KR100458505B1 - Multiplex primer for non-specific amplification of nucleic acid - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나의 생물체의 DNA 또는 전체 mRNA의 비특이적 증폭에 사용되는 멀티플렉스 프라이머에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 하나의 생물체로부터 추출되는 DNA 또는 mRNA 전체를 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 증폭시킬때, 증폭되는 반응생성물의 수를 최대화시키는 동시에 주형으로 작용하는 DNA 또는 mRNA와 프라이머간의 혼성화 온도를 높임으로써, 재현성을 높일 수 있는 멀티플렉스 프라이머에 대한 것이다.The present invention relates to a multiplex primer used for nonspecific amplification of DNA or whole mRNA of one organism, and more particularly, amplification of the entire DNA or mRNA extracted from one organism through polymerase chain reaction (PCR). In this case, it maximizes the number of reaction products to be amplified and at the same time increases the hybridization temperature between the primers and DNA or mRNA acting as a template, to increase the reproducibility.
Description
본 발명은 하나의 생물체의 DNA 또는 전체 mRNA의 비특이적 증폭에 사용되는 멀티플렉스 프라이머에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 하나의 생물체로부터 추출되는 DNA 또는 mRNA 전체를 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 증폭시킬때 증폭되는 반응생성물의 갯수를 최대화시키는 동시에 주형으로 작용하는 DNA 또는 mRNA와프라이머간의 혼성화 온도를 높임으로써, 재현성을 높일 수 있는 멀티플렉스 프라이머에 대한 것이다.The present invention relates to a multiplex primer used for nonspecific amplification of DNA or whole mRNA of one organism, and more particularly, amplification of the entire DNA or mRNA extracted from one organism through polymerase chain reaction (PCR). Maximizing the number of reaction products to be amplified at the same time, while increasing the hybridization temperature between the DNA or mRNA and the primer acting as a template, to increase the reproducibility.
본 발명에서 재현성이란, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머를 사용한 중합효소연쇄반응시, 높은 온도에서 혼성화 반응을 수행할 수 있어서 각 멀티플렉스 프라이머가 주형에 보다 특이적으로 혼성화될 수 있으므로 반복된 실험을 수행할 경우에도 각 실험간의 오차를 줄일 수 있는 특성을 의미한다.In the present invention, reproducibility means that in the polymerase chain reaction using the multiplex primer of the present invention, hybridization reaction can be performed at a high temperature so that each multiplex primer can hybridize more specifically to the template. Even if it means a characteristic that can reduce the error between each experiment.
생물체가 갖는 유전정보는 여러가지 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 진화상으로 연관되어 있는 생명체들을 유전물질에 기반을 두어 그 연관정도를 판별하고자 하는 경우(유전적 타이핑) 및 생물체가 환경 및 기타 다른 조건에 따라 어떠한 유전자들이 얼마나 발현되는지를 살펴보는 목적(발현 프로필링)에 쓰이게 된다.Genetic information of an organism can be used for various purposes. For example, if you want to determine the degree of association between evolutionary organisms based on genetic material (genetic typing), and how and how genes are expressed according to the environment and other conditions. Used for purpose (expression profiling).
이를 위하여 종래에는 DNA 또는 전체 mRNA를 무작위 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 그 생성물을 젤상에서 전기영동으로 분리하여 분석하는 방법이 사용되었으며, 최근에는 다양한 염기서열을 갖는 DNA를 2차원 표면에 고밀도로 배열시킨 DNA 칩이 이용되고 있다.To this end, conventionally, a method of performing PCR using DNA or whole mRNA using random primers and separating the product by electrophoresis on a gel has been used. Recently, DNA having various nucleotide sequences on a two-dimensional surface has been used. DNA chips arranged at a high density are used.
이와같이 생물체의 DNA 또는 전체 mRNA를 무작위 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 생성물을 얻고자 할 경우에는 다음 두 가지를 고려하여야 한다.Thus, if you want to obtain the product of the DNA or whole mRNA of the organism by polymerase chain reaction using random primers, two things should be considered.
