KR100483706B1 - A Apparatus for the Detection of Laser-induced Epifluoresecne - Google Patents
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Abstract
본 발명은 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 관한 것으로, 생체시료가 배열되는 시료기판으로 투명 또는 반투명 재질의 기판을 사용하고, 시료에서 반사되는 형광과 입사광의 산란광을 집속하는 반사경을 구비하며, 상기 시료를 투과하는 광을 포집하는 집광수단과, 상기 반사경에 의해 반사된 광 및/또는 집광수단에서 출력되는 광에서 노이즈(noise)를 제거하는 기능을 갖는 공간필터와, 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계와, 평행광학계를 통과한 광 중에서 순수한 형광성분을 추출하는 형광필터 및 형광필터에서 출력되는 광을 전기신호로 변환하는 광검출기를 포함하여 시료를 투과하는 빛을 시료측으로 궤환시키는 광 궤환수단을 더 구비함으로써 시료를 투과하는 여기광을 재활용함으로써 발광 포집 효율을 향상시키도록 한 것이다. The present invention relates to a laser-induced surface fluorescence detection device, using a transparent or semi-transparent substrate as a sample substrate arranged biological samples, and comprises a reflector for focusing the scattered light of fluorescence and incident light reflected from the sample, the sample A spatial filter having a light collecting means for collecting light passing through the light, a spatial filter having a function of removing noise from light reflected by the reflector and / or light output from the light collecting means, and light passing through the spatial filter The light passing through the sample is returned to the sample side, including a parallel optical system for converting light, a fluorescence filter for extracting pure fluorescent components from the light passing through the parallel optical system, and a photo detector for converting light output from the fluorescence filter into an electrical signal. Light return means is further provided to improve the light emission collection efficiency by recycling the excitation light passing through the sample. Will.
Description
본 발명은 일반적으로 레이저-유도된 형광(fluorescence)의 검출 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 자세하게는 생체시료가 부착된 투명 또는 반투명 재질의 기판 표면에 부착된 형광체에 레이저나 적절한 파장의 빛을 조사할 때 나오는 형광을 타원반사경 또는 구면반사경 또는 원통형 반사경을 이용하여 포집함과 아울러 생체시료를 투과하는 빛을 포집하여 형광을 검출하는 방법 및 장치에 관한 것이다.BACKGROUND OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention generally relates to methods and apparatus for detecting laser-induced fluorescence, and more particularly to irradiating a laser or light of an appropriate wavelength to a phosphor attached to a surface of a transparent or translucent material to which a biological sample is attached. The present invention relates to a method and apparatus for detecting fluorescence by collecting fluorescence emitted by using an ellipsoidal mirror, a spherical reflector or a cylindrical reflector, and collecting light passing through a biological sample.
현재 DNA 칩 또는 멤브레인을 이용한 단백질 칩에 대해 형광을 검출하는 방법으로는 레이저 유발 형광 검출법(laser-induced fluorescence detection)이 대표적으로 이용되고 있다. 레이저 유발 형광 검출법은 형광물질이 흡수하는 파장의 들뜸 광원으로 레이저를 사용하여 형광물질을 여기 상태(excited state)로 만들고 다시 바닥 상태(ground state)로 이동되면서 나오는 형광의 세기를 측정하는 것이며 각 형광의 세기로부터 농도를 알 수 있다. 이러한 방법으로 DNA 또는 단백질 시료에 형광물질을 붙여 정량 분석을 할 수 있다.Currently, laser-induced fluorescence detection is used as a method for detecting fluorescence of a protein chip using a DNA chip or a membrane. Laser-induced fluorescence detection is a floating light source of wavelengths absorbed by a fluorescent material. The laser is used to measure the intensity of the fluorescence emitted by exciting the fluorescent material in an excited state and moving back to the ground state. The concentration can be known from the intensity of. In this way, fluorescent materials can be attached to DNA or protein samples for quantitative analysis.
레이저 유발 형광 검출법을 이용하여 형광을 검출하는 장치중에서 가장 많이 사용되는 것은 공초점 레이저 주사 장치(confocal laser scanning system)이다. 이 장치는 레이저를 광원으로 이용하고 표본으로부터 발산된 형광 신호를 별도의 특수 검출기인 광증배관(photomultiplier tube)로 받아들인 후 디지털 영상으로 변환시키는 것이다. Among the apparatuses for detecting fluorescence using a laser induced fluorescence detection method is the confocal laser scanning system (confocal laser scanning system). The device uses a laser as a light source, accepts the fluorescence signal emitted from the sample into a special detector, a photomultiplier tube, and converts it into a digital image.
즉, 도 1에 도시한 바와 같이, 공초점 레이저 주사 장치에서는 레이저 광원(11)을 사용하여 표본에 표지한 형광물질에 적합한 파장대의 빛만을 조사(excitation)하여 형광의 발광(emission)을 유도한다. 수십 마이크로 미터 크기의 면적에서 발광한 형광은 최종적으로는 광검출기(17) 앞에 위치한 공간필터(pinhole)(16)를 통하면서 형광점에서 발광한 형광만이 검출 될 수 있도록 구성되어 있다. 미설명 부호 (12)는 입사광용 공간필터, (14)는 대물렌즈, (15)는 시료이다.That is, as shown in Fig. 1, in the confocal laser scanning device, the laser light source 11 is used to induce emission of fluorescence by only excitation of light of a wavelength band suitable for the fluorescent material labeled on the specimen. . The fluorescence emitted in an area of several tens of micrometers is finally configured to detect only the fluorescence emitted at the fluorescence point through a pinhole 16 located in front of the photodetector 17. Reference numeral 12 denotes a spatial filter for incident light, 14 an objective lens, and 15 a sample.
이러한 공초점 레이저 스캐닝 장치는 표본 제작시에 적당한 두께의 커버 글라스를 사용하고, 적합한 대물렌즈를 선택하며, 마운팅 매질(mounting medium)의 올바른 선택 등을 요구하는 한편 초점이 일치하지 않는 부분(out of focus)의 상을 제거할 수 있는 장점이 있으나, 다음과 같은 문제점이 있다.Such a confocal laser scanning device uses a cover glass of a suitable thickness for sample preparation, selects an appropriate objective lens, requires a proper selection of a mounting medium, and the like, and out of focus. There is an advantage that can remove the focus (phase), but there are the following problems.
첫째, 집광 효율이 미약한 문제점이 있다.First, there is a problem that the light collection efficiency is weak.
종래 기술에 의한 장치는 집광 효율면에서 집광각이 60°일 때, 8％선을 넘기 어렵다. 형광은 시료 주변의 모든 방향으로 진행하지만 집광렌즈가 포획할 수 있는 부분은 렌즈와 발광점이 이루는 입체각에 비례하기 때문에 전체 입체각 4π에 대한 렌즈 입체각의 비가 8％선을 넘기 어려운 것이다.The device according to the prior art hardly crosses the 8% line when the light collecting angle is 60 ° in terms of light collecting efficiency. Fluorescence proceeds in all directions around the sample, but the portion that can be captured by the condensing lens is proportional to the solid angle formed by the lens and the light emitting point, so that the ratio of the solid angle of the lens to the total solid angle 4π is less than 8%.
