KR100460440B1 - 항체-dna 복합체와 상보적 dna를 이용한 단백질 칩및 이의 제작방법 - Google Patents

항체-dna 복합체와 상보적 dna를 이용한 단백질 칩및 이의 제작방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체-DNA 복합체와 상보적 DNA를 이용한 단백질 칩 및 이의 제작방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상보적 배열을 갖는 DNA의 선택적 결합력을 이용하여 마이크로 배열장치(micro-arrayer)가 없는 곳에서도 쉽게 단백질 검출센서를 제작하게 하는 디바이스(device)를 개발함으로써 단백질 칩의 어레이(array) 크기를 DNA 칩 수준으로 줄여 단위면적당 항원과의 반응성을 향상시키고, 유통 및 보관에 있어서도 매우 편리한 단백질 칩 및 이의 제작방법에 관한 것이다.

Description

항체-DNA 복합체와 상보적 DNA를 이용한 단백질 칩 및 이의 제작방법{Fabrication of protein chip using site selective surface binding of antibody-DNA conjugates by DNA hybridization}
본 발명은 항체-DNA 복합체와 상보적 DNA를 이용한 단백질 칩 및 이의 제작방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상보적 배열을 갖는 DNA의 선택적 결합력을 이용하여 마이크로 배열장치가 없는 곳에서도 쉽게 단백질 검출센서를 제작하게 하는 디바이스를 개발함으로써 단백질 칩의 어레이 크기를 DNA 칩 수준으로 줄여 단위면적당 항원과의 반응성을 향상시키고, 유통 및 보관에 있어서도 매우 편리한 단백질 칩 및 이의 제작방법에 관한 것이다.
1990년부터 시작된 게놈 프로젝트(genome project)의 진전에 힘입어 최근 인간유전자의 구조가 대부분 밝혀지면서 인체를 구성하는 유전자의 기능연구에 대한 관심이 급증하고 있다. 유전자는 단백질을 발현해 세포 내에서 그 기능을 수행하기 때문에 게놈의 기능연구는 단백질에 대한 연구로 귀결되며, 최근 프로테오믹스(proteomics, 단백질체학)라는 새로운 연구분야가 국내외적으로 많은 관심을 불러일으키고 있다. 프로테오믹스는 게놈(genome)에 의해 발현되는 모든 단백질들의 총합을 일컫는 프로테옴(proteome)을 다루는 학문으로, 어떤 단백질이 얼마의 양으로 어떤 환경에서 발현되는 가를 파악하는 것을 목적으로 한다. 생명체의 게놈이 생명체가 수행하는 기능의 이론적인 면만을 제시할 수 있음에 반해, 프로테옴은 세포가 처해있는 환경에 따라 세포의 실제적인 기능을 표현해 준다. 이러한 이유로 급속한 속도로 밝혀지고 있는 미지의 유전자들의 기능을 밝혀내고자 하는 기능유전체학(functional genomics)의 한 부분으로 새롭게 부각되고 있고, 세포내에서 일어나는 실제적인 현상들을 전체 단백질 단계에서 통합적으로 파악하는 수단으로 제공된다. 이러한 프로테오믹스 연구에 필수적으로 이용될 수 있는 핵심기술이 단백질 칩이며, 이는 수십 내지 수백 개의 단백질을 작은 칩 상에 고정해 동시다발적으로 단백질의 결합을 분석하는 자동화 기기 시스템이다. 이는 질병의 진단, 단백질의 발현 및 기능연구, 단백질의 상호작용 연구, 신약개발 등 다양한 응용분야를 가지고 있어 의학, 약학, 생명과학분야에서 광범위하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
기존의 단백질 칩은 마이크로 배열장치(pin형, ink jet형)를 이용하여 단백질 결합을 용이하게 하여줄 수 있는 유기물질로 처리된 고형 기판 위에 특이 단백질(항체)을 고정시키면서 제작된다. 여기에 특이 단백질(항체)이 결합되지 않은 나머지 부분을 항체가 붙지 않는 물질로 피복(blocking)한 후 분석물질(항원)에 반응시킨다. 마지막으로 형광물질이 표지된 2차 항체를 이용하거나, 표면플라즈몬 공명장치 등을 이용하여 반응여부를 확인한다. 그러나, 단백질 어레이는 단백질 그 자체의 크기(보통 항체의 크기는 분자량이 155000 Da정도임)와 단백질 자체의 수용액 상에서 발생되는 집합체(aggregate) 문제 때문에 수백 마이크로 단위 이상에서 컨트롤이 되고, 실질적으로 100 ㎛ 이하의 단위에서 컨트롤이 어려운 단점을 가지고 있다. 이로 인하여 기존의 개발된 단백질 칩은 그 어레이 크기가 수백 마이크로 단위의 집적도에서 한계를 가진다. 또한, 일반적 단백질 칩을 제작 시에 항체의 수만큼 일일이 마이크로 배열장치를 이용하여 항체를 기판에 고정화시켜야 한다. 그러나, 단백질이 가지고 있는 불안정성으로 인하여 제작된 단백질 칩은 그 보관 및 유통에 있어서 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 제시된 기존의 단백질 칩이 가지고 있는 집적도의 문제점과 제작시 어려움 및 단백질의 불안정성으로 인한 단백질 칩의 상용화의 문제점을 해결할 수 있는 방법으로 항체-DNA 복합체와 상보적 DNA간의 특이적 결합을 토대로 한 단백질 칩 제작 기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 항체-DNA 복합체와 상보적 DNA를 이용한 단백질 칩 및 이의 제작방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 외가닥 DNA가 골드표면에 고정됨을 확인한 그래프이다.