첫째, 중합효소연쇄반응의 결과로 생성되는 생성물의 갯수이다. 일반적으로 PCR의 생성물을 분석하기 위하여 크기에 따라 분리되는 전기영동법이 이용되는데, 이 때 PCR의 생성물의 갯수가 지나치게 과량으로 만들어지는 경우에는 전기영동으로 크기에 따라 분리하면 생성물들간의 분리 확인이 불가능하게 되고, 생성물이 지나치게 적게 만들어질 경우에는 얻어지는 정보의 양이 적어 원하는 목적을 달성할 수 없게 된다.First, the number of products produced as a result of the polymerase chain reaction. In general, electrophoresis which is separated by size is used to analyze a product of PCR. In this case, if the number of PCR products is excessively large, separation by size is performed by electrophoresis. In the case where the product is made too small, the amount of information obtained is so small that the desired purpose cannot be achieved.
둘째, 프라이머와 주형으로 이용되는 핵산과의 혼성화(hybridization) 온도이다. 일반적으로 혼성화 온도가 높을수록 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 보다 정확한 정보가 얻어지게 된다. 그러나 혼성화 온도를 높이기 위해서는 프라이머를 이루는 염기서열의 길이가 길어져야 한다. 그러나, 프라이머 염기서열의 길이가 길어질수록 PCR 반응시 생성되는 생성물의 갯수는 급격히 감소하게 되므로 이 두 가지 요소 사이의 적절한 조화가 필요하다.Second is the hybridization temperature of the primer and the nucleic acid used as a template. In general, the higher the hybridization temperature, the more reproducible results are obtained and more accurate information is obtained. However, in order to increase the hybridization temperature, the length of the nucleotide sequence constituting the primer should be long. However, as the length of the primer sequence increases, the number of products generated during the PCR reaction decreases drastically, and therefore, an appropriate balance between the two elements is required.
무작위 프라이머를 사용하는 PCR을 이용하여 유전자 발현의 측정 방법의 예를 살펴보면 다음과 같다.An example of measuring gene expression using PCR using a random primer is as follows.
생물체는 환경 및 기타 다른 조건에 따라 다수의 운전자들의 발현정도가 차등화된다. 즉, 어떤 약물이나 환경이 어떤 생물체 또는 어떤 세포에 어떠한 영향을 끼치는지 알아보기 위하여, 또는 암세포와 정상세포사이에서의 유전자 발현에는 어떠한 차이점이 있는지 알아보기 위하여 널리 쓰이는 방법 중의 하나가 두 세포 각각에서 발현되는 mRNA의 양을 측정하는 것이다. 즉, 암세포에서 추출한 전체 mRNA와 정상세포에서 추출한 전체 mRNA를 PCR을 통해 증폭시킨후, 전기영동으로 분리해보면 암세포와 정상세포간의 발현차이를 확인할 수 있다.Organisms differ in the degree of expression of a number of drivers depending on the environment and other conditions. In other words, one of the most widely used methods to find out what drug or environment affects which organisms or cells, or what differences in gene expression between cancer cells and normal cells is The amount of mRNA expressed is measured. In other words, the total mRNA extracted from cancer cells and the total mRNA extracted from normal cells can be amplified by PCR and separated by electrophoresis, and the expression difference between cancer cells and normal cells can be confirmed.
사람을 포함하는 고등생물은 십만개 안팎의 유전자를 갖고 있으며, 한 가지 종류의 세포에서는 이들중 약 10,000 내지 20,000개 정도의 유전자만이 발현되는것으로 알려져 있고, 이때 생성되는 각 mRNA의 평균적인 길이는 약 3,000 염기쌍 정도이다.Higher organisms, including humans, contain about 100,000 genes, and only one type of cell is known to express about 10,000 to 20,000 genes. The average length of each mRNA produced is About 3,000 base pairs.
