KR100490682B1 - A process for isolating epi-oleanolic acid from Viscum album coloratum - Google Patents
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Abstract
본 발명은 한국산 겨우살이로부터 분리추출한 항암활성 화합물, 이의 분리방법 및 이를 포함하는 약학적 및 식품학적 조성물에 관한 것으로, 한국산 겨우살이를 에탄올 추출한 뒤 상기 추출물을 감압 여과 또는 동결건조하여 얻은 건조물에 물을 가하여 디클로로메탄으로 분배추출한 후 무수황산나트리움으로 탈수하고 여과한 다음 감압 농축하여 항암활성 물질인 에피오레아놀린산이 함유된 디클로로메탄 가용성 추출물을 얻은 뒤 상기 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 다섯 개의 분획으로 나누고 그 중 항암활성이 높은 분획에 대하여 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 고속액체크로마토그래피를 행하여 백색의 분말상 화합물 VD-3을 순수분리하고 상기 화합물의 이화학적 성상 및 화학적 구조를 확인한 뒤 상기 화합물을 인간 및 마우스유래의 암세포주에 대하여 처리하여 암세포에 대한 세포독성의 활성을 측정함으로서 각종 암세포에 대한 증식억제효과가 뛰어난 항암활성 화합물의 분리가 가능하여 암 예방을 위한 기능성 식품 및 암의 예방 및 치료를 위한 약제산업상 매우 뛰어난 효과가 있다.The present invention relates to an anticancer active compound isolated from Korean mistletoe, a method for separating and a pharmaceutical and food composition comprising the same, by adding water to the dried product obtained by ethanol extraction of Korean mistletoe, and extracting the extract under reduced pressure filtration or lyophilization. After partition extraction with dichloromethane, dehydration with anhydrous sodium sulfate, filtration and concentration under reduced pressure to obtain a dichloromethane soluble extract containing the anti-cancer active substance epioreanolinic acid, the extract was purified by silica gel column chromatography and divided into five fractions. Among them, silica gel column chromatography and high-performance liquid chromatography were performed again on the high anticancer activity fraction to purely separate the white powdery compound VD-3, and then check the physicochemical properties and chemical structure of the compound. It is possible to separate anti-cancer active compounds with excellent anti-proliferative effect on various cancer cells by measuring the cytotoxic activity of cancer cells by treating them with cancer cells derived from Sue-derived cancer cells. The pharmaceutical industry has a very good effect.
Description
본 발명은 한국산 겨우살이로부터 분리추출한 항암활성 화합물, 이의 분리방법 및 이를 포함하는 약학적 및 식품학적 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 한국산 겨우살이로부터 분리추출한 항암활성 화합물과; 열수 추출, 에탄올 추출, 용해도 차, 실리카젤 및 고속액체크로마토그래피를 이용하여 상기 화합물을 분리추출하는 방법; 및 상기 화합물을 포함하는 약학적 및 식품학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an anticancer active compound isolated from Korean mistletoe, a method for separating the same, and a pharmaceutical and food composition comprising the same. More specifically, the present invention is an anticancer active compound separated from Korean mistletoe; A method of separating and extracting the compound using hot water extraction, ethanol extraction, solubility difference, silica gel, and high performance liquid chromatography; And pharmaceutical and food composition comprising the compound.
기생식물의 일종인 비스쿰 알붐 콜로라툼(Viscum album coloratum)은 겨우살이과 (Loranthaceae)에 속하며 한국명으로는 겨우살이로 불리우고 생약명으로는 지엽(枝葉), 곡기생( 寄生), 기생목(寄生木), 또는 북상기생(北桑寄生) 등으로 불리운다 (약품식물학 각론, 한국학습교재사, 1982년, 137쪽 및 한국의 자원식물, 서울대학교 출판부,1996년 1권 140쪽). 한국산 겨우살이는 해발 50∼1,100 m 지역 참나무, 팽나무, 오리나무, 밤나무 및 자작나무 등에 기생하는 상록성 기생관목이며 둥지모양으로 둥글게 자라고 지름 1m에 달하는 것도 있다. 잎은 대생, 피침형이며 길이 3∼6 cm, 너비 6∼12mm로 밑으로 갈수록 좁아진다. Viscum album coloratum , a parasitic plant, belongs to the mistletoe family and is called Mistletoe in the Korean name, and the name of the herb is leafy, grainy, parasitic, or It is called the North Sangsangsaeng. Mistletoe from Korea is an evergreen parasitic shrub that lives in oak, hackberry, alder, chestnut and birch in the area of 50 ~ 1,100m above sea level. It grows in a nest shape and has a diameter of 1m. The leaves are college, lanceolate, 3-6 cm long, 6-12 mm wide, and narrower toward the bottom.
