KR100466995B1

KR100466995B1 - 인위적으로오결합시킨하이브리다이제이션

Info

Publication number: KR100466995B1
Application number: KR10-1998-0709917A
Authority: KR
Inventors: 젠 구오; 로이드 엠. 스미스
Original assignee: 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date: 1996-06-06
Filing date: 1997-06-05
Publication date: 2005-04-14
Also published as: KR20000016344A

Abstract

개선된 핵산 하이브리다이제이션 방법은 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 서열 변이를 함유하는 핵산 타겟의 변이체들로부터 대조군 핵산 타겟을 구별하는 능력을 개선시키므로 제공된다. 변형된 프로브(probe)는 서열 변이로부터 만들어지는 오결합 뿐만 아니라 대조군 핵산 타겟에 대한 하나 이상의 인위적 오결합을 함유한다.

본 발명은 예를 들면, PCR(polymerase chain reaction), 특정 대립유전자 핵산 서열화(allele-specific nucleic acid sequencing) 방법 및 진단 하이브리다이제이션(diagnostic hybridization) 방법을 사용하고 있는 용도를 포함하는 수많은 현존하는 하이브리다이제이션 방법보다 직접적이며 유리한 용도를 갖는다.

Description

인위적으로 오결합시킨 하이브리다이제이션 {Artificial Mismatch Hybridization}

본 발명은 분자생물학, 더 구체적으로는 핵산 하이브리다이제이션 분야에 관한 것이다.

핵산 서열에 있어서의 변이를 검출하는 표준 방법은 상보적인 핵산 타겟 가닥에서 하나의 올리고뉴클레오티드 가닥에 의한 특이적인 인식에 의존한다. 프로브와 타겟이 동일하지 않은 경우, 두 가닥들의 서로에 대한 친화도는 감소된다. 친화도가 감소되는 것은 이중쇄(duplex) 융해 온도(T_m)를 측정하여 용이하게 모니터링될 수 있는 이중쇄 열 안정성에 있어서의 저하로 분명히 알 수 있다. 완전하게 결합된 프로브와 제1 타겟 및 완전하게 결합된 동일한 프로브와 하나의 뉴클레오티드에서 제1 타겟과 차이가 있는 제2 타겟 사이의 이중쇄 융해 온도의 차이(△T_m)는 DNA에서 서열 변이를 검출하는데 유용하게 사용되는 것으로 밝혀졌다. 하나의 염기에서 차이가 있는 짧은 올리고머들을 구별하는 방법이 웰레이스, 비.알. 등에 의한 문헌(Nucleic Acids Research 9:879(1981))에 기재되어 있다. 다음으로, 코너, 비이. 제이. 등의 문헌(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:278(1983))에서는 β-글로빈 유전자에서 국부 돌연변이를 조사하기 위하여 웰레이스 방법(Wallace approach)을 사용하였다. 이와 같은 분자 구별에 기초를 둔 열역학은 이쿠타, 에스 등에 의한 문헌(Nucleic Acids Research 15:797(1987)), 독틱스, 엠. 제이. 등에 의한 문헌(Journal Biological Chemistry 270:8439(1995)), 브레스라우어, 케이. 제이. 등에 의한 문헌(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83:3746(1986)), 맥그로, 알. 에니. 등에 의한 문헌(BioTechniques 8:674-678(1990))등에 의해 더 특징 되어 진다. 그 결과, 이중쇄의 열 안정성은 서열의 오결합을 바탕으로 합리적으로 정확하게 예측할 수 있다. 본문에서 언급한 논문들은 본 발명에 특히 인용 문헌으로서 기재되었다.

비록, 하이브리다이제이션이 유용하고 유력한 기술이 될 수 있지만, 완전히 결합된 이중쇄와 단지 하나의 염기에서만 오결합된 이중쇄 사이의 안정성 차이는 두 이중쇄 사이의 T_m의 차이가 0.5도 정도밖에 나지 않는 정도로 너무 작다는 점에 한계가 있다. 티반옌다, 엔. 등의 문헌(Eur. J. Biochem. 139:19(1984)) 및 에벨, 에스. 등의 문헌(Biochem. 31:12083(1992))을 참고하며 이들 두 문헌은 본 발명에 인용 문헌으로 기재하였다. 더 중요한 것은, 올리고머성 프로브의 길이가 길어질수록 전체 이중쇄 안정성에 대한 염기 하나의 오결합에 의한 영향은 감소함을 알았다. 관련성이 적은 유전자는 제외시키더라도 단일 유전자에 대한 하이브리다이제이션 특이성을 증진시키기 위하여 프로브의 길이를 증가시키는 것이 바람직하기 때문에 이것은 중요한 제한이다. 따라서, 관련성이 깊은 유전자를 특이적으로 검출하는 능력은 게놈의 점점 더 좁은 구역에 관한 하이브리다이제이션 연구에 촛점을 두고 있는 요구를 따라가지 못하고 있다. 요구되는 것은 프로브와 타겟 사이에서 만들어진 이중쇄의 융해 온도의 차이를 크게 하여 관련성이 깊은 유전자를 구별하는 능력을 개선시키는 방법이다.

보편적인 뉴클레오시드 유사체인, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤은 DNA 이중쇄를 입체적으로 와해시키지 않으면서 수소결합 상호 작용은 최소화하는 반면 스테킹(stacking) 상호 작용은 최대화한다. 이러한 유사체는 니콜스 등에 의한 문헌("A universal nucleoside for use at ambiguous sites in DNA primers", Nature 369:492(1994)) 및 버그스트롬, 디. 이. 등에 의한 문헌("Synthesis, Structure, and Deoxyribonucleic Acid Sequencing with a Universal Nucleoside: 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤”, J.A.C.S. 117:1201(1995))에 기재되어 있으며 이들 두 문헌은 본 발명에 인용 문헌으로 기재되어 있다. 유사체는 핵산 이중쇄에서 염기 결합에 있어서 예측할 수 없는 요인(wild card)으로 작용할 수 있다.

<발명의 요약>

본 발명은 제1 핵산 타겟(대조군)과 차이가 있는 제2 핵산 타겟(변이체)으로부터 제1 핵산 타겟을 구별하는 능력을 향상시킨, 올리고뉴클레오티드 프로브를 핵산 타겟에 하이브리드화시키기 위한 개선된 방법에 관한 것으로 요약된다.

따라서, 본 발명은 어느 정도는, 대조군 핵산 타겟과 완전히 상보적이지는 않지만 거의 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 하이브리다이제이션 방법에 관한 것이다. 프로브가 변형되리라고 알려진 곳 이외에도 한 부분 이상에서 변형되어 있어서 프로브는 대조군 타겟에 완전히 상보적이지는 않다. 변형으로 인해 프로브와 타겟사이에 비상보적인 오결합이 만들어진다.

프로브가 하나의 위치에서 인위적인 변형을 받은 경우, 프로브와 대조군 타겟은 서로 적어도 하나의 위치에서 차이가 있을 것이다. 이에 반해, 인위적으로 변형된 상기 프로브와 서열 변이를 함유하는 타겟사이에는 적어도 둘의 위치(하나는 인위적으로 오결합시킨 곳이고 하나는 진정으로 오결합된 곳)에서 차이가 있을 것이다. 여기에서는 하나의 오결합을 함유하는 이중쇄와 오결합을 하나도 함유하지 않은 이중쇄 사이(도1, 패널 A)에서 관찰된 것보다 두 개의 오결합을 함유하는 이중쇄와 한 개의 오결합을 함유하는 이중쇄 사이(도1, 패널 B)에서 더 큰 이중쇄 열안정성 차이가 관찰되었다고 기재하고 있다. 따라서, 본 방법은 하이브리다이제이션 반응 후에 대조군 타겟으로부터 변이체 타겟을 구별할 수 있는 개선된 능력을 제공한다. 본 발명은 또한, 샘플 내의 핵산 타겟이 관심을 갖고 있는 서열 변이를 함유하고 있는 지를 결정하는 방법이다.