따라서, 어느 한 종류의 세포로부터 전체 mRNA를 추출하면 각 3,000 염기쌍 정도의 길이를 갖는 수 만 가지 종류의 mRNA 혼합물이 얻어지게 되며, 이렇게 얻어진 mRNA 혼합물에서 각 mRNA의 양(또는 갯수)을 측정하기 위하여 PCR로 증폭시킨후 전기영동으로 분리하여 확인하는 방법이 이용된다. 이를 이용한 대표적인 방법이 디퍼렌셜 디스플레이 역전사 중합효소연쇄반응(differential display reverse transcription PCR, DD-RT PCR)으로서, 이에 사용되는 프라이머 중 하나의 예를 살펴보면 다음과 같은 구조를 가지고 있다.Thus, extracting whole mRNA from any one type of cell yields tens of thousands of mRNA mixtures, each about 3,000 base pairs in length, in order to measure the amount (or number) of each mRNA in the mRNA mixture thus obtained. After amplification by PCR, a method of separating and confirming by electrophoresis is used. A typical method using the same is differential display reverse transcription PCR (DD-RT PCR), and one example of the primers used therein has the following structure.
상기 프라이머의 5' 말단 부위의 AAGCTT는 제한효소 HindIII가 인식할 수 있는 염기서열이며, 3' 말단 부위의 7개의 염기쌍(GATTGCC-3')은 주형에 혼성화되어 PCR이 진행되는 염기서열이다.AAGCTT at the 5 'end of the primer is a nucleotide sequence that can be recognized by restriction enzyme HindIII, and 7 base pairs (GATTGCC-3') at the 3 'end are hybridized to the template to proceed with PCR.
그러나, 상기 DD-RT PCR에 사용되는 프라이머의 가장 큰 단점은 혼성화에 참여하는 염기의 수가 적으므로, 낮은 온도에서 혼성화 반응이 진행되어야 하므로, 따라서 PCR의 재현성이 떨어지고, PCR 산물의 수가 많아지게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 길이가 긴 프라이머가 사용될 경우에는 PCR 생성물의 갯수가 급속히 감소한다는 점이다.However, the biggest disadvantage of the primer used in the DD-RT PCR is that the number of bases participating in the hybridization is small, so that the hybridization reaction should proceed at a low temperature, thus reducing the reproducibility of the PCR and increasing the number of PCR products. . In order to solve this problem, when a long primer is used, the number of PCR products decreases rapidly.
최근에는 서로 상이한 염기서열을 갖는 다수의 프라이머로 구성되는 멀티플렉스 프라이머를 사용하여 DNA 또는 전체 mRNA를 분석하는 방법이 개발되었다. 멀티플렉스 프라이머란 중합효소연쇄반응시에는 한 반응에 동시에 사용되는 두 개 이상의 서로 다른 프라이머 조합물, 핵산합성반응시에는 하나 이상 사용되는 서로 다른 프라이머의 조합물을 의미한다. 즉, 멀티플렉스 프라이머를 사용하면 각각의 프라이머로 반응하는 개별적인 서로 다른 두 개의 반응을 하나의 시험관에서 수행하는 것과 동일한 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 하나의 프라이머로 반응시켰을 경우보다 PCR 생성물의 수를 증가시킬 수 있다.Recently, a method of analyzing DNA or total mRNA using multiplex primers composed of a plurality of primers having different nucleotide sequences from each other has been developed. The multiplex primer refers to a combination of two or more different primers used simultaneously in one reaction in a polymerase chain reaction and one or more different primers used in a nucleic acid synthesis reaction. In other words, using multiplex primers not only has the same effect as performing two separate reactions with each primer in one in vitro, but also increases the number of PCR products than when reacted with one primer. You can.