상기 식물은 한국에서는 오대산, 지리산, 소백산 등 대한민국 전역에 걸쳐 자생하며 민간에서는 간혹 요통, 고혈압, 부인병, 통경, 진정약 등에 이용하여 왔으나 기능성 식품 또는 의약품의 재료로서는 아직까지는 적극적으로 사용되고 있지는 않은 실정이다.The plants are native to Korea throughout the Republic of Korea, such as Odaesan, Jirisan, Sobaeksan, etc. In the private sector, sometimes used for low back pain, high blood pressure, women's disease, pain relief, sedatives, but has not been actively used as a functional food or medicine yet .
한국산 겨우살이에 함유된 화합물로 렉틴류가 개시되어있으나 상기 화합물은 화학적으로 당단백질의 일종으로 본 발명의 트리테르펜의 골격을 갖는 화합물과는 이화학적 성상이 전혀 다른 화합물이다. 또한 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)에 대한 구조 및 이화학적 특성은 이미 밝혀진 바 있으나 암 세포주에 대해 강한 독성을 나타내며 그 활성의 기전이 아폽토시스(apoptosis)에 의한 것임은 본 발명에 의해 최초로 밝혀졌다.Although lectins have been disclosed as compounds contained in Korean mistletoe, the compounds are chemically a kind of glycoprotein and are completely different in physicochemical properties from compounds having a skeleton of the triterpene of the present invention. In addition, although the structural and physicochemical properties of epi- oleanolic acid have already been revealed, it is strongly toxic to cancer cell lines and the mechanism of its activity is due to apoptosis. Turned out.
본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 한국산 겨우살이를 에탄올 추출한 뒤 상기 추출물을 감압 여과 또는 동결건조하여 얻은 건조물에 물을 가하여 디클로로메탄으로 분배추출한 후 무수황산나트리움으로 탈수하고 여과한 다음 감압 농축하여 항암활성 물질인 에피오레아놀린산이 함유된 디클로로메탄 가용성 추출물을 얻은 뒤 상기 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 다섯 개의 분획으로 나누고 그 중 항암활성이 높은 분획에 대하여 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 고속액체크로마토그래피를 행하여 백색의 분말상 화합물 VD-3을 순수분리하고 상기 화합물의 이화학적 성상 및 화학적 구조를 확인한 뒤 상기 화합물을 인간 및 마우스유래의 암세포주에 대하여 처리하여 암세포에 대한 세포독성의 활성을 측정함으로써 본 발명을 완성하였다.In view of the above, the present inventors extracted Korean mistletoe with ethanol, and extracted the extract with dichloromethane by adding water to the dried product obtained by filtration or lyophilization of the extract. After obtaining a dichloromethane soluble extract containing the anticancer active substance epioreanolinic acid, the extract was divided into five fractions by silica gel column chromatography. Among the fractions having high anticancer activity, silica gel column chromatography and high-performance liquid chromatography were performed again. The white powdery compound VD-3 was purified to confirm the physicochemical properties and chemical structure of the compound, and then the compound was treated with cancer cell lines derived from humans and mice to measure cytotoxic activity against cancer cells. invent It was completed.
따라서, 본 발명의 목적은 한국산 겨우살이로부터 분리추출한 항암활성 화합물을 제공함에 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide an anticancer active compound separated from Korean mistletoe.
본 발명의 다른 목적은 한국산 겨우살이로부터 항암활성 화합물을 분리하는 방법을 제공함에 있다.Another object of the present invention is to provide a method for separating anticancer active compounds from Korean mistletoe.
본 발명의 또 다른 목적은 한국산 겨우살이로부터 분리추출한 항암활성 화합물을 포함하는 약학적 및 식품학적 조성물을 제공함에 있다.Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical and food composition comprising an anticancer active compound extracted from Korean mistletoe.