도 2는 외가닥 DNA 고정화, 피복(blocking) 과정, 항체-DNA 복합체와 고정화된 상보적 DNA와의 결합반응, 항체와 항원의 반응을 보여주는 그래프이다.
도 3은 전기영동법을 통해 외가닥 DNA-항체 복합체 형성 유무를 직접적으로 확인한 도면이다.
도 4는 CY3 표지된 외가닥 DNA 마이크로 단위 영역(spot)을 편광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5는 상보적 DNA와 항체-DNA 복합체의 반응에 의해 형성된 항체 영역(spot)을 편광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6은 항체-DNA 복합체와 상보적 DNA 및 비상보적 DNA와의 반응에 특이적 결합반응을 편광현미경으로 확인한 사진이다.
본 발명은
1) 외가닥 DNA의 염기 서열을 열역학적으로 안전성을 고려하여 말리는 현상 이 없게 외가닥 DNA를 만들고, 5'끝부분에 황화기를 붙인 후 황화기가 붙은 외가닥 DNA을 골드 기판 위에 분사하여 고정화시키고 2-머캡토에탄올을 이용하여 피복시키는 단계; 및
2) 항체 Fc부분의 탄수화물 부분을 소디움 페리오데이트(sodium periodate)를 이용하여 알데하이드기로 산화시킨 후 아민기가 붙은 외가닥 DNA와 반응시켜 항체-DNA 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 단백질 칩의 제작방법에 그 특징이 있다.
또한, 상기 방법으로 제작된 항체-DNA 복합체와 상보적 DNA를 이용한 단백질 칩을 포함한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 상보적 배열을 갖는 DNA의 선택적 결합력을 이용하여 마이크로 배열장치(micro-arrayer)가 없는 곳에서도 쉽게 단백질 검출센서를 제작하게 하는 디바이스를 개발함으로써 단백질 칩의 어레이 크기를 DNA 칩 수준으로 줄여 단위면적당 항원과의 반응성을 향상시키고, 유통 및 보관에 있어서도 매우 편리한 단백질 칩 및 이의 제작방법에 관한 것이다.
기본적으로 DNA는 당, 인산 및 염기가 조합되어 하나의 단위로 된 뉴클레오티드들의 결합에 의한 이중 나선 구조(double helix structure)를 가지고 있다. 이러한 DNA는 반응 온도를 비등점 근처까지 가열하거나 pH 3 이하, 10 이상으로 만들어 주면 이중나선 구조의 수소 결합이 끊어지면서 외가닥 DNA 구조로 만들어지며, 다시 주위조건을 원상태로 복원시킬 시 서로 상보적 배열을 갖는 DNA간에 가역적 반응이 발생된다. 따라서, DNA는 매우 안정한 물질로서 검출센서의 고정화 및 결합재료로서 적당한 물질이다.
본 발명은 이러한 DNA의 가역적 상보적 특이 반응과 DNA는 안전성 및 나노수준에서 제어가 가능하다는 장점에 기본 토대를 둔다. 이에, 본 발명자는 외가닥 DNA를 항체에 직접 연결시키는 물질을 선택하여, 목적 항체에 외가닥 DNA를 직접 연결한다. DNA의 상보적 결합력을 이용하여 기판에 선택적으로 고정하는 이 방법을 개발하였다.