본 발명에서, 변형된 올리고뉴클레오티드 프로브는 적당한 하이브리다이제이션 조건 하에서 대조군 타겟으로부터 변형될 수 있는 핵산 타겟으로 하이브리드화된다. 프로브가 변이체 타겟으로 만들어진 이중쇄는 인위적으로 오결합시킨 염기쌍 뿐 아니라 진정으로 오결합된 염기쌍을 함유하므로 대조군 타겟으로 만들어진 이중쇄에 비해 열적 안정성이 낮아서 낮은 융해 온도를 갖는다.

두 이중쇄 사이의 융해 온도의 차이는 완전히 결합된 헬릭스와 단지 다형성( polymorphic) 위치에서만 오결합된 헬릭스사이의 이전의 비교에서보다 상당히 크기 때문에 변이체 타겟으로부터 대조군(또는 정상군) 타겟을 구별하기가 용이하다. 본 발명의 방법은 다른 곳에서 상세하게 기재된 바와 같이, 개선된 특이성과 선택성이라는 이점을 가지면서 현재의 분자생물학 분야에서 직접적으로 활용될 수 있다.

본 발명의 목적은 서열 변이를 함유하는 핵산 타겟과 함유하지 않은 핵산 타겟을 구별하는 능력을 개선시키는 것이다.

본 발명의 특징은 올리고뉴클레오티드 하이브리다이제이션 프로브와 대조군 타겟이 서열 변이 위치를 제외하고도 적어도 하나의 뉴클레오티드 위치에서 서로 상보적이지 않다는 것이다.

본 발명의 다른 특징은 프로브의 추가적인 비 상보성이 프로브를 함유하는 이중쇄의 안정성과 융해 온도를 저하시킨다는 것이다.

본원 발명의 이점은 비변형 프로브와 대조군 타겟 및 비변형 프로브와 변이체 타겟으로 제조된 이중쇄들을 사용하는 종래 방법에서 관찰된 것보다 변형 프로브와 대조군 타겟 및 변형 프로브와 변이체 타겟으로 제조된 이중쇄들 사이에서 더 큰 융해 온도 차이가 관찰된다는 것이다.

본 발명의 또 다른 이점은 본 방법은 분자 생물학적 공정에서 큰 선택성과 특이성을 제공한다는 것이다.

본 발명의 다른 목적, 이점 및 특징은 다음의 도면을 참고하여 아래의 상세한 설명에 의해 명백하게 될 것이다.

도1의 A 내지 C는 하나의 뉴클레오티드 다형성(polymorphism) 감지를 위하여 종래의 방법을 갖는 인위적으로 오결합시킨 하이브리다이제이션 방법의 두 실시예를 비교 설명하였다.

도2는 타겟 서열과 오결합된 염기수가 0, 1, 2 또는 3인 프로브를 함유하는 이중쇄들의 융해 온도를 비교하였다.

도3은 타겟 서열과 길이를 따라 여러 위치에서 인위적으로 오결합시킨 염기쌍을 하나 가지는 프로브를 함유하는 이중쇄의 융해 온도를 비교하였다. 또한, 동일한 타겟 서열과 완전히 결합된 프로브를 함유하는 이중쇄의 융해 온도도 나타낸다.

도4의 A 내지 C는 타겟상에 진정으로 오결합된 것과 프로브상에 인위적으로 오결합시킨 것 사이의 간격의 효과를 비교하였다. 도4의 A 내지 C는 또한, 진정으로 오결합된 것에 대응되는 프로브에서의 위치를 변화시키는 경우 융해 온도 차이(△Tm)의 효과를 나타낸다.

도5는 하나 이상의 이러한 오결합된 것을 함유하고 있는 프로브상에서 인위적으로 오결합시킨 것들 사이의 간격을 변화시키는 경우 융해 온도 차이(△Tm)에 대한 효과를 나타낸다.

도6은 인간 HLA-DRF 로커스(locus)의 관련성이 큰 대립 유전자들을 구별하는 방법으로 종래의 하이브리다이제이션 방법과 본 발명의 인위적으로 오결합시킨 하이브리다이제이션 방법을 비교하였다.

본 특허 출원의 목적을 위해서 "핵산 타겟"은 염색체 또는 염색체의 일부분이거나 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 다른 핵산 단편과 같은 재조합 핵산 분자일 수 있고 자연적으로 생성되거나 합성될 수 도 있다. 본 발명의 다른 곳에서 기재하고 있는 것처럼, 만약 타겟이 변형된 프로브에 상보적이기에 충분할 정도로 길다면, 타겟의 길이는 중요하지 않다. 핵산 타겟은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 타겟이 DNA인 경우, DNA는 본 발명에 사용되기 위하여, 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드화될 수 있는 변성된 또는 단일 가닥 형태로 제공되는 것으로 이해된다.

또한, 본 출원에서는 "서열 변이" 또는 "변이체"는 대조군 또는 정상 핵산 타겟과 비교하여 타겟 서열에 있어서 부분적 변화를 포함할 수 있다. 그 차이는 하나의 뉴클레오티드 다형성(polymorphism)처럼 구별하기 어려울 수도 있으나 핵산 첨가, 결실, 및 재배열을 포함하는 대조군과 비교하여 더 분명한 변화 뿐만 아니라, 둘 또는 그 이상의 인접한 또는 인접하지 않은 하나의 뉴클레오티드 변화를 포함할 수 있다. 이와 같은 첨가 및 결실될 수 있는 수는 한 개의 뉴클레오티드처럼 작을 수 도 있고, 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머가 적절하게 만들어졌다면 첨가 또는 결실되는 갯수의 상한은 예상할 수 없다.

타겟은 "변이체" 타겟의 다른 서열에 대해서만 "대조군" 타겟이 될 수 있는 것으로 예상된다. 실용적인 목적으로, 특별한 방법에 있어서 임상적 또는 실험적으로 중요성을 갖는 단일 가닥 타겟을 분석을 위해 찾는다면 타겟은 특히, 염, 온도, 및 pH 조건을 포함하는 선택된 하이브리다이제이션 조건 하에서 올리고뉴클레오티드에 더 안정하게 염기쌍 결합된 상태를 유지하여야 한다. 하이브리다이제이션 조건은 낮은 열적 안정성을 갖는 변이체 이중쇄를 대조군 이중쇄에 비하여 불안정하게 만드는 조건이 되어야 한다. 이는 변이체 이중쇄가 두 가닥사이에 인위적으로 오결합시킨 염기쌍 뿐 아니라 진정으로 오결합된 염기쌍도 함유하고 있기 때문이다.

따라서, 만약 특정한 핵산 타겟 서열을 검출하거나 PCR 또는 서열화와 같은 연속적인 방법에 있어서 올리고뉴클레오티드에 대응되는 특정 서열을 사용하기를 원하는 경우, 그 서열을 함유하는 타겟을 "대조군 타겟"으로 명명하여야 한다. 본 출원의 목적을 위하여, 선택된 하이브리다이제이션 조건 하에서 선택된 프라이머 또는 프로브와 더 안정하게 하이브리드화된 핵산 타겟으로 대조군을 정하여야 한다.