따라서 시료에서 발광된 형광의 90％ 이상은 유용한 정보의 생산에 이용되지 못하고 손실되고 있다. 이와 같이 유실된 형광을 효율적으로 집적할 수 있다면 형광 포착 장비로 이용되는 고가의 광증배관을 사용하지 않고 저가의 실리콘 광 검출기 등을 사용할 수 있는 것이다.Therefore, more than 90% of the fluorescence emitted from the sample is lost in the production of useful information. If the lost fluorescence can be efficiently integrated, a low-cost silicon photodetector can be used without using an expensive photomultiplier tube used as a fluorescent capture device.
둘째, 형광 발광 효율이 미약하다는 문제가 있다.Second, there is a problem that the fluorescence emission efficiency is weak.
형광 발광량은 근본적으로 대상 시료에 포함된 형광 요소들의 양에 의해 결정되는데, 일차적으로 입사 광량을 증대시키면 형광 광량이 증가하게 된다. 그런데 입사광의 강도가 어느 특정치를 넘어서면 형광의 증가는 관찰되지 않고 오히려 높은 에너지 밀도에 의하여 형광 발광 기전이 파괴되는 현상이 관찰된다. 따라서 종래의 장치는 형광을 발광시키기 위하여 특정 파장을 가진 일정 세기 이하의 입사광을 시편에 입사시켜야만 한다.The amount of fluorescent light emission is basically determined by the amount of fluorescent elements included in the target sample, and increasing the amount of incident light increases the amount of fluorescent light. However, when the intensity of incident light exceeds a certain value, the increase in fluorescence is not observed, but rather a phenomenon in which the fluorescence emission mechanism is destroyed by a high energy density is observed. Therefore, the conventional apparatus must inject incident light of a certain intensity or less with a specific wavelength onto the specimen in order to emit fluorescence.
그러나 이러한 입사광 중에서 형광의 발광기전에 참여한 일부의 빛을 제외한 나머지의 광 즉, 시편을 투과한 광은 그대로 빔-덤프(Beam Dump), 빔-트랩(Beam Trap) 등에 의해 포획하여 소진시킨다. 이 빔-덤프 또는 빔-트랩을 이용한 투과광의 소진은 형광 검출에 사용되지 않은 광이 최종면에서 반사된 뒤 임의의 경로를 통하여 광 검출계에 도달함에 따라 신호대 잡음비가 저하되는 것을 방지하기 위한 방안이다. 이러한 방법으로 투과광의 악영향은 방지할 수 있으나, 이를 재활용할 수 있다면 단위 시간당 입사한 광자의 수를 증가시켜 형광을 효율적으로 발광시킬 수 있다.However, the remaining light except for a part of the light participating in the fluorescence emission of the incident light, that is, the light transmitted through the specimen, is captured and exhausted by a beam dump, a beam trap, and the like. The exhaustion of the transmitted light using this beam-dump or beam-trap is a method for preventing the signal-to-noise ratio from deteriorating as light not used for fluorescence detection reaches the photodetector through an arbitrary path after the light is reflected off the final surface. to be. In this way, the adverse effects of the transmitted light can be prevented, but if it can be recycled, the number of photons incident per unit time can be increased to efficiently emit fluorescence.
이와 같은 문제점을 감안하여 이루어진 본 발명은 타원, 구면 또는 원통형 반사경을 사용하여 집광 효율을 향상시킨 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공함에 목적이 있으며, 또한 본 발명의 추가 목적은 시료를 투과하는 여기광을 재활용하여 형광 발광 효율을 획기적으로 개선하도록 한 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공함에 있다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a laser-induced surface fluorescence detection device having an improved light collection efficiency by using an ellipse, spherical or cylindrical reflector. It is to provide a laser-induced surface fluorescence detection device to significantly improve the fluorescence emission efficiency by recycling.
한 가지 관점으로서, 본 발명은 레이저 광을 출사하기 위한 광원; 상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터; 상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단; 상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 타원반사경; 상기 시료를 투과하는 광을 포집하기 위한 집광수단; 상기 타원반사경으로부터 반사되는 광 및 상기 집광수단으로부터 출력되는 광에서 노이즈(noise)를 제거하는 기능을 하는 공간필터; 상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계; 상기 평행광학계를 통과한 광에서 입사 여기광 성분을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터; 상기 형광필터의 출력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광 검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공한다.In one aspect, the present invention provides a light source for emitting laser light; An incident filter for exciting light emitted from the light source; Sample control means for controlling a position of a sample to which light passing through the incident filter is scanned; An elliptical reflector reflecting fluorescence emitted from the sample and scattered light of incident light; Light collecting means for collecting light passing through the sample; A spatial filter for removing noise from light reflected from the ellipsoidal reflector and light output from the light collecting means; A parallel optical system for converting light passing through the spatial filter into parallel light; A fluorescence filter for filtering the incident excitation light component from the light passing through the parallel optical system and passing only the pure fluorescent component; It provides a laser-induced surface fluorescence detection device comprising a photo detector for converting the output light of the fluorescent filter into an electrical signal.
다른 관점으로서, 본 발명은 레이저 광을 출사하기 위한 광원; 상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터; 상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단; 상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 구면반사경; 상기 시료를 투과하는 광을 포집하기 위한 집광수단; 상기 구면반사경으로부터 반사되어 시료를 투과하는 광과 상기 집광수단으로부터 출력되는 광 중에서 노이즈 성분을 제거하기 위한 공간필터; 상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계; 상기 평행광학계를 통과한 광에서 여기광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터; 상기 형광필터의 출력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광 검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a light source for emitting laser light; An incident filter for exciting light emitted from the light source; Sample control means for controlling a position of a sample to which light passing through the incident filter is scanned; A spherical reflector reflecting fluorescence emitted from the sample and scattered light of incident light; Light collecting means for collecting light passing through the sample; A spatial filter for removing noise components from light reflected from the spherical reflector and transmitted through the sample and light output from the light collecting means; A parallel optical system for converting light passing through the spatial filter into parallel light; A fluorescent filter that filters only excitation light from the light passing through the parallel optical system and passes only pure fluorescent components; It provides a laser-induced surface fluorescence detection device comprising a photo detector for converting the output light of the fluorescent filter into an electrical signal.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 1차원의 레이저 광을 출사하기 위한 광원, 상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터, 상기 입사필터를 통과한 1차원의 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단, 상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 원통형 반사경, 상기 시료를 투과하는 1차원의 광을 포집하기 위한 집광수단, 상기 원통형 반사경으로부터 반사되는 광 및 상기 집광수단으로부터 출력되는 1차원의 광에서 노이즈를 제거하기 위한 공간필터, 상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계, 상기 평행광학계를 통과한 광에서 여기광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터, 상기 시료의 각 점에서 나온 형광을 점위치별로 분리하여 검출할 수 있도록 상기 형광필터를 통과한 1차원적 광을 1차원 배열 광검출기로 1차원적으로 집속하는 결상렌즈, 상기 결상렌즈로부터 출력된 1차원적 광을 전기 신호로 변환하기 위한 1차원 배열 광검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공한다. In still another aspect, the present invention provides a light source for emitting laser light in one dimension, an incidence filter for exciting light emitted from the light source, and a position of a sample to which one-dimensional light passing through the incidence filter is scanned. A sample control means, a cylindrical reflector reflecting fluorescence emitted from the sample and scattered light of incident light, a light collecting means for collecting one-dimensional light passing through the sample, light reflected from the cylindrical reflector, and output from the light collecting means A spatial filter for removing noise from one-dimensional light, a parallel optical system for converting light passing through the spatial filter into parallel light, and a fluorescence filter for filtering excitation light from the light passing through the parallel optical system to pass only pure fluorescent components Passing through the fluorescence filter to detect the fluorescence from each point of the sample for each point location separated Laser-induced surface fluorescence detection device comprising an imaging lens for focusing dimensional light into a one-dimensional array photodetector one-dimensionally, and a one-dimensional array photodetector for converting the one-dimensional light output from the imaging lens into an electrical signal To provide.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 레이저 광을 출사하기 위한 광원; 상기 광원으로부터 출사된 광의 파장대역을 조절하는 입사필터; 상기 입사필터를 통과한 광이 주사되어지는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단; 상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 반사경; 상기 시료의 후방에 설치되어 상기 시료를 투과하는 여기광을 시료로 궤환시키는 광 궤환수단; 상기 광 궤환수단의 후방에 설치되어 시료로부터 투과하는 광을 포집하는 집광수단; 상기 반사경으로부터 반사되는 광에서 노이즈 제거를 위한 핀홀을 갖는 공간필터; 상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계; 상기 평행광학계를 통과한 광에서 산란광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터; 상기 형광필터의 출력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광 검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a light source for emitting laser light; An incident filter controlling a wavelength band of the light emitted from the light source; Sample control means for controlling a position of a sample into which light passing through the incident filter is scanned; A reflector reflecting fluorescence emitted from the sample and scattered light of incident light; An optical feedback means installed at the rear of the sample to feed back the excitation light passing through the sample to the sample; Condensing means installed behind the light return means and collecting light transmitted from a sample; A spatial filter having a pinhole for removing noise from light reflected from the reflector; A parallel optical system for converting light passing through the spatial filter into parallel light; A fluorescence filter for filtering the scattered light from the light passing through the parallel optical system to pass only pure fluorescent components; It provides a laser-induced surface fluorescence detection device comprising a photo detector for converting the output light of the fluorescent filter into an electrical signal.