그러나, 종래의 멀티플렉스 프라이머는 사용되는 서로 다른 프라이머 사이에 혼성화될 수 있다는 단점이 있었다. 즉, 일반적으로 PCR 또는 핵산합성반응에 사용되는 프라이머의 몰 수는 주형에 비하여 훨씬 많이 첨가되므로, 만일 멀티플렉스프라이버들 사이에 혼성화가 일어나면, 주형과 정상적으로 혼성화되는 프라이머의 양이 감소하여 결국 PCR반응의 생성물의 수는 즐어들게 된다.However, conventional multiplex primers have the disadvantage that they can hybridize between different primers used. That is, since the molar number of primers generally used for PCR or nucleic acid synthesis reaction is much higher than that of the template, if hybridization occurs between the multiplex primers, the amount of primers that normally hybridize with the template decreases, resulting in a PCR reaction. The number of products of is enjoyed.
따라서, 당업계에서는 DNA 또는 전체 mRNA의 발현 양상을 연구할 경우, PCR을 통한 생성물의 갯수가 적절한 수로 얻어질 수 있도록 늘림과 동시에, 높은 혼성화 온도에서 PCR을 진행시켜 재현성이 우수한 멀티플렉스 프라이머의 개발이 요구되어 왔다.Therefore, in the art, when the expression pattern of DNA or total mRNA is studied, the number of products through PCR is increased to obtain an appropriate number, and at the same time, the PCR is performed at a high hybridization temperature to develop a highly reproducible multiplex primer. This has been required.
따라서, 본 발명의 목적은 DNA 또는 전체 mRNA를 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 경우, 중합효소연쇄반응의 재현성을 높임과 동시에 반응 생성물의 갯수를 늘릴 수 있는 멀티플렉스 프라이머를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a multiplex primer that can increase the number of reaction products while increasing the reproducibility of the polymerase chain reaction when amplifying DNA or whole mRNA by the polymerase chain reaction.
도 1은 본 발명의 멀티플렉스 프라이머의 염기서열의 예로서, a는 8+4 구조의 멀티플렉스 프라이머, b는 8+5 구조의 멀티플렉스 프라이머 그리고 c는 9+4 구조의 멀티플렉스 프라이머의 예(여기에서 N은 동일한 세트에 대해서는 정해진 임의의 염기, S는 구아닌 또는 시토신, W는 아데닌 또는 티민을 뜻한다)이다.1 is an example of the nucleotide sequence of the multiplex primer of the present invention, a is an 8x4 multiplex primer, b is an 8 + 5 multiplex primer and c is a 9x4 multiplex primer example Where N is any base defined for the same set, S is guanine or cytosine, and W is adenine or thymine.
도 2는 올리고-dT를 이용하여 역전사 반응 후 본 발명의 멀티플렉스 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응시킨 후 전기영동한 결과이다.Figure 2 is a result of electrophoresis after the polymerase chain reaction using the multiplex primer of the present invention after reverse transcription using oligo-dT.
도 3은 본 발명의 멀티플렉스 프라이머만을 이용하여 역전사 및 중합효소연쇄반응 수행 후 전기영동한 결과이다.Figure 3 shows the results of electrophoresis after reverse transcription and polymerase chain reaction using only the multiplex primer of the present invention.
상기 본 발명의 목적은 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트를 이루는 각 프라이머의 특정 위치가 동일한 종류의 염기로 이루어지는 멀티플렉스 프라이머를 제공함으로써 달성된다.The object of the present invention is achieved by providing multiplex primers in which specific positions of each primer constituting one multiplex primer set are composed of the same kind of base.
본 발명의 멀티플렉스 프라이머는 서로 다른 염기서열을 갖는 여러개의 프라이머의 혼합물로 구성되고, 각 프라이머를 이루는 염기서열의 길이는 11염기쌍(base pair, bp) 이상이며, 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트내의 모든 프라이머는 동일한 길이의 염기쌍으로 이루어져 있다.The multiplex primer of the present invention is composed of a mixture of several primers having different nucleotide sequences, and the base sequence constituting each primer is 11 base pairs (bp) or more in length, and all in one multiplex primer set. Primers consist of base pairs of equal length.
본 발명의 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트를 구성하는 각 프라이머간의 혼성화를 방지하기 위하여 각 프라이머상의 특정 염기서열의 위치는 동일한 종류의 염기로 이루어져 있으며, 나머지 염기들은 각 프라이머마다 서로 다른 염기를 가진다.In order to prevent hybridization between each primer constituting one multiplex primer set of the present invention, the position of a specific base sequence on each primer is composed of the same type of base, and the remaining bases have different bases for each primer.