DNA 칩이나 단백질 칩의 크기가 단위 면적당 어레이 되는 수가 많아져야 하는 이유는 실제로 인간의 피(검사대상,in vivo) 속의 단백질이 밖으로(in vitro) 채취되었을 때 이를 검출하기 위한 센서가 실질적으로 감지하기 위해선 민감성이 매우 높아야 하기 때문이다. 이는 항체는 매우 불안정해서 몸밖으로 추출되면 대부분이 활성을 잃기 때문에, 단위 면적당 보다 많은 단백질이 고정되어 검출 단백질(항원)과 결합 확률을 높여야 한다. 따라서, 단위 면적당 검출영역(spot)을 넓히기 위해서 어레이 크기가 작아져야 하는데, 고정된 DNA의 어레이(array) 영역의 크기(spot size)를 100 ㎛ 이하 수준으로 낮추기 위해서 DNA 칩의 배열기술을 이용한다. DNA 칩 기술은 30 ㎛ 이하에서 어레이(array)가 가능하기 때문에 이 기술을 단백질 칩에도 적용하면 이 정도의 배열이 가능하리라 사료된다.
이와 같은 단백질 칩 제작과정을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저 외가닥 DNA를 만들어 기판에 고정화시키는 단계로서, DNA 염기서열을 열역학적 안전성을 고려하면서 설계하여 DNA 자체가 말리거나 꼬이는 현상이 없도록 외가닥 DNA를 만든다. 골드 기판에 DNA를 고정화시키기 위해서 상기 외가닥 DNA 5`끝 부분에 황화기를 붙인다. DNA의 고정화여부는 표면 플라즈몬 분석장치(SPR)를 통하여 확인하였다[도 1]. 상기 외가닥 DNA을 DNA와 결합이 일어나지 않은 상태의 단백질이 붙는 경우를 막기 위해서 결합방해물질, 바람직하게는 2-머캡토에탄올(2-Mercaptoethanol)을 이용하여 골드 기판을 피복시킨다[도 2]. 실질적으로 마이크로 배열장치를 이용하여 골드 기판 위에 DNA를 분사방식으로 분사하여 어레이(약 30 ㎛)를 제작한다[도 4].
다음은 외가닥 DNA와 항체를 결합시킨 후 이를 이용하여 단백질 칩을 제작하는 단계이다. 항체는 크게 항원과 반응하는 곳인 Fab 부분과 전 부분(heavy chain)의 끝 부분인 Fc 부분으로 나뉜다. 이때 아민기는 항체 전 부분(heavy chain)에 골고루 퍼져 있고 특히 항원과의 반응 부분인 Fab 부분에도 분포하고 있다. 따라서 결합 물질로 아민기를 활성화시켜 항원과 DNA를 결합시키는 방법은 지양해야 하는데, 본 발명에서는 Fc 부분에 DNA를 연결하기 위해 소디움 페리오데이트(sodium periodate)라는 물질을 이용하여 Fc 부분의 탄수화물 부분을 알데하이드 그룹으로 활성시킨다. 즉, 소디움 페리오데이트(20 mM)를 PBS 버퍼를 이용하여 만든 후 항체를 이 용액을 이용하여 20 μM이 되게 만들어 약 3시간 정도 상온에서 반응시킨다. 산화된 탄수화물기에 5'에 아민기를 붙인 외가닥 DNA를 상온에서 약 3시간 이상 반응시켜 항체와 외가닥 DNA의 복합체를 완성한다[도 3]. 이를 상보적인 외가닥 DNA가 고정화된 기판에 반응시켜 단백질 칩을 제작한다[도 5].