또한, 본 특허 출원에서, "대응되는" 뉴클레오티드는 정상적으로 서로 염기쌍을 이루는 상대 가닥 상의 뉴클레오티드이다. "오결합"은 직접적인 왓슨-크릭 염기쌍 대응(A/T, G/C, C/G, T/A)이 두 가닥 사이의 상보적 구역에서 올리고뉴클레오티드와 타겟 사이에 존재하지 않는 어느 위치에서나 발견된다. 인위적으로 오결합시킨 염기쌍은 올리고뉴클레오티드에서 하나 이상의 단일(single) 뉴클레오티드 위치들에 일반적으로 제공되지만 더 많은 변화를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 변이체 타겟 사이에서 만들어진 이중쇄에서의 진정한 오결합은 타겟에 대한 올리고뉴클레오티드 핵산의 치환, 첨가, 결실 및 재배열을 포함한다. 치환은 올리고뉴클레오티드에서 하나 이상의 위치에서 일어날 수 있다. 도1의 패널 A 내지 C에서, 도식적으로 나타낸 이중쇄의 상부 가닥은 본 발명의 목적을 따라 인위적인 오결합을 형성할 수 있거나 형성할 수 없는 올리고뉴클레오티드 프로브를 나타낸다. 하부 가닥은 정상적(왼쪽)이거나 하나의 뉴클레오티드 위치에서 변이된 변이체(오른쪽)인 타겟 서열을 나타낸다. 각 패널에서, 뾰족하게 표시된 오결합은 진정한 오결합을 나타내고 둥글게 표시한 오결합은 인위적인 오결합을 나타낸다.

패널 A는 완전히 결합된 이중쇄와 하나의 진정한 오결합을 함유하는 이중쇄의 열적 안정성을 비교하는 종래의 대립유전자 특이적(allele-specific) 올리고뉴클레오티드 하이브리다이제이션을 나타낸다. 패널 B는 하나의 염기에서 오결합된 이중쇄와 두 개의 염기에서 오결합된 이중쇄사이에서의 이중쇄의 열적 안정성에 있어서의 차이를 결정하기 위하여 올리고뉴클레오티드 프로브가 의도적으로 도입된 하나의 인위적인 오결합을 함유하는, 본 발명의 인위적으로 오결합시킨 하이브리다이제이션 방법을 나타낸다. 패널 C는 하나 이상의 인위적 오결합을 프로브에 도입시킨 인위적으로 오결합시킨 하이브리다이제이션 방법의 두 번째 실시예를 나타낸다. 만약, 프로브가 인위적인 오결합을 형성시킬 수 있는 두 위치를 함유한다면, 이중쇄의 열적 안정성의 차이는 두 개의 염기가 오결합된 것과 세 개의 염기가 오결합된 것 사이에서 결정된다.

하이브리다이제이션은 프로브를 타겟에 결합시키기 위한 당업계에 공지된 표준 조건 하에서 수행될 수 있다. 실시예에서 사용된 조건은 적당하였으나, 염, 온도, 및 pH에서의 변화는 형성되는 이중쇄의 하이브리다이제이션의 강도 및 열적 안정성에 영향을 미칠 수 있다고 이해된다. 당업자는 종래의 용도에 따라 요구되는 특정한 프로브와 타겟 및 특정한 용도를 위하여 본 발명을 최적화하기 위하여 하이브리다이제이션 조건들을 변경할 수 있다. 프라이머 또는 프로브 서열 및 하이브리다이제이션 조건들은 당업계에서 인식되고 있는 여러 하이브리다이제이션 기술에서 이중쇄의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 요인들의 이해에 따라서 결정되어야 한다.

발명자들은 완전히 결합된 이중쇄(도1의 패널A)로부터 하나의 오결합을 함유하는 이중쇄를 구별하는 것보다 n은 2이상이며 7이상까지도 될 수 있는, n-1개의 오결합을 함유하는 이중쇄로부터 n개의 오결합을 함유하는 이중쇄(도1의 패널B 및 C)를 구별하는 것이 더 쉽다는 것을 단정하였다. 본 발명의 방법에서, 이들 이중쇄들 사이의 △T_m은 일반적으로 1℃ 내지 25℃이며 이보다 클 수도 작을 수도 있다. 더 좋은 구별을 위하여, 차이는 바람직하게는 5℃ 내지 25℃이며, 더 바람직하게는 10℃ 내지 25℃이고 가장 바람직하게는 15℃ 내지 25℃이다.

이러한 원리의 예비적 설명을 위하여 0, 1, 2, 또는 3개의 인접한 오결합을 함유하는 20-머(mer)인 이중쇄의 T_m들을 표준 방법을 사용하여 결정하였다. 프로브와 타겟 서열은 도2의 도면 아래에 나타내었다.

도2 내지 5에서 나타내고 있는 모든 실험은 HP89090A Peltier block을 장착한 Hewlett Packard 8452A UV 스펙트로미터를 사용하여 260 나노미터에서 흡광도를 측정하였다. 분당 1℃의 온도 상승률을 적용하였다. 모든 측정은 1.0M NaCl, 0.1mM EDTA, 10mM 인산 나트륨, pH 7.0, 가닥 농도 50μM에서 수행되었다. 모든 융해 온도는 세 번씩 그리고 0.4 미만의 정도로 변화시키면서 결정하였다. 온도에 대한 흡광도를 보이는 융해곡선을 도표화하였고 각 이중쇄의 평균 T_m을 결정하였다.

도2의 데이터는 도표 아래에 나타낸 진정으로 오결합된 염기들을 사용하여 얻었다. 도2는 하나가 오결합된 것에 대한 표준의 완전히 결합된 것사이의 차이(△T_m=65℃-61℃=4℃)보다 두 개가 오결합된 것에 대한 하나가 오결합된 것사이(△T_m=60℃-47℃=13℃)의 융해 온도 차이(△T_m)가 더 크다는 것을 보여준다. 자연적으로 오결합된 염기들 중에는 어느 정도의 잔류 상호작용이 존재할 수 있다고 평가하고 있다(번트게스, 에이취. 등의 문헌(Nucleic Acids Research 14:3773(1986)) 참조). 상호작용의 정도는 오결합된 염기들의 개별적인 조합에 따라 변할 수 있다. 또한, 이중쇄의 열적 안정성은 오결합의 서열 내용 및 프로브의 길이 뿐만 아니라 프로브 내의 오결합의 성질과 위치를 포함하는 다른 변수들에 의하여 영향을 받을 수 있다.

오결합 자체의 성질에 의하여 야기되는 영향을 제거하기 위해서는 타겟과 함께 인위적인 오결합을 형성시킬 뉴클레오티드는 프로브에서 비 자연적인 뉴클레오티드 잔기일 것이 바람직하다. 단순화를 위하여 대조는 오결합은 변형된 프로브가 타겟과 쌍을 이룰 때만 실질적으로 발생한다는 이해를 바탕으로 프로브 내에 인위적인 또는 진정한 오결합에 대하여 만들어졌다.