또한, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머를 구성하는 각 프라이머는 서로 유사한 혼성화 온도를 가지도록 하기 위하여 한 세트내의 각 프라이머의 GC 함량, 즉 구아닌 및 시토신의 함량이 동일하다.In addition, each primer constituting the multiplex primer of the present invention has the same GC content, that is, the content of guanine and cytosine in each set in order to have a similar hybridization temperature.
본 발명의 멀티플렉스 프라이머를 구성하는 각 프라이머를 이루는 염기서열의 수는 11개 이상이며, 바람직하게는 11 내지 20이다.The number of base sequences constituting each primer constituting the multiplex primer of the present invention is 11 or more, preferably 11 to 20.
본 발명의 한 세트의 멀티플렉스 프라이머는 다음의 예와 같은 형태를 가지게 된다.One set of multiplex primers of the present invention will have the form as in the following example.
여기에서 N은 4가지 염기 중 어느 하나의 종류를 특정하는 것이고, S는 구아닌 또는 시토신, W는 아데닌 또는 티민을 의미한다.Here, N specifies any one of four bases, S means guanine or cytosine, and W means adenine or thymine.
상기 염기서열을 갖는 멀티플렉스 프라이머는 본 발명의 하나의 예에 불과하며, 프라이머의 전체 길이와 S와 W의 개수 및 위치가 다양한 형태로 제작될 수 있다.The multiplex primer having the nucleotide sequence is only one example of the present invention, and the total length of the primer and the number and positions of the S and W may be prepared in various forms.
상기 염기서열을 갖는 멀티플렉스 프라이머는 실제로 16가지 서로 다른 프라이머의 혼합물로서, 예를들면 5'-GCWGASCTSSNN으로 나타낼수 있고, 다음에 16가지의 프라이머를 나타내었다.The multiplex primer having the base sequence is actually a mixture of 16 different primers, for example represented by 5'-GCWGASCTSSNN, followed by 16 primers.
상기 염기서열을 갖는 프라이머들은 DNA 화학합성장치를 통하여 서로 다른 뉴클레오티드들을 혼합하여 얻을 수 있고, 각 프라이머를 별도로 합성을 한 후에 혼합시켜 얻을 수도 있다.Primers having the nucleotide sequence may be obtained by mixing different nucleotides through a DNA chemical synthesizer, may be obtained by mixing each primer separately after synthesis.
한편, 중합효소연쇄반응 결과 얻어지는 생성물의 수를 더욱 늘리기 위해서는, 실험 대상이 되는 생물체의 이미 알려진 DNA 염기서열을 조사하여 가급적 높은 확률로 나타나는 염기서열을 본 발명의 멀티플렉스 프라이머에 적용하는 것이 가능하다.On the other hand, in order to further increase the number of products obtained as a result of the polymerase chain reaction, it is possible to examine the known DNA sequences of the organisms to be tested and apply the nucleotide sequences appearing at the highest possible probability to the multiplex primer of the present invention. .
본 발명의 멀티플렉스 프라이머와 기존에 알려진 염기서열에서 얻은 정보를 적용한 멀티플렉스 프라이머를 이용하여 주형에 혼성화될 수 있는 확률을 높여주는 방법은 하나의 생물체가 가진 DNA 또는 전체 mRNA의 종류와 그들의 양의 측정에 사용할 수 있는 매우 효과적인 방법이 될 수 있음을 실제로 증명한 예가 아래의 실시예로 제시되었다. 즉, 이 두 가지가 서로 상승작용을 하여 재현성이 매우 높고 적절한 수의 생성물을 수득하는 효과를 달성한다.The method of increasing the probability of hybridization to a template using the multiplex primer of the present invention and the multiplex primer applied with information obtained from a known base sequence is based on the type and amount of DNA or total mRNA of one organism. In the following examples are given examples which actually proved to be very effective methods for the measurement. That is, the two synergize with each other to achieve the effect of obtaining a very high reproducibility and an appropriate number of products.
