KR100453096B1 - 헤지호그-유래의신규한폴리펩티드 - Google Patents

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더 존스 홉킨스 유니버시티 스쿨 오브 메디신
유니버시티 오브 워싱톤
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Abstract

본 발명은 각각 헤지호그의 "N" 및 "C" 단편 또는 N-말단 및 C-말단 단편이라 칭하는 신규한 두 개의 폴리펩티드를 제공하는 것에 관한 것이다. 상기 두 개의 신규한 폴리펩티드는 천연 단백질내의 자가 단백질 분해 영역에 의해 인식되는 G↓CF 위치에서의 특이성 분해후에 유도된다. 또한, 본 발명은 상기 N 및 C 단편의 사용방법을 제공한다.

Description

헤지호그-유래의 신규한 폴리펩티드
본 발명은 일반적으로 단백질 처리 및 단백질 신호 전달 경로 분야에 관한 것이고, 구체적으로 공통적인 헤지호그(hedgehog) 단백질 전구물질에서 유래되는 독특한 활성을 지닌 2가지 신규 단백질에 관한 것이다.
발생학자들은 척추동물의 배아내 특정 구조체가 주위 조직에 대해 패턴을 부여하는 놀라운 작용을 나타내는 실험적 조작을 오랜동안 수행해왔다. 이러한 패턴화 효과를 나타내는 기작에 대한 고찰은 일반적으로 패턴화되는 조직으로부터 적절한 반응을 유도하는 신호 전달 분자의 분비에 촛점을 두고 있다. 이러한 신호 전달 분자를 동정하는 것을 목적으로 하는 보다 최근 연구는 소수의 유전자류를 구성하는 개개의 군에 의해 암호된 분비형 단백질과 연루되어 있다. 이러한 패턴화 활성에 유력한 영향을 미칠 수 있는 하나의 단백질류는 헤지호그 유전자류에 의해 암호된 단백질이다.
헤지호그(hh) 유전자는 드로소필라(초파리) 내에서의 정상적인 분절 패턴화에 필요하다는 발견에 입각하여 처음 규명되었다[참조: Nusslein-Volhard, C. & Wieschaus, E, Nature 287:795-801(1980)]. 이 유전자의 기능은 초기 배 분절내의 인접 세포드들의 동질화[참조: Hooper, J.E., & Scott, M.P.Early Embryonic Development of Animals, pp.1-48 (1992)] 및 많은 세포 직경을 따라 전개되는 각피 패턴화의 이후의 기능[참조: Heernskerk,J.& DiNardo, S., Cell, 76:449-460 (1994)]을 통합시키는 국소 신호 전달 기능을 포함한다. 또한 hh 유전자는 부속기관 및 눈을 비롯한 성숙한 구조들의 성체 전구물질을 패턴화하는 작용을 한다[참조: Mohler, J. Genetics, 120:1061-1072 (1988); Ma등, Cell, 75:927-938 (1993); Heberlein등, Cell, 75:913-926 (1993); Tabata, T. & Kornberg, T.D., Cell, 76:89-102 (1992); Basler, K. & struhl, G., Nature, 368:208-214 (1994)]. 또한 헤지호그 단백질이 분비되어 세포외 신호 전달에 작용을 한다는 유전자적 및 분자적 증거가 제시되었다[참조: Mohler, J. 상기 문헌 참조; Lee 등, Cell, 71:33-50 (1992); Taylor 등, Mech.Dev., 42:89-96 (1993)].
척추동물내에서 hh 상동체에 의해 암호되는 활성들은 사지의 전엽/후엽 패턴화[참조: Riddle 등, Cell, 75:1401-1416 (1993): Chang 등, Development, 120:3339 (1994)], 및 신경관의 배측/복측 패턴화[참조: Echelard 등, Cell, 75:1417-1430 (1993); Krauss 등, Cell, 75:1431-1444 (1993); Roelink 등, Cell, 76:761-775 (1994)]에 연루되어 있다.
척추동물의 복측 중뇌는 변성 또는 이상 기능시 파킨슨병 및 정신분열증을 비롯한 많은 질병과 연관된 신경원을 함유한다. 운동 신경원은 복측 중뇌의 바닥판(floor plate)에 근접한 부위에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 선조체로의 중뇌 돌기는 수의 운동의 조절에 관여하고[참조: Bjorklund and Lindvall, In: Handbook of Chemical Neuroanatomy, eds., Borklund, et al., Amsterdam: Elsevier, pp55-122, 1984), 이러한 신경원의 상실은 파킨슨병의 운동 질환을 산출한다(Hirsch, et al., Nature, 334:345 (1988)]. 사지 구조체 및 피질에 신경을 분포시키는 중뇌 도파민 작용성 신경원은 각각 정동 행위 및 인식 행위에 영향을 미치고 이러한 신경원의 비정상적인 기능은 정신분열증 및 약물중독과 관련된다[참조: Seeman 등, Nature, 365:441 (1993)].
신경원 세포 운명을 특정하는 인자들의 분자적 본성에 대해서는 아직 확정된 것은 없지만, 변형 성장 인자-β(TGF-β)군[참조: Lyons 등, Trends in Genetics, 7:408 (1991)] 또는 헤지호그 단백질류[참조: Smith, J.C., Cell, 76:193 (1994)]의 성분들은 세포 운명의 특정화에 관여하여 조직간 유도적 상호작용을 매개하고, 대부분의 경우 단지 몇몇 세포 직경의 일정 거리에서 작용할 때 상기 인자들로부터 예상되는 특징들을 가질 수 있다.
본 발명은 hh 유전자에 의해 암호된 hh 활성이 눈 발생의 초기 패턴화 및 뇌 패턴화에 중요한 역할을 한다는 것을 입증한 것이다. 먼저, 본 발명은 헤지호그 단백질 생성물의 내부 절단이 완전한 기능에 중요하고, 이러한 자가-단백분해성 절단된 2가지 신규 생성물은 각각 뚜렷한 활성을 나타내고, 이에 따라 hh 신호 전달 활성이 공통적인 hh 단백질 전구물질로부터 유래되는 2개의 분리된 신호 전달 단백질의 복합 효과임을 증명한다. 이와 같이 하므로써, 본 발명은 신경원 변성 또는 이상 기능으로부터 발생하는 질환을 다루기 위한 바람직한 신경원 세포 종류의 증식과 특이적인 패턴화 수단을 제공한다.
도 1은 아미노(Ab1) 및 카르복시-말단(Ab2) 에피토프들에 대한 항체와의 면역블롯(A, C)으로 hh 단백질의 처리를 도시한 것이다. 도 1(B) 및 도 1(D)는 Ab1(B, 레인 7-9), Ab2(D, 레인 19-21), 또는 전면역 혈청(B, 레인 10-12 및 D, 레인 22-24)으로 면역침전시킨 샘플의 블롯이다.
도 1(E)는 헤지호그 절단 기작의 모식도를 도시한 것이다.
도 2는 hh 단백질과 세린 프로테아제간의 서열 유사성을 나타낸 것이다. 디. 멜라노가스터 단백질의 잔기 323 내지 329에 hh 단백질 서열을 정렬시키고, 위치 1 내지 7로서 번호를 매겼다(그룹 A). 포유류 세린 단백분해효소의 촉매적 히스티딘(그룹 B)은 hh 단백질내 위치 7에 존재하는 불변성 히스티딘에 정렬되어 있다.
도 3은 hh 단백질의 자가 단백질 분해작용을 도시한 것이다. 도 3(A)는 이.콜리 유래의 His6-U 및 His6-UH329A 단백질의 생산과 정제를 나타내는 쿠마시 블루 염색한 폴리아크릴아미드 겔을 도시한 것이다. 샘플은 분자량 표지인자(레인 1 및 2); IPTG 유도성(레인 3) 및 비유도성(레인 4) His6-U 발현 작제물을 운반하는 이.콜리 세포의 용균물; 정제된 His6-U 단백질(레인 5); IPTG 유도성(레인 6) 및 비유도성(레인 7) His6-HH329A 발현 작제물을 운반하는 이.콜리 세포의 용균물; 정제된 His6-UH329A 단백질(레인 8)이다. 도 3(B)는 hh을 발현하도록 유도된 형질감염된 S2 세포(레인 1); 절단 반응 완충액중에서 0시간 동안(레인 2 및 5), 20시간 동안(레인 3 및 6) 및 20mM TAME(세린 프로테아제 억제인자) 존재하에 20시간 동안(레인 4 및 7) 항온처리한 His6-U 및 His6-UH329A 단백질을 Ab2로 검출한 면역블롯이다.
도 4는 야생형 및 돌연변이 hh 단백질을 시험관내 해독시켜 카르복시 말단 단편에 대한 드로소필라(4A-C) 및 제브라피쉬(D) hh 단백질 지도의 자가 단백질 분해 기능을 도시한 것이다. 이 단백질내의 돌연변이 및 절단 부위(화살표)의 위치는 도 4(E)에 모식적으로 예시하고 있다.
도 5는 드로소필라 배(A) 및 (B)내에 존재하는 야생형 및 H329A 변이 hh 단백질의 열충격 유도된 발현을 나타내기 위해 각각 Ab1 및 Ab2 항체를 사용하여 발색시킨 면역블롯이다. 레인 1 및 6, 유도된 형질감염되지 않은 S2 세포; hh를 발현하도록 유도된 형질감염된 S2 세포; 레인 3 및 8, 열충격된 야생형 배; 레인 4 및 9, 열충격된 hshh 배; 레인 5 및 10, 열충격된 hshh H329A 배.
도 6은 편재적으로 발현되는 야생형 및 H329A hh 단백질의 배 효과를 나타내는 동일계내 하이브리드화를 도시한 것이다. 도 6은 (A) 야생형(동형접합형 y1w1118), (B) hshh, 및 (C) 90분간의 회복기간을 두고 10분간의 열충격에 2회 노출시킨 hshh H329A 배중에서 나타나는 동위치 하이브리드화로 밝혀진 바와 같은 윙리스(wg) RNA의 배내 분포를 도시한 것이다(33). 야생형 배는 wg 발현에 거의 변화를 나타내지 않은 반면, 야생형 단백질과 이보다 적은 정도이지만 H329A 단백질도 각각 전위성 wg 발현을 유도하였다(표 1). 패널(D), (E) 및 (F)는 제 4의 복부 분절의 수준에서 각각 y1w1118, hshh 및 hshh H329A 유충의 복측 표면을 도시한 것이다. 이 유충을 배 상태일때 30분동안 열충격시켜 완전한 배형성이 일어나도록 하였다. 각피 세포 유형(1°, 2°, 3°및 4°)를 도시한 바와 같이 표시하였다[참조: J.Heemskerk and S. Dinardo, Cell 76, 449 (1994)]. hshh H329A 배(F)의 표현형이 대조용 배(D)의 표현형과 동일한 조건하에서 3°대신에 2°세포 유형(나출된 각피) 및 일부 4° 세포 유형이 팽창됨을 주목하라.
도 7은 편재적인 야생형 및 H329 hh 단백질의 성체 디스크 효과를 나타내는 X-gal 염색법을 도시한 것이다. 이 X-gal 염색법은 wg-lacZ 또는 dpp-lacZ 리포터 유전자를 운반하는 후기 제3-영충기 유충의 성체 디스크에서 wg(A-C) 또는 dpp(D-L)의 발현을 추적하는데 사용하였다. 대조군 유충(A, D, G, J), hshh 돌연변이 유전자(B, E, H, K)를 운반하는 유충 및 hshh H329A 돌연변이 유전자(C, F, I, L)를 운반하는 유충으로부터 유래하는 다리(A-F), 날개(G-I) 및 눈-촉각 디스크(J-L)를 나타낸 것이다. 모든 패널에서 앞면이 왼쪽을 향하고 있다.
도 8(A) 및 (B)는 HH 단백질을 발현하는 형질감염된 S2 세포 배양물 유래의 세포 펠렛(레인 1) 및 상청액(레인)을 Ab1(A) 및 Ab2(B)로 발색시킨 면역블롯이다. 각 레인중의 샘플은 동일한 부피의 재현탁시킨 총 배양물로부터 수득한 것이다. N은 대부분 세포 펠릿에 결합되어 있는 반면(A에서 레인 1 및 2를 비교하라), C는 상청액에 거의 정량적으로 해리되었다(B에서 레인 1 및 2를 비교하라). U는 N 및 C간의 분할 특성을 나타낸 것이다(A 및 B). 도 8(C)는 미소체와 함께 시험관내 해독으로 발생한 다양한 HH 단백질 성분의 헤파린 결합 활성을 입증한 것이다. 샘플은 총 해독 혼합물(레인 1); 헤파린 아가로스 또는 아가로스(대조군) 비드와 항온처리한 후의 상청액(레인 2 및 레인 4); 및 세정한 후 헤파린 아가로스 또는 아가로스 비드로부터 용출시킨 물질(레인 3 및 5)이다. F, U, NSS 및 N 단편은 아가로스 비드가 아닌 헤파린 아가로스와 함께 항온처리한 반응액중에서는 소모되었고(레인 1에 대해 레인 2와 4를 비교), 따라서, 아가로스 비드가 아닌 헤파린 아가로스로부터 동일한 성분을 용출시킬 수 있다(레인 1와 레인 3 및 5를 비교).
도 9는 hh 전사체의 동위치 편재화로 배내에서의 N 및 C를 차등 편재화를 나타낸 것이다. 도 9(A)는 패널(B) 및 (C)에서 각각 Ab1 및 Ab2로 검출한 N 및 C 에피토프 분포성을 비교하여 도시한 것이다. N 및 C 에피토프는 각각 각 분절 단위의 약 1/3 및 1/2에 걸쳐 분포하나, 전사체는 각 단위의 약 1/4에만 제한됨을 주목하라. (D)에서, hh13E 대립유전자에 대해 동형접합성인 배내의 C 에피토프의 편재화는 Ab2를 사용하여 검측하였다. 손상된 자가 단백질 분해 활성을 나타내는 돌연변이체(명세서 참조)중에 있어서의 C 에피토프는 보다 제한적으로 편재화되고, 야생형의 N의 편재와 유사하였다. 동형접합성 hh13E 배는 이형접합성 모액으로부터 표지된 평형인자를 제거하므로써 확인되었다. 모든 배는 중간 단계 내지 후기 단계 9(신장된 배-밴드)에 있다.
도 10은 hh 단백질 작용의 이중 작용 모델 대 신호 중계를 도시한 것이다. 도 10(A)에서, hh 신호 전달의 장거리 효과는 제 2 신호 전달 분자(X)의 단거리 유도를 통해 간접적으로 수득된다. 이의 생화학적 성질과 제한된 조직 편재화를 근거로 할 때, N은 활성적인 단거리 신호를 나타내는 것으로 추정되는 반면, C의 역할은 N의 생물발생에 필요한 촉매적 기구를 공급하는데 한정될 것이다. 도 10(B)에서, hh의 장거리 및 단거리 신호 전달 기능은 U 전구물질의 내부 자가 단백질 분해작용에 의해 유도된 N 및 C 단백질에 의해 공급된다. N은 세포 합성 부위 부근에만 체류하여 단거리 신호 전달에 연루되어 있는 반면, C는 그 분포의 제한성이 보다 적어 장거리 신호 전달 기능을 발휘할 수 있을 것이다. 어떤 모델이든지간에, 자가단백질 분해 작용은 완전한 활성 신호 전달 단백질을 생성하는데 필요하다.
도 10(C) 및 도 10(D)는 야생형 구성물(C) 또는 C 영역이 결실된 구성물(D)로부터 합성된 N 단편의 면역블롯을 도시한 것이다.
도 11(A) 및 도 11(B)는 부분 인체 hh 클론에 있어서의 뉴클레오티드 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 12(A) 및 도 12(B)는 이.콜리중에서 생성하여 동형접합성으로 정제된 드로소필라 hh 단백질의 시험관내 절단 반응을 도시한 것이다. 도 12에서, 패널 A는 DTT 첨가에 의한 개시 후 절단반응의 시간 경과에 따른 과정을 도시한 것이다. 패널 B는 일정 시간동안(4 시간) 3 등급의 범위에 걸친 농도들의 항온처리 결과, 절단된 형태로의 전환정도에는 차이가 없다는 것을 나타낸 것이다. 패널 C는 절단된 단편 C의 아미노-말단 서열 결정한 결과 절단 부위 주위의 서열을 나타낸 것이다. 절단 부위는 화살표로 나타내고, C 단편을 에드만 분해법으로 서열결정한 실제 잔기는 밑줄친 것이다. 패널 C는 또한 모든 공지된 척추동물의 hh 서열과 피쉬 및 제노퍼스 유래의 공지되지 않은 서열 일부를 정렬시킨 것이다. 제시된 서열은 절단이 일어나는 드로소필라 hh의 영역에 상응하는 것으로, 절단 부위에 Gly-Cys-Phe 서열이 절대적으로 보존됨을 입증하고 있다. 패널 D는 주형으로서 hh 유전자를 사용하여 종래 실시예들에 기술된 바와 같은 시험관내 전사/해독 반응물을 장입한 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다. dhh는 드로소필라이고, twhh 및 zfshh는 제브라피쉬의 트위기-윙클(twiggy-winkle) 및 소닉(sonic) hh 유전자이며, mshh는 생쥐의 shh/Hgh-l/vhh-l 유전자이다. 패널 E는 C 단편을 에드만 분해시킨 결과 모든 단백질들에 있어서, 제 1 회에서만(모든 반응 횟수에서는 아님) 35S 계수치를 방출하였고, 이것은 모든 hh 단백질의 자가 단백질 분해 작용성 절단 부위가 패널 C의 강조된 Gly-Cys-Phe 서열의 중심을 구성하는 Cys 잔기의 아미노-말단 측에 대한 아미드 결합임을 나타내는 것이다.