본 발명의 상기 목적은 한국산 겨우살이를 에탄올 추출한 뒤 상기 추출물을 감압 여과 또는 동결건조하여 얻은 건조물에 물을 가하여 디클로로메탄으로 분배추출한 후 무수황산나트리움으로 탈수하고 여과한 다음 감압 농축하여 항암활성 물질인 에피오레아놀린산이 함유된 디클로로메탄 가용성 추출물을 얻은 뒤 상기 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 다섯 개의 분획으로 나누고 그 중 항암활성이 높은 분획에 대하여 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 고속액체크로마토그래피를 행하여 백색의 분말상 화합물 VD-3을 순수분리하고 상기 화합물의 이화학적 성상 및 화학적 구조를 확인한 뒤 상기 화합물을 인간 및 마우스유래의 암세포주에 대하여 처리하여 암세포에 대한 세포독성의 활성을 측정함으로써 달성하였다.The object of the present invention is ethanol extract of Korean mistletoe, the extract is extracted by distillation with dichloromethane by adding water to the dried product obtained by filtration or lyophilization under reduced pressure, dehydrated with anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to the anticancer active substance After obtaining a dichloromethane soluble extract containing epioreanolinic acid, the extract was divided into five fractions by silica gel column chromatography. Among the fractions having high anticancer activity, silica gel column chromatography and high-performance liquid chromatography were performed again. The powdery compound VD-3 was purely isolated and confirmed by physicochemical properties and chemical structure of the compound, and then treated with the human and mouse-derived cancer cell lines to achieve the cytotoxic activity against cancer cells.
이하 본 발명의 구성을 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention.
본 발명은 한국산 겨우살이를 에탄올 추출한 뒤 상기 추출물을 감압 여과 또는 동결건조하여 얻은 건조물에 물을 가하여 디클로로메탄으로 분배추출한 후 무수황산나트리움으로 탈수하고 여과한 다음 감압 농축하여 항암활성 물질인 에피오레아놀린산이 함유된 디클로로메탄 가용성 추출물을 얻는 단계; 상기 단계에서 얻은 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 다섯 개의 분획으로 나누고 그 중 항암활성이 높은 분획에 대하여 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 고속액체크로마토그래피를 행하여 백색의 분말상 화합물 VD-3을 순수분리하고 상기 화합물의 이화학적 성상 및 화학적 구조를 확인하는 단계; 및 상기 화합물을 인간 및 마우스유래의 암세포주에 대하여 처리하여 암세포에 대한 세포독성의 활성을 측정하는 단계로 구성된다.The present invention is ethanol extract of Korean mistletoe, the extract is extracted by distillation with dichloromethane by adding water to the dried product obtained by filtration or freeze-drying under reduced pressure, then dehydrated with anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to concentrate the anti-cancer active substance Epiorea Obtaining a dichloromethane soluble extract containing nolinic acid; The extract obtained in the above step was divided into five fractions by silica gel column chromatography. Among the fractions having high anticancer activity, silica gel column chromatography and high performance liquid chromatography were further performed to purely separate white powdery compound VD-3. Identifying the physicochemical properties and chemical structure of the; And treating the compound against cancer cell lines derived from humans and mice to determine the activity of cytotoxicity against cancer cells.
본 발명에 사용한 한국산 겨우살이는 대한민국 지리산 일대에서 수집된 것이다.Korean mistletoe used in the present invention is collected from the region of Jirisan Korea.
한국산 겨우살이로부터 분리정제된 본 발명의 항암 활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)은 분자식이 C30H48O3(Mw=456)인 화합물로 그 화학구조상의 특징으로는 트리테르펜 골격에 한 개의 이중결합, 한 개의 히드록시 그룹 및 한 개의 카르복실산 그룹을 포함하며 일곱 개의 메틸 그룹을 가지는 화합물이다.Ain epi fluorescein anti-cancer active compounds of the present invention purified from Korean mistletoe acid Quinoline (epi -oleanolic acid) has a molecular formula is C 30 H 48 O 3, characterized in that chemical structure to the compound (Mw = 456) are triterpene It is a compound having seven methyl groups, including one double bond, one hydroxy group and one carboxylic acid group in the backbone.
