KR100488309B1

KR100488309B1 - 글루타치온과 치자를 유효성분으로 하는 혈관신생억제용조성물

Info

Publication number: KR100488309B1
Application number: KR10-2001-0046076A
Authority: KR
Inventors: 박은희; 임창진; 김선형
Original assignee: 박은희
Priority date: 2001-04-20
Filing date: 2001-07-30
Publication date: 2005-05-10
Also published as: KR20020082390A

Abstract

본 발명은 글루타치온과 치자를 유효성분으로 하는 혈관신생억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 생체내(in vivo) 실험을 통해 글루타치온과 치자 추출물 및 이들 혼합물의 신생혈관억제 효과가 밝혀지며, 이를 기초로 글루타치온과 치자 추출물의 혼합물 또는 치자 추출물을 단독으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물이 제공된다.

Description

글루타치온과 치자를 유효성분으로 하는 혈관신생억제용 조성물 {Anti-angiogenic composition comprising glutathion and gardenia fruits}

본 발명은 글루타치온과 치자를 유효성분으로 함유하는 혈관신생억제용 조성물에 관한 것이다.

안지오스타틴(angiostatin)과 엔도스타틴(endostatin)이 혈관신생을 억제한다는 사실이 밝혀진 이래 혈관신생 억제가 신약개발의 중요한 목표가 되고 있다. 그러나 현재까지 광범위하게 사용되고 있는 약물은 거의 없는 실정으로, 새로운 약물을 개발한다는 것은 매우 시급하고도 기대되는 과제이다. 부작용이 없는 새로운 혈관신생억제 물질이 발견된다면 암 등 여러 질환의 치료에 획기적인 기여를 하게 될 것이다.

신생혈관은 두 개의 다른 과정, 즉 바스큘로제네시스(vasculogenesis)와 안지오제네시스(angiogenesis)에 의하여 생성된다. 바스큘로제네시스는 내피세포 (endothelial cell)의 새로운 분화에 의하여 생성되고, 안지오제네시스는 이미 존재하는 혈관에서 생성된다. 안지오제네시스(이하, "혈관신생"이라 함)는 배아 (embryo)의 발생, 창상치유, 종양성장, 염증, 건선(psoriasis) 및 여러 가지 혈관계 질환에 중요한 역할을 한다. 따라서 질환에 따라 혈관신생의 저해 또는 촉진이 이루어질 필요가 있다 (Veikkola and Alitalo, 1999; Tong and Yuan, 2001).

혈관신생은 통상 엄격하게 조절되는 과정이며 성인조직에서 대부분의 내피세포는 비분화상태에 있다. 혈관신생을 조절하는 능력은 임상과 연구 모두에서 많이 활용되는 것으로, 혈관신생이 억제되도록 조절하는 것은 유용하다. 혈관신생 억제는 암세포의 성장과 같은 부적절한 성장기간 및 만성염증에 있어서 유용하며, 반대로 혈관신생의 촉진적 조절은 이식치료(이식조직의 정착 촉진)나 상처치유를 위해 중요하다. 이러한 것들이 혈관신생이 최근 주목을 받는 이유이다.

혈관신생의 양성 조절제로는 피브로블라스트 성장인자 및 내피세포 성장인자와 같은 미토젠(mitogens), 플라스미노겐 활성화제(PA)와 같은 매트릭스-분해 효소 등이 있다. 음성조절제의 예로는, 트롬보스폰딘-1, 안지오스타틴 및 엔도스타틴 등이 있다. 이밖에 혈관신생과 관련하여 알려진 물질들은 다음과 같다.

쿠르쿠미노이드 (curcuminoid)는 FGF-2에 의하여 유발된 혈관신생을 억제하며(Moahn et al. 2000), 산화질소 공여체(nitric oxide donor)인 S-니트로소캡토프릴(S-nitrosocaptopril)도 혈관신생 효과를 갖는다고 보고되었다 (Jia et al., 1997). 또, 종양치료에 사용되고 있는 자연식품인 상어연골 분말도 랫트 실험에서 혈관신생을 억제하고 (Davis et al., 1997), 내피 단핵세포 활성 폴리펩타이드 Ⅱ(endothelial monocyte activating polypeptide Ⅱ)도 종양 혈관신생을 저해한다고 보고되어 있으며 (Berger et al., 1998), full-length 휴먼 엔도스타틴도 시험관내 혈관신생에 대해 억제효과를 갖는 것으로 보고되었다 (Taddel et al., 1999). 수라민(Suramin) 유사체도 시험관내에서 사람의 혈관신생을 억제하고 (Meyers et al., 2000), heparin sulfate suleparoid는 랫트 각막 혈관신생에 대하여 억제작용을 나타내며 (Benelli et al., 1998), 캡토프릴도 혈관신생의 저해제로 판명되었다 (Qui et al., 2000).

