KR100480972B1

KR100480972B1 - 초피나무 추출물을 유효성분으로 하는 다이옥신유사물질에 대한 길항성 조성물

Info

Publication number: KR100480972B1
Application number: KR10-2002-0015882A
Authority: KR
Inventors: 장문석; 이석근; 신호진; 노현모
Original assignee: (주)내츄럴엔도텍
Priority date: 2001-03-24
Filing date: 2002-03-23
Publication date: 2005-05-06
Also published as: KR20030003672A

Abstract

본 발명은 초피나무 추출물을 유효성분으로 하는 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 조성물 그리고 초피나무 추출물을 유효성분으로 하는 약제학적 조성물 및 건강 식품 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 초피나무 추출물을 유효성분으로 하고, 다이옥신 유사물질의 XRE (xenobiotic response element) 관련 신호전달 체계에 대한 작용을 방해하여 다이옥신 유사물질의 세포 내 작용을 억제하는 길항성 조성물 그리고 초피나무 추출물의 약제학적 유효량을 포함하며, 다이옥신 유사물질의 독성에 의한 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 및 건강 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 다이옥신 유사물질의 독성을 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라 종래부터 약제로 사용되고 있는 천연물인 초피나무 추출물을 유효성분으로 포함하고, 매우 특이적으로 다이옥신 유사물질에 대하여 길항 작용을 나타내기 때문에 인체에 대한 부작용이 화학적 합성 의약보다 극히 적다.

Description

초피나무 추출물을 유효성분으로 하는 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 조성물{Antagonistic Compositions Against Dioxin-like Compounds Comprising Extract of Zanthoxylum piperitum}

본 발명은 초피나무 추출물을 유효성분으로 하는 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 조성물 그리고 초피나무 추출물을 유효성분으로 하는 약제학적 조성물 및 건강 식품 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 환경성 내분비 교란물질 중 다이옥신 유사물질의 세포 내 작용을 억제하는 조성물 그리고 다이옥신 유사물질에 의한 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물 및 건강 식품 조성물에 관한 것이다.

내분비 교란물질 (Endocrine Disruptor)이란 미국 환경처 (EPA)에 따른 정의에 의하면 항상성의 유지와 발달의 조절을 담당하는 체내의 자연 호르몬의 생산, 방출, 이동, 대사, 결합, 작용 또는 배설을 간섭하는 외인성 물질을 말한다. 내분비 교란물질은 약물, 식물성 내분비 교란물질 및 환경성 내분비 교란물질로 대별할 수 있고, 현재 가장 문제가 되고 있는 것은 소위 환경 호르몬이라고 불리는 환경성 내분비 교란물질이다. 상기 환경성 내분비 교란물질은 현재 100 여종이 알려져 있고, 가장 대표적인 것은 다이옥신, PCB, DDT, 중금속, 플라스틱 가소제 등이다.

상기 환경성 내분비 교란물질은 그 작용 기작에 따라 다음과 같이 대별할 수 있다: (1) 자연 호르몬을 모방하여 자연 호르몬과 같은 세포 반응을 유발하는 것으로서 예컨대 DES(Diethylstilbestrol); (2) 자연 호르몬이 결합할 수용체를 봉쇄하여 자연 호르몬의 작용을 억제하는 것으로서 예컨대 DDT; (3) 내분비계와 무관한 단백질 수용체와 결합하여 비정상적인 일련의 연쇄적 세포반응을 촉발시키는 것으로서 예컨대 다이옥신; 및 (4) 수용체와 결합하지 않고 간접적으로 자연 호르몬의 합성, 저장 등을 증가시키거나 감소시키는 것으로서 예컨대 납과 같은 중금속.

상기한 내분비 교란물질 중 다이옥신은 현재 가장 주목을 받고 있다. "다이옥신"이라는 용어는 일반적으로 대중매체에서 사용되고 있는 용어로서, 2,3,7,8-테트라클로로디벤조-p-다이옥신 (이하, "TCDD"라 한다)에 대한 단축어로서 사용되고 있다. 그러나, TCDD는 폴리염소화 디벤조-p-다이옥신 (이하, "PCDD"라 한다) 패밀리의 일종으로서, PCDD는 염소 원자의 위치 및 수에 따라 75종의 동족체 (congener)를 갖는다. 생물학적으로, TCDD는 가장 강력한 독성을 갖는 PCDD로 알려져 있다.

한편, TCDD와 공통된 생물학적 특성을 갖는 다른 방향족 탄화수소가 공지되어 있으며, 예컨대 폴리염소화 디벤조퓨란 (PCDFs) 패밀리 및 폴리염소화 비페닐 (PCBs) 패밀리가 있다. 이에, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "다이옥신"은 PCDD에 포함되는 모든 화합물을 의미하고, "다이옥신 유사물질"은 상기한 PCDD, PCDFs 및 PCBs를 포함하는 것으로서, PCDD와 동일한 세포적 효과를 나타내는 물질을 의미한다.