본 발명의 활성 화합물은 한국산 겨우살이 전초에서 추출, 분리, 정제함으로써 얻을 수 있으며 추출, 정제 및 분리는 하기와 같이 수행한다.The active compound of the present invention can be obtained by extracting, separating and purifying Korean mistletoe from the outpost, and the extraction, purification and separation are performed as follows.
우선 한국산 겨우살이를 수집하여 이물질을 제거한 다음 식물체를 실온 내지 100℃, 바람직하게는 95℃에서 2시간 내지 24시간, 바람직하게는 5시간 동안 열수, 디클로로메탄, 또는 에탄올, 바람직하게는 95% 에탄올로 추출한 후 추출물을 동결건조, 증류, 또는 감압증류, 또는 스프레이 드라이에 의한 건조 후 열수 추출물, 에탄올, 또는 95% 에탄올로 추출한 경우에는 이들의 농축 건조물에 2내지 10배량, 바람직하게는 5배량의 디클로로메탄을 가하여 분배추출하고 디클로로메탄에 가용성인 성분을 모아 증류, 또는 감압증류, 또는 스프레이 드라이에 의한 건조 후 건조물을 얻는다.First, the mistletoe from Korea was collected to remove foreign substances, and then the plants were treated with hot water, dichloromethane, or ethanol, preferably 95% ethanol for 2 hours to 24 hours, preferably 5 hours at room temperature to 100 ° C, preferably 95 ° C. After extraction, the extract is lyophilized, distilled, or distilled under reduced pressure, or dried by spray drying, and then extracted with hot water extract, ethanol, or 95% ethanol. Partition extraction is performed by adding methane, and the components soluble in dichloromethane are collected to obtain a dried product after distillation, distillation under reduced pressure, or drying by spray drying.
상기 건조물을 실리카젤과 이동상으로서 벤젠-초산 에틸의 혼합용매를 사용하여 세 개에서 열 개, 바람직하게는 열 개의 분획으로 나누고 이 중에서 활성을 나타내는 분획에 대하여 다시 실리카젤과 이동상으로서 헥산-초산 에틸의 혼합용매를 이용하여 세 개에서 여덟 개, 바람직하게는 여덟 개의 분획으로 나눈다. 상기 분획 중에서 항암활성을 나타나는 분획에 대하여 순수한 물질이 될 때까지 실리카젤 (이동상으로서 벤젠-초산 에틸의 혼합 용액) 및 고속 액체크로마토그라피 (고정상으로서는 실리카젤, 이동상으로서는 벤젠-초산 에틸, 또는 헥산-초산 에틸, 바람직하게는 벤젠-초산 에틸의 혼합 용액)를 행하여 항암 활성물질 VD-3를 얻는다.The dried product was divided into three to ten, preferably ten fractions using a mixed solvent of silica gel and ethyl benzene as a mobile phase, and the hexane-ethyl acetate as a mobile phase was again divided into silica gel and a mobile phase. Using a mixed solvent of three to eight, preferably divided into eight fractions. Silica gel (a mixed solution of benzene-ethyl acetate as a mobile phase) and high performance liquid chromatography (silica gel as the fixed phase, benzene-ethyl acetate as the mobile phase, or hexane-) until a pure substance is obtained for the fraction showing anticancer activity in the fraction. Ethyl acetate, preferably a mixed solution of benzene-ethyl acetate) to obtain an anticancer active substance VD-3.
상기 방법에 의해 분리된 화합물들을 IR (적외선 분광분석), NMR (핵자기 공명분석), MS (질량 분광분석) 등의 분석방법으로 분석하여 화합물들의 이화학적 성상 및 화학적 구조를 확인한다.Compounds separated by the above method are analyzed by analytical methods such as IR (infrared spectroscopy), NMR (nuclear magnetic resonance analysis), MS (mass spectrometry), etc. to confirm the physicochemical properties and chemical structures of the compounds.