본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 장치에서 표면형광(epifluorescence)은 DNA 칩 또는 멤브레인을 이용한 단백질 칩과 같은 바이오칩(biochip)에 고정되는 분석물로부터 발광되는 형광을 가리킨다. In the laser-induced surface fluorescence detection device of the present invention, the surface fluorescence (epifluorescence) refers to the fluorescence emitted from an analyte immobilized on a biochip such as a protein chip using a DNA chip or a membrane.
DNA 칩이란 기계 자동화와 전자 제어 등을 이용하여 적게는 수백 개부터 많게는 수십만 개의 DNA를 아주 작은 공간에 집어넣을 수 있게 만든 것이다. 다시 말해 DNA 칩은 유리, 실리콘 등의 투명 또는 반투명 재질로 된 작은 기판 위에 DNA를 결합시켜 유전자 발현 양상, 유전자 결합, 단백질 분포, 반응 양상 등을 분석해 낼 수 있는 생물학적 마이크로칩을 말한다. DNA 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA 칩과 올리고 뉴클레오타이드 칩으로 나누어질 수 있다. cDNA 칩에는 최소한 500 bp 이상의 유전자(full-length open leading frame)가 붙여져 있고, 올리고뉴클레오타이드 칩에는 약 15 내지 25개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 붙여져 있다.The DNA chip uses mechanical automation and electronic control to make it possible to put as little as hundreds to hundreds of thousands of DNA into a very small space. In other words, a DNA chip refers to a biological microchip capable of analyzing gene expression, gene binding, protein distribution, and reaction by binding DNA on a small substrate made of transparent or translucent material such as glass or silicon. DNA chips can be divided into cDNA chips and oligonucleotide chips depending on the size of the genetic material attached. At least 500 bp of gene (full-length open leading frame) is attached to the cDNA chip, and an oligonucleotide of about 15 to 25 bases is attached to the oligonucleotide chip.
표적 DNA를 이용한 DNA 칩의 제작 기술은 크게 기판 위에 올리고뉴클레오타이드를 직접 합성하는 방식과 합성 또는 증폭된 표적 DNA를 기판 위에 심는 방식으로 나뉜다. 전자는 반도체 칩을 제작하는 방식에서 유래된 포토리소그래픽(photolithographic) 방법을 이용한 것으로 고밀도 집적이 가능하지만 표적 DNA의 길이가 20개 뉴클레오타이드 내외로 제한된다. 질병의 진단 혹은 일염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)의 연구 등에 적합하다. 후자인 DNA 칩은 차등 유전자 발현(differential gene expression)의 연구에 많이 응용되며 폴리 L-라이신, 아민 혹은 알데하이드로 코팅된 슬라이드 위에 표적 DNA를 심는다. The technology of manufacturing DNA chips using target DNA is largely divided into a method of directly synthesizing oligonucleotides on a substrate and a method of planting synthesized or amplified target DNA on a substrate. The former uses a photolithographic method derived from a method of fabricating a semiconductor chip, and is capable of high density integration, but the target DNA is limited to about 20 nucleotides in length. It is suitable for the diagnosis of disease or the study of Single Nucleotide Polymorphism (SNP). The latter DNA chip has many applications in the study of differential gene expression, and the target DNA is planted on slides coated with poly L-lysine, amine or aldehyde.
본 발명의 다른 양태로서, 멤브레인을 이용한 단백질 칩으로부터 발산되는 표면형광을 검출한다. 이러한 단백질 칩은 제법 또는 응용에 있어서 당업자에게 잘 알려져 있음은 물론 많은 과학전문지 및 특허 문헌에 다양하게 기술되어 있다. 예를 들면, 단백질 칩은 소형의 투명 또는 반투명 기판 위에 여러 질환에 관계되는 단백질에 대한 항체를 집적하고, 환자의 체액으로부터 준비한 분석물을 생화학적 마커로 하여 그 질환의 존재여부 및 진행상태를 조기에 진단한다. 상기 소형의 기판은 통상의 유리판 위에 아비딘(avidin) 등을 이용하여 원하는 단백질을 고착할 수 있다. 다른 방도로서, 폴리스티렌(polystylene)을 기판 재질로 사용할 수 있으며 이러한 폴리스틸렌 기판은 단백질 부착이 용이하고 부착효율도 좋다. 이외에도 기판에 부착하는 단백질의 성질에 따라 폴리염화비닐(polyvinylchloride) 및 폴리프로필렌 (polypropylene)도 사용할 수 있다. In another embodiment of the present invention, surface fluorescence emitted from a protein chip using a membrane is detected. Such protein chips are well known to those skilled in the art for preparation or application, as well as variously described in many scientific and patent literature. For example, a protein chip accumulates antibodies against proteins related to various diseases on a small transparent or translucent substrate, and uses an analyte prepared from the body fluid of a patient as a biochemical marker to detect the presence and progress of the disease early. Diagnose on The small substrate can fix a desired protein on a common glass plate using avidin or the like. Alternatively, polystyrene (polystylene) can be used as the substrate material, such a polystyrene substrate is easy to attach proteins and good adhesion efficiency. In addition, polyvinyl chloride and polypropylene may also be used depending on the nature of the protein attached to the substrate.