도 13은 일문자 코드로 나타낸 예상되는 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 13(a)는 5개의 독특한 hh-유사 유전자에 공통적인 서열을 제브라피쉬 트위기-윙클의 상응하는 잔기와의 동일성을 나타내는 점선으로 표시하였다. 도 13(b)는 twhh 및 shh의 아미노산 서열을 병아리 및 마우스 유래의 소닉 lvhh-l류의 아미노산 서열과 정렬시킨 것이다. 모두 5개의 hh 유전자에 공통적인 아미노-말단 소수성 신장부는 어둡게 나타내었다. 별표(*)는 다양한 종 유래의 C 단편의 단백질 분해 영역과 관련된 불변 아미노산 잔기를 나타낸 것이다. 도 13(c)는 소수성 영역에 대해 카르복시-말단인 잔기들의 동일성 %를 도시한 것이다.
도 14는 제브라피쉬 배형성동안 twhh, shh 및 pax-2의 형질발현을 비교하여 나타낸 것이다.
도 15는 제브라피쉬 발생에 대한 전위성 hh의 효과를 나타낸 것이다. 야생형 제브라피쉬, 다니오 레리오(Danio rerio)(Ekkwill Waterlife Resources)를 28.5℃에서 유지시키고, 그 다음 일부 배를 실온에서 하룻밤동안 배양하였다. 제브라피쉬 배가 1 내지 8의 세포 단계일 때, twhh, shh 또는 lacZ RNA를 주입하고 28시간 경과 후 발생에 대해 조사하였다. (A-C) 중뇌-후뇌 영역의 배측면도; 앞부분이 왼쪽이다. (A) lacZ. (B)twhh. (C)shh. (D-F) 전뇌 영역의 전부 시각부; 앞부분은 위쪽이다. (D) lacZ. (H) twhh. (F) shh. (G-L) 시각부위 측면도; 앞부분이 왼쪽이다. (G) lacZ. (H) twhh. (I) twhh.
도 16은 제브라피쉬 배 발생시 shh, twhh 및 twhh 변이체의 전위성 발현 효과를 나타내는 표이다.
도 17은 제브라피쉬 트위기-윙클 헤지호그 유도체를 나타낸 것이다. 도17(A)는 다양한 twhh 개방 해독틀의 모식도. SS(어두운 부분)는 각 개방 해독틀의 처음 27개 아미노산을 포함하고 상기 단백질의 분비에 필요한 예상되는 N-말단 신호 서열이다. 화살표는 자가 단백질 분해 절단의 예상되는 내부 부위를 나타낸 것이다. 아미노산 잔기번호는 도13(B)에 따른 것이다. 검은 삼각형은 twhh 개방 해독틀의 정상적인 종결 코돈을 나타내는 것이다. 구성물 UHA는 자가 단백질 분해작용을 차단하는 돌연변이를 포함한다(잔기 273에 있는 히스티딘이 알라닌으로 변화됨; 참조 Lee,J.J.등, 상기 문헌 참조). 구성물 U356HA는 UHA내의 H273A 돌연변이 뿐만 아니라 아미노산 잔기 357 대신에 종결 코돈을 포함한다. 작제물 N은 twhh의 처음 200개 아미노산만을 암호한다. 구성물 C는 삭제된 잔기 31-197의 코돈을 갖고 있다. 도 17(B)는 도 17(A)에서 모식적으로 도시한 형질발현 구성물의 시험관내 해독 결과를 나타낸 것이다. 작제물은 35S 메티오닌의 존재하에 시험관내에서 해독시켰고, 이를 SDS-PAGE 이후 자동방사능사진촬영하여 분석하였다.
도 18은 다양한 신경 표지인자들의 발현에 대한 헤지호그의 효과를 노던 블롯 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 자연발생적인 신경 표지인자(예, XAG-1, XANF-2, Otx-A, En-2, Krox-20, Xlh box-6, NCAM 및 EF-1α)에 의한 hh 상승작용을 도시한 것이다.
도 20은 다양한 신경 표지인자들에 대한 헤지호그 N 또는 C의 효과를 노던 블롯 분석한 것이다.
도 21은 RT-PCR 분석법으로 도시한 바와 같이, △N-C가 동물뇌관 외이식편내의 X-bhh 및 N-활성을 방해한다는 것을 나타낸 것이다.
상세한 설명
본 발명은 뚜렷한 구조적 및 작용적 특성을 지니는 단일 전구물질 단백질에서 유도된 두가지 신규한 폴리펩티드를 제공한다. 상기 단백질은 헤지호그 단백질에서 유도되며, 전체 길이의 헤지호그 단백질의 자가 단백질 분해성 절단으로 자연적으로 생성될 수 있다. 헤지호그 전구물질 단백질 및 헤지호그 전구물질 단백질의 자가 단백질 분해 생성물이 신경관 및 척삭의 복측 중앙선의 바닥판에서 형질발현되는 본 명세서에 제공된 증거를 기준으로 하면, 본 발명은 바닥판 및 척삭과 연결되거나 또는 이와 근접한 신경 세포의 증식 및 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
제 1 실시태양에 있어서, 본 발명은 헤지호그 단백질의 아미노 말단 아마노산으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하며, 이의 카르복시 말단에 천연 헤지호그 폴리펩티드의 카르복시 말단 단편의 단백분해 활성에 의해 특별하게 인지되는 글리신-시스테인-페닐알라닌(G↓CF) 절단을 포함하는 것을 특징으로 하는 거의 순수한 폴리펩티드를 제공한다. 상기 단편은 본 명세서에서 N-말단 단편 또는 폴리펩티드 또는 "N"으로 표기한다. 예를들면, 드로소필라 헤지호그의 경우, 헤지호그 단백질의 N 단편은 아미노산 1-257을 포함하며, 이때, 아미노산 85-257은 비환원성 SDS-PAGE 에 의한 분자량이 약 19kD 이다(아미노산 잔기 번호 1-257이 신호 서열과 같이 비구조성 특징을 지님). 드로소필라 헤지호그 전구물질 단백질의 G↓CF 절단은 아미노산 잔기 257-259에서 발생한다. 당업자는 아미노산 위치가 유사하고, 상기 부위는 상응하는 C 단편의 자동단백분해 활성에 의해 특별하게 인식되기 때문에 다른 헤지호그 유전자에서의 G↓CF 절단을 식별할 수 있다.
또한, N-말단 폴리펩티드는 생체내 폴리펩티드를 형질발현하는 세포와 세포연결되며, 예를들면 척추동물 또는 드로소필라 세포 또는 배에 편재되어 있는 것을 특징으로 한다. 즉, 헤지호그의 N-말단 단편은 세포 합성 부위와 근접하게 된다. N 과 세포와의 결합은 아미노 말단 영역의 친유성 변형을 포함하는 처리의 결과이다(도 1 참조). 이러한 변형은 티오에스테르 중간물질을 생성하는 카르복시 말단 영역의 작용에 의해 개시되며; 그리하여 펩티드 결합이 궁극적으로 이러한 작용으로부터 유래하더라도, 카르복시 말단 영역은 단백분해효소로서 단순히 작용하지는 않는다. 또한, N 단편은 생체내에서 헤파린 아가로스에 결합한다.
본 발명의 N 폴리펩티드는 아미노산 1-257 이 비환원 SDS-PAGE 에 의한 약 19kD 의 분자량을 갖는 드로소필라의 1-257과 같은 헤지호그 단백질의 아미노 말단 아미노산에서 유도된 아미노산 서열을 특징으로 한다. N 폴리펩티드는 헤파린에 결합되는 전체 길이 N 의 작용성 특징을 지니는 작은 단편을 포함한다. N이 유도되는 헤지호그 단백질의 비제한적인 예로는 드로소필라, 제노퍼스, 닭, 제브라다니오, 쥐 및 사람이 있다. 결정학 분석에 의하면, SHH-N 구조는 아연 이온의 존재를 포함하는 것을 나타낸다. 특정 이론에 국한시키고자 하는 의도는 아니지만, 아연 이온의 존재는 아연 가수분해효소 활성을 암시한다. 아연 가수분해효소의 예로는 카르복시펩티다제 A 및 써모리신과 같은 단백분해효소, 포스포리파제 C 와 같은 지방분해효소 및 카본산 탈수효소와 같은 기타 효소가 있다. 아미노 말단 신호 전달 영역의 아연 가수분해효소에서의 변형은 헤지호그 단백질의 확산 범위를 변형시키거나 또는 아미노 말단 신호 전달 영역의 신호 전달 특성을 변형시키는데 유용할 수 있다. 예를들면, 아연 가수분해효소에서의 변성은 주로 단백질이 소정의 이격상태로 분비되는 속박된 단백질을 생성할 수 있다. 그 결과, 대개 유도되지 않는 세포형을 유도한다. 아연 부위에서의 변형은 바닥판이 아니라 운동 신경을 유도할 수 있는 분자를 또는 반대로 생성할 수 있다.
척삭 및 바닥판에 결합된 세포에서의 N 및 이의 형질발현의 세포 표면 또는 세포외 매트릭스 편재화를 인식하는 것은 예를들면, 척삭 샘플을 분리하거나 또는 평면판 세포를 분리하는 세포 형질발현 N 의 분리 또는 특정 선택 수단을 제공한다. 또한, N과 관련된 항체는 N 단백질을 형질발현시키는 것으로 생각되는 조직의 조직학적 분석에 유용하다.
또한, 본 발명은 헤지호그 단백질의 카르복시 말단 아미노산에서 유도된 아미노산 서열을 포함하며, 이의 아미노 말단에서 천연 헤지호그 폴리펩티드의 카르복시 말단 단편의 단백질 가수분해 활성에 의해 인식되는 G↓CF 절단을 포함하는 것을 특징으로 하는 거의 순수한 폴리펩티드를 제공한다. 상기 단편은 본 명세서에 C-말단 단편 또는 폴리펩티드 또는 "C"로 표기한다. 예를들면, 드로소필라에서, "C" 폴리펩티드는 아미노산 잔기 258에서 출발한 헤지호그 전구물질 단백질의 C 말단 영역에서 유도되며, 전체 길이의 C 말단 영역은 비환원성 SDS-PAGE 에 의한 약 25kD 의 분자량을 가지며, 72 위치에서 히스티딘 잔기를 포함하며 단백분해 활성을 갖는다. 천연 헤지호그 폴리펩티드의 카르복시 말단 단편의 단백분해 활성에 의해 인식되는 G↓CF 절단은 아미노산 잔기 257-259에 위치한다. N 단편에 대해 상기 기재된 바와같이, 본 발명은 헤지호그의 자가단백분해성 영역에 대한 인식 부위의 정확한 절단을 나타내며, 당업자는 다른 헤지호그 단백질에서의 절단 부위를 용이하게 식별할 수 있어서 임의의 헤지호그 전구물질 단백질의 임의의 N 또는 C 폴리펩티드의 식별을 용이하게 한다.
본 발명의 "C" 폴리펩티드는 드로소필라에서는 아미노산 257-259에 상응하는 GCF 아미노산 서열에서 인식된 자가단백분해성 절단 부위에서 출발하여 헤지호그 전구물질 단백질의 C 말단에서 유도된다. 드로소필라에서, 천연 헤지호그 단백질의 아미노산 잔기 329 및 C 폴리펩티드의 아미노산 잔기 72에서 항상 발견되는 히스티딘 잔기는 아미노산 257 및 258(G 및 C)사이에서의 자가단백분해성 절단에 필수적이다. 따라서, 본 발먕의 C 폴리펩티드는 마찬가지로 드로소필라 C 폴리펩티드에 대한 비교와 같이 용이하게 식별되는 유사하게 위치하는 히스티딘 잔기를 포함한다. 다양한 종중에서, 단백분해성 영역은 아미노산 서열 XTXXHLXX에 의해 특징지워질 수 있다.
N 과는 달리, 본 발명의 C 폴리펩티드는 헤파린 아가로스에 강하게 결합하지 않는다. C 는 생체내 C 폴리펩티드를 형질발현시키는 세포의 배양 상청액에 방출되고, 세포 및 배내에 확산 편재화된 것을 특징으로 한다. C 폴리펩티드가 자유로이 확산되기 때문에, 이는 다양한 피검체의 체내 유체 및 조직내에서 검출될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와같이 신경관의 중앙선 부근에서의 C 폴리펩티드의 식별은 배/태아내의 신경관 폐쇄에 대한 유용한 분석을 제공한다. 양막 유체내의 C 폴리펩티드의 존재는 신경관이 변형될 수 있는 질병을 진단하게 된다.
뇌척수액에서의 C 폴리펩티드의 변형된 정도는 예를들면 신경변성 질환의 예시가 될 수 있다. C 폴리펩티드는 천연 헤지호그 전구물질 폴리펩티드의 합성 및 자가단백분해후 세포로부터 방출되기 때문에, 높은 정도의 C 폴리펩티드를 합성하고 방출하는 종양은 종양의 정확한 위치에 대한 사전 지식이 없이도 검출할 수 있다.
C 단편은 뇌하수체 및 전뇌의 유전자를 유도하는데 효과적이다. 특히, 성장 인자의 TGF-β과의 일원을 첨가하여 유도를 증가시킨다. 예를들면, C 단편과 결합된 사람의 액티빈은 뇌하수체 세포 성장 및 활성 또는 전개를 향상시키는데 효과적일 수 있다.
C 단편은 N 을 억제시켜 뇌의 후엽 마커를 유도하기에 효과적이다. 상기 단편은 실시예 18에 ΔN-C 로서 예시된다. 그러므로, 다른 한 실시태양에 있어서, 본 발명은 X-bhh의 폴리펩티드 제거 아미노산 잔기 28-194 를 포함한다. (자가 단백질분해는 198-409의 C 영역 뿐 아니라, 아미노산 24-27 및 195-197을 나타내는 7가지의 아미노산 펩티드를 생성한다). 상기 폴리펩티드는 외식편의 X-bhh 및 N의 활성을 방해하며, 배에서의 배전위 구조물을 감소시킨다. 또한, ΔN-C 를 암호화하는 폴리펩티드 서열은 후엽 신경 마커(예, En-2, Krox-20, Xlttbox-6)의 형질발현을 증가시키고, 신경 패턴을 조절하도록 하는 것이 바람직한 경우, 전엽 신경 마커(예, XANF-2, XAG-1, Otx-A)의 형질발현을 감소시키는데 유용하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "거의 순수한"이란 기타 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 또는 기타 자연적으로 결합되어 있는 물질이 거의 없는 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드를 의미한다. 당업자는 단백질의 정제에 대한 표준 기술을 사용하여 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 거의 순수한 폴리펩티드는 비환원성 폴리아크릴아미드 겔상에 단일 주요 밴드를 생성한다. 또한, 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드의 순도는 아미노 말단 아미노산 서열 분석에 의해 측정할 수 있다.
본 발명은 작용성 N 또는 C 폴리펩티드 및 이의 작용성 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와같이, 용어 "작용성 폴리펩티드" 또는 "작용성 단편"은 규정된 작용성 분석을 통해 식별되며, 세포내의 특정 생물학적, 형태학적 또는 표현형 변형과 관련된 생물학적 작용 또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 일컫는다. 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드의 작용성 단편은 가능한한 활성이 오래 지속되는, 예를들면 C 폴리펩티드가 지속되는 N 또는 C 폴리펩티드의 단편을 포함한다. 그래서, N 또는 C 폴리펩티드의 생물학적 활성을 포함하는 작은 펩티드가 본 발명에 포함된다. 예를들면, 생물학적 작용성은 항체 분자가 결합될 수 있는 에피토프 정도로 작은 폴리펩티드 단편 내지는 세포내에서 표현형 변화를 특징적으로 유도하거나 또는 프로그래밍할 수 있는 거대 폴리펩티드까지 다양하게 변화될 수 있다. "작용성 폴리펩티드"는 본 명세서에 기재된 바와같이 작용성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
N 또는 C 폴리펩티드 1차 아미노산 서열의 약간의 변형은 본 명세서에 기재된 N 또는 C 와 거의 동등한 활성을 갖는 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 변형은 부위가 지정된 변이생성에 의해서와 같이 중요할 수 있거나 또는 자발적일 수 있다. 상기 변형에 의해 생성된 모든 폴리펩티드는 예를들면 C 폴리펩티드의 단백분해 성이 존재하는 가능한한 포함된다. 부가로, 하나이상의 아미노산의 제거는 이의 활성을 크게 변경시키지 않고 생성된 분자의 구조를 변화시킬 수 있다. 이는 더 다양한 용도를 지니게 되는 더 작은 활성 분자의 발전을 가능케할 수 있다. 예를들면, N 또는 C 폴리펩티드 활성에 필요하지 않을 수 있는 아미노 또는 카르복시 말단 아미노산을 제거할 수 있다.