다이옥신은 발암성 물질로 생식계 및 발생과정 교란, 면역체계의 손상 및 호르몬 조절작용의 간섭 등의 심각한 질병을 유발하는 것으로 보고 되고 있다 (Yang, J. H. et al., Carcinogenesis. 20: 13-18(1999), Lee, Y. W. et al., Toxicol. Lett., 102-103:29-83(1998)). 미국환경처(EPA)의 보고에 의하면 다이옥신 및 다이옥신 유사물질에 노출시 일어나는 인체내의 악영향에 대한 통계로서, 50년 전과 비교하여 남성의 정자수가 50% 수준으로 감소하고, 고환암 발생 빈도가 3배 정도 증가하며, 전립선암은 2배 이상 증가하는 것으로 보고되었다. 또한, 다이옥신 등에 기인하여 과거와 달리 자궁내막 증식증과 여성의 유방암 발생빈도의 증가 등이 확인되고 있다.

한편, 다이옥신이 인체 내로 유입되는 가장 중요한 경로는 음식물로서, 다이옥신이 지용성인 까닭에 지질성분을 다량 함유하고 있는 고기, 우유 등 상용식품을 섭취할 때 인체 내로 유입된다. 또한, 다이옥신은 소수성이므로 물에 용해되지 않고 어류 등에서 체내 축적이 일어나며 동물에서도 비슷한 양상을 나타내고, 이에 생태계의 먹이사슬에 따라 상층부로 유입되어 생태계 전반에 걸쳐 그 영향이 나타난다.

다이옥신을 포함한 독성물질들의 생체 내 작용 기전에 관한 연구는 동물실험을 비롯한 다양한 조직세포에서의 연구가 진행되고 있다. 특히, 간세포를 중심으로한 인 비보 및 인 비트로에서의 대사성 산화와 관련된 유전자군들의 유도기능, 면역계와 관련된 유전자 및 세포신호 전달계의 중간 물질, 그리고 산화성 스트레스를 유발하는 기전 등 다양한 경로의 접근이 이루어지고 있다.

한편, TCDD를 매개로 하는 세포 내 표적 유전자들의 발현 변화 및 신호전달 체계에 관여하는 중간물질의 생리 활성 변화에 대한 연구결과가 활발하게 보고되고 있다. Jeong 등 (Jeong, H. G., 및 Lee, S. S., Cancer Lett., 138:131-137 (1997))은 쥐의 Hepa-Ic1c7 세포에서 알파-헤데린 (alpha-Hederin)이 TCDD에 의해 유도되는 쥐의 cypla-1의 발현을 억제한다고 보고하였고, 에스트라디올은 아릴 탄화수소 (Aryl hydrocarbon: Ah) 수용체가 다이옥신-반응 요소서열 (dioxin-response element), 즉 XRE (xenobiotic response element)에 결합하는 것을 저해함으로써, TCDD의 생리적 효과를 일정 부분 감소시킨다고 보고하였다 (Jeong, H. G. 및 Lee, S. S., Cancer Lett., 133:177-184(1998)).

Yang 등 (Yang, J. H. et al., Carcinogenesis., 20:13-18(1999))은 TCDD에 의해 형질전환된 세포에서 RT-PCR등의 방법을 이용하여 TGF-β, 플라스미노겐 활성자 억제제-2 그리고 TNF-α등 성장 조절 인자의 변화를 탐색함으로써, 세포 내 중요 성장 조절 유전자의 이상조절 (dysregulation)이 TCDD-유도 세포의 형질전환에 관계되어 있을 것으로 보고하였다. Lee 등 (Lee, Y. W. et al, Toxicol. Lett., (1998))은 2-아미노-3-메틸이미다조[4,5-f]퀴놀린이 단백질 키나아제 C를 하향 조절 (down regulation)함으로써 면역 저해 효과를 나타낸다고 보고하였다.

Park 등 (Park, R. et al., Biochem Biophys Res Commun., 253: 577-581(1998))은 티로신 키나아제 신호 전달 체계에 위치하는 아탑터 복합체의 분자적 상호작용에 TCDD가 미치는 영향을 고찰하였고, Ah 수용체, ARNT, XRE (xenobiotic response element)의 매개에 의한 벤지이미다졸의 cyp1a-1 유전자 발현 유도 효과가 보고되었다 (Backlund, M. et al., Eur. J. Biochem., 261: 66-71(1999)).