상술한 투명 또는 반투명 기판에 단백질을 집적하는 공정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면 폴리스티렌 기판을 사용하는 경우 가로 1.5cm, 세로 1.5cm 크기의 폴리스틸렌 기판에 가로 1mm, 세로 2mm, 깊이 1.5 mm의 홈(groove) 8개를 1mm 간격으로 나란히 형성한다. 분석하고자 하는 단백질을 각각의 홈에 대략 직경 400nm, 간격 500nm로 하여 집적할 경우, 1cm 길이에 10가지 종류의 단백질을 집적하는 것이 가능하다. 즉, 1개의 기판에 80여 종류의 단백질을 집적할 수가 있다. The process of integrating proteins into the transparent or translucent substrate described above is well known to those skilled in the art. For example, when a polystyrene substrate is used, eight grooves having a width of 1 mm, a length of 2 mm, and a depth of 1.5 mm are formed side by side at 1 mm intervals on a polystyrene substrate having a width of 1.5 cm and a length of 1.5 cm. When the protein to be analyzed is integrated in each groove with a diameter of approximately 400 nm and an interval of 500 nm, it is possible to accumulate 10 kinds of proteins in a length of 1 cm. That is, about 80 kinds of proteins can be integrated in one substrate.
본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 방법 및 장치에서 분석물 시료를 표지하는 형광물질은 흡수파장과 방출파장이 20 nm 이상의 차이가 나는 것을 사용할 수 있는데, 대표적인 형광물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 형광 입자, 퀀텀 도트(quantum dot), 란타니드 킬레이트(lanthanide chelate)(예, 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu) 및 테르븀(Tb)) 및 플루오레슨스(fluorescence)(예, FITC, 로다민 그린, 티아디카르보시아닌, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594 및 Alexa 647)가 포함된다. DNA를 검출하는데 사용되는 바람직한 형광물질은 Cy3와 Cy5이다. 일반적으로 형광의 세기는 여기광의 세기가 지나치게 강하지 않으면 여기 광(excitation light)의 세기에 직접 비례한다. In the laser-induced surface fluorescence detection method and apparatus of the present invention, a fluorescent material for labeling an analyte sample may have a difference in absorption wavelength and emission wavelength of 20 nm or more, but representative fluorescent materials are not limited thereto. Particles, quantum dots, lanthanide chelates (e.g. samarium (Sm), europium (Eu) and terbium (Tb)) and fluorescence (e.g. FITC, rhodamine green, Thiadicarbocyanine, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594 and Alexa 647). Preferred fluorescent materials used to detect DNA are Cy3 and Cy5. In general, the intensity of fluorescence is directly proportional to the intensity of excitation light unless the intensity of excitation light is too strong.
본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 방법 및 장치에 사용되는 레이저는 대표적으로 He-Ne 레이저 및 다이오드 레이저가 포함된다. He-Ne 레이저의 예로는 National Research Laboratory of Metrology(NRLM), Agency of Industrial Science and Technology(AIST), Ministry of International Trade and Industry(MITI)에서 개발한 소형의 휴대용 정밀 요오드-안정화 He-Ne 레이저(Model NEO-92SI) 및 모델 05 LYR 173(캘리포니아 어어빈 소재 Melles Griot 제품)을 들 수 있다. 다이오드 레이저는 He-Ne 레이저보다 컴팩트하고 보다 정밀하며 적외선 또는 적색광 다이오드 레이저가 있다. Lasers used in the laser induced surface fluorescence detection method and apparatus of the present invention typically include a He-Ne laser and a diode laser. Examples of He-Ne lasers include small portable precision iodine-stabilized He-Ne lasers developed by the National Research Laboratory of Metrology (NRLM), Agency of Industrial Science and Technology (AIST), Ministry of International Trade and Industry (MITI). Model NEO-92SI) and Model 05 LYR 173 (Melles Griot, Irvine, Calif.). Diode lasers are more compact and more precise than He-Ne lasers and include infrared or red light diode lasers.
본 발명의 장치는 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 반사경 및 시료를 투과하는 광을 포집하기 위한 집광수단을 포함한다. 반사경이 타원반사경인 경우에는 입사필터를 통과한 광이 주사되는 타원반사경의 제1초점에 시료를 위치시키고, 타원반사경에 반사되는 광 및 집광수단에서 출력되는 광은 타원반사경의 제2초점에 집속시킨다. 반사경이 구면반사경인 경우에는 입사필터를 통과한 광이 주사되는 구면반사경의 중심에 상기 시료를 위치시킨다. 또한, 광원을 1차원의 레이저광을 사용하는 경우에는 반사경이 원통형 반사경을 구비하여 상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는 원통형 반사경의 제1초점에 상기 시료를 위치시킨다.The apparatus of the present invention includes a reflector reflecting fluorescence emitted from a sample and scattered light of incident light, and a light collecting means for collecting light passing through the sample. If the reflector is an elliptical reflector, the sample is placed in the first focus of the elliptical reflector from which the light passing through the incident filter is scanned, and the light reflected from the elliptical reflector and the light output from the light collecting means focus on the second focus of the elliptical reflector. Let's do it. In the case where the reflector is a spherical reflector, the sample is placed in the center of the spherical reflector through which the light passing through the incident filter is scanned. In addition, when the light source uses a one-dimensional laser light, the reflector includes a cylindrical reflector to position the sample at a first focus of the cylindrical reflector through which the light passing through the incident filter is scanned.
본 발명의 장치는 다른 관점으로서 시료의 후방에 설치되어 시료를 투과하는 여기광을 시료로 궤환시키는 광 궤환수단을 포함한다. 이러한 광 궤환 수단은 구면반사경이 바람직하다.In another aspect, the apparatus of the present invention includes light feeding means for feeding back the excitation light passing through the sample to the sample. As for this light feedback means, spherical reflector is preferable.
이하, 상기한 바와 같은 본 발명에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 실시 예를 첨부도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, an embodiment of a laser-induced surface fluorescence detection device according to the present invention as described above will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.
도 2는 본 발명의 제1 실시 예에 따른 타원반사경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도로서, 점상의 레이저 광을 출사하기 위한 광원(21)과, 광원(21)으로부터 출사되는 광을 필터링하는 입사필터(22)와, 입사필터(22)를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단(24)과, 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩)의 면에서 발광된 형광과 입사광의 산란광을 반사시키는 타원반사경(23)과, 시료 제어수단(24)을 통과한 광을 포집하는 집광수단(25)인 대물렌즈와, 타원반사경(23)의 제2초점(F′)에 위치되어 타원반사경(23)에서 반사되는 광 및 집광수단(25)으로부터 출력되는 광에서 노이즈를 제거하는 핀홀을 갖는 공간필터(26)와, 공간필터(26)를 통과한 광을 평행광으로 변환하는 평행광학계(27)와, 평행광학계(27)를 통해 출력되는 광신호에서 여기광 성분은 필터링하고 순수한 형광성분을 통과시키는 형광필터(28)와, 형광필터(28)를 통과한 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광검출기(29)와, 광검출기(29)로 입력되는 신호를 분석처리하여 디스플레이하는 컴퓨터 단말기(30)로 구성되어 있다.2 is a block diagram of an elliptical reflector laser-induced surface fluorescence detection device according to a first embodiment of the present invention, which filters a light source 21 for emitting a point-shaped laser light and light emitted from the light source 21. The incident filter 22, the sample control means 24 for controlling the position of the sample to which the light passing through the incident filter 22 is scanned, and the fluorescence and incident light emitted from the surface of the sample (DNA chip or protein chip) An elliptical reflector 23 for reflecting scattered light, an objective lens which is a light collecting means 25 for collecting light passing through the sample control means 24, and a second focal point F ′ of the ellipsoidal reflector 23 A spatial filter 26 having a pinhole for removing noise from light reflected by the elliptical reflector 23 and light output from the light collecting means 25, and parallel to convert light passing through the spatial filter 26 into parallel light. The excitation light component in the optical signal output through the optical system 27 and the parallel optical system 27 is A fluorescence filter 28 for filtering and passing pure fluorescent components, a photodetector 29 for converting light passing through the fluorescence filter 28 into an electrical signal, and a signal input to the photodetector 29 And a computer terminal 30 for display.