간극교원효소(Interstitial collagenase)가 시험관내 혈관신생 (in vitro angiogenesis)에 요구 된다고 하며(Fisher et al., 1994), 프로테아솜(proteasome) 역시 혈관신생에 관여한다고 밝혀졌고(Oikawa et al., 1998), 아포리포프로테인 (apolipoprotein)은 안지오스타틴과 유사하지만 혈관신생에 영향이 없는 것으로 밝혀졌다 (Lou et al., 1998).

또, 혈관신생 촉진제와 억제제는 혈관 내피세포 (vascular endothelial cell)에서 카베올린-1(caveolin-1) 발현과 caveolae을 달리 조절한다고 보고되어 있다 (Liu et al., 1999).

글루타치온 (Glutathione: GSH)은 모든 세포에 존재하는 트리펩타이드인 Υ-글루타밀-L-시스테인닐글리신 (Υ-glutamyl-L-cysteinylglycine)이다. 글루타치온은 세포내에서 고농도로 발견되는데 그 85%가 세포질에 있고 나머지가 미토콘드리아(10%) 등 다른 세포내 소기관에서 발견된다. 따라서, GSH는 정량적으로 가장 중요한 내인성 항산화제 (endogenous antioxidant)라고 할 수 있다.

GSH는 매우 다양한 기능을 갖는데, 시스테인의 저장 및 수송형태, 생체이물 (xenobiotics)과 전기적 매개체 (electrophilic intermediate)와의 결합 (conjugation), 설프히드릴기(sulfhydryl group)의 유지, 환원가(reducing equivalent)의 이동, 단백질 대사에 있어서의 조절 등을 들 수 있다. 또한, 면역기능과 유전자 발현 조절에 있어서도 GSH의 역할이 알려져 주목되고 있다.

GSH는 세포내에서 Υ-글루타밀시스테인 합성효소(Υ-glutamylcysteine synthetase)(EC 6.3.2.2; GCS)와 글루타치온 합성효소(glutathione synthetase) (EC 6.3.2.3; GS)에 의하여 생성되며, Υ-글루타밀 트랜스펩티다제 (Υ-glutamyl transpeptidase)(EC 2.3.2.2; Υ-GT)에 의하여 분해된다.

GSH의 여러 가지 생물학적 기능을 고려해 볼 때 세포내 GSH 항상성 (homeostasis)은 매우 중요하다. 실제로 GSH는 여러 가지 질병들과 밀접하게 연관되어 있는데, 증가된 oxidative stress와 관련하여 GSH 대사의 변화가 많은 질병발생에 연관된다. 단백질 영양장애 (protein energy malnutrition), 발작, 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease), 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 겸상적혈구 빈혈증 (sickle cell anemia), 노화 관련 만성질환, 루 게리히 질환(Lou Gehrig's disease), 프리드리히 기능장애(Friedrich ataxia), SIDS (sudden infant death syndrome), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 당뇨(diabetes), 폐감염(lung inflammation) 등에 GSH가 관계되는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 GSH가 유행성 감기 바이러스 (influenza virus)로 인한 감기를 예방하는데 좋은 효능을 보인다는 새로운 연구 결과가 발표되었다. 따라서, 염증에서 GSH 조절과 유전자 전사 기전을 이해하게 되면 GSH의 약물학적 생성에 바탕을 둔 새로운 화학요법의 개발 가능성으로 이어질 수 있다. 이와 관련하여 알코올이나 코카인이 투여된 마우스의 혈액에서 GSH수준이 현저히 감소되었음이 관찰되기도 하였으며, 또 정상적인 랫트에서 GSH의 고갈에 의하여 oxidative stress가 야기되면 심한 고혈압이 유발되었다는 보고도 있다.