최근의 TCDD에 관련된 중요한 연구 흐름 중 하나는 간세포에서 TCDD의 독성효과가 산화성 스트레스 유발 기전과 밀접한 연관성이 있음을 시사하는 보고들로서, Radijendirane 등 (Radijendirane, V. 및 Jaiswal, A. K., Biochem. Pharmarcol. 58:1649-1655(1999))은 TCDD 매개에 의한 CYP1A-1 유전자의 유도가 산화성 스트레스를 증대시키며 항산화 반응부위를 통해 NAD(P)H:퀴논 산화환원효소Ⅰ 유전자를 유도한다고 보고하였고, Shertzer 등 (Shertzer, H. G. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 253:44-48(1998))도 각각 산화성 스트레스에 의한 P4501A1 유전자의 발현 저해와 지속적인 산화성 스트레스 반응의 유발이 TCDD에 의해 기인함을 보고하였다.

이와 같은 다이옥신에 기인한 여러 가지 생체 시스템의 변화는, 다이옥신이 Ah 수용체에 작용하여 XRE에의 결합을 야기하고, 이에 XRE 반응부위를 포함하는 유전자의 발현을 상향 혹은 하향 유도한다는 것이 입증되었다 (Telakowoski-Hopkins, C.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:1000-1004 (1988); Denison, M.S. et al., J. Biol. Chem., 263:17221-17224(1988); Kamath, A. B. et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 142:367-377(1997); McConkey, D. J. et al., Science, 242:256-259(1988); McConkey, D. J. 및 Orrenius, S., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1003-1008(1989)).

PCB도 다이옥신과 유사한 경로로 체내에 유입되며, 신경전달 물질인 도파민, 글루타메이트, GABA 그리고 세로토닌 등의 흡수를 저해하고, 혈액 내의 성호르몬 결합 글로부린에 대하여 친화성을 나타냄으로써 위해성을 보인다고 보고 되었다 (Mariussen E, Fonnum F Toxicology 21:11-21(2001) 및 Jury HH, Zacharewski TR, Hammond GL J Steroid Biochem Mol Biol 15:167-76(2000)). 또한, PCB 동족체들의 구조적 차이에 의해 간에서 CYP1A1 유전자의 유도 효과가 차이를 보이는 사실과 Ah 수용체를 통한 다이옥신의 작용 경로를 이용함이 보고되어 있다 (Van der Burght AS et al., Chemosphere 41:1697-708(2000), van der Burght AS et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 15:13-23(1999), Tilson HA, Kodavanti PR Neurotoxicology 19:517-25(1998)).

한편, 상술한 바와 같이 다이옥신 및 다이옥신 유사물질의 독성에 대한 분자적 수준의 연구는 활발하게 진행되고 있으나, 이의 생체내 작용을 억제할 수 있는 길항성 물질에 대한 연구는 현재까지 미진한 상태이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

따라서, 본 발명의 목적은 다이옥신 유사물질의 세포 내 작용을 억제하는 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 다이옥신 유사물질의 독성에 의한 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 건강 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 초피나무 추출물을 유효성분으로 하고, 다이옥신 유사물질의 XRE 관련 신호전달 체계에 대한 작용을 방해하여 다이옥신 유사물질의 세포 내 작용을 억제하는 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 조성물을 제공한다.

본 발명자는 다이옥신 또는 다이옥신 유사물질의 독성을 치료 또는 예방할 수 있는 물질을 찾아내고자 노력한 결과, 종래부터 한약재로서 사용되고 있는 초피나무 (Zanthoxylum piperitum A.P.D.C)의 추출물이 효과적으로 다이옥신 또는 다이옥신 유사물질의 독성을 제거할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서 유효성분으로 이용되는 초피나무는 운향과에 속하는 것으로서, 바람직하게는 초피나무의 열매를 이용하는 것이다. 초피나무는 베타-펠란드렌 (β-Phellandrene), 크산토실린 (Xanthoxylin), 베르베린크 (Berberinc), 산술 (Sanshool), 디펜텐 (Dipentene), 딕타민 (Dictamine), 테르피놀렌 (Terpinolene) 및 베르갑텐 (Bergapten) 등을 주성분으로서 함유하고 있고, 한의학에서는 소염, 이뇨, 국소 흥분, 위장병 등의 치료약으로 사용되고 있다.

본 발명의 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 조성물은 특히, PCDD, PCDF, PCB에 속하는 다이옥신 유사물질의 세포 내 작용을 억제하는 데 유용하고, 보다 바람직하게는 PCDD 및 PCB에 속하는 다이옥신 유사물질, 가장 바람직하게는 세포 내 독성이 가장 큰 TCDD의 세포 내 작용을 억제하는 데 유용하다.