바람직한 안정성 효과가 인위적인 오결합의 도입으로 거의 인식되지 않도록 하기 위하여 인위적인 오결합은 자연적으로 발생되는 4개의 뉴클레오티드 A, C, G, 및 T에 약하게 결합되는 것이 바람직하다. 따라서, 적당한 자연적 또는 비 자연적인 인위적 오결합은 바람직하게는 보편적인(universal) 오결합이다. 이와 같은 보편적인 오결합은 자연적으로 발생되는 변형된 뉴클레오티드 또는 비 자연적인 뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브내로 혼입될 경우, 적당한 인위적인 오결합은 바람직하게는 T_m이 25℃ 내지 80℃인 상당히 안정한 이중쇄를 형성하여야 한다. 비 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드인, "3-니트로피롤-2′-디옥시리보뉴클레오티드" 또는 "3-니트로피롤"로도 불려지는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤은 상기한 니콜스 등에 의한 문헌에 의하여 DNA 프라이머에서 양면성 부위에 사용하기에 적당한 보편적인 뉴클레오티드로 확인되었다. 이 뉴클레오티드는 이중쇄 형성을 와해시키지 않으면서 스태킹 상호작용을 최대화하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 이유로 상기 분자는 인위적으로 오결합시킨 하이브리다이제이션 프로브에서 사용될 수 있는 바람직한 보편적인 오결합된 뉴클레오티드가 될 수 있다. 그러나, 짧은 길이를 갖는 프로브의 경우, 3-니트로피롤에 의한 인위적 오결합을 함유하는 이중쇄는 너무 불안정해서 정상의 실온 하이브리다이제이션 조건 하에서는 형성될 수 없을지도 모른다. 이와 같은 치명적인 불안정화는 올리고뉴클레오티드의 길이를 증대시킴으로써 극복될 수 있으며, 이로 인해, 더 큰 특이성을 갖는 프로브와 프라이머를 반드시 생산할 수 있다. 따라서, 본 방법에 있어서 장애가 될 수 있는 불안정화는 사용자들에게 큰 이점으로 실질적으로 작용할 수 있다. 적당한 길이의 프로브를 제조하여 높은 특이성에 대한 요구와 종래의 하이브리다이제이션 온도에서 반응을 수행할 수 있어야 한다는 요구 사이의 균형을 유지할 수 있다. 따라서, 개선된 구별법은 인위적인 오결합의 도입이 초기에 이중쇄 형성을 불가능하게 하는 것으로 보이는 경우일지라도 달성될 수 있다.

본 발명에서 개시된 내용에 따르면, 당업자는 주어진 용도에 적합하고 본 발명의 이점을 갖는 적당한 프로브 또는 프라이머를 계획하기에 충분한 정보를 소유하게 될 것이다. 게다가, 시중의 컴퓨터 프로그램은 올리고뉴클레오티드와 같은 것을 사용하는 반응을 위한 적당한 하이브리다이제이션 조건 뿐만 아니라 적당한 올리고뉴클레오티드 서열을 결정하는 것을 도울 수 있다. 당업계에서는 한정된 조건 하에서 하이브리다이제이션 반응에서 프로브와 타겟의 행동을 완전히 예상하는 것은 불가능하다고 인식하고 있기 때문에, 제시된 올리고뉴클레오티드 및 조건에서의 경험적인 실험은 당업자들에게는 프로브 또는 프라이머 계획의 일면으로 알려져 있으며 따라서, 이러한 실험은 부적당한 실험으로 간주되지는 않는다. 비록, 여기에서 기재하고 있는 것처럼, 구별법을 개선하기 위하여 하이브리다이제이션 조건들을 조절하는 것이 바람직하지만 인위적인 오결합의 혼입은 프로브 또는 프라이머의 필요조건에 달리 영향을 끼치지는 않는다.

다른 니트로- 및 시아노- 치환 피롤 디옥시리보뉴클레오티드들은 염기 쌍 결합의 특이성에 있어서 수소 결합의 역할을 경감시킬 수 있는 유사한 강한 스태킹 특성을 갖는다. 어떤 경우, 더 큰 이중쇄 안정성을 제공할 수 있는, 여기에 인용 문헌으로 기재하고 있는 로아케스, 디. 및 디. 엠. 브라운에 의한 문헌(Nucleic Acids Research 22:4039(1994))에 기재되어 있는, 5-니트로인돌 유도체와 같은 다른 보편적인 염기 유사체를 찾는 것이 바람직하다. 또한, 다른 니트로- 또는 시아노- 치환 인돌은 적당한 인위적인 오결합 뉴클레오티드가 될 수도 있다. 또한, 염기성 뉴클레오티드 잔기가 적당할 수 있다. 다른 언급이 없으면 본 출원에 기재된 모든 서열들은 3-니트로피롤을 사용한다.

이하에서는 인위적인 오결합 하이브리다이제이션 방법에서 이중쇄 안정성에 대한 다른 변이체들의 효과에 대한 안내가 제공된다. 또한, 인용 문헌으로 기재된 상기한 니콜스 등 및 버그스트롬 등에 위한 문헌에서 보편적인 유사체가 적당한 프로브로 혼입될 수 있을 상당한 정도에 대하여 추가적인 안내가 제공된다.

<오결합 위치의 효과>

도3은 프로브내의 3-니트로피롤에 의한 하나의 오결합 위치에 따라 이중쇄의 열적 안정성이 변한다는 것을 보인다. 타겟 서열(5′-AGATACTTCTATAACCAA

GAG-3′)과 전체 15개의 염기 길이에 따라 완전히 상보적인 프로브 사이의 안정한 이중쇄의 T_m은 적용된 조건들에서 약 52℃이다. 인위적인 오결합이 올리고뉴클레오티드 프로브의 중앙에 또는 그 근처에 있으면, 프로브/타겟 이중쇄는 예를 들면, 오결합이 프로브의 다섯째 및 아홉째 위치 사이에 있으면 완전히 결합된 것에 비하여 T_m은 15℃ 내지 17℃ 정도 감소하는 것과 같이, 최대로 불안정화 된다. 인위적인 오결합이 양쪽 중 어느 말단에 근접한 경우, 이중쇄는 예를 들면, 오결합이 프로브의 말단 뉴클레오티드에 있는 경우, 완전히 결합된 것에 비하여 T_m은 6℃ 내지 7℃ 정도 감소하는 것과 같이, 조금 불안정화 된다.

<진정한 오결합과 인위적인 오결합 사이 간격의 효과>

도4의 A 내지 C에서, 3-니트로피롤 뉴클레오티드는 진정으로 오결합된 부위에서 1 내지 6 염기가 떨어진 프로브의 위치내로 체계적으로 도입되었다. 진정한 오결합 위치는 15-머 올리고뉴클레오티드 프로브의 8, 6, 또는 4번 위치에 대응되는 부위(각각, 도4의 A, B, C 참조)에서 변한다. 대조군 타겟, 변이체 타겟 및 각 경우에 대한 6개의 프로브 변이체들은 각 도표 아래에 나타내었다. 비교를 위하여, 도4의 A 내지 C는 인위적인 오결합을 포함하는 이중쇄들 사이의 △T_m보다 1 및 0개의 오결합(도1의 패널 A참조)을 함유하는 이중쇄들 사이의 △T_m이 일반적으로 작다는 것을 나타낸다.

하나의 인위적 오결합이 진정한 오결합에서 세 개 또는 네 개의 염기가 떨어진 위치에 도입되는 경우, 진정한 오결합이 15-머 프로브의 8, 6, 또는 4번의 위치에 자리하느냐와는 상관없이 가장 큰 △T_m이 관찰되었다.

도4의 A 내지 C는 이중쇄 열적 안정성면에서 표준 하이브리다이제이션 방법에서 관찰된 것보다 더 큰 차이를 보이기 때문에, 표준 하이브리다이제이션 방법보다 인위적 오결합 하이브리다이제이션 방법이 하나의 뉴클레오티드 다형성의 우수한 구별법을 제공한다는 것을 직접적으로 설명한다. 게다가, 이러한 일련의 결과는 하이브리다이제이션 안정성에 대한 인위적 오결합의 효과는 진정한 오결합 및 인위적인 오결합의 상대적인 위치에, 즉, 세 개 내지 네 개의 염기가 이 두 개의 오결합을 분리한 경우 최대의 불안정화를 일관되게 보이는 것처럼, 강하게 의존한다는 것을 나타낸다. 약 50% 구별력을 갖는 각 경우에 대응되는, 이와 같은 최적의 간격에서는 △T_m들은 3℃ 내지 8℃ 증가한다.