시료가 일정한 패턴으로 배열된 시료기판을 갖는 시료제어 수단(24)은 시료기판으로 투명 또는 반투명 재질의 기판을 사용하고, 반사경으로 타원반사경(23)을 사용하며, 시료 제어수단(24)에 의해 시료를 타원반사경(23)의 제1초점(F)에 위치시키도록 구성한다.The sample control means 24 having a sample substrate in which the samples are arranged in a constant pattern uses a transparent or semitransparent substrate as the sample substrate, an elliptical reflector 23 as the reflector, and is provided by the sample control means 24. The sample is configured to be positioned at the first focal point F of the ellipsoidal reflector 23.
본 발명에 적용된 광원(21)인 레이저는 형광물질 표지 Alexa의 흡수 최대치에 근접하는 파장 638 nm에서 방출하는 2 mW He-Ne 레이저이다. The laser, which is the light source 21 applied in the present invention, is a 2 mW He-Ne laser that emits at a wavelength of 638 nm near the absorption maximum of the fluorescent substance label Alexa.
이와 같이 구성되는 본 발명의 제1 실시예에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 동작은 레이저 광원(21)의 빛이 입사필터(22)를 통과하고 타원반사경(23)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 이때 광원(21)의 빛이 입사필터(22)를 지나 타원반사경(23)의 구멍을 적절히 통과할 수 있도록 광원(21), 입사필터(22) 및 타원반사경(23)은 일렬로 나란히 배치되는 것이 바람직하다. The operation of the laser-induced surface fluorescence detection device according to the first embodiment of the present invention configured as described above is performed by the light of the laser light source 21 passing through the incidence filter 22 and the hole located at an intermediate point of the elliptical reflector 23. To pass. At this time, the light source 21, the incident filter 22 and the ellipsoidal reflector 23 are arranged side by side so that the light of the light source 21 can pass through the hole of the elliptical reflector 23 through the incident filter 22 appropriately. It is preferable.
타원반사경(23)을 통과한 빛은 시료 제어수단(24)의 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩)의 면에 적절한 크기로 집속되며, 이때, 시료는 빛이 최적으로 집속될 수 있도록 시료 제어수단(24)에 의하여 상,하 혹은 전,후(지면에 수직한 방향)로 이동하여 위치를 변경할 수 있다. 이 집속점은 타원반사경(23)의 제1초점(F)에 위치하고 있다. The light passing through the ellipsoidal reflector 23 is focused to an appropriate size on the surface of the sample (DNA chip or protein chip) of the sample control means 24, and in this case, the sample is controlled by the sample control means so that the light can be optimally focused. By 24), the position can be changed by moving up and down or before and after (in the direction perpendicular to the ground). This focusing point is located at the first focal point F of the ellipsoidal reflector 23.
시료의 표면에서 입사광에 의해 발광된 형광은 시료 제어수단(24)의 전면부(입사광이 들어온 방향)와 후면부로 진행한다. 전면부로 진행한 빛(A)은 타원반사경(23)에 반사되어 시료 제어수단(24)의 후면부로 진행되고, 후면부로 진행하는 빛(B)은 집광수단(25)에 의해 공간필터(26)의 핀홀로 집속된다. 이때, 타원반사경(23)에 의해 반사되어 후면부로 진행되는 빛(A)도 공간필터(26)의 핀홀로 집속된다.The fluorescence emitted by the incident light on the surface of the sample proceeds to the front part (direction in which incident light enters) and the rear part of the sample control means 24. The light A traveling to the front part is reflected by the ellipsoidal reflector 23 and proceeds to the rear part of the sample control means 24, and the light B traveling to the back part is collected by the light collecting means 25. Focused in the pinhole. At this time, the light A reflected by the ellipsoidal reflector 23 and proceeds to the rear part is also focused into the pinhole of the spatial filter 26.
이와 같이 공간필터(26)를 통과하는 빛은 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈(noise)를 제거하는 작용을 실시하게 되며, 공간필터(26)를 통과한 빛은 평행광학계(collimator)(27)에 의하여 평행광으로 변형되고, 평행광학계(27)을 통과하면서 형성된 평행광은 형광필터(28)를 지나면서 여기광은 걸러지고 순수한 형광성분만이 광검출기(29)로 입사되어 이의 세기(fluorescence intensity)를 표시하는 신호(signals)로 컴퓨터(30)로 전송되어 분석 처리된다.In this way, the light passing through the spatial filter 26 serves to remove noise caused by dust and the like located on the surface of the sample, and the light passing through the spatial filter 26 is a parallel optical system (collimator) 27. The parallel light is transformed into parallel light by the light beam, and the parallel light formed while passing through the parallel optical system 27 passes through the fluorescence filter 28, and the excitation light is filtered out. Only the pure fluorescence component is incident on the photodetector 29, and its intensity is fluorescence. Signals indicating intensity are transmitted to the computer 30 for analysis.
시료기판에 배열된 시료의 일 지점에 대하여 이상과 같은 과정을 수행하고 난 후에는 시료 제어수단(24)을 상,하 또는 전,후방향으로 이동시켜 동일한 과정을 반복수행함으로써 시료의 형광성분을 측정한다.After performing the above-described process on one point of the sample arranged on the sample substrate, the sample control means 24 is moved up, down or forward and backward to perform the same process and repeat the same process. Measure
도 3은 본 발명의 제2 실시예에 따른 구면경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도로서, 투명 또는 반투명 재질의 시료기판을 포함하는 시료 제어수단(34)을 구비하고, 반사경으로 구면반사경(33)을 사용하며, 구면반사경(33)의 중심(O)에 시료가 위치되도록 시료 제어수단(34)을 설치한 것이다.3 is a block diagram of a spherical laser-induced surface fluorescence detection device according to a second embodiment of the present invention, comprising sample control means 34 including a sample substrate made of transparent or translucent material, and having a spherical reflector 33 as a reflector. ), And the sample control means 34 is installed so that the sample is located at the center O of the spherical reflector 33.
장치의 구성은 점상의 레이저 광을 출사하기 위한 광원(31)과, 광원(31)으로부터 출사되는 광을 필터링하는 입사필터(32)와, 입사필터(32)를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단(34)과, 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩)의 면에서 발광된 형광과 입사광의 산란광을 반사시키는 구면반사경(33)과, 시료 제어수단(34)을 통과한 광을 포집하는 집광수단(35)인 대물렌즈들(35A,35B)과, 집광수단(35)으로부터 출력되는 광에서 노이즈를 제거하는 핀홀을 갖는 공간필터(36)와, 공간필터(36)를 통과한 광을 평행광으로 변환하는 평행광학계(37)와, 평행광학계(37)를 통해 출력되는 광신호의 여기광은 필터링하고 순수한 형광성분을 통과시키는 형광필터(38)와, 형광필터(38)를 통과한 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광검출기(39)와, 광검출기(39)로 입력되는 신호를 분석 처리하는 컴퓨터 단말기(40)로 구성되어 있다.The configuration of the device is a light source 31 for emitting a point-shaped laser light, an incident filter 32 for filtering the light emitted from the light source 31, and a sample for scanning the light passing through the incident filter 32. Sample control means 34 for controlling the position, spherical reflector 33 for reflecting fluorescence emitted from the surface of the sample (DNA chip or protein chip) and scattered light of incident light, and light passing through the sample control means 34. Through the spatial filter 36 and the spatial filter 36 having objective lenses 35A and 35B which are light collecting means 35 for collecting light, a pinhole which removes noise from the light output from the light collecting means 35. A parallel optical system 37 for converting a light into parallel light, a fluorescence filter 38 for filtering excitation light of an optical signal output through the parallel optical system 37 and passing pure fluorescent components, and a fluorescence filter 38 Photo detector 39 for converting the light passing through the signal into an electrical signal, and the input to the photo detector 39 It consists of the computer terminal 40 which analyzes a call.