본 발명의 초피나무 추출물의 다이옥신 유사물질에 대한 길항 작용은, 하기 실시예에서 명확히 설명되듯이, 다이옥신 유사물질의 XRE 관련 신호전달 체계 (signal transduction)에 대한 작용을 억제함으로써 나타난다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 초피나무 추출물의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 다이옥신 유사물질의 독성에 의한 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 다른 특징으로 한다.

초피나무 추출물의 약제학적 유효량을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 다이옥신 유사물질에 의해 유발되는 질병의 치료 또는 예방에 유용하다. 상기 다이옥신 유사물질에 의해 유발되는 질병은 매우 복합적으로 나타나며, 정자수 감소, 고환암, 전립선암, 자궁내막 증식증, 유방암, 간독성, 면역기능 저하, 고지혈증, 요도하열, 잠복고한, 기형아 출산, 혈관 손상, 간세포성 암종, 간의 비대, 선섬유증, 체중 손실, 모발 손실, 구강 부종, 안검 부종 및 위점막성 궤양 (Carter et al., Science 188:738(1975); Fourth Annual Report on Carcinogens, NTP 85-002:170, 185(1985)) 등을 포함한다.

한편, 본 발명의 초피나무 추출물을 포함하는 약제학적 조성물은 상술한 바와 같이, 분자적 수준에서 다이옥신 유사물질에 대한 길항 작용을 나타내므로, 효과적이고 원천적인 치료 또는 예방제로서 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내 주입으로 투여하는 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물을 경구 투여하는 경우, 적합한 투여량은 초피나무 열매의 4배 증류수 추출액을 성인 기준으로 1일 1회 10-400 ㎖씩 투여하는 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 초피나무 추출물을 포함하는 건강 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 초피나무 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다. 내분비 교란물질에 대하여 항시적으로 노출되어 있는 환경을 고려한다면, 본 발명의 식품은 내분비 교란물질에 의한 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하다.

본 발명의 조성물은 다이옥신 유사물질의 독성을 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라, 종래로부터 약제로 사용되고 있는 천연물인 초피나무 추출물을 유효성분으로 포함하고, 매우 특이적으로 다이옥신 유사물질에 대하여 길항 작용을 나타내기 때문에, 인체에 대한 부작용이 화학적 합성 의약보다 극히 적다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 재료

실시예에 사용된 시료 및 시약은 실시예에 다르게 언급된 바가 없으면, 제한효소는 NEB로부터, 각종 시약은 SIGMA사에서 분자생물학 등급의 제품을 사용하였다. 초피나무의 열매는 대한민국 서울시 종로구에 위치에 있는 경동시장에서 그늘에서 건조시킨 상태의 상품을 구입하여 추출물 제조에 사용하였다.

실시예 1: 초피나무의 추출물 제조

건조된 초피나무의 열매 1 g당 4 ㎖의 3차 증류수를 첨가한 후 121℃에서 30분 동안 증류시킨 다음 상온에서 4000 x g로 원심분리하고, 상층액을 얻어 이를 본 발명의 추출물로 사용하였다.

실시예 2: 세포 배양

실시예에서 사용된 모든 세포주는 5% CO₂와 37℃의 조건에서 배양 및 유지하였으며, 페니실린 (100 유니트/㎖, Gibco BRL사)과 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖, Gibco BRL사) 항생제와 10% 우태아 혈청 (Gibco BRL사)이 함유된 둘베코 변성 이글스 배지 (DMEM)를 이용하였다.

본 발명에서 사용된 세포주인 HeLa 세포주 및 HepG2 세포주는 ATCC로부터 구입한 것이다.

실시예 3: TCDD 및 PCB의 세포적 활성 측정

Ⅰ. TRAS-XRE 및 TRAS-mXRE 리포터벡터의 제작

다이옥신 (또는 다이옥신 유사물질)-수용체 복합체가 결합하는 것으로 알려진 XRE의 기본형이 세 번 중복된 염기서열을 포함하는 TRAS-XRE 리포터 벡터를 다음과 같이 제작하였다:

먼저, BGH pA, f1 ori, 네오마이신 내성 유전자, ColE1 및 암피실린 내성 유전자를 얻기 위하여, pcDNA3 (Invitrogen사)를 BglⅡ (Promega사)와 XbaI (Promega사)으로 절단하고, 루시퍼라아제 유전자를 얻기 위하여 pGL3-베이직 벡터 (Promega사)를 BglⅡ (Promega사)와 XbaI (Promega사)으로 절단하여 단편을 얻었다. 절단하여 얻은 두 단편을 T4 DNA 리가아제 (Promega사)로 연결하였다.