본 발명의 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)은 상기한 바와 같은 이화학적 성질을 가지고 있으며 항암 활성을 가지는 화합물로 겨우살이 뿐 아니라 다른 식물류 및 균류에서도 발견될 수 있으며 따라서 본 발명의 상기 화합물에 대한 제조방법은 특히 겨우살이를 이용하는 방법에만 한정되는 것은 아니다.Epi Orea acid Quinoline (epi -oleanolic acid) of the present invention have the physicochemical properties as described above may be a compound having antitumor activity as well as mistletoe found in other Plants and fungi and, in the compounds of the invention In particular, the manufacturing method is not limited only to the method using mistletoe.
본 발명의 약학적 또는 식품학적 조성물은 상기 활성 화합물과 함께 약제학적 또는 식품학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제 등을 포함할 수 있으며 쉽게 입수할 수 있는 성분들을 이용하여 공지의 방법에 따라 제제화할 수 있다.The pharmaceutical or food composition of the present invention may contain a pharmaceutically or food acceptable excipient, carrier or diluent, etc. together with the active compound, and may be formulated according to a known method using readily available ingredients. Can be.
제제의 제조시는 활성 성분 또는 활성 성분을 함유하는 추출물을 담체와 혼합하거나 담체로 희석하거나 캡슐, 사셰, 종이 또는 다른 용기의 형태인 담체 내에 담을 수 있다. 담체가 희석제의 역할을 할 경우에는 활성 성분을 위한 비히클, 부형제 또는 매질로 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 따라서, 제제는 정제, 환제, 분산제, 과립제, 엘릭서, 현탁제, 유화제, 용액, 시럽제, 에어로졸제, 연질 및 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사용액, 멸균 포장된 분말제, 연고, 또는 비스킷, 스틱형태의 과자류, 빵, 캔디, 음료 등의 형태일 수 있다.In the preparation of the formulation, the active ingredient or extract containing the active ingredient may be mixed with the carrier, diluted with the carrier or contained in a carrier in the form of a capsule, sachet, paper or other container. If the carrier serves as a diluent, it may be a solid, semisolid or liquid substance which acts as a vehicle, excipient or medium for the active ingredient. Thus, the preparation may be in the form of tablets, pills, dispersants, granules, elixirs, suspensions, emulsifiers, solutions, syrups, aerosols, soft and hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile packaged powders, ointments, or biscuits, in the form of sticks Confectionary, bread, candy, beverages and the like.
본 발명에서 사용할 수 있는 적당한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필 하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일 등이 있다.Examples of suitable carriers, excipients and diluents which may be used in the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, poly Vinylpyrrolidone, water, sugar syrup, methylcellulose, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
본 발명의 조성물은 상기 성분들 외에도 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자에게 투여된 후 활성 성분을 급속하게, 지속적으로 또는 지연시켜 방출하도록 당분야의 공지 기술들을 이용하여 제제화할 수 있다.The composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components. Compositions of the present invention can be formulated using techniques known in the art to release the active ingredient rapidly, continuously or delayed after administration to a patient.
본 발명의 약학적 또는 식품학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 활성 화합물은 광범위한 투여 범위에 대하여 유효하다. 예를 들어 활성 화합물의 1일 투여량은 통상적으로 체중 1kg 당 약 0.1내지 20mg 범위이며 기능성 식품으로 사용될 경우 물, 또는 에탄올 추출물로서 100mg 내지 10g의 범위다. 그러나, 실제적으로 투여되는 화합물의 양은 치료하려는 질환의 상태, 선택된 투여경로, 개별적인 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 병의 중증도를 비롯한 관련상황에 비추어 의사, 또는 약사가 결정할 것이므로 상기 투여 범위는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.The pharmaceutical or food composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and the active compound is effective for a wide range of administration. For example, daily dosages of active compounds typically range from about 0.1 to 20 mg per kg of body weight and range from 100 mg to 10 g as water or ethanol extract when used as a functional food. However, the amount of the compound to be administered will be determined by the physician or pharmacist in light of the relevant conditions, including the condition of the disease to be treated, the route of administration chosen, the age, weight and response of the individual patient, and the severity of the disease. It does not limit the scope of the invention.
이하 본 발명을 하기 위한 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the following Examples are only intended to illustrate the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.