이와 같이 구성된 본 발명의 제2 실시예에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 동작은 레이저 광원(31)의 빛은 입사필터(32)를 통과하고 입사필터(32)와 시료 사이에 배치되어 있는 구면반사경(33)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 구면반사경(33)을 통과한 빛은 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩)에 적절한 크기로 집속되어 형광의 발광이 유도되는데, 이때 시료의 표면에서 입사광에 의해 발광된 형광은 시료의 전면부(입사광이 들어온 방향)와 후면부로 진행된다. 전면부로 진행하는 빛(D)은 시료에서 그 반지름만큼의 거리에 위치한 구면반사경(33)에 수직으로 입사한 후에 정확하게 다시 본래의 위치인 시료의 위치로 반사된다. 이와 같이 시료쪽으로 재입사한 형광은 시료에 일부 밖에 흡수되지 않기 때문에 대부분은 시료를 투과하여 진행된다.In the operation of the laser-induced surface fluorescence detection device according to the second embodiment of the present invention configured as described above, the light of the laser light source 31 passes through the incident filter 32 and is disposed between the incident filter 32 and the sample. It passes through the hole located at the midpoint of the reflector 33. The light passing through the spherical reflector 33 is focused on a sample (DNA chip or protein chip) to an appropriate size to induce fluorescence. In this case, the fluorescence emitted by the incident light on the surface of the sample is the front part of the sample (incident light). Direction) and back part. The light D traveling to the front part is incident perpendicularly to the spherical reflector 33 located at the distance of the radius from the sample, and is reflected back to the position of the sample which is exactly the original position. Since the fluorescence reincident to the sample is only absorbed by the sample, most of it passes through the sample.
따라서 시료의 후면부로 진행하는 빛(E)과 구면반사경(34)에 의하여 반사되어 진행하는 빛(D)은 집광수단(35)을 거치게 된다. 본 발명의 제2 실시예에서는 집광수단(35)을 대물렌즈(35A)와 대물렌즈(35B)를 사용하고 있는 바, 이에 한정되는 것이 아니라 다양한 종류의 볼록 또는 오목형태의 렌즈의 조합이 실시가능하다.Therefore, the light D traveling to the rear portion of the sample and the light D reflected by the spherical reflector 34 pass through the light collecting means 35. In the second embodiment of the present invention, the light collecting means 35 uses the objective lens 35A and the objective lens 35B, but the present invention is not limited thereto, and a combination of various types of convex or concave lenses can be implemented. Do.
집광수단(35)을 통과한 빛은 공간필터(36)의 핀홀을 통해 노이즈 제거 과정(36)를 거치면서 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈를 제거하는 작용을 실시하며, 공간필터(36)를 통과한 빛은 평행광학계(37)에 의하여 평행광으로 변형되고, 이러한 평행광은 형광필터(38)를 지나면서 입사 여기광은 걸러지고 순수한 형광성분만이 광검출기(39)로 입사되어 이의 세기를 표시하는 신호로 컴퓨터 단말기(40)로 전송되어 분석 처리된다.The light passing through the light collecting means 35 performs a noise removing process 36 through the pinhole of the spatial filter 36 to remove noise caused by dust or the like located on the surface of the sample, and the spatial filter 36. The light passing through is transformed into parallel light by the parallel optical system 37, and the parallel light passes through the fluorescence filter 38, and the incident excitation light is filtered out, and only the pure fluorescence component is incident on the photodetector 39 and its intensity is increased. The signal is transmitted to the computer terminal 40 and analyzed.
본 발명의 제2 실시 예에서도 동일하게 시료의 일 지점에 대하여 이상과 같은 과정을 수행하고 난 후에는 시료 제어수단(34)에 의해 시료를 상,하 또는 전,후로 이동시켜 동일한 과정을 반복수행함으로써 시료의 형광성분을 측정하게 된다.In the second embodiment of the present invention, the same procedure is repeatedly performed by moving the sample up, down, before, or after by the sample control means 34 after performing the above process with respect to one point of the sample. As a result, the fluorescent component of the sample is measured.
도 4는 본 발명의 제3 실시예에 따른 원통형 반사경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도로서, 반사경은 원통형(Cylindrical) 반사경(43)을 사용하고, 시료가 원통형 반사경(43)의 중심에 위치하도록 시료 제어수단(44)을 설치한 것이다.4 is a block diagram of a cylindrical reflector laser-induced surface fluorescence detection device according to a third embodiment of the present invention, the reflector using a cylindrical reflector 43, the sample is located in the center of the cylindrical reflector 43 The sample control means 44 is provided so that it may become.
장치의 구성은 1차원적으로 확장되는 1차원의 레이저광을 출사하기 위한 광원(41)과, 광원(41)으로부터 출사된 광을 필터링하는 입사필터(42)와, 입사필터(42)를 통과한 1차원 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단(44)과, 시료의 형광과 입사광의 산란광을 반사시키는 원통형 반사경(43)과, 시료를 통과한 광을 포집하는 집광수단(45)인 대물렌즈와, 원통형 반사경(43)에서 반사되는 광 및 시료를 통과한 광에서 노이즈를 제거하는 공간필터(46)와, 공간필터(46)를 통과한 광을 평행광으로 변형하는 평행광학계(47)와, 평행광학계(47)를 통해 출력되는 광신호의 여기광은 필터링하고 순수한 형광성분을 통과시키는 형광필터(48)와, 시료(44)의 각 점에서 나온 형광을 점위치별로 분리하여 검출할 수 있도록 형광필터(48)를 통과한 1차원적 광을 1차원 배열 광검출기(49)로 1차원적으로 집속하는 결상렌즈(51)와, 결상렌즈로부터 출력된 1차원적 광을 전기 신호로 변환하기 위한 1차원 배열 광검출기(49)와, 1차원 배열 광검출기(49)로 입력되는 신호를 분석처리하는 컴퓨터 단말기(50)로 구성되어 있다.The configuration of the device passes through a light source 41 for emitting a one-dimensionally extended laser light, an incident filter 42 for filtering the light emitted from the light source 41, and an incident filter 42. Sample control means 44 for controlling the position of the sample to which the one-dimensional light is scanned, cylindrical reflector 43 for reflecting the fluorescence of the sample and scattered light of the incident light, and condensing means 45 for collecting the light passing through the sample. The objective lens, the spatial filter 46 for removing noise from the light reflected by the cylindrical reflector 43 and the light passing through the sample, and the parallel optical system for transforming the light passing through the spatial filter 46 into parallel light. (47), the excitation light of the optical signal output through the parallel optical system 47 is separated by the fluorescence filter 48 for filtering and passing the pure fluorescence component, and the fluorescence from each point of the sample 44 for each point position The one-dimensional light passed through the fluorescence filter 48 so as to be detected by An imaging lens 51 that focuses one-dimensionally with the photodetector 49, a one-dimensional array photodetector 49 for converting one-dimensional light output from the imaging lens into an electrical signal, and a one-dimensional array photodetector It consists of a computer terminal 50 for analyzing and processing the signal input to 49.