별도로, 멀티플 클로닝 자리에 해당하는 DNA 서열 (참조: 서열 1)을 디자인하였고, 제노텍사 (대한민국)에 합성을 의뢰하였다. 이어, 합성된 멀티플 클로닝 자리를 상기 벡터 중간체의 BglⅡ와 HindⅢ위치에 삽입하여 TRAS-프로모터-베이직 벡터를 제작하였다. 이어, 공지된 hCMV의 즉시형 초기 프로모터 (immediate early promoter: Gene bank 접근 번호: k03104)의 인핸서 부위를 제외한 최소 프로모터 (참조: 서열 2) 부분만을 제노텍사에 의뢰하여 제작하였고, 5'쪽에는 BamHI 링커 그리고 3'쪽에는 HindⅢ 링커가 추가되도록 합성하였다. 그런 다음, 상기 TRAS-프로모터-베이직 벡터를 BamHI (Promega사)과 HindⅢ (Promega사)로 절단하고, 상기 제작된 CMV 최소 프로모터를 T4 DNA 리가아제 (Promega사)로 연결하여 TRAS-인핸서-베이직 벡터를 제작하였다.

그리고 나서, XRE의 DNA 서열에 추가적으로 5'에 BamHI 링커 그리고 3'에 BglⅡ 링커가 형성되도록 DNA 서열을 합성하고, 이를 세 번 반복하여 최종적으로 서열 3에 기재된 DNA 서열을 합성하였다 (제노텍사). 이어, 상기 TRAS-인핸서-베이직 벡터를 BamHI (Promega사)로 절단하고, 그 위치에 상기 합성된 서열 3의 DNA 서열을 T4 DNA 리가아제 (Promega사)를 이용하여 연결함으로써 최종적으로 TRAS-XRE 벡터를 제작하였다. TRAS-XRE의 유전자 지도는 첨부 도 1에 나타내었다.

한편, 다이옥신-수용체의 XRE 부위에 대한 특이성을 확인하기 위한 TRAS-mXRE는, 먼저 상기한 XRE를 위치-지정 변이유발(site-directed mutagenesis) 과정으로 변형시켜 mXRE가 세 번 중복된 서열 4의 DNA 염기 서열을 합성하였다 (제노텍사). 그 이후의 TRAS-mXRE의 제작 과정은 TRAS-XRE의 제작과정과 동일하다.

Ⅱ. 동물 세포주의 형질전환

위에서 제조한 TRAS-XRE 리포터벡터를 HepG2 세포에 다음과 같은 방법으로 리포펙틴 (lipofectin) 방법으로 형질전환시켰다: 100 ㎕ 혈청 부재 및 항생제 부재 DMEM에 2 ㎕ 리포펙틴 (Gibco BRL사)을 혼합하고, 30분 동안 상온에서 항온처리한 다음, 100 ㎕ 혈청 부재 및 항생제 부재 DMEM에 상기 리포터벡터 1 ㎍를 혼합하여 둔 것과 혼합하였다. 이어, 15분 동안 상온에서 항온처리하고, 800 ㎕ 혈청 부재 및 항생제 부재 DMEM을 첨가하여 1 ㎖을 만든 후, PBS로 두 번 세척한 HepG2 세포에 뿌려주었다. 그런 다음, 6 시간이 경과한 후, DMEM에 10% 우태아 혈청 및 페니실린 (100 유니트/㎖, Gibco BRL사)과 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖, Gibco BRL사) 항생제가 첨가된 배지로 교체하고, 정해진 시간만큼 37℃에서 항온처리 하였다.

Ⅲ. TRAS-XRE HepG2 및 TRAS-mXRE HepG2의 구축

상기 Ⅱ)에 기재된 방법으로 HepG2 세포주를 형질전환시킨 하루 뒤부터, 세포를 네오마이신 (400 ㎍/㎖, Gibco BRL사)이 함유되어 있는 선택 배지 DMEM에서 성장시켰다. 형질전환시킨 이틀 뒤에 세포들을 1/10 비율로 나누었다 (서브컬쳐). 이어, 세포를 상기한 선택배지에서 20여일 동안 더 성장시킨 다음 각각의 네오마이신-내성 콜로니를 분리하여 성장시켰다.

이렇게 하여 분리된 HepG2 세포를 "TRAS-XRE HepG2" 세포주라 명명하고, 한국세포주 연구재단에 2000년 10월 16일자로 기탁하고, 기탁번호 KCLRF-BP-00034를 부여받았다. 한편, TRAS-mXRE에 의해 형질전환된 HepG2 세포주를 "TRAS-mXRE HepG2"라 명명하였다.