또한, 본 발명의 N 또는 C 폴리펩티드는 폴리펩티드 서열의 보존성 변형을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와같은 용어 "보존성 변형"이란 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 아미노산 잔기를 대체하는 것을 의미는다. 보존성 변형의 예로는 다른 기 대신에 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기를 치환하는 것 또는 다른 기 대신에 하나의 극성 잔기를 치환하는 것, 예를들면, 리신 대신에 아르기닌, 아스파르트산에 대한 글루탐산 또는 아스파라긴 대신에 글루타민으로 치환하는 것을 포함한다. 또한, 용어 "보존성 변형"은 치환된 폴리펩티드에 상승된 항체가 치환되지 않은 폴리펩티드와 면역 반응하는 한 치환되지 않은 모 아미노산 대신에 치환된 아미노산을 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 N 단편은 절단되지 않은 신호 서열을 비롯한 활성형 N 단편 및 폴리펩티드를 포함한다. 예를들면, 신호 서열이 내부에 있는 (대략 아미노산 60-80에서) 드로소필라에서 개시 메티오닌에서 출발한 전체 절단되지 않은 N 단편이 본 발명에 포함된다. 당업자는 문헌[참조: von Heijne, G., Nucl. Acids Res. 14 : 4683, (1986)]에 기재된 바와같은 알고리즘을 사용하여 신호 서열의 특성 및 위치를 용이하게 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 N 또는 C 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열로 거의 구성된 분리형 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "분리형"이란 기타 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 기타 자연적으로 결합되어 있는 물질이 거의 없는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열의 예로는 N 또는 C 폴리펩티드를 암호화하는 DNA, cDNA 및 RNA 를 포함한다. 또한, N 또는 C 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 모든 폴리뉴클레오티드는 이들이 N 또는 C 폴리펩티드 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 한 본 발명에 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드의 예로는 천연, 합성 및 고의로 조작한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를들면, N 또는 C 폴리펩티드 폴리뉴클레오티드는 부위가 지정된 변이생성 처리될 수 있다. 또한, N 또는 C 폴리펩티드에 대한 폴리뉴클레오티드 서열이 안티센스 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전 암호의 결과로서 변성되는 서열을 포함한다. 20가지의 천연 아미노산이 있는데, 이들 대부분은 하나이상의 코돈에 의해 명시된다. 그러므로, 모든 변성 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 N 또는 C 폴리펩티드의 아미노산 서열이 작용적으로 변화되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명은 N 또는 C 의 아미노산 서열을 포함하며, N 또는 C 폴리펩티드와 면역반응성인 항체에 대해 하나이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열로 거의 구성된 폴리뉴클레오티드이다.
N 또는 C 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 폴리펩티드 또는 이의 단편 뿐 아니라, 서열에 대해 상보성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 상보성 서열의 예로는 안티센스 뉴클레오티드가 있다. 서열이 RNA 인 경우, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T 는 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U 에 의해 교환된다. 또한, 길이가 15 염기 이상이며 생리적 조건하에서 단편이 단백질을 암호화하는 DNA 로 선택적으로 접종형성하도록 하기에 충분한 상기 기재된 핵산 서열의 단편을 포함한다. 단편은 스트린젠트 조건하에서 잡종형성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA 서열은 여러가지 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를들면, DNA 는 당업계에 공지된 하이브리드화 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 이의 예로는 1) 동종 뉴클레오티드 서열을 검출하는 프로브를 사용한 게놈 또는 cDNA 라이브러리 하이브리드화법; 2) 공유하는 구조적 특징을 지닌 클로닝된 DNA 단편을 검출하기 위한 형질발현 라이브러리의 항체 선별법; 및 3) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 목적 뉴클레오티드 서열의 PCR 증폭법을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 헤지호그, N 또는 C 폴리뉴클레오티드는 척추동물 개체 유래인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 인체에서 유래할 것이다. 핵산 하이브리드화법을 근거로 한 선별 방법은 적절한 프로브가 사용될 수만 있다면, 임의 개체로부터의 모든 유전자 서열을 분리하는데 사용할 수 있다. 당면 문제의 단백질을 암호하는 서열 일부에 상응하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 화학적으로 합성할 수 있다. 이 경우에는 아미노산 서열의 짧은 올리고펩티드 서열들이 공지되어 있어야만 한다. 단백질을 암호하는 DNA 서열은 유전자 코드로부터 추론될 수 있으나, 코드의 축퇴도 인지되어야만 한다. 서열이 축퇴성인 경우에는 복합 부가 반응을 수행할 수 있다. 이 반응에는 변성된 이본쇄 DNA의 이종 혼합물을 포함한다. 이러한 선별법에 있어서, 하이브리드화는 일본쇄 DNA 또는 변성된 이본쇄 DNA에 대해 수행하는 것이 바람직하다. 하이브리드화는 목적하는 폴리펩티드와 관련된 mRNA 서열이 극히 소량으로 존재하는 원천으로부터 유래된 cDNA 클론을 검출하는데 특히 유용하다. 즉, 비특이적인 결합반응을 피하기 위한 엄격한 하이브리드화 조건을 사용하여, 예컨대, 표적 DNA를 이의 완전한 보체인 혼합물중의 단일 프로브에 대해 하이브리드시켜 특이적인 cDNA 클론을 자동방사성사진촬영법으로 가시화할 수 있다[참조: Wallace 등, Nucl.Acid Res., 9:879 (1981)].
헤지호그를 암호화하는 특이적인 DNA 서열은 1) 게놈 DNA 유래의 이본쇄 DNA 서열을 분리하는 방법; 2) 목적 폴리펩티드에 필요한 코돈을 제공하기 위해 DNA 서열을 화학적 제조하는 방법; 3) 진핵 공급체 세포로부터 분리된 mRNA를 역전사하여 이본쇄 DNA 서열을 시험관내 합성하는 방법으로 수득할 수 있다. 그 다음, 일반적으로 cDNA로 명명되는 mRNA의 이본쇄 DNA 보체가 사실상 형성된다.
재조합 절차에 사용하기 위한 특이적인 DNA 서열을 제조하는 상기 3가지 방법들에 있어서, 적어도 공통적인 것은 게놈 DNA 분리물을 분리하는 것이다. 이것은 특히 인트론이 존재함으로 인해 포유류 폴리펩티드를 미생물 발현시키는 것이 바람직한 경우에 특히 필요한 것이다.
DNA 서열의 합성은 목적 폴리펩티드 생성물의 아미노산 잔기의 전체 서열이 공지되어 있는 경우 종종 선택되는 방법이다. 목적 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 전체 서열이 알려져 있지 않은 경우에는 DNA 서열의 직접적인 합성법은 사용할 수 없고 따라서 선택할 수 있는 방법은 cDNA 서열의 합성법이다. 목적 cDNA 서열을 분리하는 표준 방법중에는 유전자 발현율이 높은 공급체 세포중에 풍부한 mRNA의 역전사로부터 유도되는 플라스미드 또는 파지-함유 cDNA 라이브러리의 형성법이 있다. 이 방법을 폴리머라제 연쇄 반응 기법과 함께 사용하는 경우, 형질발현율이 낮은 생성물도 클로닝할 수 있다. 폴리펩티드의 상당한 부분의 아미노산 서열이 알려져 있는 경우에는, 표적 cDNA내에 추정적으로 존재하는 서열을 복제하여 표지된 일본쇄 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA 프로브 서열을 제조하는 방법이, 일본쇄 형태로 변성시킨 cDNA의 클로닝된 복제물을 사용하여 수행하는 DNA/DNA 하이브리드화 절차중에 사용할 수 있다[참조: Jay 등, Nucl.Acid Res., 11:2325 (1983)].
게놈 DNA를 수득하는 바람직한 방법은 예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로서, DNA의 특정 단편이 특이적으로 복제되는 시험관내 핵산 합성법이다. 증폭될 DNA 단편에 인접한 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 DNA 열변성 단계, 상보 서열에 프라이머의 어닐링 단계, 및 어닐링된 프라이머의 DNA 폴리머라제에 의한 신장 단계로 이루어지는 과정을 반복 사이클로 수행한다. 이 프라이머들은 표적 서열의 대향 가닥에 하이브리드하고 폴리머라제에 의한 DNA 합성이 프라이머사이의 영역을 따라 진행하도록 배향된다. 신장 생성물 자체는 또한 프라이머에 상보적이어서 결합할 수 있고, 증폭의 연속 사이클은 실질적으로 이전 사이클에서 합성된 표적 DNA의 양을 이배화시킨다. 그 결과 특이적인 표적 단편의 지수적 축적량, 약 2n(이 때, n은 수행된 증폭 사이클 수)이 된다[참조: PCR Protocols, Eds. Innis 등, Academic Press, Inc.(1990), 본원에 참조문헌으로 포함됨]이 된다.
λgt11과 같은 cDNA 발현 라이브러리는 헤지호그 N 또는 C에 특이적인 항체를 사용하여 하나 이상의 에피토프를 지닌 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드에 대해 직접 선별할 수 있다. 상기 항체는 다중클론 또는 단일클론으로 유래될 수 있고 목적 헤지호그 cDNA의 존재를 나타내는 발현 생성물을 검출하는데 사용할 수 있다.
헤지호그 N 또는 C에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 헤지호그 N 또는 C를 암호하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열(안티센스 서열)을 포함한다. 안티센스 핵산은 특이적인 mRNA 분자의 일부분 이상에 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다[참조: Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990]. 본 발명은 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드의 생성을 억제할 수 있는 모든 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 세포중에서, 안티센스 핵산은 상응하는 mRNA에 하이브리드하여 이본쇄 분자를 형성한다. 이 세포가 이본쇄인 mRNA는 해독할 수 없으므로 안티센스 핵산은 mRNA의 해독을 방해한다. 따라서, 약 15개 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 바람직한데, 이는 이 올리고머가 쉽게 합성되고 표적 헤지호그 N 또는 C-생산 세포로 도입되는 경우 이보다 큰 분자에 비해 문제를 일으킬 우려가 적기 때문이다. 유전자의 해독을 억제하는 안티센스 방법의 사용에 대해서는 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Marcus-Sakura, Anal.Biochem. 172-289 (1988)]. 표적 뉴클레오티드의 억제는 예컨대, 헤지호그 N 또는 C에 의해 매개되는 특정 종양과 같은 세포-증식성 질환을 억제시키는데 바람직할 것이다.
또한, 헤지호그 N 또는 C의 리보자임 뉴클레오티드 서열도 본 발명에 포함된다. 리보자임은 DNA 제한 엔도뉴클레아제와 유사한 방법으로 다른 일본쇄 RNA를 특이적으로 절단할 수 있는 작용을 지닌 RNA 분자이다. 이러한 RNA를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 변형시켜, RNA 분자내에 특이적인 뉴클레오티드 서열을 인식하여 절단하는 분자를 제작할 수 있다[참조: Cech, J. Amer.Med.Assn., 260;3030 (1988)]. 이러한 시도의 주요 장점은 이들이 서열-특이성이 있기 때문에 특정 서열을 지닌 mRNA만이 불활성화된다는 것이다.
2가지 기본적인 유형의 리보자임, 즉 테트라히메나형[참조: Hasselhoff, Nature, 334:585 (1988)] 및 "해머헤드"-형이 있다. 테트라히메나형 리보자임은 염기 길이가 4개인 서열을 인식하는 반면, "해머헤드"-형 리보자임은 길이가 11-18염기인 염기 서열을 인식한다. 인식 서열이 보다 길어지면 그 서열이 표적 mRNA 종에서만 발생할 가능성도 커진다. 결과적으로, 해머헤드-형 리보자임은 특이적인 mRNA종을 불활성화시키는데 있어서 테트라히메나형 리보자임보다 바람직하고, 18-염기 인식 서열이 이보다 짧은 인식 서열에 비해 바람직하다.
헤지호그 N 또는 C를 암호화하는 DNA 서열은 적합한 숙주 세포내로 DNA 전이시켜 시험관내에서 발현시킬 수 있다. "숙주 세포"는 이 중에서 벡터가 전파하여 그 DNA를 발현할 수 있는 세포이다. 이 용어는 또한 그 주 숙주 세포의 임의의 자세포도 포함한다. 모든 자세포는 복제중에 돌연변이가 일어날 수도 있기 때문에 모세포와 동일할 수는 없다는 것은 당연한 것이다. 그러나, 이러한 자세포도 "숙주 세포"라는 용어가 사용될 때 포함되는 것이다. 이종 DNA가 숙주내에서 지속적으로 유지되는 것을 의미하는 안정한 전이 방법은 당해 기술분야에 공지된 것이다.
본 발명에서, 헤지호그 N 또는 C 폴리뉴클레오티드 배열은 재조합 발현 벡터안으로 삽입된다. "재조합 발현 벡터" 란 헤지호그 N 또는 C 유전자 배열을 삽입 또는 혼입하여 조작할 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 비루스 또는 다른 매개체를 말한다. 이 발현 벡터는 숙주의 삽입된 유전자 배열의 효과적인 전사를 용이하게 하는 프로모터 서열을 포함한다. 전형적으로 발현 벡터는 복제 원점, 프로모터를 포함하며 그외에 형질전환된 세포의 표현형 선택을 가능하게 하는 특별한 유전자를 보유한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터로는 박테리아에서 발현시키기 위한 T7-염기 발현 벡터(Rosenberg 등, 유전자, 56:125,1987), 포유동물의 세포에서 발현시키기 위한 pMSXND 발현 벡터[참조: Lee 및 Nathans, J. Biol, Chem., 263,3521 (1988)] 및 곤충 세포에서 발현시키기 위한 바쿨로비루스-유도된 벡터를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. DNA 단편은 예를 들어 프로모터(예; T7, 메탈로티오네인 I 또는 폴리헤드린 프로모터)와 같은 조절 성분에 작동가능하게 결합되어 벡터내에 존재할 수 있다.
비록 카르복실화와 같은 진핵 생물에서 유도된 폴리펩티드의 해독후 변형이 진핵 세포에서 일어나지만, 헤지호그 N 또는 C를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 원핵 또는 진핵생물 내에서 발현될 수 있다. 미생물, 효모, 곤충 및 포유동물이 숙주가 될 수 있다. 진핵 생물의 DNA 서열 또는 원핵 생물 의 비루스 서열을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 숙주에서 발현 및 복제를 할 수 있는 생물학적인 기능을 갖는 비루스 및 플라스미드 DNA 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 벡터는 본 발명의 DNA 배열을 혼입하는데 사용된다.
당 업계에 널리 알려진 방법을 이용하여 헤지호그 N 또는 C 암호 서열 및 적당한 전사/해독 조절 신호를 포함하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 재조합/유전자 기술을 포함한다. 예를 들어 Maniatis 등, 1989 Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 에 설명된 기술을 참조한다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 헤지호그 N 또는 C 암호 서열을 발현하는데 유용하다. 헤지호그 N 또는 C 서열을 포함하는 재조합 박테리오 파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 박테리아와 같은 미생물; 헤지호그 N 또는 C 암호 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모; 헤지호그 N 또는 C 암호 서열을 갖는 재조합 비루스 발현 백터(예, 꽃양배추 모자이크 비루스, CaMV; 담배 모자이크 비루스, TMV)에 감염된 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예 Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 헤지호그 N 또는 C 암호 서열을 갖는 재조합 비루스 발현 벡터(예, 바쿨로비루스)에 감염된 곤충 세포 시스템; 또는 헤지호그 N 또는 C 암호 서열을 갖는 재조합 비루스 벡터(예, 레트로비루스, 아데노비루스, 백시니아비루스)에 감염된 동물의 세포 시스템, 또는 안정한 발현을 위해서 처리한 형질전환된 동물 세포 시스템을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
사용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성 및 유도성 프로모터, 전사 인헨서 성분, 전사 종결자 등과 같은 다수의 적합한 전사 및 해독 성분이 발현 벡터에서 사용된다[참조: 예, Bitter 등, 1987, Methods in Enzymology, 153:516-544]. 예를 들어, 박테리아 시스템에서 클로닝시에 박테리오파지 γ의 pL, plac, ptrp, (ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 및 이와 유사한 것과 같은 유도성 프로모터를 사용한다. 포유동물 세포 시스템에서 클로닝 할 때는 포유동물 세포의 게놈(예, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 비루스(예, 레트로비루스 긴 말단 반복부; 아데노비루스 후기 프로모터; 백시니아 7.5K 프로모터)로부터 유도된 프로모터가 사용된다. 재조합 DNA 에 의해서 생성된 프로모터 또는 합성 기술은 삽입된 헤지호그 N 또는 C 암호 서열을 전사시키는데 사용된다.