또한, 글루타치온이 NO (nitric oxide)의 수준을 조절한다고 보고하는 논문도 있으며, 이와 반대로 NO가 글루타치온 합성효소에 작용하여 글루타치온 수준을 조절한다는 논문도 있다. 그러나, 아직까지 글루타치온이 혈관신생억제에 미치는 효과에 대하여는 명확하게 규명되어 있지 않은 실정이다.

치자는 꼭두서니과에 속하는 가르데니아 자스미노이데스 (Gardenia jasminoides)의 과실로, 한방에서는 사화제번, 청열이습, 양혈해독 등의 작용이 있는 것으로 알려져 있다. 치자의 수추출물은 독성이 약하고 대량에서는 하리를 일으키는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 혈관신생억제 효과를 나타내는 새로운 물질을 찾던 중 글루타치온과 치자 및 이들의 혼합물에 혈관신생억제 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서는 병아리의 CAM 분석 (chick embryo chorioallantoic membrane assay) 등을 통해 치자 (Gardenia jasminoides Ellis : GFE) 추출물에 혈관신생억제 효과가 있음이 밝혀진다.

삭제

또한, 본 발명에서는 글루타치온과 치자 추출물의 혼합물에 이들을 각각 단독으로 사용한 것보다 더 우수한 혈관신생억제 효과가 있음이 밝혀진다.

상기와 같은 연구결과를 기초로, 본 발명에서는 글루타치온과 치자의 혼합물 또는 치자를 단독으로 포함하는 새로운 혈관신생억제용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기에 설명될 것이며, 본 발명의 실시에 의해 더 잘 알게 될 것이다.

본 발명에서는 CAM 분석을 통해 글루타치온, 치자 및 이들의 혼합물에 대한 혈관신생억제효과가 밝혀진다.

실험결과, 글루타치온과 치자 추출물은 CAM 분석에서 양성 대조군인 레틴산(retinoic acid)과 비슷한 무혈관영역을 유발하여, 유의성있는 혈관신생억제효과를 갖는 것으로 확인되었다.

또한, 농도를 달리한 치자 추출물의 CAM 분석실험에서 치자의 혈관신생억제활성은 농도의존적인 것으로 나타났다.

글루타치온과 치자의 혼합물에 대한 혈관신생억제 효과 실험에서는 글루타치온과 치자를 각각 단독으로 사용한 경우에 비해 더 우수한 혈관신생억제 효과가 나타나는 것으로 확인되었다.

이러한 실험결과들은 혈관신생억제물질로서의 글루타치온, 치자 및 이들의 혼합물의 새로운 유용성을 제시하는 것이다.

이에 따라, 본 발명에서는 글루타치온과 치자의 혼합물 또는 치자를 단독으로 포함하는 새로운 혈관신생억제용 조성물이 제공된다.

글루타치온은 5㎍/egg 에서 유의성 있는 혈관신생억제 효과를 나타내었으며, 치자는 10㎍/egg 에서 유의성 있는 혈관신생억제 효과를 나타내고 50㎍/egg 에서는 효과가 증가하여 농도의존적인 것으로 나타났다.

본 발명의 혈관신생억제용 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제나 보조제 또는 운반체를 첨가하여 통상의 약제학적 방법으로 제제화할 수 있으며, 다양한 투여경로를 통해 투여될 수 있다. 바람직하게는 정제, 캅셀제, 시럽제와 같은 경구제와 외용제, 점막투여제 등으로 제제화될 수 있다. 유효 투여량은 항혈관신생 활성범위 내에서 상기 부형제 또는 운반체의 종류 및 양, 투여경로 등에 따라 변화될 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

시료의 준비

하기 실시예에서 글루타치온은 시그마(주)의 제품을 구입하여 사용하였다. 치자추출물로는, 치자를 3배 부피의 에탄올(50%)에 1개월 이상 냉침하여 여과한 뒤 그 여액을 감압농축하여 얻은 치자 에탄올 추출물을 사용하였다.

실시예 1

글루타치온의 혈관신생억제효과

CAM 분석으로 글루타치온의 혈관신생억제 효과를 확인하였다. 글루타치온을 CAM에 5㎍/egg 처리하였다. 음성 대조군으로는 식염수를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 혈관신생 억제효과를 갖는 것으로 알려져 있는 레틴산(retinoic acid)을 1㎍/egg 사용하였다. 결과는 도 1과 같다 (A: 음성 대조군, B: 글루타치온, C: 양성 대조군).