Ⅳ. TCDD 또는 PCB가 TRAS-XRE 리포터벡터의 발현에 미치는 영향

각각의 실험군 및 대조군에 따라 상기 TRAS-XRE HepG2에 TCDD 10 nM, PCB 32종 동족체 각각 3.2 ng/㎖ 최종농도 (PCB 동족체 믹스; Accustandard사, C-SCA-06) 또는 TCDD 5 nM과 PCB 32종 동족체 각각 1.6 ng/㎖ 최종농도의 혼합물을 처리하고, 24시간 동안 37℃에서 항온처리 하였다. 이어, 세포를 수확해서 형질전환 효율을 정규화한 후, 다음과 같이 루시퍼라아제의 활성을 측정하였다: 우선, 디쉬에 있는 배지를 제거한 다음, 1X PBS로 세척하고 용해 완충액 (1% Triton X-100; 25 mM 글리실글리신, pH 7.8; 15 mM MgSO₄; 4 mM EGTA; 및 1 mM DTT) 350 ㎕를 첨가하고, 10분 동안 상온에서 항온처리하였다. 이어, 360 ㎕ 분석 완충액 (25 mM 글리실글리신, pH 7.8; 15 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.8; 15 mM MgSO₄; 4 mM EGTA; 2 mM ATP; 및 1 mM DTT)이 첨가된 튜브에, 상기 디쉬에 있는 용액 100 ㎕를 첨가하고, 200 ㎕ 루시페린을 첨가한 다음, 루미노미터 (Turner Designs Instrument사, TD 2020)에서 형광을 측정하였다. 그 결과는 도 2와 같다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, TRAS-XRE HepG2에 TCDD를 처리한 경우에는 무처리 대조군과 비교하여 약 5배, PCB를 처리한 경우에는 약 1.8배, 그리고 TCDD와 PCB의 혼합물을 처리한 경우에는 약 3.8배 정도의 증가된 루시퍼라아제 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 TCDD 또는 PCB가 Ah 수용체와 결합하여 Ah 수용체를 자극하고, 이에 TCDD-Ah 수용체가 Arnt (Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator)와 결합하게 되며, 결과 복합체가 XRE에 결합하여 활성화된 전사조절 인자의 역할을 함으로써 루시퍼라아제의 발현을 촉발하기 때문이다. 한편, TCDD 보다는 PCB가 덜 루시퍼라아제의 발현을 촉발하는 것으로 보아, TCDD가 가장 강력한 독성물질이며 PCB 역시 독성을 나타낼 수 있음을 알 수 있고, 이는 기존의 보고와 일치되는 바 본 발명에서 이용된 분석 시스템의 정확성을 확인시키는 증거가 된다. 한편, TRAS-mXRE HepG2에 TCDD 또는 PCB를 처리한 경우에는 루시퍼라아제의 활성 증가가 관찰되지 않았다 (본 명세서에 데이터는 기재되지 않음).

결국, 상기한 공지된 문헌에 개시된 바와 같이 TCDD 또는 PCB는 XRE 서열에 특이적으로 작용하는 신호전달 체계를 촉발하고, 이에 따라 세포독성 등, TCDD 또는 PCB에 의한 병적 상태가 초래됨을 확인할 수 있다.

실시예 4: 본 발명의 초피나무 추출물의 다이옥신 또는 PCB에 대한 길항 작용 확인

상기 실시예 3에서 구축된 TRAS-XRE HepG2 세포에 TCDD 10 nM, PCB 32종 동족체 각각 3.2 ng/㎖ 최종농도 (PCB 동족체 믹스; Accustandard사, C-SCA-06) 또는 TCDD 5 nM과 PCB 32종 동족체 각각 1.6 ng/㎖ 최종농도의 혼합물을 24시간 동안 37℃에서 처리한 다음, 상기 실시예 1에서 수득한 초피나무 추출물을 50 ㎕ 첨가하고 24시간 동안 37℃에서 항온처리 하였다. 이어, 처리된 세포를 수확해서 형질전환 효율을 정규화한 다음 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 루시퍼라아제의 활성을 측정하였고, 그 결과는 도 2와 같다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 초피나무 추출물은 TCDD 또는 PCB에 의한 루시퍼라아제 발현 유도 효과를 무처리 대조군의 수준으로 저하시키고 있음을 알 수 있다. 한편, 초피나무 추출물만을 처리한 실험예에서 루시퍼라아제 발현이 전혀 영향을 받지 않는 것으로 보아, 상기 초피나무 추출물의 상쇄 효과는 TCDD 또는 PCB의 작용에 대한 길항 작용에 기한 것임을 확인할 수 있다.

더불어, TCDD 또는 PCB에 의한 세포적 작용이 상기한 문헌에 개시된 바와 같이 XRE에 작용하는 신호전달 체계의 촉발에 기인한 것이고, 본 실시예에서 채용하고 있는 분석 시스템이 단지 XRE에의 결합 여부에 따른 리포터 유전자 (루시퍼라아제 유전자)의 발현 정도를 측정하는 것이므로, 상기한 결과는 초피나무 추출물의 길항 작용이 TCDD 또는 PCB에 의한 XRE-관련 신호전달 체계의 촉발을 억제함으로써 달성된다는 것을 파악할 수 있다.