도4의 A 내지 C는 함께 진정한 오결합이 프로브의 하나의 말단에 근접한 경우, 융해 온도 차이의 최대치는 약 15℃ 또는 16℃에서 10℃미만으로 감소하여 본 방법에 의해 제공되는 개선성을 어느 정도 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 도2에 나타난 바와 일치하는 것이고 진정한 오결합이 프로브의 중앙이나 중앙 근처에 대응되는 프로브를 사용하는 것이 바람직하다는 것을 제시하고 있다. 그러나, 각각의 경우 개선은 종래의 방법에 비하여 여전히 관찰되었다.

유사한 실험을 자연적 비변형된 염기가 오결합된 것을 사용하여 실시하였으나, 복잡한 결과를 얻었다. 몇몇의 경우에서는 제2 오결합을 첨가하는 것이 이중쇄를 치명적으로 불안정하게 만들고 두 개의 염기가 오결합된 것과 하나의 염기가 오결합된 것(도1의 패널 B) 사이의 △T_m가 하나의 염기가 오결합된 것과 완전히 결합된 이중쇄(도1의 패널 A) 사이의 △T_m보다 더 크다. 그러나, 다른 몇몇 경우에는 제2 오결합을 첨가하는 것이 이중쇄를 단지 조금만 불안정화시키고 실질적으로는 T_m에서 거의 차이가 없었다. 자연적 염기가 오결합된 것의 고유한 양면성에 비하여, 프로브내에 비 자연적으로 발생되는 염기의 사용은 하나의 염기 변화를 구별할 수 있는 능력을 일관되게 개선시킨다.

<하나 이상의 인위적 오결합을 위치시키고 제공하는 것의 효과>

프로브가 하나 이상의 인위적 오결합을 함유하는 경우, 구별력의 개선은 종래 방법에 비하여 항상 관찰되었다. 비록, 오결합이 나선 한 바퀴에 의하여 분리되어 서로 가장 가깝게 될 수 있도록 오결합을 분리하는 것이 명백히 바람직하다는 것이 관찰되었지만, 개선은 오결합이 어느 부위에 도입되었는지에는 상관없이 관찰되었다. 인위적인 오결합 위치들 사이에서 10개의 염기가 분리되는 것이 바람직하다. 이러한 공간상의 간격에서 관찰되는 열안정성에 있어서의 상당한 감소는 오결합된 기들 사이의 물리적 또는 화학적 상호작용이 있음을 제시한다.

예를 들면, 도5는 21-머 올리고뉴클레오티드의 거의 중앙에 대칭적으로 위치하는 두 개의 3-니트로피롤 뉴클레오티드가 10개의 염기에 의해 분리되어 있을 때 T_m이 가장 낮은 지점(약 44℃)까지 갑자기 떨어진다는 것을 나타낸다. 더 많이 분리되는 경우에는 분리되는 정도가 증가할수록 T_m은 서서히 증가한다. 약 56℃ 내지 약 44℃의 범위인 도5에서 나타내고 있는 타겟과 인위적 오결합의 여러 쌍들을 함유하는 프로브 사이에서 형성된 이중쇄의 T_m은 오결합된 잔기들 사이의 간격에 의존한다. 오결합이 프로브의 하나의 말단에 가까우면 하나의 오결합의 경우에 대한 상기 도3 및 도4의 A 내지 C에서 본 바와 같이, 어느 정도는 작지만 그래도 여전히 중요한 효과가 관찰될 것이다. 비교를 목적으로, 도5는 21개 염기 길이의 타겟과 타겟에 완전히 결합된 프로브로 형성된 이중쇄에 대하여 T_m이 약 68℃임을 나타낸다.

표1은 프로브들이 두 개의 3-니트로피롤 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 종래의 하이브리다이제이션과 인위적 오결합된 하이브리다이제이션에서 관찰된 융해 온도의 차이를 보고하고 있다. "Z"는 표시된 위치에 3-니트로피롤을 나타낸다. 각각의 타겟에서 다형성 염기는 밑줄을 하였다.

3-니트로피롤 사이의 간격		△T_m(℃)
	프로브 서열	타겟 A^*	타겟 B^*
N/A	5' CTCTTGAGAGAGCTAGTATCT 3'	2.0	2.2
8	5' CTCTTGZGAGAGCTZGTATCT 3'	3.3	3.8
10	5' CTCTTZAGAGAGCTAZTATCT 3'	6.4	7.4
12	5' CTCTZGAGAGAGCTAGZATCT 3'	3.1	3.9

^*타겟 A : AGATACTAGCGCTCTCAAGAG

^*타겟 B : AGATACTAGCTCGCTCAAGAG

완전하게 결합된 타겟 : AGATACTAGCTCTCTCAAGAG

표1의 첫째 줄에서 나타낸 것은, 프로브가 인위적인 오결합을 갖지 않는 두 경우에 있어서 완전하게 결합된 이중쇄와 하나의 염기가 오결합된 이중쇄를 비교하는 △T_m들이다. 완전하게 결합된 이중쇄에서 타겟은 프로브에 전적으로 상보적이었다. 하나의 염기가 오결합된 이중쇄에서 타겟은 다형성 타겟 A 이거나 B이었다.

표1의 다음 줄들은 도1의 C에서 도식화한 것처럼, 다형성 타겟 A와 B 모두를 다시 사용하고 있는 두 개의 염기가 오결합된 것에 대한 세 개의 염기가 오결합된 것에 대한 △T_m들을 나타낸다. 여러 가지의 프로브를 표1에 나타내었다. 인위적인 오결합이 8 또는 12개의 염기에 의하여 분리된 경우, 하나의 인위적 오결합이 있는 경우에 얻은 것과 유사한 결과인 △T_m은 약 50% 정도 증가한다. 흥미로운 것은, 인위적으로 오결합된 것 사이의 간격이, 상기한 나선 한 바퀴에 해당되는 10개의 염기인 경우, △T_m은 종래의 하나의 염기가 오결합된 경우 얻어진 것보다 약 3배 정도로 상당히 증가하였다. 10개의 뉴클레오티드의 간격에서 이중쇄들을 구별하는 능력의 급속한 증가는 도5에서 나타낸 바와 같이, 10개의 뉴클레오티드의 간격에서 관찰되는 안정성에서의 감소와 상호관계를 나타낸다.

이 결과는 추가적으로 인위적인 오결합을 프로브 서열에 혼입시킴에 의하여 전체 프로브 길이를 길게할 수 있게 되어 프로브 서열의 특이성과 복합체 배경(complex backgrounds)에서 상당히 관련성이 있는 DNA서열들을 구별할 수 있는 능력을 추가적으로 개선시킬 수 있다는 것을 제시한다.

본 발명에서 나타내고 있는 데이터는 인위적인 오결합 사이에 10 개의 뉴클레오티드의 간격이 요구된다는 것을 제시한다. 또한, 간격이 좁을수록 본 방법에 있어서는 효과적인 것으로 평가되고 있다. △T_m에 있어서의 허용 가능한 증가는 간격이 8개의 염기일 때에 나타났으며 유사한 결과가 간격이 4개 이하의 염기인 경우에도 관찰되는 것으로 판단된다.

너무 많은 오결합을 함유하는 이중쇄는 너무 불안정하여 실온에서 형성되기가 어렵다는 추가적인 인식하에서, 인위적 오결합의 위치들이 본 발명의 용도에 사용되는 변형된 프로브에서 전체 위치들의 수의 단지 20%뿐 일 것이 발명자에 의하여 바람직하게 여겨졌다. 더 바람직하게는, 프로브에서 전체 위치들의 단지 15%가 인위적 오결합인 것이다. 가장 바람직하게는, 프로브에서 전체 위치들의 단지 10%가 인위적 오결합인 것이다.