실시예Example
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더 설명하나, 본 발명은 여기에 한정되는 것은 아니다.The present invention is further described through the following examples, but the present invention is not limited thereto.
＜실시예 1＞<Example 1>
올리고-dT를 이용한 역전사 반응 후 본 발명의 멀티플렉스 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응Polymerase chain reaction using multiplex primer of the present invention after reverse transcription using oligo-dT
1) 올리고-dT를 이용한 역전사 반응1) Reverse Transcription Using Oligo-dT
생체 시료에서 전체 RNA를 분리해낸 다음, 약 1μg을 역전사 반응에 사용하였다. 여기에 올리고-dT(길이는 각각 13, 15, 17개의 염기)를 20pmole, RNase 저해제 10unit, MMLV RTase 20unit을 50mM Tris-HCI(pH 8.3), 7mM MgCI2, 40mM KCI, 10mM DTT, 0.1 mg/ml BSA, 250μM의 dNTP가 든 반응 완충용액 안에 넣고 역전사반응을 실시하였다. 여기서 사용된 올리고-dT는 다음과 같았다.Total RNA was isolated from the biological sample and about 1 μg was used for reverse transcription. Here oligo-dT (13, 15, 17 bases in length) is 20 pmole, RNase inhibitor 10 units, MMLV RTase 20 units are 50 mM Tris-HCI (pH 8.3), 7 mM MgCI 2 , 40 mM KCI, 10 mM DTT, 0.1 mg / Into the reaction buffer containing ml BSA, 250μM dNTP was carried out reverse transcription. Oligo-dT used here was as follows.
반응은 RNA의 이차구조를 풀어주기 위해 57℃에서 약 10분간 변성과정을 거치며, 역전사 반응은 42℃에서 약 1시간동안 실시하였다. 이후 역전사효소의 활성을 없애주기 위해 94℃에서 5분간 반응시켰다. 전체 반응액의 부피는 20㎕로 실시하였다.The reaction was denatured at 57 ° C. for 10 minutes to release the secondary structure of RNA, and reverse transcription was carried out at 42 ° C. for about 1 hour. After 5 minutes at 94 ℃ to eliminate the reverse transcriptase activity. The volume of the whole reaction solution was carried out at 20 μl.
2) 본 발명의 멀티플렉스 프라이머를 이용한 중합효소연쇄 반응2) polymerase chain reaction using the multiplex primer of the present invention
역전사 과정을 마친 용액을 2㎕취하여, 새 시험관에 옮기고 여기에 본 발명의 멀티플렉스 프라이며 중에서 선택된 한 세트 20 pmole과 1unit의 Taq DNA 폴리머라제, 각 25μM의 NTP, 40mM KCl, 1.5mM MgCl2, 10mM Tris-HCl(pH 9.0), 250μM의 dNTP를 첨가하여 전체 반응부피를 20㎕로 하였다. 사용된 본 발명에 따른 각 멀티플렉스 프라이머 세트의 염기서열은 다음과 같았다.2 μl of the solution that has undergone reverse transcription was transferred to a new test tube, to which a set of 20 pmoles and 1 unit of Taq DNA polymerase selected from the multiplex plastics of the present invention, each 25 μM of NTP, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-HCl (pH 9.0) and 250 µM of dNTP were added to make the total reaction volume 20 µl. The base sequence of each multiplex primer set according to the present invention was as follows.
중합효소연쇄반응 과정은 94℃에서 5분간 변성과정을 거친 후, 94℃ 1분, 46℃ 1분, 72℃ 1분의 과정을 1단위로 30번 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 중합반응을 시켜주었다. 이 결과로 생성된 중합효소연쇄반응 산물은 8M 우레아가 든 6% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하였다.After the polymerase chain reaction was denatured at 94 ° C. for 5 minutes, the process of 94 ° C. 1 minute, 46 ° C. 1 minute, and 72 ° C. 1 minute was repeated 30 times in 1 unit. After the polymerization was carried out for 10 minutes at 72 ℃. The resulting polymerase chain reaction product was electrophoresed on 6% polyacrylamide gel with 8M urea.