실시예 5: 본 발명의 초피나무 추출물의 특이적 길항 작용 확인

Ⅰ. 리포터 벡터의 제작

세포의 주기조절 및 사멸과 관련된 중요 유전자인 p53이 암호화하는 단백질이 작용하는 부위를 갖는 TRAS-p53 벡터는 상기 실시예 3의 TRAS-XRE와 동일한 방법으로 제작하되, XRE 서열 대신에 p53이 암호화하는 단백질이 작용하는 부위 (참조: 서열 5)를 합성 (제노텍사)하여 제작하였다.

세포 내 각종 스트레스 및 신호전달 체계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NF-κB가 작용하는 부위를 갖는 TRAS-NF-κB 벡터는 상기 실시예 3의 TRAS-XRE와 동일한 방법으로 제작하되, XRE 서열 대신에 NF-κB가 작용하는 부위 (참조: 서열 6)를 합성 (제노텍사)하여 제작하였다.

또한, 세포 내에서의 내분비 관련 호르몬인 프로게스테론이 작용하는 부위인 PRE를 갖는 TRAS-PRE 벡터는 상기 실시예 3의 TRAS-XRE와 동일한 방법으로 제작하되, XRE 서열 대신에 PRE (참조: 서열 7)를 합성 (제노텍사)하여 제작하였다.

Ⅱ. 초피나무 추출물의 특이성 확인

상기 실시예 3에 기재된 방법과 동일하게 상기 각각의 벡터를 동일한 양 (1 ㎍)으로 HepG2 세포에 도입한 다음, 실험군과 대조군으로 나누고 실험군에 상기 실시예 1의 초피나무 추출물을 각각 50 ㎕ 첨가한 다음, 24시간 동안 37℃에서 항온처리 하였다. 이어, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 루시퍼라아제의 활성을 측정하였고, 그 결과는 도 2와 같다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 초피나무 추출물은 p53 단백질의 결합부위, NF-κB가 작용하는 부위 및 PRE에 대해 유의 수준에서 거의 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 특히, NF-κB는 세포에 전달되는 스트레스를 매개하여 여러 생리적 현상을 유발하는데 중요한 인자로서 갑작스런 활성의 변화는 예기치 않은 영향을 세포에 줄 수 있으므로 초피나무 추출물이 NF-κB의 활성에 영향을 미치지 않는 것은 중요한 의미를 나타낸다. 또한, PRE는 호르몬의 일종인 프로게스테론이 작용하는 부위로서, 상기 실험 결과는 호르몬의 자연스런 역할로 인한 항상성의 체계에 저해작용을 하지 않음을 나타내는 것이고, 이 또한 본 발명의 초피나무 추출물이 우수한 유효 성분으로서 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.

즉, 본 발명의 초피나무 추출물은 XRE를 제외하고는 세포 내 주요 유전자들의 발현 및 활성에 미치는 영향이 거의 없다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 초피나무 추출물은 XRE 서열에 결합하는 다이옥신 유사물질에 대하여 매우 특이적으로 길항 작용을 할 수 있는 유효 성분임을 파악할 수 있다.

실시예 6: 동물 모델을 이용한 본 발명의 초피나무 추출물의 다이옥신에 대한 길항 작용 확인

상기 실시예 4를 통하여 세포 수준에서 다이옥신에 대하여 길항 작용을 한다는 것이 확인된 본 발명의 초피나무 추출물에 대하여, 동물 모델을 이용하여 실제로 생체내에서도 길항 작용을 나타내는지 여부를 다음과 같이 확인하였다.

실험 동물은 5 주령된 웅성의 기니아 피그계 래트 (BioKorea사)를 이용하였다. 초피나무 추출물 처리군은 6 마리로 하였다. 래트에 ㎏ 당 TCDD 1 ㎍을 시험 개시일 또는 시험 개시 후 7 일째에 복강으로 1회 투여하였다. 초피나무 추출물은 시험 개시일로부터 0.03-0.3 g/day/kg의 투여량으로 음수로 28일 동안 투여 하였다. 28일 동안 사육한 다음, 마우스의 체중을 측정하고, 에틸 에테르로 마취시킨 후, 마우스를 도살시키고, 고환을 적출하여 중량을 측정 하였다. 실험 결과는 다음 표 1과 같다:

구 분	실험동물수	체중(g)	절대적 기관 무게 (㎎)		상대적 기관 무게³⁾ (㎎)
구 분	실험동물수	체중(g)	좌측 고환	우측 고환	좌측 고환	우측 고환
무처리군	6	444.79±41.33	800.15±144.65	812.35±143.65	179.89±41.28	182.63±40.09
TCDD 처리군	6	398.88±42.18	645.18±132.78	665.44±122.55	161.74±33.33	166.82±37.74
추출물 처리군	6	466.54±58.80	855.32±143.65	865.77±154.87	183.32±47.75	185.57±49.98
추출물 + TCDD 전-처리군¹⁾	6	477.85±45.67	878.92±143.58	882.66±138.75	183.93±44.12	184.71±41.98
추출물 + TCDD 후-처리군²⁾	6	461.87±39.12	849.54±132.88	850.15±149.87	181.85±33.67	182.15±38.45
¹⁾ TCDD 처리후 7일째부터 추출물 음수 투여군 ²⁾ 시험 개시일로부터 7일째에 TCDD 처리한 군 ³⁾ 실험 래트의 체중(100 g 기준)과 비교한 상대적 무게(환산값)

상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 초피나무 추출물은 TCDD에 의해 초래된 체중 감소 및 고환 중량의 감소를 예방 (참조: TCDD 전-처리군) 및 치료 (참조: TCDD 후-처리군)할 수 있음을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 초피나무 추출물은 세포 수준에서 뿐만 아니라, 개체 수준에서도 다이옥신에 대한 길항 작용을 함을 확인할 수 있다.

제조예: 건강식품 드링크제

상기 실시예 1의 초피나무 추출액 80 ㎖, 액상과당 10 ㎖, 구연산 0.5 ㎖ 및 감초 추출액 9.5 ㎖을 혼합하여 본 발명의 드링크제를 제조하였다.

본 발명은 다이옥신 유사물질의 세포 내 작용을 억제하는 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 다이옥신 유사물질의 독성에 의한 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 건강 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 다이옥신 유사물질의 독성을 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라, 종래부터 약제로 사용되고 있는 천연물인 초피나무 추출물을 유효성분으로 포함하고, 매우 특이적으로 다이옥신 유사물질에 대하여 길항 작용을 나타내기 때문에, 인체에 대한 부작용이 화학적 합성 의약보다 극히 적고, 의약 뿐만 아니라 식품 첨가제로서도 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 이용되는 TRAS-XRE의 유전자 지도; 및

도 2는 본 발명의 초피나무 추출물의 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 작용을 나타내는 그래프.

<110> MedexBio Co. <120> Antagonistic Compositions Against Dioxin-like Compounds Comprising Extract of Zanthoxylum piperitum <130> 02P-0065 <150> KR2001-15466 <151> 2001-03-24 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multiple cloning site <400> 1 gatcttgtga attctgcaga tatccatcac actggcggcc gctcgagcat ggtaccgagc 60 tccggatcca ctagtatcga ta 82 <210> 2 <211> 95 <212> DNA <213> Cytomegalo virus <400> 2 gatccactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 60 aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactg 95 <210> 3 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> triple sequence of XRE <400> 3 gatcggcggg ccacgccccc gtgaaaagga tcggcgggcc acgcccccgt gaaaaggatc 60 ggcgggccac gcccccgtga aaag 84 <210> 4 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> triple sequence of mutated XRE <400> 4 gatcggcggg caaataaccc tattaaagga tcggcgggca aataacccta ttaaaggatc 60 ggcgggcaaa taaccctatt aaag 84 <210> 5 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P53 response sequence <400> 5 ggaagatctg ggagaaaacg ttagggtgga agatctggga gaaaacgtta gggtggaaga 60 tctgggagaa aacgttaggg t 81 <210> 6 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NF-kB response sequence <400> 6 gatccgggga ctttccattt ggatccgggg actttccatt tggatccggg gactttccat 60 ttg 63 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRE <400> 7 gatccgttac aaactgttct a 21

Claims

초피나무 추출물을 유효성분으로 하고, 다이옥신 유사물질의 XRE (Xenobiotic response element) 관련 신호전달 체계에 대한 작용을 방해하여 다이옥신 유사물질의 세포내 작용을 억제하는 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 조성물.
삭제
초피나무 추출물을 유효 성분으로 포함하는 다이옥신 유사물질에 대한 길항성 건강 식품 조성물.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 다이옥신 유사물질은 PCDD (폴리염소화 디벤조-p-다이옥신), PDCF (폴리염소화 디벤조퓨란) 및 PCB (폴리염소화 비페닐)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 다이옥신 유사물질은 PCDD (폴리염소화 디벤조-p-다이옥신) 또는 PCB (폴리염소화 비페닐)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 PCDD (폴리염소화 디벤조-p-다이옥신)는 TCDD (2,3,7,8-테트라클로로디벤조-p-다이옥신)인 것을 특징으로 하는 조성물.