이와 같이 구성되어 있는 본 발명의 제3 실시예에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 동작은 시료를 원통형 반사경(43)의 제1초점(F1)에 위치시킨 상태에서 레이저 광원(41)으로부터 입사되는 1차원으로 확장된 빛이 입사필터(42)를 통과하여 시료로 주사되어 발광되는 형광과 입사광의 산란광이 원통형 반사경(43)에서 반사되어 공간필터(46)로 집속되며, 시료를 투과하는 광은 집광수단(45)에 의해 집광된 상태로 공간필터(46)로 집속된다.The operation of the laser-induced surface fluorescence detection device according to the third embodiment of the present invention configured as described above is incident from the laser light source 41 in a state where the sample is positioned at the first focal point F 1 of the cylindrical reflector 43. The one-dimensionally extended light is passed through the incident filter 42 and the fluorescence emitted from the sample is emitted and the scattered light of the incident light is reflected by the cylindrical reflector 43 and focused on the spatial filter 46, and the light passing through the sample. Is condensed into the spatial filter 46 in a state where it is collected by the light collecting means 45.
이와 같이 집속된 상태로 공간필터(46)를 통과한 광은 평행광학계(47)를 통과하면서 평행광으로 변형된 후에 형광필터(48) 및 결상렌즈(51)를 차례로 통과하여 1차원 배열 광검출기(49)로 입사되어 컴퓨터 단말기(50)로 전송되어 분석 처리된다.The light passing through the spatial filter 46 in this focused state is transformed into parallel light while passing through the parallel optical system 47, and then passes through the fluorescent filter 48 and the imaging lens 51 in order to form a one-dimensional array photodetector. It enters 49 and is sent to the computer terminal 50 for analysis.
시료의 일 배열에 대하여 이상의 과정을 수행한 후에 시료를 상, 하 또는 좌,우로 이동시켜 동일한 과정을 반복하여 시료의 형광성분을 측정한다.After performing the above procedure for one array of samples, the sample is moved up, down or left and right, and the same process is repeated to measure the fluorescent component of the sample.
상기 집광수단(45) 및 평행광학계(47)는 각각 독립적으로 실린더형 렌즈이거나 도 4에 도시된 바와 같은 반쪽 실린더형 렌즈이다.The light collecting means 45 and the parallel optical system 47 are each independently cylindrical lenses or half cylindrical lenses as shown in FIG. 4.
도 5는 도 4에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 의해 생체시료기판을 스캐닝 하는 상태를 설명하기 위한 도면이다.FIG. 5 is a view for explaining a state in which a biological sample substrate is scanned by the laser induced surface fluorescence detection apparatus of FIG. 4.
1차원으로 확장된 빛은 2차원으로 시료가 배열되어 있는 시료기판(44A)에 주사되므로 1회의 스캔(S)에 의해 다수의 시료(44B)로부터 발광되는 형광을 검출할 수 있게 되며, 결과적으로 2차원적인 스캔 과정을 1차원 스캔으로 줄일 수 있어 측정 시간을 단축함과 아울러 발광 효율을 향상시킬 수 있다.Since the light extended in one dimension is scanned on the sample substrate 44A in which the samples are arranged in two dimensions, the fluorescence emitted from the plurality of samples 44B can be detected by one scan S, and as a result, Since the two-dimensional scanning process can be reduced to one-dimensional scanning, the measurement time can be shortened and the luminous efficiency can be improved.
도 6은 본 발명의 제4 실시예에 따른 광 궤환수단이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도로서, 집광 효율을 높이기 위해 반사경을 적용함과 아울러 시료의 형광 발광 효율을 증대시키기 위하여 여기광을 재활용하도록 구성한 것이다. 이를 위하여 본 발명의 제4 실시예에서는 시료의 후방에 광 궤환수단을 구비하여 시료를 투과한 여기광을 다시 시료로 궤환시켜 다시 여기광의 기능을 수행하도록 한 것이다.6 is a block diagram of a laser-induced surface fluorescence detection device to which the light feedback means according to the fourth embodiment of the present invention is applied, and the excitation light is applied to increase the fluorescence emission efficiency of the sample while applying a reflector to increase the light collection efficiency. It is configured to recycle. To this end, in the fourth embodiment of the present invention, a light feedback means is provided at the rear of the sample to return the excitation light transmitted through the sample back to the sample to perform the function of the excitation light again.
본 발명의 제4 실시예에서는 반사경으로 구면반사경(33)을 사용하였으나, 필요에 의해 타원반사경을 사용할 수도 있다.In the fourth embodiment of the present invention, the spherical reflector 33 is used as the reflector, but an elliptical reflector may be used if necessary.
본 발명 제4 실시예의 구성은 점상의 레이저광을 출사하기 위한 광원(31)과, 광원(31)으로부터 출사된 광을 필터링하는 입사필터(32)와, 입사필터(32)를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단(34)과, 시료의 형광과 입사광의 산란광을 반사시키는 구면반사경(33)과, 시료의 후방에 설치되어 시료를 투과한 광(I)과 근축산란광(H)을 시료측으로 궤환시키기 위한 광 궤환수단(60)인 제2의 구면반사경과, 광 궤환수단(60)의 후방에 설치되어 시료 제어수단(34)을 통과한 광을 포집하는 집광수단(35)인 대물렌즈와, 집광수단(35)으로부터 출력되는 광에서 노이즈를 제거하는 핀홀을 갖는 공간필터(36)와, 공간필터(36)를 통과한 광을 평행광으로 변형하기 위한 평행광학계(37)와, 평행광학계(37)를 통해 출력되는 광신호의 여기광은 필터링하고 순수한 형광성분을 통과시키는 형광필터(38)와, 형광필터(38)를 통과한 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광검출기(39)와, 광검출기(39)로 입력되는 신호를 분석처리하여 디스플레이하는 컴퓨터 단말기(40)로 구성되어 있다.According to the fourth embodiment of the present invention, a light source 31 for emitting a point laser light, an incident filter 32 for filtering light emitted from the light source 31, and light passing through the incident filter 32 are included. A sample control means 34 for controlling the position of the sample to be scanned; a spherical reflector 33 for reflecting the fluorescence of the sample and scattered light of the incident light; and light (I) and paraxial scattered light provided behind the sample and passing through the sample; A second spherical reflector, which is an optical feedback means 60 for returning (H) to the sample side, and a light collecting means for collecting light passing through the sample control means 34 provided at the rear of the optical feedback means 60; A spatial filter (36) having an objective lens (35), a pinhole for removing noise from light output from the light collecting means (35), and a parallel optical system for transforming light passing through the spatial filter (36) into parallel light ( 37) and excitation light of the optical signal output through the parallel optical system 37 is filtered and A fluorescent filter 38 for passing light components, a photo detector 39 for converting light passing through the fluorescent filter 38 into an electrical signal, and a signal input to the photo detector 39 are analyzed and displayed. It consists of a computer terminal 40.