박테리아 시스템에서 의도하는 발현에 따라서 수많은 발현 벡터가 선택되어 사용된다. 예를 들어, 많은 양의 헤지호그 N 또는 C가 생성되기를 바란다면 미리 정제시킨 고농도의 접합 단백질 생성물의 발현을 이끄는 벡터가 바람직하다. 재생을 보조하기 위한 절단 부위를 포함하도록 처리하는 것들이 바람직하다. 이러한 벡터에는 헤지호그 N 또는 C 암호 서열을 lac Z 암호 부위와 프레임 내의 벡터 안으로 결찰시켜서 하이브리드-lac Z 단백질을 생성시키는 대장균 발현 벡터 pUR278 [참조: Ruther 등, EMBO J., 2:1791 (1983)]; pIN 백터[참조: Inouye 및 Inouye, Nucleic Acid Res., 13:3101 (1985); Van Heeke 및 Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503 (1989)] 및 이와 유사한 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
효소에서, 수 많은 구성 또는 유발 촉진 유전자가 사용된다. 하기 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2 1988, Ed.Ausubel 등, Greene Publish. Assoc. & Wiley Intersience, 13 장; Grant 등, 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, Method in Enzymology, Eds. Wu 및 Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y.. Vol. 153 p516-544; Glover, 1986,DNA Cloning, Vol. 2, IRL Press, Wash., D.C., 3장; 및 Bitter, 1987 Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger 및 Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152 p673-684; 및 The Molecular Bioligy of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern 등, Cold Spring Harbor Press, Vol. I 및 II]을 참고한다. ADH 또는 LEU2와 같은 구성 효모 프로모터 또는 GAL과 같은 유도성 프로모퍼를 사용할 수 있다[참조: R.Rothstrin, Cloning in Yeast Ch3: DNA 클로닝 Vol.11, A Practical Approach, Ed. DM Glover,1986, IRL Press, Wash., D.C.]. 대안적으로 효모의 염색체 안으로 외부 DNA 배열을 통합을 촉진시키는 벡터를 사용할 수 있다.
식물 발현 벡터를 사용하는 경우, 헤지호그 N 또는 C 암호 서열은 다수의 프로모터중 일부에 의해 이루어진다. 예를 들어, CaMV[참조: Brisson 등, Nature, 310:511, 1984]의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터와 같은 비루스 프로모터 또는 TMV에 대한 코팅 단백질 유전자를 사용할 수 있으며; 대안적으로, RUBISCO의 작은 부단위치와 같은 식물 프로모터[참조: Coruzzi, 등 EMBO J., 3:1671-1680 (1984)]; 또는 콩 hsp 17.5-E 또는 hsp17.3-B와 같은 열 충격 프로모터[참조: Gurley,등., Mol. Cell. Biol., 6:559 (1986)]를 사용할 수 있다. 이러한 구성물은 Ti-플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 비루스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 미세주입, 전기적천공 등의 방법으로 식물세포내로 투입할 수 있다. 이러한 기술의 검토는, 예를 들어, Weissbach 및 Weissbach, 1988; 및 Grierson 및 Corey, 1988, 식물 분자 생물학, 제 2판., Blackie, 런던, 7-9장을 참고하면 된다.
발현에 사용되는 또 다른 발현 시스템은 곤충 시스템이다. 이러한 시스템에서, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 다면성 비루스(AcNPV)는 외부 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 사용한다. 상기 비루스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 배양된다. 헤지호그 N 또는 C 암호 서열은 비루스의 비필수적인 부위(예를 들어, 폴리헤들린 유전자)로 클론되어 AcNPV 프로모터(예를 들어 폴리헤드린 프로모터)의 조절하에 놓이게 된다. 헤지호그 N 또는 C 암호 서열의 성공적인 삽입으로 폴리헤드린 유전자가 불활성화 되고 페쇄되지 않은 재조합 비루스를 생성한다(즉, 폴리헤드린 유전자에 의해 암호화되는 단백질 코팅이 부족한 비루스). 이들 재조합 비루스는 삽입된 유전자가 발현되는 스포도프테라 프루기페르다 세포에서 사용된다[참조: Smith 등, J. Viol., 46: 584 (1983); Smith 미국 특허 제 4,215,051 호]
진핵 생물 시스템 및 바람직하게는 포유동물의 발현 시스템은, 발현된 포유동물의 단백질의 해독후 변형이 적절히 일어나게 한다. 일차 전사체의 적합한 처리, 글리코실화, 인산화 및 유전자 생산물의 분비의 적절한 과정을 위한 세포내 기구를 포함하는 진핵 생물의 세포는 헤지호그 N 또는 C 발현을 위한 숙주 세포로 사용된다. 포유동물의 세포 계통이 바람직하다. 이러한 숙주 세포 계통은 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, -293 및 WI38을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 발현을 이끌어 내기 위한 재조합 비루스 또는 비루스 성분을 사용하는 포유동물의 세포 시스템을 조작한다. 예를 들어, 아데노비루스 발현 벡터를 사용할 때, 헤지호그 N 또는 C 암호 서열은 아데노 비루스 전사/해독 조절 복합체(예, 후기 프로모터 및 삼절 리더 서열)에 결합된다. 이어서 상기 키메라 유전자는 시험관내 및 생체내 재조합에 의해 아데노 비루스 게놈내로 삽입한다. 비루스 게놈의 비본질적인 부분(예; 부위 E1 및 E3)에서의 삽입은 감염된 숙주 내에서 증식할 수 있고, 단백질을 발현할 수 있는 재조합 비루스의 생성으로 귀결된다[참조: Logan 및 Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci., 미국, 81:3655 (1984)]. 대안적으로, 백시니아 비루스 7.5K 프로모터를 사용할 수 있다[참조: Mackett 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415 (1982); Mackett 등, J.Virol., 49:857 (1984); Panicali 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4927 91982)]. 특히 관심이 있는 벡터 중의 하나는 소 파필로마 비루스로 이는 염색체외 성분으로 복제할 수 있는 특성이 있다[참조: Sarver등., Mol. Cell. Biol., 1:486 (1981)]. 쥐의 세포내로 DNA를 삽입한 직후에, 플라스미드는 세포당 약 100 내지 200 사본으로 복제한다. 삽입된 cDNA의 전사는 숙주의 염색체로 플라스미드를 통합시킬 필요가 없으므로, 고농도로 발현된다. 이들 벡터는 플라스미드내에 선택성 마커(예를 들면 네오(neo) 유전자)를 포함하므로써 안정한 발현을 위해 사용할 수 있다. 대안적으로, 레트로비루스 게놈은 숙주 세포 내에서 헤지호그 N 또는 C 발현을 유도하고 이끌어 내는 작용을 하는 벡터로 사용하기 위해 변형시킨다[참조: Cone 및 Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 81:6349 (1984)]. 고 농도의 발현은 유도성 유전자를 사용하여 이루어지며, 여기서 유도성 프로모터는 메탈로티오닌 ⅡA 프로모터 및 열 충격 프로모터를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
재조합 단백질의 장주기, 고수율 생성을 위해서, 안정한 발현이 바람직하다. 비루스 복제 원점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는, 적절한 발현 조절 성분(예, 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 위치 등) 및 선택 성 마커로 조절된 헤지호그 N 또는 C cDNA를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킬수 있다. 재조합 플라스미드에서 선택성 마커는 선택을 방해하여 세포로 하여금 안정하게 염색체안으로 플라스미드를 통합시켜 성장하게 하므로써 클론 및 세포주로 팽창되어 병소를 형성한다. 예를 들어, 외래 DNA의 도입후에, 조작된 세포를 영양분이 풍부한 배지에서 1-2일 동안 배양한 후, 선택성 배지로 바꾼다. 다수의 선택 시스템이 사용되며, 여기에는 단순 헤르페스 비루스 티미딘 키나아제[참조:Wigler,등, Cell, 11:817 (1980)], 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제[참조: Szybalska 및 Szybalski 등, Pric. Natl. Acad. Sci. 미국, 48:2026 (1962)] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제[참조: Liwy 등, Cell, 22:817 (1980)]를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며, 각각의 유전자는 tk-, hgprt-, 또는 aprt- 세포에서 사용된다. 항 대사물질 저해는 dhfr, 메토트레자이트에 대한 저해[참조: Wigler등, Natl. Acad. Sci. 미국, 77:3567 (1980); O'Hare, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 78:1527 (1981)]; gpt, 미코페놀산에 대한 저해[참조: Mulligan 및 Nerg, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 78:2072 (1981)]; neo, 아미노글리코사이드 G-418 에 대한 저해[참조: Colberre-Garapin 등, J. Mol. Biol., 150:1 (1981)]; 및 hygro, 히그로마이신[참조: Santerre 등, Gene., 30:147 (1984)] 유전자에 대한 저해를 기준하여 선택한다. 최근에 추가로 선택 유전자가 설명되었는데, 즉 트립토판 대신에 인돌을 이용하는 세포 trpB; 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하는 세포인 hisD[참조: Hartman 및 Mulligan, Proc. Natl. ACad. Sci. 미국, 85:8047 (1988)]; 오르니틴 탈탄산화효소 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 저해를 나타내는 ODC[참조: McConlogue L., 1987; Current Communication in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.].
재조합 DNA를 이용하는 숙주세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상적인 기법이다. 대장균과 같이 숙주가 원핵세포인 경우, DNA를 취할 수 있는 수용 세포는 대수 증식기 이후에 수확하고, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 CaCl2 방법으로 처리하므로써 제조할 수 있다. CaCl2 대신에 MgCl2 또는 RbCl 을 사용할 수 있다. 필요에 따라 숙주 세포의 원형질 형성후에 형질전환을 수행할 수 있다. 칼슘 포스페이트 공동 침전, 숙주가 진핵 세포인 경우에는 미세주입, 전기적 천공법, 리포좀에 싸인 플라스미드의 삽입과 같은 통상적인 조작과정, 또는 비루스 벡터와 같은 DNA를 감염시키는 방법이 사용된다. 단순 헤르페스 비루스 티아민 키나아제 유전자와 같이, 본 발명의 헤지호그, N 또는 C 를 암호화하는 DNA 서열 및 선택성 표현형을 암호화하는 제 2 외래 DNA 분자를 이용하여 동시에 진핵 세포를 형질전환시킬 수 있다. 시미안 비루스(SV40) 또는 소 파필로마 비루스와 같이 진핵세포성 비루스 벡터를 이용하여 진핵 세포를 일시적으로 감염시키거나 형질전환시키고, 단백질을 발현시키는 다른 방법을 이용할 수도 있다[참조: Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed. (1982)].
본 발명에 의해 제조된 미생물 발현된 폴리펩티드 또는 이들 단편의 분리 및 정제는 분취용 크로마토그래피 및 단일 또는 다중클론 항체를 보유하는 면역학적 분리법을 포함하는 통상적인 수단으로 수행할 수 있다.
본 발명은 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드 또는 이들의 기능적 단편과 면역반응하거나 상기 폴리펩티드 또는 이들의 기능적 단편에 결합하는 항체를 포함한다. 필수적으로 상이한 에피토프 특성을 갖는 풍부한 단일클론의 항체들로 구성된 항체, 뿐만 아니라 특별한 단일클론의 항체를 제조하는 방법이 제시된다. 단일클론의 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해서 단백질 단편을 포함하는 항원에서 만들어진다[참조: Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)]. 본 발명에서 사용되는 항원이라는 용어는 에피토프 결정인자에 결합할 수 있는 Fab 및 F(ab')2와 같은, 이들의 단편 뿐만아니라 완전한 분자도 포함한다. 본 발명의 항체는 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드에 결합하는 항체 및 면역 반응성 단편 N 또는 C와 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 "항체"라는 용어는 에피토피 결정기에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')2 및 Fv와 같은, 이들의 단편 뿐만 아니라 완전한 분자도 포함한다. 항체 단편은 항원 또는 수용체에 선택적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하며 다음과 같이 정의된다.
(1) 단일 항원-항체 분자의 단편의 결합을 포함하는 단편, Fab는 완전한 경쇄 및 하나의 중쇄를 얻기 위해서 효소 파파인으로 모든 항체를 분해시켜서 얻어지고;
(2) 항체 분자의 단편, 즉 Fab',는 펩신으로 처리하여 얻어지고, 이후 환원시켜 완전한 경쇄 및 하나의 중쇄부를 수득한다; 항체 분자당 두 개의 Fab' 단편이 얻어지고;
(3) 모든 항체를 후속 환원 없이 효소 파파인으로 처리하여 얻을 수 있는 항체의 단편, 즉 (Fab')2; (Fab')2는 두 개의 Fab'단편이 두 개의 디설파이드 결합에 의해서 함께 유지되고 있는 이량체이며;
(4) Fv는 유전적으로 융합된 가변성 단쇄 분자를 포함하는 유전적으로 조작된 단편으로 정의한다.
이러한 단편을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어있다[참조: Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕(1988), 본원 명세서에 참고로 인용함].
본 발명에서 사용되는 "에피토프(epitope)"라는 용어는 항원의 파라토프가 결합한 항원상에 있는 항원 결정 인자를 말한다. 일반적으로 에피토프 결정기는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면기로 이루어지며, 보통 3차원 구조 특성 및 특이적인 하전 특성을 보유하고 있다.
본 발명의 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드에 결합한 항체는 면역을 일으키는 항원으로 관심의 대상이 되는 완전한 폴리펩티드 및 작은 펩티드를 갖는 단편을 사용하여 제조할 수 있다. 동물에게 면역을 주는데 사용되는 헤지호그 N 또는 C, 또는 이들의 단편과 같은 폴리펩티드는, 필요에 따라, 운반 단백질에 접합될 수 있는 해독된 cDNA 또는 화학적인 합성에서 유도될 수 있다. 펩티드와 화학적으로 결합되는 보편적으로 사용되는 담체는 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌(KLH), 티로그로블린, 소 혈청 알부민(BSA) 및 파상풍 독소를 포함한다. 결합된 펩티드는 동물(예, 생쥐, 쥐 또는 토끼)에게 면역성을 주는데 사용된다.
필요에 따라, 추가로 다중클론 또는 단일클론의 항체를 정제할 수 있는데, 상기 추가 정제는 예를 들어, 늘어난 항체가 결합하는 폴리펩티드 또는 펩티드가 결합된 매트릭스에 항체를 결합시키고, 용출시키므로써 이루어진다. 당업계에 공지된 것과 같이 면역학계에서 정제 및/또는 단일클론 항체 뿐만 아니라 다중클론 항체의 농축을 위해 보편적으로 사용되는 다양한 방법이 있다[참조: Coligan 등, Unit 9, Current Protocols in the immunology, Wiley Interscience (1991), 참고로 인용함]. 에피토프 처럼 행동하는 단일클론 항체를 제조하기 위해 항-이디오(idio)형 기술이 또한 사용 가능하다. 예를 들어, 제 1 단일클론 항체에 대해 제조된 항-이디오형 단일클론 항체는 제 1 단일클론 항체에 의해서 결합된 에피토프의 "상(image)"인 초가변성 부위에 존재하는 결합 영역을 보유할 것이다.
N 폴리펩티드에 대한 특성, 예를 들어 Abl(잔기 83-160)를 갖는 것으로 기술된 항체는 헤지호그의 N 단편을 발현하는 세포 또는 조직의 특별한 동정에 유용하다. 이와 유사하게 Ab2(잔기 300-391)와 같은 C 폴리펩티드에 대한 특성을 갖는 여기서 기술한 항체는 헤지호그의 C 단편을 발현하는 세포 또는 조직의 특별한 동정에 사용될 수 있다. 당연히 두가지 항체 모두는 본래의 헤지호그의 폴리펩티드에서 발견될 것이다.
본 발명의 N 및 C-특정 항체는 각각 N 및 C 폴리펩티드의 정제에 유용하며, 특히 고체상에서 고정된 항체를 사용한다. 항-N 항체를 갖는 시료와 접촉하여, N 및 천연 헤지호그 펩티드가 분리된다. 다음으로 항-N 항체에 의해 제거된 시료를 항-C 항체와 접촉시켜, 본래의 헤지호그 폴리펩티드가 제거되고, 따라서 N 폴리펩티드가 정제된다. 비슷한 방법으로, 시료에서 C 폴리펩티드가 정제되어 항체가 될 수 있다.
본 발명의 단일클론의 항체는 예를 들어 면역학적 분석에 적합한데, 이는 액체상 또는 고체 상 담체에 결합되어 사용될 수 있다. 추가로, 면역학적 분석에서 단일클론이 항체는 다양한 방법으로 감지하여 표시할 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체를 사용할 수 있는 면역학적 분석법은 직접 또는 간접적인 형식으로 수행되는 경쟁적 및 비경쟁적 면역학적 분석법이다. 이러한 면역학적 분석법의 예로는 방사능 면역분석(RIA) 및 샌드위치(면역메트릭) 분석법이 있다. 본 발명의 단일클론 항체를 사용한 항원의 검출은 정, 역 또는 동시 방식으로 수행되는 면역분석법을 사용하여 행해지는데, 생리학적 샘플에 대한 면역조직학적 분석을 포함한다. 이러한 기술은 이미 당업계에 공지되거나, 또는 부당한 실험법이 아닌 이미 알아낸 것들이다.
"면역메트릭분석" 또는 "샌드위치 면역분석"이라는 용어는 동시 샌드위치, 정 샌드위치 및 역 샌드위치 면역분석법을 포함한다. 이들 용어는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 따른 항체는 다른 변이에도 유용하고, 현재 알려져 있거나 앞으로 개발될 분석법의 형태에도 유용하다는 것을 평가받게 될 것이다. 이것은 본 발명의 범주에 넣고자 의도했던 상황이다.