3) 은염색법을 이용한 중합효소연쇄반응 산물의 확인3) Identification of polymerase chain reaction products using silver staining
상기 전기영동된 폴리아크릴아미드 젤을 고정액(10% 아세트산)이 든 용액에서 30분간 반응시켰다. 그 다음 이온이 제거된 증류수에 젤을 3번 씻어주었다. 이 젤을 1g AgNO3과 1.5ml 37% 포름알데하이드가 든 1L 용액에서 30분간 염색시켰다. 염색된 젤을 5초간 이온이 제거된 증류수에서 씻어준 후, 4℃로 맞추어진현상액(40g 탄산나트륨, 1.5ml 37% 포름알데하이드, 200㎕ 소듐 티오설페이트(10mg/ml)가 넣어진 1L 용액)에서 염색한 후, 다시 고정액으로 5분간 반응시키고 증류수로 10분간 씻어서 보관하였다. 그 결과를 도 2에 제시하였다. 여기서 RAS 표시는 RAS 암유발 유전자의 발현 유무를 뜻하며, 우측상단의 9/22는 실험이 수행된 날짜를 의미한다.The electrophoretic polyacrylamide gel was reacted for 30 minutes in a solution containing a fixed solution (10% acetic acid). Then, the gel was washed three times in deionized water. The gel was stained for 30 minutes in a 1 L solution containing 1 g AgNO 3 and 1.5 ml 37% formaldehyde. The stained gel was washed in deionized water for 5 seconds in deionized water, and then in a developing solution adjusted to 4 ° C. (40 L sodium carbonate, 1.5 ml 37% formaldehyde, 1 L solution containing 200 μl sodium thiosulfate (10 mg / ml)). After dyeing, the mixture was reacted with a fixed solution for 5 minutes and washed with distilled water for 10 minutes. The results are shown in FIG. Here, the RAS mark means the presence or absence of the expression of RAS cancer-causing genes, and 9/22 in the upper right corner indicates the date of the experiment.
＜실시예 2＞<Example 2>
본 발명의 멀티플렉스 프라이머를 이용한 역전사 및 중합효소연쇄반응Reverse transcription and polymerase chain reaction using the multiplex primer of the present invention
1) 본 발명의 멀티플렉스 프라이머를 이용한 역전사 반응1) Reverse transcription reaction using the multiplex primer of the present invention
생체 시료에서 전체 RNA를 분리해낸 다음, 약 1μ g을 역전사 반응에 넣어주었다. 여기에 실시예 1에서 제시된 본 발명의 멀티플렉스 프라이머중에서 선택한 한 세트 프라이머(3번, 4번, 5번 세트) 20pmole, RNase 저해제 10unit, MMLV RTase 20unit, 50mM Tris-HCI(pH 8.3), 7mM MgCl2, 40mM KCl, 10mM DTT, 0.1 mg/ml BSA, 250μM의 dNTP가 든 반응 완충용액 안에 넣고 역전사반응을 실시하였다. 이때 반응은 RNA의 이차구조를 풀어주기 위해 57℃에서 약 10분간 변성과정을 거치며, 역전사 반응은 42℃에서 약 1시간동안 실시하였다. 이후 역전사 효소의 활성을 없애주기 위해 94℃에서 5분간 반응시켰다. 전체 반응액의 부피는 20㎕로 실시하였다.Total RNA was isolated from the biological sample and about 1 μg was added to the reverse transcription reaction. 20 pmole, RNase inhibitor 10 unit, MMLV RTase 20 unit, 50 mM Tris-HCI (pH 8.3), 7 mM MgCl 2 , 40mM KCl, 10mM DTT, 0.1 mg / ml BSA, 250μM in a reaction buffer containing dNTP was carried out reverse transcription reaction. At this time, the reaction is denatured at 57 ℃ for 10 minutes to solve the secondary structure of the RNA, reverse transcription was carried out at 42 ℃ for about 1 hour. After 5 minutes at 94 ℃ to remove the reverse transcriptase activity. The volume of the whole reaction solution was carried out at 20 μl.