실시예 1 : 한국산 겨우살이로부터 항암 활성 물질 에피오레아놀린산이 함유된 추출물의 제조Example 1: Preparation of extract containing anti-cancer active substance epioreanolinic acid from Korean mistletoe
신선한 한국산 겨우살이 또는 그 풍건물 1 kg을 잘게 썰은 후 10ℓ 95% 에탄올에 넣고 95℃에서 3시간 동안 수욕상에서 3회 반복 추출한 후 여과지를 이용하여 식물체 조각을 제거하여 추출물만 얻었다. 상기 추출물을 감압 여과 또는 동결건조 후 건조물에 적당량의 물을 가하여 분산한 다음 10ℓ의 디클로로메탄으로 3회 분배추출하고 이를 포화식염수로 세척 후 무수황산나트리움을 가하여 탈수하고 여과한 다음 여액을 감압 농축하여 항암활성 성분인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)이 함유된 디클로로메탄 가용성 추출물 38.9 g을 얻었다.1 kg of fresh Korean mistletoe or its dry matter was finely chopped and placed in 10ℓ 95% ethanol and extracted three times in a water bath at 95 ° C. for 3 hours, and then extracted with plant paper using filter paper to obtain only extracts. The extract was filtered under reduced pressure or lyophilized, dispersed in an appropriate amount of water and dried. The mixture was extracted three times with 10 l of dichloromethane, washed with saturated brine, dehydrated with anhydrous sodium sulfate, filtered and the filtrate was concentrated under reduced pressure. 38.9 g of a dichloromethane soluble extract containing epi- oleanolic acid as an anticancer active ingredient was obtained.
실시예 2 : 에피오레아놀린산의 분리정제Example 2 Separation and Purification of Epioreanoic Acid
상기 실시예 1에서 얻은 디클로로메탄 가용성 성분 38.9 g을 실리카겔 컬럼크로마토그라피(벤젠 : 초산에틸 = 7 : 1에서 시작하여 최종 농도 메탄올 100%가 되도록 용매의 기울기를 주어 용출)하여 fr. I부터 V까지의 다섯 개의 분획으로 나누고 그 중 항암 활성이 높은 fr. I, II, III 부분에 대하여 다시 정제를 시도하였다. 38.9 g of the dichloromethane soluble component obtained in Example 1 was eluted with silica gel column chromatography (benzene: ethyl acetate = 7: 1 to give a gradient of solvent to a final concentration of 100% methanol) and then eluted with fr. Divided into five fractions from I to V, fr. Purification was again attempted for parts I, II, and III.
우선 fr. III에 대하여 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (헥산 : 초산 에틸 = 10 : 1부터 1 : 1까지 농도기울기를 주어 용출, Merck사 Art. No. 7734)하여 fr. I부터 XI까지의 열한 개의 분획으로 나누고 이중 항암 활성이 높은 fr. VII 75.5 mg에 대하여 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (벤젠 : 초산 에틸 = 20 : 1에서 시작하여 15 : 1이 되도록 용매의 기울기를 주어 용출, Merck사 Art. No. 7734)를 다시 행하여 fr. VII-I부터 VII-III의 3 개의 분획을 얻었다. 상기 분획중 VII-II에 대하여 고속액체크로마토그라피 (컬럼: Econoshphre 10u, 벤젠-초산에틸=15 : 1)를 행하여 백색의 분말상 화합물 VD-3 8 mg을 순수분리하였다.First of all fr. For III, silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 10: 1 to 1: 1 was eluted with a gradient of concentration, and the product was prepared by Merck Art. No. 7734). Divided into eleven fractions from I to XI with high anti-cancer activity fr. To 75.5 mg of VII, silica gel column chromatography (benzene: ethyl acetate = 20: 1, elution was given to give a solvent gradient of 15: 1, e.g., Merck Art. No. 7734). Three fractions of VII-I through VII-III were obtained. High performance liquid chromatography (column: Econoshphre 10u, benzene-ethyl acetate = 15: 1) was performed on VII-II in the fraction to purely separate 8 mg of white powdery compound VD-3.