이렇게 제작된 단백질 칩의 어레이 크기를 DNA 칩 수준(30 ㎛ 이하)으로 줄여 단위 면적당 항원과 반응할 수 있는 항체의 집적도를 높였기 때문에 반응성이 향상되며, 또 기존의 단백질 칩을 제작하는 방법 마이크로 어레이를 구입하여 검출하고자하는 종류만큼의 항체의 점을 찍은 후 여기에 항원과 반응시키고 표지된 2차 항체를 이용하여 존재 유무를 알아내는 기존의 일반적인 방법과는 달리, 본 발명은 안정한 물질인 DNA를 이용하여 단백질 칩용 디바이스 혹은 단백질 칩을 구현함으로써 유통상, 보관상의 편리와 응용의 다양성을 동시에 얻을 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 외가닥 DNA 제조 및 고정화과정
열역학적 안정성을 고려하여 외가닥 DNA의 염기서열을 조작하여 서로 말려드는 현상을 최대한 줄였다. 이를 제노택(주)에 주문 제작하여 외가닥 DNA를 만들고, 골드 기판에 DNA를 고정화시키기 위해서 DNA 5`끝부분에 황화기를 붙였다. 본 실험에선 표면 플라즈몬 분석장치(SPR)을 이용하여 결합유무를 확인하기 위해서 골드 기판을 사용하였다. 따라서 칩의 제작엔 기존의 DNA용 칩을 사용해도 무방하다. DNA의 고정화여부는 SPR를 통하여 확인하였다[도 1]. 사용한 DNA의 농도는 약 20 μM이다.
실시예 2: 항체와 외가닥 DNA의 결합
항체의 Fc부분의 탄수화물 부분을 산화시켜 알데하이드기를 형성시키는 물질인 소디움 페리오데이트(sodium periodate)를 PBS 버퍼(pH 7.4)에 녹여 20 mM을 만든다. 항체를 이 용액을 이용하여 100 nM이 되게 만들어 약 3시간 정도 상온에서 반응시켰다. 이를 5'에 아민기를 붙인 외가닥 DNA(20 μM)를 상온에서 약 3시간 이상 반응시켜 결합시킴으로써 항체와 외가닥 DNA의 복합체를 완성하고 이를 겔여과 크로마토그래피법(gel filtration chromatography)을 이용하여 정제하였다.
실험예 1: DNA 고정화 여부 확인
항원 항체 반응은 결합 특이성이 있어서 반드시 자기와 짝을 이루는 단백질과 반응이 일어나게 된다. 이 원리에 의해서 단백질 검출 센서를 만들 수 있다. 본 발명에서는 위의 방법에 의해 결합된 항체가 기판에 고정되었을 때 항원, 항체 반응의 여부를 확인하였고 반응이 일어나는 것으로 확인되었다[도 2]. 도 2에서 가장 좌측의 부분이 순수한 기판을 나타내고 그 다음 곡선이 DNA와 결합 방해물질인 2-머캡토에탄올(200 mM)을 고정한 것, 다음 곡선은 항체-DNA 복합체를 결합한 것을 반응시킨 것, 마지막 곡선은 항원을 반응시킨 것을 나타낸다. 각각의 곡선은 표면의 상태를 나타내는 것으로 질량의 변화를 감지하여 차이가 생길 때마다 곡선이 우측으로 움직인다. 실제로 제시한 도면을 보면 각 단계마다 우측으로 이동했음을 보여주고 있다. 그런데 외가닥 DNA의 분자량과 크기가 매우 적어 외가닥 DNA가 골드 표면에 붙은 여부를 나타내는 변화의 크기가 오차범위에 존재한다. 따라서, 외가닥 DNA가 표면에 고정되었는지를 확인하기 위해서는 도 1처럼 표면 플라즈몬 공명 장치를 이용한in situ실험 결과가 필요하다. 도 1의 도입 부분은 물을 흘려보냈을 때의 반사도 세기가 0.32을 나타내며, 약 900초 정도 시간이 흐른 후 외가닥 DNA를 넣어 주었는데, 반사도 크기가 0.45로 크게 변함을 알 수 있었다. 그러나, 약 6000초가 지나고 다시 물로 세척을 해주었으나 반사도 세기가 0.45에서 크게 변화하지 않았다. 따라서, 외가닥 DNA가 기판 위에 고정화되었음을 알 수 있었다.
실험예 2: DNA와 항체의 결합 유무 확인
겔 이동 분석법(Gel shift assay)을 응용한 전기 영동법을 통하여 DNA와 항체의 결합 유무를 직접 확인하였다. 즉, 좌측부터 소량의 항체(2 ㎕), 외가닥 DNA(10 ㎕)와 항체(20 nM)의 결합체, 외가닥 DNA(10 ㎕)와 항체(2 ㎕)의 결합체, 그리고, 외가닥 DNA(10 ㎕)에 해당한다. DNA와 항체를 결합시키는 방법은 상기와 동일하다. 결합 유무를 판단하기 위해 외가닥 DNA(10 ㎕)는 같은 양을 넣어주었다. 8% 폴리 아크로 아마이드 겔에 상기 시료를 각각 넣어준 후 약한 전류를 흐르게 하여 약 5시간 동안 25 V, 4 ℃에서 전기 영동시킨 후 은으로 염색하였다. 그 결과는 도 3에서와 같이, 항체와 DNA의 반응에 의한 DNA를 나타내는 선의 농도 변화로 외가닥 DNA가 항체와 결합이 일어남을 알 수 있었다.