단일클론 항체는 많은 상이한 담체에 결합되어 N 또는 C 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 사용된다. 잘 알려진 담체로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 천연 및 변형된 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 한천, 자철석을 들 수 있다. 본 발명을 위한 담체의 특성은 가용성 또는 불용성일 수 있다. 단일클론 항체에 대한 다른 적절한 담체가 당업계에 공지되어 있고, 또는 계속적인 실험으로 확인할 수 있다.
본 발명의 목적에 대해서, N 또는 C 폴리펩티드는 생물의 유동액 및 조직안에서 존재하는 단일클론 항체에 의해서 검출된다. 소변, 침, 뇌척수액, 및 이와 유사한 액체, 또는 조직, 막장, 및 이와 유사한 고체 또는 반고체, 또는 대안적으로 조직의 진단에 사용되는 것과 같은 고체 조직은 시료가 될 수 있다. 특히 C 폴리펩티드가 생물의 시료에서 감지되는데 이는 N 폴리펩티드 보다 분산이 더 잘되기 때문이다.
검정을 수행할 때에는 배양 배지에 특정 "차단제"를 포함시키는 것이 바람직하다(일반적으로 표지된 가용성 항체를 첨가). "차단제"는 첨가되어 실험 시료에 존재하는 항-C 또는 N 면역글로블린에 비-특이 단백질, 프로테아제, 및 항-비특이성 면역 글로블린이 고체상 지지체위의 항체 또는 방사능 표시된 지시 항체와 교차 결합하거나 파괴하지 않아서, 위양성 또는 위음성 반응을 나타내게 한다. 따라서, 이러한 "차단제"의 선택은 본 발명에서 기술된 분석의 실질적인 특징에 부가될 수 있다.
또한 발명은 헤지호그 폴리펩티드를 함유하는 세포와 접촉하는 것을 포함하는 신경 세포의 증식 또는 분화를 조절하기 위한 방법을 제시한다. 헤지호그 폴리펩티드는 자연 발생하는 헤지호그 폴리펩티드, 또는 N 또는 C 폴리펩티드, 또는 이들의 기능적 단편일 수 있다. 바람직하게도 이러한 조절은 특별한 세포 형태의 증식 및 분화를 유발한다. 이것은 예를 들어 N 에 의한 신경 세포의 상승적인 양성 유도, 또는 델타N-C에 의한 음성 조절을 포함할 수 있다[참조: Lai 등, Development 121:2349 (1995)]. 델타N-C 는 신경 유전자의 전엽에 비해 후엽의 발현을 증진시키며 이는 N 의 억제에 의한 것이다(실시예 18 및 도 18(D)). 헤지호그 폴리펩티드외에, TGF-β 인자가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
쥐 헤지호그 유전자를 이용하여 수행한 이전의 연구는 신경관으로부터 유래한 외이식편을 갖는 쥐 헤지호그 전구물질 유전자를 발현하는 세포의 공동배양이 외이식편으로부터 운동신경 및 바닥판의 형성을 유도하기에 충분함을 나타내고 있다[참조: Jessel, T. 및 Dodd, J., In Cell-Cell Signaling in Vertebrate Development(ed. E.J. Robertson,등 p139-155, 산디에고, 캘리포니아),1993]. 그러므로, 여기서 제시하는 예에 기초하여 헤지호그는 신경관 및 척삭의 복부 중심선이 바닥판 부근에서 발현되며, 바닥판에서 실질적으로 유도된 신경세포는 헤지호그 N 또는 C 폴리펩티드와의 접촉에 의해서 유도된다. 본 명세서에서 사용된 "실질적으로 유도된" 이라는 용어는 바닥판 또는 바닥판 근처의 세포로부터 얻어진 것이다. 예를 들어, 이러한 세포는 운동 신경 및 도파민 신경을 포함한다. 당업자는 바닥판으로부터 실질적으로 유도된 다른 신경 세포를 동정할 수 있다. 이러한 세포는 척추동물, 더욱 바람직하게는 동물의 것이 좋다.
또한, 본 발명의 실시예에서 기술된 바와 같이 헤지호그, 및 특히 C단편은 뇌하수체 유전자의 발현을 유도한다. 헤지호그는 OTX-A 마커에 의해 예시되는 전엽 뇌 유전자를 유도하는데 효과적이다. 추가로, 액티빈과 같은 TGF-β류는 이러한 유전자의 발현을 유도하는데 이용된다. 다른 TGF-β류가 당업계에 공지되어 있다. TGF-β류를 갖는 hh 단편의 분명한 상승 작용은 노긴 및 폴리스테인과 같은 신경 유도체의 발현을 유발하는 TGF-β 단백질을 통해 일어난다. hh 단편은 이러한 유도체와 상승작용하여 신경 유전자 발현을 나타낸다.
hh 단편은 사지 창상을 치료하는 동안 신경-스페어링 제제 및 적당한 형태로 저장 또는 촉진제로 사용된다. 추가로, N 및 C 단편은 유전 카운셀링 영역에서도 사용된다. 특히, 사이클로피디아, 다지증, 또는 신경관의 결점과 같은 계통의 중심선 결점이 hh에 가까이 지도화되어 진단될 수 있다. 자가단백질 분해 결점이 장애의 원인이 되므로, N 또는 C 치료법이 제공될 수 있다.
본 발명은 C 폴리펩티드의 단백질 분해 영역을 포함하는 제 1 폴리펩티드, 제 1 폴리펩티드에 의해서 인식되는 절단 부위, 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 자가 단백질 분해성 융합 단백질을 제공한다(제 1 및 제 2 폴리펩티드는 가역적이다). 천연 헤지호그 단백질의 자기 분해 활성은 C 폴리펩티드안에서 완전하게 발견되며, 따라서, C 폴리펩티드는 C 폴리펩티드와 제 2 폴리펩티드의 접합부에서 분해될 수 있는 융합 폴리펩티드를 생성하는데 유용하다. 융합 단백질은 니켈 칼럼, 또는 항체 에피토프 택, 더욱 바람직하게는 C 단편에서 분리하기 위해서 폴리-히스틴-택과 같은 정제 택을 갖는 것이 바람직하다. 분열 부위는 서열 "GCF"를 포함하는데, 이 서열은 C 폴리펩티드의 분해 영역에 의해 인식되고 단편 C로부터 제 2 폴리펩티드를 분해하는데 사용된다. 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에 포함된다.
본 발명은 제1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 결합을 포함하는 자가단백질 분해성 융합 단백질을 생성하는 방법을 제공하는데, 여기서 제 1 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 C 폴리펩티드의 단백질 분해 영역 및 상기 단백질 분해 영역에 의해서 인식되는 절단 영역을 포함하는 제 1 폴리펩티드를 암호화하며, 제 2 폴리뉴클레오티드는 제 2 폴리펩티드를 암호화한다. 전술한 것과 같이, 융합 단백질은 운반 펩티드 및/또는 정제 택을 포함한다.
C 폴리펩티드 또는 이들의 기능성 단편은 시험관내 또는 세포 내에서 친유성 변형 및 다른 단백질의 계목을 유도하기 위한 융합 파트너로 유용하다. 이러한 융합 단백질은 예를 들어, 제한된 방법에서 요구되는 활성을 갖는 인자에 대하여 특정 세포에 DNA 구성물을 표적화하거나 또는 특정 DNA 구성물을 이식시킨 세포를 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 세포-관련 단백질을 생성하기 위해서 정상적으로 분비되는 단백질을 지방-변형시키는 것이 바람직하다. 예를들어, 세포 연합된 상태로 남아 있는 비루스 항원을 생성하는 것이 바람직하다.
대안적으로, C 폴리펩티드 또는 이들의 기능을 갖는 단편이 흥미있는 단백질의 융합 파트너가 될 수 있다(예, hh-C 영역에 융합된 단백질 X). 이러한 융합은 단백질 X 및 hh-C 사이의 접합부에 티오에스테르를 형성한다(S 에서 N 으로 이동함). 이어서, 티오에스테르는 아미노 말단 시스테인(펩티드 Y)을 갖는 임의의 펩티드 또는 단백질이 첨가되어 단백질 X 및 펩티드 Y사이에 안정한 펩티드 결합을 형성하는 자발적인 재배열 반응(S 에서 N으로 이동)을 진행하는, 결찰 반응의 기질로 유용하다. 예를 들어, 생체내에서 생성되면 독성을 갖는 단백질은 hh-C 영역 융합 단백질 방법을 사용하여 시험관내에서 생성된다.
또한, 융합 폴리펩티드는 임의의 운반 펩티드를 포함할 수 있다. "운반 펩티드", 또는 신호 서열은 융합 팹티드 서열의 아미노 말단에 위치한다. 진핵생물의 경우는, 운반 펩티드가 소포체를 통과하는 융합 단백질을 전달하는 기능을 한다고 생각된다. 그 후 분비 단백질은 골지체를 통하여 분비 매개체 및 세포외 공간 또는 더욱 바람직하게 외부로 운반된다. 운반 펩티드는 단백질 분해성 효소 인식 위치를 포함하는 프리-프로 펩티드를 포함하는 본 발명에 따라서 이용될 수 있다. 수용가능한 운반 펩티드는 칼시토니아 또는 다른 호르몬의 아미노 말단 프로-부위를 포함하며, 인접 이염기성 위치를 절단한다. 그러나, 본 발명은 운반체로 특별한 펩티드를 사용하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상이한 운반체가 당업계에 공지되어 있으며 이미 적당한 실험으로 확인되었다.
본 발명의 한 구체예에서, 신호 서열인 운반 펩티드는 발현 벡터내에 존재하며, 특히 융합 단백질의 N-말단에 인접하여 위치한다. 이러한 신호 서열은 소포체로 융합 단백질을 이동하게 한다. 전형적으로, 신호 서열은 약 16 내지 약 29 아미노산으로 이루어진 리더로 구성되며, 이는 둘 또는 세 개의 극성 잔기로 시작하고, 고농도의 소수성 아미노산을 갖는다; 그렇지 않으면 알려진 서열의 보존을 검출할 수 없다. 이러한 신호 배열이 당업계에 공지되어 있으며, 헤지호그 단백질로부터 유도된 신호 배열의 자연발생을 포함한다.
본 발명의 융합 폴리펩티드는 구조 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하며, 바람직하게는 융합 폴리펩티드의 아미노 말단에서 일어난다. 임의의 구조 유전자는 C-폴리펩티드(폴리뉴클레오티드) 및 적당한 운반 펩티드의 접합으로 발현된다. 구조 유전자는 발현 벡터 안에서 운반체와 결합되어 융합 폴리펩티드를 단일체로 발현시킨다.
N 및 C 영역 안으로의 헤지호그의 자가 단백질 분해의 확인은 상기 처리 활성에 영향을 주는 화합물 또는 조성물을 확인하기 위한 스크리닝법에서 유용하다. 그러므로, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 활성 또는 유전자 발현에 의해 결정될 수 있는 hh 처리 과정에 영향을 주는 조성물을 확인하는 방법을 제공하는데, 본 발명은 조성물이 충분히 상호 작용할 수 있는 조건하에서, 시험될 조성물(예: 약물, 작은 분자, 단백질) 및 hh 폴리펩티드 또는 헤지호그 또는 N 영역이나 이들이 단편에 결합된 C 영역이나 이들의 단편을 암호화하는 유전자 재조합 세포를 배양하는 단계 및 헤지호그 활성 또는 발현에 대한 상기 조성물의 효과를 측정하는 단계를 포함한다. 헤지호그 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 단편은 자가 단백질 분해 활성이 남아있는 한 본 발명의 방법에 사용된다(예: 도 12(A) 및 12(B), 실시예 10에 예시한 구성물). hh 에 대해 관찰된 효과는 저해성 또는 촉진성일 수 있다. 예를 들어, N 영역이 세포와 연합되었는지, 또는 N 영역이 배지안으로 분비되는지, 즉 불완전한 처리과정이 일어났는지를 결정할 수 있다. hh 처리과정에서 화합물 및 조성물의 효과를 결정하는 이러한 방법은 자가 단백질 분해성 절단 또는 농도 범위에 따른 분해과정과 같이 전술한 것을 포함한다(실시예 10, 도 12(A) 및 12(B)). 대안적으로, hh 에 대한 조성물의 효과는 전엽 또는 후엽 신경 마커의 발현에 의해 결정된다. N 및 C의 처리과정에 대한 조성물의 효과를 결정하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 다양한 라벨이 N 및 C 영역을 검출하는데 사용되며, 예를 들어 방사성동위원소, 형광화합물, 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소가 사용된다. 적당한 표지가 당업계에 공지되어 있으며 일상적인 실험을 통하여 확인할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "hh 활성" 은 스크리닝 법에서 사용된 바와 같이 자가 단백질 분해 활성을 의미한다. 그러나, 당업자는 아연 가수분해효소 활성 같은 기타 hh 활성에 영향을 주는 조성물을 확인하기 위해 전술한 스크리닝 분석이 사용될 수 있다는 것을 알아야한다. 이러한 활성에 대한 효과를 결정하기 위한 적당한 분석이 당업계에 공지되어 있다.
하가 실시예는 본 발명의 비제한적인 실시예를 기술한다. 이들은 사용될 수 있는 통상적인 것들이며, 당업계에 공지된 다른 과정들이 대안으로 사용될 수 있다.
본 발명은 헤지호그 단백질이 자가 단백질분해 절단되어 독특한 기능적 구조적 특성을 지닌 2개의 분리된 단백질을 산출한다는 발생학적 발견에 근거한 것이다. 각각 N-말단과 C-말단 단편 또는 헤지호그의 "N" 또는 "C" 단편으로 지칭되는 이 2개의 폴리펩티드는 천연 단백질내의 자가 단백질 분해성 영역에 의해 인식되는 G↓CF 부위에서 특이적으로 절단된 후 생성된다.
따라서, 일양태로서 본 발명은 헤지호그 단백질의 아미노 말단 아미노산으로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖고 있고, 그 카르복시 말단에 천연 헤지호그 폴리펩티드의 카르복시 말단 단편의 단백질 분해 활성에 의해 특이적으로 인식되는 G↓CF 절단 부위를 갖고 있음을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 헤지호그 폴리펩티드와 세포를 접촉시키는 것으로 구성되어, 신경원 세포의 증식이나 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 천연의 헤지호그 폴리펩티드, 이의 N 말단 또는 C 말단, 이로부터 유래되는 기능적 단편은 바닥판 신경원 세포로부터 실질적으로 유래되는 신경원 세포의 증식 또는 분화를 유도하는데 가장 유용하다.
실시예 1
헤지호그 단백질의 변형처리
hh 단백질(F)의 전체길이 형태는 46 kD의 상대분자질량에 상응하는 이동성으로 이동한다. 도 1(A) 및 1(C)는 아미노말단(Ab1) 및 카르복시말단(Ab2) 에피토프에 대한 항체를 사용한 면역블롯이다. HH 단백질에서 유래한 잔기 83 내지 160 또는 300 내지 391을 포함하는 GST 융합 단백질을 에스케리키아 콜리에서 발현시키고, 문헌[참조: F.M. Ausubel등, Current Protocols in Molecular Biology(Greene and Wiley-Interscience, 뉴욕, (1991)]에 제시된 방법으로 정제하여, 표준 방법에 의해 토끼를 면역화하는 데에 사용하였다. 항체들은 아피-겔 10 비드(바이오-래드)에 연결된 His6-U 단백질 칼럼[참조: E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 1988)]상에서 친화도 정제하였다. 산 및 염기 용출물이 10% 디옥산을 함유한 것을 제외하고는, 문헌(Harlow and Lane, 상기 참조)에 개시된 대로 정제를 실시하였다. 단백질 A 칼럼상에서 토끼 항혈청을 정제한 다음, 면역프로브 비오티닐화 키트(시그마)를 사용하여 비오티닐화함으로써 비오티닐화된 hh 항체를 제조하였다. 0.25 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 및 5 mM EDTA를 함유하는 냉 RIPA 용해 완충액을 사용하여 문헌(Harlow and Lane)에 개시된 대로 면역침전을 수행하여 조직을 균질화하였다. 용해물을 면역전 토끼 혈청과 단백질 A 비드(Gibco-BRL)를 사용하여 2회 사전 세정하였다. 그 후 친화도-정제된 항체 또는 면역전 혈청을 첨가하고, 세척용 NP-40 용해 완충액을 사용하고 단백질 A 비드를 사용하여 면역침전을 실시하였다.
