가 감염 후 적어도 한 달 후에 전기 이형유전자를 발현하도록 하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 주.
  21. 제 20항에 있어서,
    바이러스 주는 HSV 주인 것을 특징으로 하는
    바이러스 주.
  22. 제 21항에 있어서,
    LAT P2 영역은 내인성 HSV LAT P2 영역인 것을 특징으로 하는
    바이러스 주.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. (a) 제 1항의 발현 카세트를 진핵세포로 도입시키는 단계; 및,
    (b) 전기 진핵세포에서 전기 이형 유전자 또는 이형 유전자들의 발현효과를 검정하는 단계를 포함하며, 진핵세포에서 하나 이상의 이형 유전자의 기능을 연구하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    발현 카세트는 제 2항 내지 16항 중 어느 한 항에 개시되어 있고, 제 17항 내지 19항 중 어느 한 항에 개시된 벡터 또는 제 20항 내지 22항 중 어느 한 항에 개시된 바이러스 주로 삽입되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  27. 제 25항에 있어서,
    이형 유전자 또는 이형 유전자들은 질병과 관련된 야생형 또는 돌연변 이형 유전자인 것을 특징으로 하는
    방법.
  28. 제 25항에 있어서,
    진핵세포는 기능부전이고, 이형 유전자 또는 이형 유전자들은 야생형 이며, 이형 유전자 또는 이형 유전자들의 발현효과는 세포의 기능을 분석함으로써 검정되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  29. 제 25항에 있어서,
    진핵세포는 돌연변이에 의해 불활성화된 하나 또는 그 이상의 내인성 유전자를 가지는 것을 특징으로 하는
    방법.
  30. 순차적으로 조작이 가능하도록 연결된,
    (i) 뉴클레오타이드 118,866 내지 120,219로 정의된 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 1 주(strain) 17+의 영역에 상응하는 HSV 1 또는 HSV 2의 잠복기-관련 전사체(LAT) P2 영역 또는 전기 LAT P2 영역의 단편;
    (ii) 비-LAT 프로모터(non-LAT promoter); 및,
    (iii) 이형 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 HSV 주로 감염된 세포는 감염 후 적어도 한 달 후에 전기 이형유전자를 발현하며, HSV 주의 게놈에 상동적인 서열의 측면에 발현 카세트를 포함하는 벡터와 게놈의 상동적 재조합을 통하여, 제 1항에 개시된 발현 카세트를 헤르페스 심플렉스 바이러스의 게놈에 도입시키는 단계를 포함하는, 발현 카세트를 포함하는 바이러스 주의 생산방법.
  31. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 개시된 발현 카세트, 제 17항 내지 19항 중 어느 한 항에 개시된 벡터 또는 제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 개시된 바이러스 주를 치료가 필요한 인간을 제외한 동물의 세포에 치료용 폴리펩타이드를 코딩하는 이형 유전자가 효과적으로 발현되는 양으로 처리하여 전기 세포에 도입하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 유전자 치료방법.
  32. 제 1항에 있어서,
    이형 유전자는 적어도 하나의 항원 결정부를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  33. 제 32항에 있어서,
    폴리펩타이드는 병원체로부터 유래된 것을 특징으로 하는
    발현 카세트.
  34. 제 32항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  35. 제 32항의 발현 카세트를 포함하는 바이러스 주.
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
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