실시예 3: 항체-DNA 복합체와 상보적 DNA를 이용한 단백질 칩 구현
형광물질이 표지된 DNA(CY3)와 FITC가 표지된 항체를 사용하여 단백질 칩을 구현하였다. 우선 DNA용 기판에 20 μM 외가닥 DNA을 마이크로 배열장치를 사용하여 점을 찍고(d:100 ㎛, d:30 ㎛) 약 24시간 암실에서 상온에서 보관 후 DNA 어레이를 완성하였다. 이것을 편광현미경 사진을 찍으면 도 4와 같이 붉은색 점을 관찰할 수 있고 지름이 약 30 ∼ 100 ㎛ 정도 된다. 다음 과정으로 결합 억제 능력을 향상시키기 위해서 3% BSA(Blocking Agents)를 이용하여 피복반응을 시켰다. 이후 항체-DNA 복합체에 20 ×SSC 버퍼를 첨가하여 만든 용액을기판(본 실험에서는 지름이 100 ㎛인 것을 사용)과 약 5시간 동안 차광된 용기에 넣어 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 세척을 하고 편광현미경으로 관찰하면 형광을 나타내는 항체의 점이 지름 약 100 ㎛ 정도로 도 5처럼 나오게 된다.
실험예 3: 형광물질을 이용한 비특이 반응성의 유무의 평가
기판에 비특이적 DNA 2종류를 한 점씩 교대로 20 μM씩 어레이한 후 약 24시간 반응시켰다. 미리 준비한 FITC가 표지된 항체를 고정된 외가닥 DNA 중 하나와 상보성 있는 DNA를 붙인 샘플용액을 이용하여 위에 표기된 방법과 동일하게 피복과정을 거쳐 반응시켰다. FITC는 초록색 형광빛을 내는데, 세척을 한 후 편광사진을 찍어 배열된 부분이 교차로 나타나면 DNA 비특이반응의 유무를 알 수 있었다. 실험 결과는 도 6에 나타내었으며, 비특이적 반응이 일어나지 않음이 확인되었다. 이 실험을 통해서 간단한 조작에 의해서 만들어진 어레이를 이용하여 DNA 칩 수준의 크기의 단백질 칩을 만들 수 있음을 보여주고 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질 칩의 어레이 크기를 DNA 칩 수준(30 ㎛ 이하)으로 줄여 단위 면적당 항원과 반응할 수 있는 항체의 집적도를 높였기 때문에 반응성이 향상되며, 또 기존의 단백질 칩을 제작하는 방법 마이크로 어레이를 구입하여 검출하고자하는 종류만큼의 항체의 점을 찍은 후 여기에 항원과 반응시키고 표지된 2차 항체를 이용하여 존재 유무를 알아내는 기존의 일반적인 방법과는 달리, 본 발명은 안정한 물질인 DNA를 이용하여 단백질 칩용 디바이스 혹은 단백질 칩을 구현함으로써 유통상, 보관상의 편리와 응용의 다양성을 동시에 얻을 수 있다.

Claims (2)

1) 외가닥 DNA의 염기 서열을 열역학적으로 안전성을 고려하여 말리는 현상 이 없게 외가닥 DNA를 만들고, 5'끝부분에 황화기를 붙인 후 황화기가 붙은 외가닥 DNA을 골드 기판 위에 분사하여 고정화시키고 2-머캡토에탄올을 이용하여 피복시키는 단계; 및
2) 항체 Fc부분의 탄수화물 부분을 소디움 페리오데이트(sodium periodate)를 이용하여 알데하이드기로 산화시킨 후 아민기가 붙은 외가닥 DNA와 반응시켜 항체-DNA 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 칩의 제작방법.
청구항 1의 방법으로 제작된 것을 특징으로 하는 항체-DNA 복합체와 상보적 DNA를 이용한 단백질 칩.
KR10-2002-0074307A 2002-11-27 2002-11-27 항체-dna 복합체와 상보적 dna를 이용한 단백질 칩및 이의 제작방법 KR100460440B1 (ko)

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