두 개의 화학발광에 기초한 프로토콜중 하나에 의해 친화도 정제된 Ab1 또는 Ab2를 사용하여 면역블롯을 실시하였다. 첫 번째 프로토콜(도 1, 3 및 5에서 사용됨)에서는, 샘플을 15% 또는 12%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 용해시키고(F.M. Ausubel등, 상기 참조), 전기블로팅에 의해 마그나그래프 나일론 막(MSI)으로 옮겼다. 추천된 조건하에서 알칼리 포스파타제 접합된 당나귀 항-토끼 IgG 2차 항체 및 루미-포스 530(베링거 만하임)을 사용하여 블롯을 현상하였다. 두 번째 프로토콜(도 8에 사용됨)에서는, 샘플을 니트로셀룰로오즈 필터로 옮기고(Schleicher and Schuell), 추천된 ECL 시약(아머샴)을 사용하여 블롯을 현상하였다. 이 경우에 2차 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 염소 항-토끼 IgG(잭슨 임뮤노리서치)였다. 레인들은 유도되고 비형질감염된 S2 세포(레인 1 및 13), 유도되어 hh를 발현시키는 형질감염된 S2 세포(레인 2 및 4), 성체 디스크(레인 3 및 15), 야생형 배(레인 6 및 18), 및 마이크로좀의 존재하에서의(레인 5 및 17) 및 부재하에서의(레인 4 및 16)에서 합성 h mRNA의 시험관내 해독물에서 유래한 단백질을 함유한다.
다양한 hh 단백질종을 암호화하는 cDNA를 pMK33 벡터내로 클로닝하여 메탈로티오네인 프로모터 조절하에서 유도성 발현을 일으켰다[참조: M.R. Koelle 등, Cell 67:59 (1991)]. 하이그로마이신 내성에 대해 일정하게 선별하면서 hh/pMK33 플라스미드의 형질감염에 의해 안정한 S2 세포주를 제조하였다. 0.1 A595 단위로 희석된 세포의 대수기 배양물을 도말하고, 48 시간 동안 기다린 다음, 0.2 mM 최종 농도의 CuSO4를 사용하여 유도하고, 24 시간 후에 세포 및/또는 상청액을 수거함으로써 단백질을 발현시켰다. 면역블로팅을 위한 세포 샘플은 10 부피의 1× SDS PAGE 적재 완충액을 펠렛화된 세포에 첨가함으로써 제조하였다.
TNT 연계된 전사-해독 시스템(프로메가)을 사용하여 시험관내 해독을 실시하였다. 자동방사선사진분석법에 의한 검출에는 35S 메티오닌(듀퐁 넨)을 사용하였다. 헤파린 결합 실험에서 야생형 hh 단백질을 생산하는 마이크로좀을 가진 시험관내 해독 용해물을 헤파린 결합 완충액(HBB, 20 mM 트리스(7.4), 150 mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100)으로 사전평형화한 헤파린 아가로스(시그마) 또는 세파로스 CL-4B(파마시아) 비드에 첨가하였다. 비드를 펠렛화한 후, 일부 샘플내 상청액을 분석하였다(레인 2 및 4). 그 후 비드를 냉각된 HBB로 5회 세척하고, 이어서 샘플(레인 3 및 5)을 SDS PAGE 적재 완충액(F.M. Ausubel 등의 문헌, 상기 참조)에서 10 분 동안 80℃에서 용출시켰다.
야생형 캔턴-S 라인 및 교배물에서 유래한 배, 즉 hshh/hshh 또는 hshh H329A/hshh H329A Xy; Sco/CyO, enlacZ::wg[참조: Kassis등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 89:1919 (1992)]를 25℃에서 산란(AEL)한 지 0 내지 16 시간후에 수집하였다. 이들을 37℃에서 30분 동안 열충격을 가하고, 25℃에서 1 시간 동안 회수되게 하였다. 도 1의 배(캔턴-S)를 25℃에서 산란한 지 4 내지 8 시간 후에 수집하였다. 면역블로팅용으로 제조시에, 모든 배를 2.6%의 차아염소산나트륨에서 융모막을 제거하고, 10 부피의 1× SDS PAGE 적재 완충액에서 균질화하였다.
다수종을 검출하였는데, 유도된 비형질감염된 S2 세포(레인 1 및 13)의 추출물을 포함하는 대부분의 샘플에서 교차반응성의 소밴드가 확인된다. 이들 밴드중 하나(두 패널에 존재)는 U(39 kD)와 함께 이동하며, 도 1(A)의 레인 6에 특히 풍부하다.
도 1(B) 및 (D)는 Ab1(B, 레인 7-9), Ab2(D, 레인 19-21) 또는 사전면역 혈청(B, 레인 10-12 및 D, 레인 22-24)으로 면역침전시킨 샘플의 블롯이다. Ab1(B) 및 Ab2(D)의 비오티닐화된 유도체를 사용하여 검출하였다. 사용된 샘플은 유도된 비형질감염된 S2 세포(레인 7, 10, 19 및 22); hh를 발현시키는 것으로 유도된 형질감염된 S2 세포(레인 8, 11, 20 및 23); 및 배(레인 9, 12, 21 및 24)였다. 둘중 하나의 항체의 경우, hh 단백질 단편이 hh 발현 세포 및 배로부터 특이적으로 면역침전되나 비형질감염된 세포로부터는 면역침전되지 않았다. 도 1(E)에서, 절단 부위는 화살표로 나타낸다. 별표로 표시한 절단 부위는 단 하나의 절단 생성물의 확인에 의해 추론되며, 그러므로 C 단편내 또 다른 위치에 존재할 수도 있다. 도 1(E)의 우측 첫 번째 두 칼럼은 Ab1 및 Ab2의 각 hh 단편에 대한 반응성을 나타낸다. 다른 하나의 칼럼은 다양한 샘플내 각 hh 단편의 존재(+) 또는 부재(-)를 나타낸다. F 및 Nss 주위의 괄호는 시험관내 해독 반응에서 검출되나 생체내에서는 검출되지 않는다.
46 kD종은 Ab1 및 Ab2에 의해 시험관내 해독 추출물로부터 검출되고(도 1, 레인 4 및 16), 마이크로좀의 존재하에 해독이 일어날 경우 39 kD(U)종으로 부분적으로 전환되었다(도 1, 레인 5 및 17). U와 함께 이동하는 39 kD종 역시 모든 생체내 기원에서 유래한 추출물에 존재하나, 이들중 어느 추출물도 검출가능한 수준의 F를 함유하지 않는다. U는 F의 신호-절단된 형태를 나타내고; 따라서 신호 전달은 종래 보고된 바와 같이[참조: J.J. Lee등, Cell, 71:33 (1992)], 시험관 내에서 비교적 비효율적이나, 생체내에서는 매우 효율적이다. 신호 전달이 실제로 이 특이한 내부 위치에서 일어나는 지를 확인하기 위하여, 예측된 신호 전달 부위에서 잔기 S84를 N으로 변화시키는 돌연변이를 도입하였다. 이 돌연변이는 마이크로좀에 의한 F의 U로의 전환을 방해하며, 또한 배양된 S2 세포내로 형질감염시 F로 동시이동된 종을 생산하였다. 신호 서열의 상류에 존재하는 두 개의 메티오닌 코돈을 독립적으로 돌연변이시키는 효과 또한 검사하였다. 첫 번째 메티오닌이 제거되는 서열의 시험관내 해독은 F와 U 사이의 이동성이 중간정도인 단백질종을 생산하며, 이 종들은 마이크로좀의 존재하고 또는 생체내에서 생산될 때 U와 함께 동시 이동하는 종으로 전환된다. 두 번째 메티오닌 코돈은 생체내 또는 시험관내에서 생산된 Hh 단백질의 전기영동의 이동성에 변화를 일으키지 않았다.
생체내 공급원으로부터 보다 작은 Hh 단백질 종은 종래에 보고되었다[참조: T. Tabata 및 T. B. Kornberg, Cell 76: 89 (1994)]. 후자의 연구는 내생의 단백질을 검사하는 것이 아니라, 외인적으로 도입된 구성체로부터 고수준로 발현되도록 유도된 단백질을 검사하였다. 사용된 항체는 에피토프를 분자의 특징적 부분과 구별하지 않았다.
신호 전달외에도, U 전구물질의 추가의 절단은 생체내에서 관찰된 hh 단백질의 기타 형태를 생성시키는 작용을 한다. 이것은 Ab1 및 Ab2는 U(비절단)종을 검출하지만, 또한 배 및 성체 디스크에서 내생적으로 발현되는 보다 작은 단백질종과, 또는 hh 유전자를 S2 세포내로 도입시 발현되는 종과 개별적으로 상호작용하였다는 관찰로부터 추론되었다. 따라서 Ab1은 이들 조직 모두로부터 19 kD 종과 상호작용하는 반면에(도 1, 레인 2, 3, 6, 8, 9), Ab2는 25 kD종 및 16 kD종과 상호작용한다(도 1, 레인 14, 15, 18, 20, 21). 19 kD종은 이하 N(N-말단 단편)으로 언급하며, 25 kD종은 C(C-말단 단편)으로, 16 kD종은 C*로 언급하며; 이들 종은 생체내에 존재하는 내생 hh 단백질의 주 형태를 나타낸다.
이들 종에 일어나는 제안된 절단은 도 1의 하부에 도식적으로 나타낸다. N 및 C종은 각각 Ab1 및 Ab2에 의해 특이적으로 검출되고, 두 개의 보다 작은 종의 상대질량의 합계는 대약 U의 상대질량과 동등하다. F 및 U종의 전기영동적 이동성은 그 예측된 상대질량(각각 52.1 kD 및 43.3 kD)으로 다소 유동적이다. 이들 종의 실체는 NH2- 또는 COOH-말단에서 서열의 상이한 정도를 포함하도록 변형된 다양한 헤지호그 개방 판독틀의 시험관내 해독에 의해, 그리고 에피토프 표지의 삽입에 의해 확인하였다. 이동 이상은 NH2- 및 COOH-말단 단편의 서열들이 동시에 존재하는 단백질종과 관련 있는 것으로 보인다. 대조적으로 NH2- 및 COOH-말단 단편의 이동성은 대략 예측된 상대질량의 U와 동등한 44 kD를 산출하는 상대질량(각각 19 kD 및 25 kD)에 상응한다.
그러므로 두 개의 보다 작은 종의 유도를 설명할 수 있는 단순한 메카니즘은 U 전구물질의 단일의 내부 절단이다. 시험관내에서 해독될 경우 hh 단백질의 변형처리는 또한 25 kD종(C; 레인 16 및 17) 및 29 kD 또는 19 kD(N)종(레인 4 및 5)을 생산한다. 19 kD종은 N과 동시에 이동하며, 그 형성은 마이크로좀의 존재에 의해 좌우되는데, 이것은 N이 신호 전달 및 추가의 내부 절단에 의해 F로부터 유도된다는 제안과 일치하는 것이다. 따라서 생체내에서 관찰되는 hh 단백질의 주요 형태의 형성을 위한 전체 경로는 U를 생성시키는 F의 신호 전달과 관련된 것으로 보인다. U는 내부적으로 절단되어 N 및 C를 형성하며, 이들은 생체내에서 발견되는 주요 형태이다. 25 kD C종의 추가의 변형처리는 16 kD C*종을 생성시킬 수 있으나, 이 변형처리가 단일의 절단 현상인지 여부는 Ab2가 생성될 보다 작은 9 kD 단편을 인지하지 못하기 때문에 명확하지 않다. C*를 생성시키는 C의 변형처리는 배와 비교하여(레인 15 및 18 비교), 성체 디스크에서 보다 큰 효율로 일어나는 것 같으며; 이것은 성체 디스크의 보다 확장된 질량 분리 절차에 의해 일어날 수 있다[참조: O.M.Eugene 등, Tissue Culture Assn. Man., 5: 1055 (1979)].
실시예 2
헤지호그 단백질의 자가 단백질 분해
내생 및 시험관내-생성 hh 단백질종의 동시 이동은 시험관내 변형처리가 생체내에서 관찰되는 것과 유사함을 제안하는 것이다. 도 2는 hh 단백질과 세린 프로티나제 사이의 제한된 서열 유사성을 나타낸다. hh 단백질 서열은 디. 멜라노가스터 단백질의 잔기 323 내지 329로 배열되고, 위치 1 내지 7(A 군)로 번호가 매겨진다. 보존된 hh 잔기는 대문자로 나타낸다. 포유류의 세린 프로티나제(B 군)의 촉매 히스티딘[참조: A.J. Barrett, in Proteinase inhibitors A.J. Barrett, G. Salvesen 편집(암스테르담 엘세비어 (1986), 3-22면]은 Hh 단백질내 7 위치에서 불변 히스티딘까지 배열된다. 약어는 다음과 같다: C-Shh, 병아리 소닉 hh(R.D.Riddle 등, Cell 75: 1401, 1993); M-Shh, 생쥐 소닉 hh(Y. Echelard 등, Cell 75: 1417, 1993)(Hhg-1과 동일함; R vhh-1, 쥐 vhh-1(H. Roelink등, Cell 76: 761, 1994); Z-Shh, 제브라피쉬 소닉 hh(S. Krauss등, Cell 75: 1431, 1993)(shh와 동일함) 및 제브라피쉬 vhh-1(H. Roelink등, 상기 참조); twhh, 기타 약어 없음; M-Dhh, 생쥐 데저트 hh(Y.Echelard등, Cell 75: 1417, 1993); M-Ihh, 마우스 인디언 hh(Echelard등, 상기 참조); CHT, 소 키모트립신; TRP, 소 트립신; ELA, 돼지 엘라스타제; UKH, 인간 유로키나제; CIR, 인간 보체 인간 1R; C1S, 인간 보체 인자 1S; MCP, 쥐 비만세포 프로테아제; FAX, 인간 혈액 응고인자 X; TPA, 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자.
도 2는 hh 암호 서열의 7개 잔기 영역(드로소필라 단백질내 잔기 323 내지 329)은 세린 프로테아제의 서열과 일부 유사성을 나타내는 것을 도시한다. 이 영역은 신호 전달 부위로부터 카르복시-말단까지의 거리의 약 ⅔에 있고, 모든 종에서 유래한 모든 hh 서열중에서 불변인 잔기(도 2에서 위치 4 및 7), Thr 및 His를 포함한다. 세린 프로테아제에서, 이 보존된 서열은 촉매작용에서 일반 염기로서 작용하는 불변 His를 포함한다(A.J.Barrett, in Proteinase inhibitors A.J. Barrett, G. Salvesen 편집, 암스테르담 엘세비어, 1986, 3-22면).
hh 단백질내 상기 불변 His 잔기가 실제로 자가 단백질분해에서 역할을 하는지를 측정하기 위해, 이.콜리로부터 두 개의 단백질을 정제하였다: 하나는 야생형의 서열을 보유하고, 다른 하나는 위치 329에 His 코돈(H329A)을 암호화하는 알라 코돈의 치환체를 포함한다. 이들 단백질은 둘다 신호 전달 부위 직전의 잔기로부터 카르복시-말단(잔기 83 내지 471; 이 단백질의 야생형 형태는 His6-U로 언급함)까지의 드로소필라 서열에 융합된 아미노 말단에 헥사-히스티딘 표지를 포함하도록 조작한 것이었다. Ni++-킬레이팅 매트릭스를 사용하여 변성 조건하에 두 단백질을 광범위하게 정제하였다. 도 3(A)는 이.콜리로부터 His6-U 및 His6-UH329A 단백질의 생산 및 정제를 나타내는 쿠마시 블루 염색된 폴리아크릴아미드 겔을 도시한 것이다. 샘플은 분자량 마커(레인 1 및 2); IPTG에 의한 유도의 부재하(레인 3) 및 존재하(레인 4)에서 His6-U 발현 구성물을 보유하는 이.콜리 세포의 용해물; 정제된 His6-U 단백질(레인 5); IPTG에 의한 유도의 부재하(레인 6) 및 존재하(레인 7)에서 His6-UH329A 발현 구성체를 보유하는 이.콜리 세포의 용해물; 정제된 His6-UH329A 단백질(레인 8)이었다. 정제된 단백질은 보다 낮은 상대질량의 여러개의 소수종을 제외하고는 거의 균질하였고; 이들 종은 비유도된 추출물에 부재하고 hh 항체로 검출가능하기 때문에 전체길이의 단백질의 내생 분해 생성물이다. 도 3(B)는 hh(레인 1); 0 시간(레인 2 및 5), 20 시간(레인 3 및 6) 및 20 mM TAME(세린 프로테아제 억제제)의 존재하에 20 시간(레인 4 및 7) 동안 절단 반응 완충액에서 항온처리된 His6-U 및 His6-UH329A 단백질을 발현시키도록 유도된 형질감염된 S2 세포를 나타내는 Ab2로 검출된 면역블롯이다. 항온배양시, His6-U는 Ab2와의 반응성 및 S2 세포에서 생산된 C와 동시 이동에 근거하여 C로 추측되는 단편을 방출하였으나, His6-UH329A 단백질은 그렇지 않았다. C(레인 3)의 방출은 TAME에 의해 부분적으로만 억제되었다.
예비 프로티나제 억제제 연구는 해독 반응의 개시시에 다양한 억제제를 첨가하여 시험관내 해독된 Hh 단백질상에서 실시하였다. 이들 연구는 다수의 프로테아제 억제제가 해독 효율을 낮추거나 또는 차단한다는 사실에 의해 복잡하게 되었다. 일부 경우에 억제제의 효율은 완료된 해독 반응에 억제제를 첨가하면 정상적으로 계속 일어나는 자가 변형처리를 억제하는 지를 측정하므로써 분석하였다. 이 시점에서 다음 사실을 확실히 언급할 수 있다: (1)세린 프로테아제 억제제 TAME(p-톨루엔설포닐-L-아르기닌 메틸 에스테르)는 시험관내 해독된 Hh 단백질의 자가 단백질분해를 억제하며; (ii) 대두의 트립신 억제제, a1 항-트립신, 아프로티닌, 루펩틴 및 E-64는 해독된 Hh 단백질의 자가 단백질분해를 차단하지 않으며; (iii) TAME는 정제된 His6-U 단백질의 자가 단백질분해를 부분적으로 억제한다(도 3, 패널 B).