본 발명의 제4 실시예에서는 시료 제어수단(34)의 후방에 시료의 영상점에 중심점이 일치하도록 광 궤환수단(60)인 제2 구면반사경을 설치하여 시료를 투과하는 광(I)과 근축산란광(H)을 궤환시켜 다시 여기광의 기능을 수행케 한다. 시료를 통과한 광은 광 궤환수단(60)의 후방에 설치된 집광수단(35)에 의해 포집되어 이를 통해 공간필터(46)로 집속된다.In the fourth embodiment of the present invention, the second spherical reflector, which is the optical feedback means 60, is installed at the rear of the sample control means 34 so that the center point coincides with the image point of the sample. The scattered light (H) is fed back to perform the function of the excitation light again. The light passing through the sample is collected by the light collecting means 35 installed at the rear of the light feedback means 60, and is then focused on the space filter 46.
이와 같이 구성된 본 발명의 제4 실시예의 동작은 시료 제어수단(34)에 의해 시료를 구면반사경(33)의 중심(O1)에 위치시키고, 외부의 광원(31)으로부터 특정 파장의 빛을 집속시켜 형광의 발광을 유도하면, 시료의 표면에서 입사광에 의해 발광된 형광은 시료의 전면부와 후면부로 진행된다.The operation of the fourth embodiment of the present invention configured as described above places the sample at the center O 1 of the spherical reflector 33 by the sample control means 34 and focuses light of a specific wavelength from the external light source 31. When fluorescence is induced, fluorescence emitted by incident light on the surface of the sample proceeds to the front and rear portions of the sample.
따라서 전면부로 진행하는 빛(D)은 시료에서 구면반사경(33)의 반지름의 거리에 위치한 구면반사경(33)에 수직으로 입사하여 반사됨으로써 정확하게 제 위치인 시료로 재입사되는데 이때 재입사되는 형광은 시료의 흡수에너지와 다르기 때문에 시료에 일부 밖에 흡수되지 않고 대부분이 시료를 투과하여 진행된다.Therefore, the light (D) traveling to the front part is incident to the spherical reflector 33 located at the distance of the radius of the spherical reflector 33 from the sample perpendicularly reflected and re-entered into the sample in the correct position. Since it is different from the absorbed energy of the sample, only part of it is absorbed by the sample and most of it proceeds through the sample.
한편, 시료를 투과하여 후면부로 진행한 광(I) 및 근축산란광(H)은 광의 폭보다 약간 큰 너비를 갖는 광 궤환수단(60)인 제2 구면반사경에 의해 반사되어 시료로 재입사되면서 다시 빛(G)의 상태로 구면반사경(33)으로 궤환되어 결과적으로 시료에는 입사광과 광 궤환수단(60)에 의하여 궤환된 광이 조사하게 되어 생체시료의 발광효율을 향상시키는 것이다.On the other hand, the light I and paraxial scattered light H transmitted through the sample to the rear part are reflected by the second spherical reflector, which is a light feedback means 60 having a width slightly larger than the width of the light, and then re-injected into the sample. The light is fed back into the spherical reflector 33 in the state of light G, and as a result, the incident light and the light returned by the light feedback means 60 are irradiated to improve the luminous efficiency of the biological sample.
이후에 시료를 투과하는 광은 광궤환수단(60)의 후방에 위치한 집광수단(35)을 통해 공간필터(36)에 집속되고, 평행광학계(37)를 통과하면서 적절한 광속 처리과정을 거치게 되며, 최종적으로 형광필터(38)를 통과한 후에 광 검출기(39)로 입사되어 컴퓨터 단말기(40)로 전송되어 분석 처리된다.Thereafter, the light passing through the sample is focused on the spatial filter 36 through the light collecting means 35 located at the rear of the light feeding means 60, and passes through the parallel optical system 37 to undergo an appropriate light beam processing. Finally, after passing through the fluorescence filter 38, it is incident on the photodetector 39 and transmitted to the computer terminal 40 for analysis.
이처럼 본 발명의 제4 실시예는 시료를 투과한 광을 궤환시켜 단위시간당 입사되는 광자의 수를 증가시키게 되므로 입사광량을 증가시킬 필요가 없게 되고, 입사 광량을 지나치게 증가시킴에 따라 형광 발광기전이 파괴되는 문제점을 해결할 수 있게 된다.As such, the fourth embodiment of the present invention does not need to increase the amount of incident light because the number of photons incident per unit time is increased by feeding back light passing through the sample, and the fluorescence emission mechanism is increased by excessively increasing the amount of incident light. The problem of being destroyed can be solved.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 DNA 또는 단백질 칩과 같은 생체시료가 일정한 패턴으로 형성된 기판을 투명 또는 반투명 재질의 기판을 사용하도록 하고, 이러한 기판을 홀딩하여 위치를 제어할 수 있는 시료 제어수단을 구비하며, 시료로 주사되는 입사광을 집속시키기 위한 수단으로 타원, 구면 또는 원통형 반사경을 사용함으로써 집광 효율을 종래의 기술보다 최소 5배 이상으로 향상시키는 효과가 있다.As described above, the present invention provides a sample control means for controlling the position by holding a substrate formed of a predetermined pattern of biological samples such as DNA or protein chips using a transparent or translucent material and holding such a substrate. It is provided with an ellipse, spherical or cylindrical reflector as a means for focusing the incident light to be scanned into the sample has the effect of improving the light collection efficiency to at least 5 times or more than the prior art.
또한, 시료로부터 투과되는 광을 포집하기 위하여 시료의 후방에 광 궤환수단을 설치함으로써 형광을 발생시키는 입사광의 유효에너지를 2배 이상으로 활용할 수 있어 형광 발광 효율을 극대화시키는 효과가 있다.In addition, by collecting the light feedback means behind the sample to collect the light transmitted from the sample, the effective energy of the incident light for generating fluorescence can be utilized twice or more, thereby maximizing the fluorescence emission efficiency.
도 1은 종래 기술에 따른 레이저 유발 형광 검출 장치의 구성도.1 is a block diagram of a laser-induced fluorescence detection device according to the prior art.
도 2는 본 발명에 따라 타원반사경이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도.Figure 2 is a block diagram of a laser-induced surface fluorescence detection device to which an elliptical reflector is applied according to the present invention.
도 3은 본 발명에 따라 구면경이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도.3 is a block diagram of a laser-induced surface fluorescence detection apparatus is applied according to the present invention.
도 4는 본 발명에 따라 원통형 반사경이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도.Figure 4 is a block diagram of a laser-induced surface fluorescence detection device applied with a cylindrical reflector in accordance with the present invention.
도 5는 도 4에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 의해 스캔을 실시하는 상태도.Fig. 5 is a state diagram of scanning by the laser induced surface fluorescence detection device according to Fig. 4.
도 6은 본 발명에 따라 광궤환 수단이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도.Figure 6 is a block diagram of a laser-induced surface fluorescence detection device to which the optical feedback means is applied in accordance with the present invention.
< 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명 ><Description of Symbols for Major Parts of Drawings>
21,31,41: 광원 22,32,42: 입사필터21,31,41: light source 22,32,42: incident filter
23: 타원반사경 33: 구면반사경23: elliptical reflector 33: spherical reflector
43: 원통형 반사경 24,34,44: 시료기판43: cylindrical reflector 24, 34, 44: sample substrate
25,35(A, B),45: 집광수단 26,36,46: 공간필터25, 35 (A, B), 45: Condensing means 26, 36, 46: Spatial filter
27,37,47: 평행광학계 28,38,48: 형광필터27,37,47: Parallel optical system 28,38,48: Fluorescence filter
29,39,49: 광검출기 30,40,50: 컴퓨터 단말기29,39,49: photodetectors 30,40,50: computer terminals
51: 결상렌즈 60: 광 궤환수단51: imaging lens 60: optical feedback means
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