상기에서 얻은 화합물을 IR(적외선 분광분석), NMR(핵자기 공명분석), MS(질량 분광분석) 등의 분석방법으로 분석하여 이화학적 성상 및 화학적 구조를 확인한 결과, 에피오레아놀린산(epi-oleanolic acid)임을 알 수 있었다. 상기 에피오레아놀린산(epi-oleanolic acid)의 이화학적 성질은 하기와 같으며 그 구조식을 도 1에 도시하였다.The compound obtained in the IR (infrared spectroscopy), NMR (nuclear magnetic resonance analysis), MS (mass spectrometry) analyzes the analysis method such as a result confirming the physicochemical properties and chemical structure, epitaxial Orea Quinoline acid (epi -oleanolic acid). Physicochemical properties of epi- oleanolic acid are as follows and the structural formula is shown in FIG. 1.
물질의 성상 : 백색 분말, 혹은 백색 침상 결정Form of material: White powder, or white needle crystal
녹는점 (℃) : 280±1Melting Point (℃): 280 ± 1
분자량(분자식) : 456(C30H48O3)Molecular weight (molecular formula): 456 (C 30 H 48 O 3 )
적외선 흡수 스펙트럼 : IR γcm-1 (KBr); 1945, 1696(도 6 참조)Infrared absorption spectrum: IR γcm-1 (KBr); 1945, 1696 (see Figure 6)
정색반응 : FeCl3에 음성, H2SO4에 양성 반응Color reaction: negative on FeCl 3 , positive on H 2 SO 4
수소 및 탄소 핵자기공명 : CDCl3 용매에서 테트라메틸실란(TMS) 스펙트럼을 표준물질로 측정한 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 도 3에 나타내었으며 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 도 4에, DEPT 스펙트럼을 도 7에 나타내었다.Hydrogen and Carbon Nuclear Magnetic Resonance: Hydrogen nuclear magnetic resonance spectra obtained by measuring tetramethylsilane (TMS) spectra in a CDCl 3 solvent as standard materials are shown in FIG. 3, and carbon nuclear magnetic resonance spectra are shown in FIG. Shown in
용해성 : DMSO, 물, 에탄올에 난용성이며 클로로포름, 벤젠, 헥산에 가용성이다.Solubility: Soluble in DMSO, water, ethanol and soluble in chloroform, benzene, hexane.
실시예 3 : 활성 성분의 암세포에 대한 세포독성Example 3 Cytotoxicity of Cancerous Cells to Active Ingredients
암세포에 대한 세포독성의 활성 측정은 인간 및 마우스유래의 암세포주에 대하여 실시하였으며 실시방법은 하기와 같다.The measurement of cytotoxic activity against cancer cells was carried out on cancer cell lines derived from humans and mice.
96-well plate에 well당 2.5×104개의 암세포를 함유하는 액 50㎕를 넣고 여기에 VD-3가 적당량 함유된 EMEM-5% FBS액 50㎕를 가한 다음 37℃에서 36시간동안 배양한 다음 Cell Counting Kit (일본 Dojindo사 제품)를 사용하여 세포의 성장 저해활성을 백분율(%)로 나타내었다. 그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 VD-3 7.5∼94.5㎍/ml 농도에서 암세포의 성장을 50% 억제하였으며 그 중에서도 P388 및 MDA 435S 세포에 가장 높은 활성을 나타내었다.Add 50µl of solution containing 2.5 × 104 cancer cells per well to 96-well plate, add 50µl of EMEM-5% FBS solution containing appropriate amount of VD-3, and incubate for 36 hours at 37 ℃. Using the Counting Kit (manufactured by Dojindo, Japan), the growth inhibitory activity of the cells was expressed as a percentage (%). As a result, as shown in Table 1, the growth of cancer cells was inhibited by 50% at a concentration of 7.5 to 94.5 μg / ml of VD-3, and among them, the highest activity was observed in P388 and MDA 435S cells.
[주] *1 : 50% 암세포 생장 유효 저지 농도* 1: 50% cancer cell growth effective blocking concentration
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명의 한국산 겨우살이를 에탄올 추출하고 농축하여 조추출물을 얻은 뒤 물에 분산시켜 디클로로메탄으로 분배추출한 후 농축하여 디클로로메탄 가용성 분획을 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 고속액체 크로마토그래피를 수행하여 얻은 에피오레아놀린산은 항암활성이 뛰어나 암 예방을 위한 기능성 식품 및 암의 예방 및 치료를 위한 약제산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the Korean mistletoe of the present invention was extracted with ethanol, concentrated to obtain a crude extract, dispersed in water, extracted with dichloromethane, concentrated to obtain a dichloromethane soluble fraction, and then silica gel column chromatography and Epioreanoic acid obtained by performing high-performance liquid chromatography is a very useful invention in the pharmaceutical industry for the prevention and treatment of cancer and functional food for cancer prevention and excellent anti-cancer activity.