도 3(B)에서 볼 수 있는 바와 같이, 변성제의 희석시, 야생형의 단백질은 Ab2에 의해 검출가능하고 시험관내 해독물 및 다양한 생체내 공급원으로부터 생산된 C종과의 이동성이 동일한 25 kD 종을 방출하였으나, H329A 돌연변이 단백질은 그렇지 않았다. 상기와 같은 절단은 야생형 단백질이 기타 프로토콜에 의해 정제 및 재생하고, 구별되는 조건하에 절단될 경우에도 관찰되었다. His6-U 및 His6-UH329A 단백질을 암호화하는 플라스미드는 야생형 또는 hh H329A ORF로부터 잔기 83 내지 471에 상응하는 서열을 pRSETB 발현 벡터(인비트로겐)내로 삽입함으로써 생성시켰다. 기본적인 정제는 당업계에 추천된 대로(사용된 정확한 조건의 상세한 프로토콜은 신청시에 이용가능함) 6M 구아니디늄 HCl 및 8 M 우레아를 사용하여 변성 프로토콜에 의해 Ni-NTA 아가로스 비드(퀴아젠)상에서 수행하였다. 세척액은 0.2%의 트윈 20 및 5 mM b-메르캅토에탄올을 함유하였다. 최종 세척 완충액은 6 M 우레아, 100 mM 트리스, 500 mM NaCl, 20% 글리세롤(pH 7.4)였다. 250 mM 이미다졸을 함유하는 최종 세척 완충액으로 용출시켰다. 시험관내 반응은 절단 완충액[50 mM 트리스, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.2% 트리톤 X-100, 50 mM DTT(pH 7.4)]에서 정제된 단백질(최종 혼합물에서 1:30으로 희석된 것)을 항온배양함으로써 수행하였다. 변성제 또는 세제가 없는 가용성의 전체길이의 His6-U 단백질을 분리하기 위해, 추가의 단계를 실시하였다(이것은 본 명세서에서 언급된 재생 프로토콜을 말한다).전술한 용출액에서 유래한 전체길이의 단백질은 침전에 의해, 투석을 통한 우레아 제거에 의해 분해 생성물로부터 추가로 정제하였다. 침전물은 구아니디늄 HCl을 함유하는 완충액에 재용해시키고 또 다른 Ni-NTA 아가로스 칼럼상에 적재하였다. 전술한 바와 같이 세척한 후, 단백질을 4℃에서 8 시간에 걸쳐 희석 완충액[(100 mM 트리스, 500 mM NaCl, 20% 글리세롤(pH 7.4)으로 우레아를 점진적으로 희석시켜(6 M에서 0.5 M까지) 재폴딩시켰다(비드에 부착된 채로). 단백질은 250 mM 이미다졸 및 0.5 M 우레아를 함유하는 희석 완충액으로 용출시켰다. 용출물을 4℃에서 100 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤(pH 7.4)에서 투석하고 -70℃에서 보관하였다.
실시예 3
hh의 자가 단백질 분해 기능의 지도화
상기 자가 단백질분해 작용을 담당하는 hh 단백질의 영역을 보다 정확히 규명하기 위해, 시험관내 변형처리에 여러 가지 구별되는 유형의 돌연변이의 영향을 시험하였다. 가장 유익한 돌연변이는 잔기 89 내지 254(Δ89-254)를 제거하는 결실인데, 상기 잔기는 함께 N 단편을 형성하는 것으로 추측되는 분자의 부분내 대부분의 아미노산을 구성하는 것이다. 드로소필라(도 4(A-C)) 및 제브라피쉬(도 4(D))에서 유래한 야생형 및 돌연변이 Hh 단백질의 시험관내 해독을 도시한다. 이들 단백질내 돌연변이 및 절단 부위(화살표)의 위치는 개략적으로 예시되어 있다(도 4(E)). 드로소필라 단백질(도 4(A, B 및 C))에서, 자가 단백질 분해는 COOH-말단에서의 몇가지 돌연변이(H329A, 294 trunc, 410 trunc, flu408 및 456 trunc)에 의해 차단되거나 또는 심각하게 억제되나, NH2-말단에서의 대형 결실(Δ89-254) 또는 flu-표지 에피토프 트라이머(flu227)의 삽입에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서 자가 단백질분해는 주로 C 단편내 잔기(아래 다이아그램에서 절단 부위 우측 서열)에 의해 좌우된다(도 1 참조). 또한, H329A/flu227 이중 돌연변이체는 혼합 실험(레인 11)에서 야생형 단백질에 의해 절단되지 않는데, 이것은 자가 단백질분해의 분자내 메카니즘을 암시하는 것이다. 제브라피쉬 유전자 twhh 및 shh에 의해 암호화되는 Hh 단백질은 드로소필라 단백질의 그것과 유사한 변형 처리 패턴(D)을 나타내지만, 각각의 제브라피쉬 단백질의 NH2-말단 단편(twhh는 23 kD, shh는 22 kD)은 COOH-말단 단편(twhh 및 shh 둘다 25 kD)보다 낮은 겉보기 질량을 가진다. 이것은 드로소필라 단백질과 비교하여 신호 서열에 선행하는 잔기의 짧은 연장체의 결과이다. 변형처리는 twhh 및 shh 단백질에서의 H273A 및 H270A 돌연변이(드로소필라 단백질에서 H329A 돌연변이와 유사함)에 의해 차단되는데, 이것은 드로소필라 단백질에 대해 관찰되는 것과 유사한 자가 단백질분해성 변형처리 메카니즘이 사용된다는 것을 암시하는 것이다.
TNT 연계된 전사-해독 시스템(프로메가)을 사용하여 시험관내 해독을 실시하였다. 자동방사선사진분석법에 의한 검출에는 35S 메티오닌(듀퐁 넨)을 사용하였다. 헤파린 결합 실험(도 8C)에서, 야생형 Hh 단백질을 생산하는 마이크로좀을 가진 시험관내 해독 용해물을 헤파린 결합 완충액(HBB, 20 mM 트리스(7.4), 150 mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100)으로 사전평형화한 헤파린 아가로스(시그마) 또는 세파로스 CL-4B(파마시아) 비드에 첨가하였다. 부드럽게 요동시키면서 4℃에서 샘플을 항온처리하였다. 비드를 펠렛화한 후, 일부 샘플내 상청액을 분석하였다(레인 2 및 4). 그 후 비드를 냉각된 HBB로 5회 세척하고, 이어서 샘플(레인 3 및 5)을 SDS PAGE 적재 완충액(F.M. Ausubel 등의 문헌, 상기 참조)에서 10 분 동안 80℃에서 용출시켰다.
hh 유전자내 모든 돌연변이는 플라스미드 pF1에 생성시켰다(J.J.Lee 등, 상기 참조). 제브라피쉬 twhh 및 shh 유전자내 돌연변이는 문헌[참조: Ekker 등, Current Biology, 5(8): 944 (1995)]에 개시된 대로 본래의 cDNA 클론을 사용하여 생성시켰다. 모든 점 돌연변이는 재조합 서클 PCR을 사용하여 생성시켰다[참조: D.H. Jones and S.C. Winistorfer, Biotechniques 12: 528 (1992)]. flu408 및 flu227 돌연변이는 인플루엔자 헤마글루티닌 항원의 삼량체(flu408은 42 잔기, flu227은 43 잔기)를 hh ORF에 존재하는 AlwN I 및 Bgl I 부위(각각 뉴클레오티드 위치 1604 및 1058)내로 삽입함으로써 생성시켰다(J.J. Lee등, 상기 참조). Δ89-254 돌연변이는 EcoN I 부위(644)와 Pml I 부위(1145) 사이의 서열을 제거함으로써 생성시켰다. 294 trunc 돌연변이는 Acc I 부위(1265)와 Xcm I 부위(1792) 사이의 서열을 제거함으로써 생성시켰다. 410 trunc 돌연변이는 전술한 방법으로 생성시켰고 Hh410으로 동정하였다(J.J. Lee등, 상기 참조). hh13E 대립인자내 돌연변이(C1756의 A로의 염기 변화; Tyr457의 정지 코돈으로의 코돈 변화)를 지도작성하기 위해서는, hh13E/TM3에서 분리한 DNA를 사용하여 PCR 반응을 개시함으로써 hh ORF 영역 및 주위 서열을 생성시키고, 블루스크립트 KSM(스트래터진)내로 서브클로닝하였다. 두 개의 상이한 PCR 증폭반응으로부터 유래한 6개의 클론을 각각 서열분석하였다.
도 4(A)의 레인 1 및 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 구성물은 33 kD의 예상된 상대질량에 상응하는 전체길이종, 및 보다 큰 종의 상대질량을 제공하는겉보기 상대질량(25 및 9 kD)의 두 개의 절단된 생성물을 생성시킨다. 절단된 생성물중 보다 작은 것은 때때로 도 4A에서 볼 수 있는 바와 같이 두 개의 밴드로서 이동할 것이다. 본원 발명자들은 분자량 측정용으로 14.3-kD 및 6.2-kD 마커 사이의 두 개의 밴드중 낮은 것을 선택하였다. 두 개의 절단된 생성물중 보다 큰 것은 야생형 단백질로부터 생산된 C 종과 함께 이동하는데, 이것은 Δ89-254 hh 단백질이 C에 통상 존재하는 잔기 및 자가 단백질분해에 요구되는 모든 결정인자, 예를 들면, 정상적인 절단 부위를 포함하며; N내 대부분의 잔기는 자가 단백질 분해 활성에 필수적이라는 것을 암시한다.
대조적으로, C내에 있는 것으로 추측되는 잔기에 영향을 미치는 병변은 시험관내에서 자가 단백질분해를 차단한다. 시험관내 해독에 의해 시험되는 모든 돌연변이는 면역블로팅에 의해 S2 세포에서도 검사하였다. 모든 경우에, S2 세포중의 절단 패턴은 C가 형성될 때마다 C*가 반드시 존재하는 것을 제외하고는 해독내에서 관찰된 것과 동일하였다. 이들은 상기한 H329A 돌연변이, 잔기 408 내지 409(flu408) 사이의 인플루엔자 비루스 에피토프를 삽입하는 돌연변이 및 카르복시 말단에서 단백질의 조기 종결을 일으키는 3개의 돌연변이를 포함한다. 두 개의 가장 심각한 절단, 즉 294 trunc 및 410 trunc는 시험관내에서 생성된 돌연변이이다. 이들은 단백질의 카르복시 말단으로부터 각각 177 및 61 잔기의 상실을 일으키고, 단백질분해를 일으키지 않는다. 456 trunc hh 단백질은 EMS-유도된 hh13E 돌연변이 대립인자에 의해 암호화된 것과 유사한데, 상기 대립인자는 단백질의 카르복시-말단으로부터 15개 잔기의 상실을 일으킨다. 이 단백질은 C 대신에 24 kD 밴드의 출현으로 입증되는 자가 단백질분해를 일으키지만, 반응의 효율은 시험관내에서 매우 손상된다(도 4B). hh 단백질의 자가 단백질분해는 주로 C내 잔기에 의해 좌우되며; 이 영역내 잔기의 결실 또는 변형은 변형처리의 효율 감소와 관련이 있고, 그러한 결실중 하나는 hh13E 돌연변이의 원인인 것으로 보인다.
전장 hh 단백질의 서열 상동성 및 자가 단백질분해 기능은 F 또는 C 단편이 서열 특이적 프로테아제일 가능성을 제안하였다. 자가 단백질분해의 메카니즘을 명확히 하기 위한 제 1 단계로서, 인플루엔자 비루스 에피토프 표지를 H329A 돌연변이도 보유하는 hh 개방 판독틀의 N-말단내로 도입시켰다. 도 4C는 에피토프 표지만을 삽입하면 자가 단백질분해가 방해받지 않으며(레인 9), 증가된 상대질량의 정상의 C 단편 및 N 단편을 산출함(레인 12의 야생형과 비교)을 나타내고 있다. 두 돌연변이를 보유하는 단백질은 단백질분해를 일으키지 않으며(레인 10), 에피토프-표지된 N-단편은 N과는 상이하게 이동하기 때문에, 이 이중 돌연변이체는 야생형 서열과 혼합시 분자간 절단을 탐색하는 이상적인 기질을 제공한다. 레인 11은 그러한 혼합물에서 정상의 N이 형성되지만, 표지된 N은 검출할 수 없음을 나타내고 있다. 따라서, 이 실험에서는, 이렇다할 분자간 절단이 일어나지 않는다. 본원 발명자들은 하기 두 실험에서 분자간 절단을 검출하지 못했다: (i) 야생형 및 410 trunc 서열의 S2 세포내로의 동시 형질감염(절단된 410 trunc 단백질은 보다 작고 따라서 동정가능한 C) 형을 산출할 것이다); (ii) 과량의 비표지되고 정제된 His6-U 단백질의 표지되고 시험관내 해독된 H329A 돌연변이 단백질과의 혼합. 따라서, 기타 단백질의 절단용 또는 자가 단백질분해의 조절용의 분자간 메카니즘을 배제할 수 없지만, 현재의 증거는 hh 단백질의 절단이 주로 분자간 메카니즘에 의해 일어남을 암시한다.
hh 유전자는 진화하면서 광범위하게 보존되어 다양한 무척추동물종에서는 동정되지 않은 단일 동족체로, 그리고 여러 가지 척추동물종의 각각에서 다수의 구별되는 동족체로 보존되어 왔다(Y. Echelard등, Cell 75: 1417, 1993; S. Krauss등, Cell 75: 1431, 1993; H. Roelink등, Cell, 상기 참조). 도 2에 도시한 바와 같이, 이들 암호 서열은 모두 드로소필라 단백질내 H329에 상응하는 위치에서 불변 히스티딘 및 기타 보존된 잔기를 포함한다. 또한, 마우스 유전자중 적어도 하나가 암호화하는 단백질은 드로소필라 단백질의 생체내 변형처리와 유사한 방법으로 두 개의 보다 작은 종은 산출하도록 변형처리되는 것으로 보인다. 자가 단백질분해가 척추동물에서도 역할을 하는 지를 측정하기 위해, 본원 발명자들은 제브라피쉬로부터 두 개의 특징적 hh 동족체, 즉 twhh 및 shh에 의해 암호화된 단백질의 특성을 검사하였다. 도 4D는 이들 서열이 시험관내에서 해독될 경우, 그 상대질량이 대략 전체길이의 단백질의 상대질량에 이르는 보다 작은 종이 생성됨을 입증하고 있다(레인 1 및 3). 레인 2 및 4에 도시한 바와 같이, 상기 절단 반응은 드로소필라내 H329에 상응하는 위치에서 His 코돈을 Ala 코돈으로 치환함으로써 차단한다(도 2 참조). 따라서, 척추동물 hh 단백질은 드로소필라 단백질과 유사한 메카니즘에 의해 변형처리되는 것으로 보인다.