또한, 프로브 길이 및 하이브리다이제이션에 관한 사항들은 당업계에 숙지되어 있는 것으로 이해된다. 본 발명은 당업계에 허용가능한 길이를 갖는 임의의 올리고뉴클레오티드에 적용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 타겟의 전체 길이에 대응될 필요는 없다. 게다가, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 타겟에 상보적인 부분 이외의 다른 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 길이는 오직 올리고뉴클레오티드를 합성하는 능력에 의해서만 제한된다. 현재의 기술을 사용하면 약 100 내지 150개의 뉴클레오티드를 갖는 합성 올리고뉴클레오티드를 쉽게 만들 수 있다. 현재, 최대 약 200 개의 염기를 갖는 긴 합성 뉴클레오티드를 제조하는 것은 다소 어려움이 있다. 그러나, 이 분야의 발전으로 인하여 200 개 이상의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것이 더 쉬워질 것으로 예상된다. 더 일반적으로, 바람직한 길이인, 약 50개의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드가 쉽게 합성되고 사용된다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 염기가 약 50개 미만일 수 있으며, 더 바람직하게는 염기가 약 40개 미만이며 더 바람직하게는 염기가 약 25개 미만일 수 있다. 특정 다형성 로커스(locus)에 대한 특이성이 프로브의 길이의 증가에 따라 증가된다는 인식하에 프로브의 상보적 부분은 바람직하게는 적절한 정도의 특이성을 원한다면 적어도 염기가 10개의 길이는 되어야 한다.

변이체 이중쇄를 불안정하게 하기 위한 세척 단계를, 반드시 필요한 단계는 아니지만, 본 발명에 적용시킬 수 있다. 그러나, 덜 안정한 이중쇄를 완전히 제거하는 것이 필수적이지는 않지만 요구되며, 덜 안정한 이중쇄를 바람직하게 와해시키는 것이 필수적이다. 또한, 덜 안정한 이중쇄 뿐만 아니라, 다소 안정한 이중쇄 중에서, 전체는 아니더라도 약간을 와해시키는 것이 요구된다. 이중쇄의 존재와 부존재를 구별할 수 있는, 표면 감지법(surface-sensitive methods)을 포함하는 검출 방법이 사용될 수 있다. 하이브리다이제이션화된 후에 세척 단계를 필요로 하지 않는 검출 방법은 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 및 순간 파장 형광 검출법(evanescent wave fluorescence detection)을 포함한다.

인위적으로 오결합된 하이브리다이제이션은 정상 서열과 국부 돌연 변이체를 구별하는 능력을 증가시킨다.

HLA-DRB 로커스에서 하나의 뉴클레오티드 다형성을 구별하는 능력은 종래의 방법에 본 발명의 원리를 적용하여, 예를 들면, 티슈 타이핑(tissue typing), DNA 진단 시험, 유전적 동일성 시험, 대립유전자 특이적 PCR 및 하이브리다이제이션에 의한 서열화의 특이성을 증가시키기 위한 인위적으로 오결합된 하이브리다이제이션의 유용성을 설명한다.

타겟들 사이의 추가적으로 더 복잡한 차이 뿐 만 아니라 본 발명의 개념 및 미세한 하나의 뉴클레오티드의 변화를 검출할 수 있는 능력을 설명하면서, 본 발명자들은 핵산 하이브리다이제이션을 특정 서열 변이체의 진단 표시기로서가 아닌 다른 방법으로 적용하고 있는 다른 기술들에 대한 본 발명의 일반적인 용도를 또한, 알려주고 있다.

대립유전자 특이적 PCR 및 대립유전자 특이적 DNA 서열화는 모두 대립 유전자들을 구별할 수 있는 능력이 불충분하여 한계가 있는 종래의 기술이며 이와 같은 용도의 비제한적인 예들이다. 하나의 가닥에는 상보적이나 다른 가닥에는 상보적이지 않는 프라이머를 선택하고 그 올리고뉴클레오티드 프라이머에 인위적인 오결합을 제공하는 경우 및 온도, pH 및 염과 같은 적당한 하이브리다이제이션 조건을 선택한 경우 중 어느 경우이든, 올리고뉴클레오티드와 다른 하나의 대립유전자 사이에서는 형성되지 않지만, 올리고뉴클레오티드와 하나의 대립유전자 사이에서 안정한 이중쇄가 형성되는 것을 보장하는 것은 가능하다. 안정한 이중쇄를 형성한 후, 증폭 또는 서열화 반응을 프라임화시켜 예를 들어 PCR 또는 다른 증폭 방법을 사용하여 하나의 대립 유전자의 선택적 증폭 또는 예를 들어, 프라이머 신장을 위한 DNA 폴리머라제를 사용하여 하나의 대립 유전자의 쇄 신장 서열화라는 이점을 가진채 종래의 프로토콜에 따라 처리될 수 있다.

게다가, 여기에서 개시하고 있는 보편적인 하이브리다이제이션 방법은 서열들의 복합 혼합물에서 개별적인 유전 서열을 선택적으로 검출하는 방법에 적용된다. 예를 들면, 샘플내의 바이러스 게놈의 프로파일은 만약, 프로브가 검출 특이성을 개선시킬 수 있는 인위적인 오결합을 함유하고 있다면, 연속적이거나 동시적으로 특정 바이러스들에 특이성을 갖는 프로브 세트를 사용하여 DNA 샘플을 프로브화하므로써 달성될 수 있다는 것을 예상할 수 있다. 유사하게, 본 방법은 만약 대립유전자가 신중하게 선택된 프로브에 의하여 구별될 수 있으면 이형 접합자(heterozygotes)의 선택적 검출을 가능하게 한다.

본 발명의 하이브리다이제이션 방법에 의하여 형성된 안정한 이중쇄는 다른 가용한 방법이나 수단에 의하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 검출은 PCR-증폭된 단편의 연속적인 생산을 모니터하거나, 올리고뉴클레오티드를 태깅하여 그들의 존재를 모니터링하거나 상기한 표면 감지법에 의하여 현실화될 수 있다. 검출 방법들은 여기에 기재된 것으로 한정되는 것은 아니다. 차라리, 본 발명의 개선된 하이브리다이제이션 방법에서 형성된 이중쇄의 검출은 하이브리다이제이션 단계를 포함하는 종래 용도에서 사용하고 있는 다른 방법이나 수단을 사용하여 달성될 수 있다. 방법의 유용성은 반응에서 형성된 더 안정한 이중쇄를 검출하기 위한 요구에 반드시 의존하는 것은 아니다. 두 이중쇄는 둘 사이의 안정성 차이를 모니터링하는, 예를 들면, 반응에 있어서 결합 또는 와해 키네틱(kinetic)을 모니터링하는 동일한 하이브리다이제이션 방법으로 검출될 수 있을 것으로 예상된다. 검출 방법이 이중쇄의 형성을 시각적, 청각적 또는 다른 감각적 확인 방법을 제공하므로써 자동 시스템으로 적용될 수 있다는 것이 더 구체적으로 예상된다.

출원인은 본 발명의 하이브리다이제이션 방법을 상당히 다형성인 HLA-DRB로커스에서 유전자좌(loci)와 관련있는 복합체들을 구별하기 위한 진단 도구로 사용되고 있는 평가 방법의 비한정적 실시예를 이하에서 설명한다.

<HLA-DRB에서 하나의 뉴클레오티드 다형성들을 구별하는 것>

인간 HLA-DRB구역의 뉴클레오티드 서열은 잘 알려져 있고 많은 다형성 부위를 함유하는 것으로 보여졌으며 그들 중 몇몇은 종래의 하이브리다이제이션으로는 서로를 구별하기가 곤란하였다.