도 1은 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)의 화학적 구조식이다.1 is a chemical structural formula of epi- oleanolic acid, an anticancer active compound of the present invention.
도 2는 한국산 겨우살이로부터 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)을 추출분리하는 방법을 도시한 개략도이다.Figure 2 is a schematic diagram showing a method for extracting and separating the anti-cancer active compound epi- oleanolic acid from Korean mistletoe.
도 3은 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)의 수소 핵자기 공명 스펙트럼이다.Figure 3 is a hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum of the anti-cancer active compound of the present invention epi- oleanolic acid (ep -oleanolic acid).
도 4는 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid) 탄소 핵자기 공명 스펙트럼이다.Figure 4 is an epi- oleanolic acid carbon nuclear magnetic resonance spectrum of the anticancer compound of the present invention.
도 5는 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)의 질량 스펙트럼이다.5 is a mass spectrum of epi- oleanolic acid, an anticancer active compound of the present invention.
도 6은 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)의 적외선 흡수 스펙트럼이다.6 is an infrared absorption spectrum of epi- oleanolic acid, an anticancer active compound of the present invention.
도 7은 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)의 DEPT (distortionless enhancement of polarization transfer) 스펙트럼이다.7 is a distortionless enhancement of polarization transfer (DEPT) spectrum of epi- oleanolic acid, an anticancer active compound of the present invention.
도 8은 실리카젤로부터 얻은 11개 분획의 RAW 264.7 암세포주에 대한 각각의 세포독성을 나타낸 그래프이다.FIG. 8 is a graph showing the respective cytotoxicity of 11 fractions of RAW 264.7 cancer cell lines obtained from silica gel.
도 9는 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)의 암세포 및 정상세포에 대한 독성의 차이를 나타낸 그래프이다.9 is a graph showing the difference in the toxicity of cancer cells and normal cells of the anti-cancer active compound epi- oleanolic acid (ep -oleanolic acid) of the present invention.
도 10은 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)의 FBS 농도에 따라 나타나는 NIH-3T3 암세포에 대한 활성을 나타내는 그래프이다.Figure 10 is a graph showing the activity against NIH-3T3 cancer cells appearing according to the FBS concentration of epi- oleanolic acid, an anticancer active compound of the present invention.
도 11은 한국산 겨우살이로부터 분리한 본 발명의 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)과 합성 에피오레아놀린 산 그리고 VD-3의 입체 이성질체인 오레아놀린 산 (oleanolic acid)의 항암활성을 비교하는 그래프이다.11 is a comparison of the anticancer activity of epi- oleanolic acid, synthetic epioreanolinic acid and oleanolic acid, a stereoisomer of VD-3, isolated from Korean mistletoe. It is a graph.
도 12는 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)에 의한 caspase-1, -3, -8 유도활성을 나타내는 그래프이다.12 is a graph showing caspase-1, -3, and -8 induced activity by epi- oleanolic acid, an anticancer active compound of the present invention.
도 13은 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)으로 처리한 Colon-26 M.3-1 세포에서 DNA 단편화의 유도를 나타낸 것이다.Figure 13 shows the induction of DNA fragmentation in Colon-26 M.3-1 cells treated with epi- oleanolic acid, an anticancer active compound of the present invention.
도 14는 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)을 colon 26 세포에 처리하였을 때 나타나는 세포의 형태학적 변화를 보여준다.Figure 14 shows the morphological changes of the cells appearing when treated with colon 26 cells, epi- oleanolic acid, an anticancer active compound of the present invention.
도 15는 본 발명의 항암활성 화합물인 에피오레아놀린 산 (epi-oleanolic acid)을 처리하였을 때 나타나는 D4-DGI의 활성화를 나타낸 것이다.Figure 15 shows the activation of D4-DGI when treated with epi- oleanolic acid, an anticancer active compound of the present invention.
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