식염수로 처리된 음성대조군(A)에서는 혈관신생을 방해하는 반응이 전혀 나타나지 않았으나, 글루타치온(5㎍/egg)으로 처리된 CAM(B)은 양성 대조군인 레틴산(1㎍/egg)으로 처리된 CAM(C)과 비슷한 무혈관영역 (avascular zones)을 유발하여 혈관신생억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 2

CAM 분석에서의 글루타치온의 항혈관신생 활성

4.5일 된 병아리 배아 (chick embryo)의 CAM 표면에 글루타치온(GSH)을 처리하였다. 2일 경과 후 10% 지방 유화제 1∼2㎖를 CAM에 주입하고, 그 결과를 현미경으로 관찰하였다. 음성대조군으로는 식염수를, 양성대조군으로는 레틴산 (retinoic acid: RA)을 각각 사용하였다. 양성대조군인 레틴산으로 처리된 CAM과 유사한 무혈관영역 (avascular zone)을 보이는 (또한 음성대조군과 비교할 때 거의 혈관이 보이지 않는) CAM을 양성으로 하여 양성샘플의 숫자를 계산하였다. 결과는 다음의 표 1과 같다.

시료	농도(㎍/egg)	항혈관신생효과를 보이는 양성샘플의 수	CAM 분석에 사용된 총 샘플의 수	억제율(%)
음성대조군(식염수)	0	3	16	18.75
양성대조군(RA)	1	11	14	78.57
글루타치온(GSH)	5	11	17	64.7

상기 결과로부터 글루타치온은 혈관신생에 있어서 양성 대조군인 레틴산과 비슷한 억제율을 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 3

치자 추출물의 혈관신생억제효과

실시예 1과 유사한 방법으로 CAM 분석을 통해 치자 추출물의 혈관신생억제 효과를 확인하였다. 치자(GFE)의 에탄올 추출물을 CAM에 10㎍/egg 처리하였다. 음성 대조군으로는 식염수를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 혈관신생 억제효과를 갖는 것으로 알려져 있는 레틴산(retinoic acid)을 1㎍/egg 사용하였다. 결과는 도 2와 같다 (A: 음성 대조군, B: 양성대조군, C: 치자).

식염수로 처리된 음성대조군(A)에서는 혈관신생을 방해하는 반응이 전혀 나타나지 않았으나, 치자(10㎍/egg)로 처리된 CAM(C)은 양성 대조군인 레틴산 (1㎍/egg)으로 처리된 CAM(B)과 비슷한 무혈관영역 (avascular zones)을 유발하여 혈관신생억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 4

CAM 분석에서의 치자의 항혈관신생 활성

4.5일된 병아리 배아 (chick embryo)의 CAM 표면에 치자 추출물을 농도를 달리하여 처리하였다. 2일 후 10% 지방 유화제 약 1 내지 2 ㎖를 CAM에 주입하고, 현미경으로 결과를 관찰하였다. 음성 대조군으로는 식염수를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 혈관신생 억제효과를 갖는 것으로 알려져 있는 레틴산(retinoic acid: RA)을 각각 사용하였다. 양성대조군인 레틴산으로 처리된 CAM과 유사한 무혈관영역 (avascular zone)을 보이는 (또한 음성대조군과 비교할 때 거의 혈관이 보이지 않는) CAM을 양성으로 하여 양성샘플의 수를 계산하였다. 결과를 표 2 및 도 3에 나타내었다.

	농도(㎍/egg)	양성샘플의 수	CAM 분석에 사용된 총 샘플 수	억제율(%)(mean±SE)
음성대조군	-	9	39	23.2±3.15
레틴산	1	21	28	76.1±3.90
치자 추출물	1	14	37	38.1±3.10
치자 추출물	10	26	41	63.1±5.15
치자 추출물	50	25	36	69.5±1.10

상기 결과로부터 치자 추출물은 혈관신생에 있어서 양성 대조군인 레틴산과 비슷한 억제율을 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 5

농도에 따른 치자의 혈관신생억제 효과

실시예 4와 같은 방법으로 4.5일된 chick embryo의 CAM 표면에 치자 추출물을 농도를 달리하여 처리하고, 용량에 따른 치자의 혈관신생억제효과를 현미경으로 관찰하였다.