PCR 프라이머를 사용한 증폭에 의해 정의된 로커스의 세 개의 현저한 부위가 타겟 서열로 사용되었다. PCR에 의한 생성물의 유전형은 인용 문헌으로 개시하고 있는 보더머, 제이. 등에 의한 문헌(Tissue Antigens 39:161(1992))에 기재된 DRB1*0301, DRB1*1101 및 DRB1*1301이다. 증폭된 세 부분은 길이가 각각 약 260개의 뉴클레오티드들이다.

DNA 타겟에 완전히 상보적으로 결합되거나 하나 또는 두 개의 인접 염기들에서 오결합된 서열을 갖는 6 종류의 올리고뉴클레오티드 프로브를 유리 지지체에 인용 문헌으로 개시하고 있는 구오, 제트. 등에 의한 문헌(Nucleic Acids Research 22:5456(1994))에 기재된 것처럼 고정시켰다. 상기한 구오에 의한 문헌에 기재된 것 처럼 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 5′말단에 15개의 염기를 갖는 길이의 dT 스페이서 및 15개의 염기 길이의 하이브리다이제이션 서열을 가졌다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 하이브리다이제이션된 서열, 이들에 대응되는 타겟 구역 및 유리 지지체상의 이들의 위치들은 표2에 나타내었다. 타겟 다형성에 대응되는 모든 염기는 굵게 그리고 밑줄을 하였다. 이탤릭체 및 밑줄을 한 염기들은 인위적으로 오결합된 하이브리다이제이션 실험에서 3-니트로피롤로 치환하였다.

<표2>

국소 위치 프로브 서열 완전히 결합되는 대상

첫째 열, 좌측 5′-GGTGCGGTACCTGGA-3′ (DRB1*0301)

첫째 열, 우측 5′-GGTGCGGTCCCTGGA-3′ (DRB1*1101, DRB1*1301)

둘째 열, 좌측 5′-CCTGATGCCGAGTAC-3′ (DRB1*0301)

둘째 열, 우측 5′-CCTGATGAGGAGTAC-3′ (DRB1*1101)

세째 열, 좌측 5′-GATACTTCTATAACC-3′ (DRB1*1101)

세째 열, 우측 5′-GATACTTCCATAACC-3′ (DRB1*0301, DRB1*1301)

HLA-DRB 타겟 DNA는 형광물질이 부착된 하나의 프라이머 및 하나의 바이오틴화된 프라이머를 사용하는 PCR에 의하여 인간 게놈 DNA로부터 증폭된다. 사용된 프라이머들은 5′-(F)-CGCCGCTGCACTGTGAAGCTCTC-3′ 및 5′-바이오틴-TTCTTGGAGTACTCTACGTCT-3′이며 F는 형광 물질 라벨을 표시한다. PCR은 퍼킨-엘머 시터스 써모사이클러 모델 9600(Perkin-Elmer Cetus Thermocycler Model 9600)에서 94℃에서 30초, 55℃에서 1분 및 70℃에서 1분 30초의 사이클을 35번 반복하여 수행된다. 이 방법은 인용 문헌으로 개시하고 있는 박스터-로우 등에 의한 문헌(J. Clinical Investigation 84:613-18(1989))에 상세히 기재되어 있다.

두 개의 상보적인 가닥을 분리하고, 형광 물질이 부착된 가닥을 지지체가 결합된 올리고뉴클레오티드 서열에 하이브리드화하였다. 종래의 하이브리다이제이션의 경우, 하이브리다이제이션은 5×SSPE, 0.5% SDS 완충액하에서 실온에서 수행되고,그 후 2×SSPE, 0.1% SDS 완충액을 사용하여 30℃에서 15분 동안 2회 세척한다. 실온에서 다소 짧은 5분 동안의 세척 단계를 거치는 것을 제외하고는 동일한 조건을 인위적으로 오결합된 하이브리다이제이션에 적용하였다. 실온에서의 세척 단계는 프로브와 변이체 타겟사이의 이중쇄를 불안정화시키는 데 적절하다. 낮은 융해 온도는 PCR 단편으로 큰 타겟을 갖고 있는 경우 용액 보다는 표면 하이브리다이제이션 반응에서 가끔 관찰된다. 게다가, 상기한 융해 온도 분석법에서 사용된 것보다 낮은 염 조건을 본 실시예에서 사용하여 추가적으로 이중쇄 융해 온도를 감소시켰다.

하이브리다이제이션은 형광 스캐닝법으로 검출하였다. 형광 이미지는 몰레큘라 다이나믹 플루오르이미져 575(Molecular Dynamics FluorImager 575)를 사용하여 얻었다. 인위적으로 오결합된 하이브리다이제이션 방법을 사용할 경우, 형광 PCR 증폭 생산물이 완전히 결합된 프로브에 검출될 정도로 결합을 만들어 낸다는 것은 도6으로부터 명백하다. 그 방법은 하나 또는 두 개의 염기가 오결합된 이중쇄를 완전히 검출한다. 대조적으로, 심지어 세척을 많이한 후에도 완전히 결합된 이중쇄 및 오결합된 이중쇄 모두는 종래의 오결합 하이브리다이제이션 방법 후에도 형광 표시를 보인다. 이러한 결과들은 인위적으로 오결합된 하이브리다이제이션 방법이 종래 하이브리다이제이션 방법보다 더 높은 검출력을 갖는다는 것을 보여준다.

본 발명은 명세서 또는 실시예에서 개시하고 있는 구체적인 예에 한정되는 것은 아니며 아래의 특허청구범위의 권리 범위에 속하는 본 발명의 변형 및 변화된 것들을 모두 포함한다.

<서열표>

(1) 일반적 정보:

(i) 출원인: 구오, 젠, 스미스, 로이드 엠.

(ii) 발명의 명칭: 인위적으로 오결합시킨 하이브리다이제이션

(iii) 서열수: 20

(iv) 통신 주소:

(A) 수신인: 콰르레스 앤드 브래디

(B) 거리: 1 사우쓰 핑크니 스트리트.

(C) 도시: 매디슨

(D) 주: 위스콘신

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 53703

(v) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: 호환성 있는 아이비엠 피시

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 페이턴트 인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.30

(vi) 최근 출원 기록:

(A) 출원번호:

(B) 출원일:

(C) 분류:

(viii) 대리인 정보:

(A) 성명: 버선, 벤넷 제이.

(B) 등록번호: 37094

(C) 참고번호: 960296.93901

(ix) 통신 정보:

(A) 전화: 608-251-5000

(B) 팩스: 608-251-9166

(2) 서열 동정 번호 제1번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제1번:

CAGATCGGCT GAACTCCACA 20

(2) 서열 동정 번호 제2번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제2번:

GTCTAGCCGA CTTGAGGTGT 20

(2) 서열 동정 번호 제3번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제3번:

AGATACTTCT ATAACCAAGA G 21

(2) 서열 동정 번호 제4번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 15 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제4번:

TGGTTATAGA AGTAT 15

(2) 서열 동정 번호 제5번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제5번:

GAGAACCAAT ATCTTCATAG A 21

(2) 서열 동정 번호 제6번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(ix) 특징:

(A) 이름/키(key): 변형된 염기

(B) 위치: 그룹(8, 14)

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 변형된 염기

(B) 위치: 그룹(7, 15)

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 변형된 염기

(B) 위치: 그룹(6, 16)

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 변형된 염기

(B) 위치: 그룹(5, 17)

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 변형된 염기

(B) 위치: 그룹(4, 18)

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제6번:

CTCTTGAGAG AGCTAGTATC T 21

(2) 서열 동정 번호 제7번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제7번:

GAGAACTCTC TCGATCATAG A 21

(2) 서열 동정 번호 제8번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 변형된 염기

(B) 위치: 그룹(7, 15)

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 변형된 염기

(B) 위치: 그룹(6, 16)

(ix) 특징:

(A) 이름/키: 변형된 염기

(B) 위치: 그룹(5, 17)

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제8번:

CTCTTGAGAG AGCTAGTATC T 21

(2) 서열 동정 번호 제9번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제9번:

AGATACTAGC GCTCTCAAGA G 21

(2) 서열 동정 번호 제10번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제10번:

AGATACTAGC TCGCTCAAGA G 21

(2) 서열 동정 번호 제11번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제11번:

AGATACTAGC GCTCTCAAGA G 21

(2) 서열 동정 번호 제12번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제12번:

AGATACTAGC TCTCTCAAGA G 21

(2) 서열 동정 번호 제13번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 15 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제13번:

GGTGCGGTAC CTGGA 15

(2) 서열 동정 번호 제14번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 15 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제14번:

GGTGCGGTCC CTGGA 15

(2) 서열 동정 번호 제15번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 15 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제15번:

CCTGATGCCG AGTAC 15

(2) 서열 동정 번호 제16번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 15 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제16번:

CCTGATGAGG AGTAC 15

(2) 서열 동정 번호 제17번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 15 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제17번:

GATACTTCTA TAACC 15

(2) 서열 동정 번호 제18번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 15 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제18번:

GATACTTCCA TAACC 15

(2) 서열 동정 번호 제19번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 23 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제19번:

CGCCGCTGCA CTGTGAAGCT CTC 23

(2) 서열 동정 번호 제20번에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 다른 핵산

(A) 설명: /desc: "올리고뉴클레오티드"

(xi) 서열 설명: 서열 동정 번호 제20번:

TTCTTGGAGT ACTCTACGTC T 21

Claims

대조군 서열에 대하여 일부 상보적인 핵산 서열을 갖지만, 대조군 서열 및 변이체 서열에 대하여 하나 이상의 인위적으로 오결합된 것과 변이체 서열에 대하여 진정으로 오결합(true mismatch)된 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계(여기서, 상기 인위적 오결합과 진정 오결합은 올리고뉴클레오티드 내의 다른 뉴클레오티드 위치에 존재한다), 및

선택된 하이브리다이제이션 조건 하에서 이중쇄(duplex)를 형성시키기 위하여 올리고뉴클레오티드와 대조군 서열을 결합시키는 단계(여기서, 상기 이중쇄는, 동일한 하이브리드화 조건 하에서 올리고뉴클레오티드와 핵산 타겟의 변이체 서열 간에 형성되는 이중쇄보다 높은 융해 온도를 가지며, 상기 인위적 오결합의 존재는, (i) 올리고뉴클레오티드와 핵산 타겟의 대조군 서열 간의 이중쇄에 대한 융해 온도와 (ii) 올리고뉴클레오티드와 핵산 타겟의 변이체 서열 간의 이중쇄에 대한 융해 온도 간의 차이를 증가시키고, 상기 인위적 오결합은, 타겟 핵산 내 위치에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 내 위치에서 발생하며, 대조군 서열 및 변이체 서열에서 동일한 것이고, 상기 진정한 오결합은, 핵산 내 위치에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 내 위치에서 발생하며 대조군 서열과 변이체 서열 간에 상이한 것이다)

를 포함하고, 상기 핵산 타겟이 천연 상태에서 대조군 서열 및 변이체 서열로 존재하는 것인, 올리고뉴클레오티드를 핵산 타겟에 하이브리드화시키는 방법.
제1항에 있어서, 인위적 오결합이 보편적(universal) 오결합 뉴클레오시드를 포함하는 것인 방법
제2항에 있어서, 보편적 오결합 뉴클레오시드가 1-(2′-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤인 방법.
제1항에 있어서, 인위적인 오결합과 진정한 오결합들이 세 개 또는 네 개의 뉴클레오티드 위치에 의해 떨어져 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 두 개의 인위적 오결합을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 열 개의 뉴클레오티드에 의해 떨어져 있는 두 개의 인위적 오결합을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 진정한 오결합이 타겟에 대한 핵산의 치환(substitution), 첨가(insertion), 결실(deletion) 및 재배열(rearrangement)로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 타겟에 상보적인 올리고뉴클레오티드 부분이 약 150개 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중쇄를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중쇄를 검출하는 단계가 PCR-증폭된(amplified) 단편의 연속적인 생산을 모니터링하는 것, 올리고뉴클레오티드의 태그(tagged)된 형태를 모니터링하는 것, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 측정하는 것, 및 순간 웨이브 형광성(evanescent wave fluorescence)을 측정하는 것으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
제9항에 있어서, 제1 이중쇄를 차별적으로(preferentially) 와해(disrupting)시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 와해 단계가 제1 이중쇄의 와해를 쉽게하는 조건 하에서 결합 단계의 생성물을 세척하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 제2 이중쇄를 형성한 후에 핵산 단편을 선택적으로 증폭하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 제2 이중쇄를 형성한 후에 핵산 단편을 선택적으로 연장시키는(extending) 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1 타겟에 대하여 일부 상보적인 핵산 서열을 갖지만 서열 변이가 없는 위치에서 제1 타겟에 대하여 하나 이상의 인위적 오결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계, 및

(a) 선택된 하이브리다이제이션 조건 하에서 올리고뉴클레오티드와 핵산을 결합시켜 올리고뉴클레오티드와 제1 타겟을 포함하는 제1 이중쇄, (b) 제1 이중쇄보다 덜 안정하고, 올리고뉴클레오티드와 제2 타겟을 포함하는 제2 이중쇄 및 (c) 제1 이중쇄와 제2 이중쇄 모두를 포함하는 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 목적물을 제조하는 단계, 및

선택적으로, 제1 이중쇄 또는 제2 이중쇄를 검출하는 단계

를 포함하며, 상기 인위적 오결합의 존재는, (i) 올리고뉴클레오티드와 제1 핵산 타겟 간의 이중쇄에 대한 융해 온도와 (ii) 올리고뉴클레오티드와 제2 핵산 타겟 간의 이중쇄에 대한 융해 온도 간의 차이를 증가시키고, 상기 인위적 오결합은, 제1 핵산 타겟 및 제2 핵산 타겟 내 위치에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 내 위치에서 발생하며, 제1 핵산 타겟 및 제2 핵산 타겟에서 동일한 것인, 핵산을 포함하는 시험 샘플에서 제1 타겟에 대한 서열 변이를 갖는 제2 핵산 타겟과 제1 핵산 타겟을 구별하는 방법.
제15항에 있어서, 제1 이중쇄 또는 제2 이중쇄를 검출하는 단계가 PCR-증폭된(amplified) 단편의 연속적인 생산을 모니터링하는 것, 올리고뉴클레오티드의 태그(tagged)된 형태를 모니터링하는 것, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 측정하는 것, 및 순간 웨이브 형광성(evanescent wave fluorescence)을 측정하는 것으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
제15항에 있어서, 제2 이중쇄를 차별적으로 와해시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 와해 단계가 제2 이중쇄의 와해를 쉽게하는 조건 하에서 결합 단계의 생성물을 세척하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 인위적 오결합이 보편적 오결합 뉴클레오시드를 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 보편적 오결합 뉴클레오시드가 1-(2′-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤인 방법.
제15항에 있어서, 인위적 오결합과 서열 변이가 세 개 또는 네 개의 뉴클레오티드 위치에 의해 떨어져 있는 것인 방법.
제15항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 두 개의 인위적 오결합을 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 열 개의 뉴클레오티드에 의해 떨어져 있는 두 개의 인위적 오결합을 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 서열 변이가 타겟에 대한 핵산의 치환, 첨가, 결실 및 재배열로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
제15항에 있어서, 제1 타겟에 상보적인 올리고뉴클레오티드 부분이 약 150개 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.