2) 본 발명의 멀티플렉스 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응2) polymerase chain reaction using the multiplex primer of the present invention
역전사 과정을 마친 용액을 2㎕ 취하여, 새 시험관에 옮기고 여기에 상기 역전사 반응에서와 동일한 세트의 멀티플렉스 프라이머 20pmole과 1unit의 Taq DNA폴리머라제, 각 250μM의 dNTP, 40mM KCl, 1.5mM MgCl2, 10mM Tris-HCl(pH 9.0)를 첨가하여 전체 반응부피를 20㎕로 하였다. 중합효소연쇄반응 과정은 94℃에서 5분간 변성과정을 거친 후, 94℃ 1분, 46℃ 1분, 72℃ 1분의 과정을 1단위로 30번 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 중합반응을 시켜주었다. 이 같은 중합효소연쇄반응 산물을 8M 우레아가 든 6% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하였다.Take 2 μl of the solution after the reverse transcription process, transfer to a new test tube, and the same set of multiplex primer 20 pmole and 1 unit of Taq DNA polymerase, 250 μM dNTP, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-HCl (pH 9.0) was added to make the total reaction volume 20 ㎕. After the polymerase chain reaction was denatured at 94 ° C. for 5 minutes, the process of 94 ° C. 1 minute, 46 ° C. 1 minute, and 72 ° C. 1 minute was repeated 30 times in 1 unit. After the polymerization was carried out for 10 minutes at 72 ℃. This polymerase chain reaction product was electrophoresed on 6% polyacrylamide gel with 8M urea.
3) 은염색법을 이용한 중합효소연쇄반응 산물의 확인3) Identification of polymerase chain reaction products using silver staining
상기 실시예 1의 3)과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과를 도 3에 제시하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 실시예 1에 기술된 것과 같은 번호에 대해서는 동일하였다. +와 -표시는 실시예 1에서와 같이 RAS 암유발 유전자의 발현 유무를 뜻하며, M은 사이즈 마커를 의미하였다.It was carried out in the same manner as in Example 3 3). The results are shown in FIG. The base sequences of the primers used were identical for the same numbers as described in Example 1. + And-marks indicate the presence or absence of the expression of RAS cancer-causing genes, as in Example 1, M was the size marker.
본 발명의 멀티플렉스 프라이머는 생물체가 가진 DNA 또는 전체 mRNA를 중합효소연쇄반응을 통하여 증폭시킬 때, 반응의 재현성을 높일 수 있는 동시에 생성되는 산물의 수를 늘릴 수 있다. 즉, 11개 염기쌍 이상의 길이를 갖는 본 발명의 프라이머들을 서로 혼합하여 사용함으로써, 주형과 프라이머를 높은 온도에서 혼성화를 시킬 수 있으므로 재현성을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 반응생성물의 수도 적절한 수가 얻어질 수 있다. 또한, 각 프라이머를 이루는 염기서열의 특정 위치에 동일한 염기를 포함하고 있으므로 PCR 반응시 각 프라이머간의 혼성화를 방지할 수 있다.The multiplex primer of the present invention can increase the reproducibility of the reaction when amplifying DNA or whole mRNA of the organism through a polymerase chain reaction and increase the number of products generated at the same time. That is, by using the primers of the present invention having a length of 11 base pairs or more mixed with each other, the template and the primer can be hybridized at a high temperature, thereby increasing the reproducibility and the appropriate number of reaction products can be obtained. . In addition, since the same base is included at a specific position of the base sequence constituting each primer, hybridization between the primers can be prevented during the PCR reaction.
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- 1998-10-07 KR KR10-1998-0041904A patent/KR100458505B1/en not_active IP Right Cessation
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