A: GFE 1㎍/egg

B: GFE 10㎍/egg

C: GFE 50㎍/egg

결과는 도 4와 같다. 처리된 치자의 농도가 클수록 무혈관영역이 뚜렷하여, 치자의 혈관신생억제 효과는 농도의존적인 것으로 나타났다.

실시예 6

시간 경과에 따른 치자 추출물의 혈관신생억제 효과

4.5일 된 병아리 배아의 CAM 표면에 치자 추출물 (GFE)을 처리하였다. 2일 경과 후 10% 지방 유화제 1∼2㎖를 CAM에 주입하고, 그 결과를 현미경으로 관찰하였다. 음성대조군으로는 식염수를, 양성대조군으로는 레틴산 (retinoic acid: RA)을 각각 사용하였다. 양성대조군인 레틴산으로 처리된 CAM과 유사한 무혈관영역 (avascular zone)을 보이는 (또한 음성대조군과 비교할 때 거의 혈관이 보이지 않는) CAM을 양성으로 하여 양성샘플의 숫자를 계산하였다. 결과는 다음의 표 3과 같다.

시간 경과		농도(㎍/egg)	양성샘플의 수	CAM분석에 사용된 총 샘플 수	억제율(%)
2일 경과	음성 대조군	0	4	20	20.0
	레틴산	1	8	10	80.0
	치자 추출물	10	15	22	68.2
4일 경과	음성 대조군	0	4	20	20.0
	레틴산	1	12	14	85.0
	치자 추출물	10	14	18	77.8

실시예 7

글루타치온과 치자 추출물의 혼합물에 대한 혈관신생억제 효과 시험

4.5일 된 병아리 배아의 CAM 표면에 글루타치온(GSH)과 치자추출물(GFE)을 각각 그리고 함께 처리하였다. 2일 경과 후 10% 지방 유화제 1∼2㎖를 CAM에 주입하고, 그 결과를 현미경으로 관찰하였다. 음성대조군으로는 식염수를, 양성대조군으로는 레틴산 (retinoic acid: RA)을 각각 사용하였다. 양성대조군인 레틴산으로 처리된 CAM과 유사한 무혈관영역 (avascular zone)을 보이는 (또한 음성대조군과 비교할 때 거의 혈관이 보이지 않는) CAM을 양성으로 하여 양성샘플의 숫자를 계산하였다. 결과는 다음의 표 4과 같다.

시료	농도(㎍/egg)	양성샘플의 수	CAM분석에 사용된 총 샘플 수	억제율(%)
음성대조군	1	4	20	20.0
레틴산	1	8	10	80.0
GSH	0.1	9	18	50.0
GSH+GFE	0.1(GSH)+1(GFE)	12	20	60.0
GFE	1	7	20	35.0

상기 결과로부터 글루타치온과 치자를 혼합한 혼합물의 경우가 이들을 각각 사용한 경우에 비해 더 우수한 혈관신생억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

본 발명에서는 글루타치온 및 치자, 그리고 이들의 혼합물에 대한 새로운 효과를 밝히고 혈관신생억제제로서의 이들의 새로운 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 글루타치온과 치자의 혼합물 및 치자를 단독으로 포함하는 새로운 혈관신생 억제용 조성물은 혈관신생억제를 위한 목적으로 다양한 분야에서 활용될 수 있다.

도 1은 CAM 분석을 통해 글루타치온의 혈관신생억제 효과를 실험한 결과이다.

도 2는 CAM 분석을 통해 치자의 혈관신생억제 효과를 실험한 결과이다.

도 3은 농도에 따른 치자(GFE)의 혈관신생억제 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 4는 CAM 분석을 통해 농도에 따른 치자(GFE)의 혈관신생억제 효과를 실험한 결과이다.

Claims

글루타치온과 치자 추출물을 유효성분으로서 함유하는 혈관신생억제성 항종양제 조성물.
제 1 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 통상의 부형제나 운반체 또는 보조제를 더 포함하는 혈관신생억제성 항종양제 조성물.
삭제
치자 추출물을 유효성분으로서 함유하는 혈관신생억제성 항종양제 조성물.