실시예 4
배에서의 자가 단백질분해의 역할
hh 유전자에 대한 다수의 기능이 드로소필라에서 설명되었다. 형태학적 수준에서, 이들 기능은 유충 표피 구조 및 눈과 부속기관 같은 성체 구조물의 유형화에 역할을 포함하고(C. Nusslein-Volhard and E. Wieschaus, Nature 287: 795, 1980; and J. Mohler, Genetics 120: 1061, 1988); 형태학적 효과에 대한 기계적 기초는 배 및 성체 디스크에서의 유전자 발현의 유지 또는 유도를 신호하는 것과 관련된다(J.J. Lee등, 상기 참조; T. Tabata and T.B. Kornberg, Cell 76: 89, 1994; and K. Basler and G. Struhl, Nature 368: 208, 1994). 이들 기능에 대한 자가 단백질분해의 중요성을 확인하기 위해, hsp 70 프로모터의 조절하의 H329A 돌연변이 유전자는 P 요소-매개 형질전환에 의해 드로소필라 배선내로 도입시켰다. hshh H329A 구성체는 H329A 돌연변이를 포함하는 hh ORF 단편을 사용하여 hshh 구성체와 동일하게 제조하였다. 돌연변이 파리는 P 원소 매개 형질전환의 표준 방법을 사용하여 y1w1118 모균주로부터 생성시켰다(A.C. Spradling and G.M. Rubin, Science 218: 341, 1982). 두 번째 염색체상에 hshh H329A P원소를 보유하는 HA3 세포주는 동형접합자 군으로 유지되었다. wg 스트라이프의 확장을 분석하기 위해, 25℃에서 산란한후(AEL) 4 내지 6 시간후에 수집된 배는 고정시키기 전에 하기 열충격 프로토콜에 적용시켰다. 단일 충격을 받는 배(37℃에서 10 또는 30분)는 25℃에서 1 시간 동안 회수하였다. 이중 충격(37℃에서 두 번의 10분 또는 30분 충격)을 받는 배는 첫 번째 충격후 90분 및 두 번째 충격후 40분째에 회수하였다(두번의 회수는 25℃에서 이루어졌다. 이중의 30분 프로토콜은 종래 문헌(S. Krauss, 상기 참조)에 개시된 대로 실시하였다). wg 특이 프로브(D.T. Chang등, 상기 참조)를 사용하여 동일계 혼성화를 실시하였다. 표피 표현형에 대해 분석하는 배는 37℃에서 30분 동안 산란후 6 내지 8시간째에 열충격을 주고, 25℃에서 36 시간 동안 발육시킨 다음, 문헌[M. Ashburner, Drosophila: A Laboratory Manual, 뉴욕 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스]에 개시된 대로 변형처리 및 장착하였다. 면역국부화(단일 또는 이중 염색)를 당업계에 개시된 대로 실시하였다. 1차 항체의 경우 친화도 정제된 Ab1 또는 Ab2를, 2차 항체의 경우 알칼리 포스파타제(AP) 또는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합된 항 토끼 또는 마우스 IgG(잭슨 임뮤노리서치)를 사용하였다. hh13E 대립인자와 동형접합자인 hh13E/TM3 ftz-lacZ(밸런서 염색체는 블루밍 스톡 센터에서 균주 3218로 입수함)군에서 유래한 배는 Ab2와 이중 염색에서 항 b-갈락토시다제 항체(프로메가)에 의한 염색 없이 동정하였다(도 9, 패널 D). 2차 항체인 AP 접합된 항-토끼 IgG를 사용하여 도 9의 패널 B 및 C의 염색을 실시하여 캔턴-S 배를 포름알데히드 고정시켰다. 표준 포름알데히드 고정을 일반적으로 사용하지만, 열 및 산-포름알데히드 고정 역시 유사한 결과를 제공한다. Hh 단백질로부터 잔기 83 내지 160 또는 300 내지 391을 포함하는 GST 융합 단백질을 이.콜리에서 발현시키고, 문헌[F.M. Ausubel등, 상기 참조)에 추천된 대로 정제하고, 표준 방법에 의해 토끼를 면역화하는 데에 사용하였다. 항체들은 Affi-Gel 10 비드(바이오-래드)에 연결된 His6-U 단백질(Harlow and Lane, 상기 참조)의 칼럼상에서 친화도 정제하였다. 정제는 산 및 염기 용출액이 10%의 디옥산을 함유한 것을 제외하고는, 문헌[Harlow and Lane, 상기 참조]에 공지된 대로 실시하였다. 비오티닐화된 hh 항체는 단백질 A 칼럼위로 토끼 항혈청을 정제하고, 임뮤노프로브 비오티닐화 키트(시그마)를 사용하여 비오티닐화함으로써 제조하였다. 조직 균질화를 위해 0.25 mM PMSF 및 5 mM EDTA를 함유하는 냉 RIPA 용해 완충액을 사용하여 문헌[Harlow and Lane, 상기 참조]에 개시된 대로 면역 침전을 실시하였다. 용해물을 면역전 토끼 혈청과 단백질 A 비드(Gibco-BRL)를 사용하여 2회 사전 세정하였다. 그 후 친화도-정제된 항체 또는 면역전 혈청을 첨가하고, 세척용 NP-40 용해 완충액을 사용하고 단백질 A 비드를 사용하여 면역침전을 실시하였다.
도 5(A) 및 5(B)는 각각 Ab1 및 AB2 항체를 사용하여 현상한 면역블롯이다. 레인 1 및 6은 유도된 비형질감염된 S2 세포; 레인 2 및 7은 hh를 발현하도록 유도된 형질감염된 S2 세포; 레인 3 및 8은 열충격을 받은 야생형 배; 레인 4 및 9는 열충격을 받은 hshh 배; 레인 5 및 10은 열충격을 받은 hshh H329A 배이다. 열충격을 받은 hshh 배에서는, 야생형 Hh 단백질이 둘다 유도되고 적절히 변형되어 기타 발현 부분에서 확인되는 U, N, C 및 C*종을 생성시킨다. 대조적으로 H329A는 hshh H329A 배에서는 유도되지만, 이렇다하게 변형되지는 않는다(레인 5 및 10의 저레베로 변형된 종은 레인 3 및 8에서 열충격을 받은 야생형 배에서와 동일한 수준로 확인되기 때문에 내생의 hh 발현으로부터 기인하는 것 같다).
도 5는 Ab1 및 Ab2(레인 5 및 10)과의 상호작용 및 그 이동성에 근거한 U에 상응하는 풍부한 종의 형성을 초래하는 열충격 유도 작용을 도시하고 있다. 대조적으로, 유사한 구성체를 사용한 야생형 hh 단백질의 유도는 절단되지 않은 U는 거의 없이 N 및 C 변형된 생성물(레인 4 및 9)의 유사한 수준을 초래하였다. 따라서, 시험관내에서 그리고 S2 세포에서 관찰되는 바와 같이, 배내 H329A 돌연변이는 hh 단백질의 자가 단백질분해 절단 효율을 상당히 감소시키는 것 같다.
도 6에서는, 동일계 혼성화에 의해 나타나는 wingless(wg) RNA의 배 분포가 도시되어 있고, 90-분 회수 기간에 의해 분리되는 두 번의 10분 열충격에 노출된 야생형(동형접합성 y1w1118) 배는 도 6(B)에, hshh 배는 도 6(B)에, 그리고 hshh H329A 배는 도 6(C)에 도시되어 있다. 야생형 배는 wg 발현에서 거의 변화를 나타내지 않은 반면, 야생형 단백질 및 그보다 적은 정도로 H329A 단백질은 각각 변위된 wg 발현을 유도하였다(표 1). 패널 (D), (E) 및 (F)는 y1w1118, hshh 및 hshh H329A 유충의 척추의 표면을 네 번째 복부 분절 수준로 나타낸다. 이들 유충은 배처럼 30분 동안 충격을 가했으며, 배가 완전히 발생되도록 하였다. 표피 세포형(1°, 2°, 3° 및 4°)은 문헌[J. Heemskerk and S. DiNardo, Cell 76: 449, 1994]에 개시된 대로 표지한다. hshh H329A 배(F)의 표현형이 대조군의 배(D)의 그것과 동일한 조건하에 hshh 배(E)에서 3° 및 4°형에 의한 2° 세포형의 확장(벗겨진 표피)을 주목하라.
Hh 단백질에 대해 가장 최초로 알려진 요건은 아마도 각각의 배분절에서 wingless(wg) 발현의 인접 스트라이프의 유지에 있다(A. Martinez Arias등, Development 103: 157, 1988; and S. DiNardo등, Nature 332: 604, 1988). 이 요건은 hh 기능이 부재할 경우 wg 발현의 상실로부터 추론되고; 또한, 야생형 Hh 단백질의 편재성 발현은 wg 유전자 발현 영역의 확장을 유도한다(P.W. Ingham, Nature 366: 560, 1993). wg 확장시 H329A 돌연변이의 효과는 야생형 구성체를 포함하는 배와 유사하게 H329A 돌연변이 구성체를 보유하는 배에 열충격을 가함으로써 검사하였다. H329A 돌연변이 단백질이 wg 영역의 약간의 확장을 유도할 수 있지만, 이 활성의 효율은 야생형 단백질의 그것에 비해 손상된다(도 6(B) 및 6(C), 표 1). 열충격 방법에 따라 거의 3배만큼 높은 효율의 차이가 있으며, 이 결과는 Hh 단백질의 자가 단백질분해가 wg 발현을 유도하도록 배를 신호하는 데에 있어 최적 활성에 대해 중요함을 암시하는 것이다.
wg 발현*의 배 유도에서의 야생형 및 돌연변이 hh 활성
열충격 시간(분)
10 30 10/10 30/30
hshh 1.0±0.3(93) 1.5±0.6(120) 2.9±0.3(41) 2.8±0.4(54)
hshh H329A 0.7±0.5(190) 0.9±0.4(111) 1.1±0.4(145) 1.9±0.5(93)
* 야생형 대조군을 넘는 wg 발현의 확장은 괄호안에 기재된 배의 수를 사용하여 세포 직경의 평균치 ± 표준편차로서 제시한다.
피 구조물의 유형화에 Hh 단백질이 미치는 효과는 4개의 구별되는 세포형이 각각의 인접 분절에서 확인될 수 있는 유충의 척추 표면상에서 가장 명확히 볼 수 있다. 이들 세포형은 전엽으로부터 후엽으로 1°, 2°, 3° 및 4°로 지정되고, hh 전사는 1° 세포의 전구물질에서 일어난다(J. Heemskerk and S. DiNardo, 상기 참조). 처음 3개의 세포형의 분화는 hh 유전자 기능에 의해 좌우되는 것으로 나타났고, 이들 세포의 사멸은 Hh 단백질의 농도에 의해 측정되며, 최고 농도는 1°의 사멸을, 중간 농도는 2°의 사멸을, 그리고 최저의 농도는 3°의 사멸을 일으킨다(Heemskerk and S. DiNardo, 상기 참조). 이 제안은 가장 전엽의 세포형이 hh 발현의 감소에 대해 최대의 민감도를 나타내고, 3°강모의 전부 및 4°강모의 일부는 hh가 편재되어 고수준로 발현될 경우 보다 전엽의 2° 세포형의 벗겨진 표피 특성에 의해 대체된다는 관찰에 의해 지지되었다. 본원 발명자들은 야생형 구성체를 보유하는 배의 열충격 유도에 의해 3° 및 4° 사멸의 억제를 재현하였으나(도 6E), H329A 돌연변이체가 유충의 척추 표피에서 세포 사멸을 변화시킬 수 없음을 발견하였다. 따라서, 자가 단백질분해, 또는 H329A 돌연변이에 의해 차단된 일부 기타 기능은 척추 표피에 Hh 단백질이 미치는 유형화 영향에 필수적인 것 같다.
실시예 5
H329A 돌연변이가 성체 디스크에서의 신호 전달에 미치는 효과
H329A 돌연변이 단백질의 연구는 성체 구조의 유형화 및 성체 디스크 내에서의 신호작용에 대한 기능에까지 확장되었다. 눈의 성체 디스크에서 hh 기능은 패턴의 적당한 발육에 필요하고(J. Mohler, Genetics 120: 1061, 1988; J.J. Lee, 상기 참조; 및 J. Mohler and K. Vani, 상기 참조), 보다 최근에는 눈의 형태발생구에서 데카펜타플레직(decapentaplegic: dpp) 유전자의 유도를 통해 분화 신호의 진행을 조절하는 것으로 나타났다(U. Heberlein등, Cell 75: 913, 1993; and C. Ma등, Cell 75: 927, 1993). 다리 및 날개 디스크에서, hh의 변위된 발현은 또한 패턴 중복 및 결함을 산출하는 것으로 나타났고, 전엽/후엽 구획 경계를 따라 일정 대역에서 정상적으로 발현되는 기타 신호 전달 분자의 변위된 발현의 유도와 관련이 있다(T. Tabata and T.B. Kornberg, Cell 76: 89, 1994; and K. Basler and G. Struhl, Nature 368: 208, 1994).
성체 디스크에서의 신호 절달의 연구를 위해 열순환기를 이용하여 열충격-유도성 hh 구성체를 보유하는 유충을 연속적인 수차례의 열충격 및 회수에 적용시켰다. 성체 디스크에서의 dpp 및 wg의 발현에 미치는 온도 순환의 효과는 dpp 프로모터 서열을 보유하는 리포터 유전자로부터 또는 wg 유전자에 삽입된 인핸서 검출자 P 원소로부터 β-갈락토시다제 발현을 모니터함으로써 검사하였다. 도 7에서는, X-gal 염색을 사용하여 wg-lacZ 또는 dpp-lacZ 리포터 유전자를 보유하는 후기 단계의 제 3의 영 유충의 성체 디스크에서의 wg(도 7A-C) 또는 dpp(도 D-L) 발현을 추적하였다. 대조군 유충(A, D, G, J)로부터 유래한 다리(A-F), 날개(G-I) 및 눈-촉각 디스크(J-L), hshh 돌연변이유전자를 포함하는 유충(B, E, H, K) 및 hshh H329A 돌연변이유전자를 보유하는 유충(C, F, I, L)이 나타난다. 모든 패널에서 전엽은 좌측에 있다. 화살표는 다음과 같은 특징을 강조하는 것이다: hshh H329A 유충(I)에서 날개 디스크의 전엽 구획에서의 dpp 발현의 변위된 패치; 및 hshh 유충(K)에서의 형태발생구(보다 후엽에 위치하는 dpp 발현의 다른 밴드에 의해 표시됨)에 대해 전엽인 눈-촉각 디스크의 눈 부분에서의 dpp 발현의 변위된 밴드. 다리 디스크에서의 wg 발현, 다리에서의 dpp 발현 및 hshh 유충에서의 날개 디스크의 전엽 구획내로의 확장은 hh의 변위된 발현에 대해 기술한 것과 유사하다. 다리의 전엽 구획(B 및 E) 및 날개 디스크(H)에서의 형태적 변화 역시 개시되어 있다(K. Basler and G. Struhl, 상기 참조). 대조적으로, hshh H329A 및 대조군 유충에서 유래한 디스크는 연장된 열충격 조건하에서조차도 wg 및 dpp 발현에 거의 변화를 나타내지 않았으며, 형태적 변화도 관찰되지 않았다. 도 7(M-O)는 유충의 발육중에 상기 성체 디스크 실험과 유사한 방법으로 충격을 받은 성체 대조군(M), hshh(N) 및 hshh H329A(O) 파리의 눈의 표현형을 나타낸다. hshh 파리에서는 중복된 눈의 구조가 관찰되었으나, hshh H329A 파리에서는 관찰되지 않았다. (N)에서의 화살표는 두 개의 눈 구조사이의 표피의 얇은 스트립을 가리킨다. hshh 파리에서는 기타의 기형도 확인된다(예를 들면, N과 M의 흉강 비교).
동형접합주 hshh(D.T. Chang등, Development, 1994, 발행중), hshh H329A 및 y1w1118에서 유래한 처녀자성 파리를 동형접합주 BS3.0(제 2 염색체상의 P 원소 dpp 리포터 구성체 보유, 이하 dpp-lacZ로 칭함)(R.K. Blackman등, Development 111: 657, 1991) 또는 y주; Sco/CyO, enlacZ11::wg(제 2 염색체 밸런서상에 wg 리포터 P 원소 인핸서 트랩 보유, wg-lacZ로 불림)(J.A. Kassis등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 89: 1919, 1992)에서 유래한 웅성 파리와 교배하였다. 자손을 효모 페이스트를 함유하는 통기된 0.5-㎖ 미량원심분리관에서 25℃에서 증식시켜 후기의 제 2 영 또는 초기의 제 3 영 단계의 유충을 발육시켰다. 그 후 유충을 37℃에서 30분 동안 계속 순환시킨다음, 그들이 후기 제 3 영 단계에 도달할 때까지 퍼킨-엘머 열순환기에서 25℃에서 90분 동안 순환시켰다. 이어서 이들을 분리하고, 문헌[M. Ashburner, 상기 참조)에 개시된 대로 X-gal로 염색하거나 또는 표현형 분석을 위해 성체가 될 때까지 성장시켰다.
도 7(A)에 도시된 바와 같이, wg 발현은 통상적으로 전엽/후엽 구획 경계를 따라 다리 디스크의 복부 섹터에서 일어나는 반면에, dpp는 이 경계를 따라 디스크의 척추부에서 발현된다(도 7(D)). 변위된 hh 발현(도 7(B) 및 (E))에 대해 상기에 보고한 바와 같이, 야생형 hh 유전자를 보유하는 유충의 열순환이 비정상적 다리 디스크 형태 및 두 표적 유전자의 광범위한 변위된 발현을 일으키지만, H329A 구성체는 이들 발현 패턴에서 검출가능한 차이를 거의 산출하지 못했다(도 7(C) 및 (E)). 날개 디스크에서의 변위된 hh 발현은 또한 형태의 변화 및 dpp의 확장된 발현을 초래하지만(도 7(G) 및 (H) 비교), H329A 구성체는 전엽의 변위된 발현의 작은 패치를 단지 이따금씩만 생성시켰다(도 7(I)).
야생형 hh의 편재성 발현은 또한 눈-촉각 디스크에서의 dpp의 변위된 발현을 초래한다(도 7(J) 및 (K) 비교). 이 디스크의 촉각부에서는 dpp 발현의 확장이 다리 디스크에서 관찰되는 것과 유사하다. 상기 디스크의 눈 부분에서는 dpp 발현이 구내 그 정상 위치에서 관찰되나; 변위된 발현 역시 그 구의 다소 전엽의 위치에서 제 2의 척추-복부 밴드 형태에서 나타나며, 따라서, 두 개의 형태발생구를 가진 눈 디스크의 외관을 제공한다(도 7(K)). 실제로, 야생형 hh 구성체를 보유하는 온도-순환된 유충에서 유래한 성체에서는, 도 7(N)에서와 같은 외관상 중복된 눈 구조가 관찰될 수 있는데, 두 개의 눈 구조는 표피의 얇은 스트립을 분리된다(화살표). 대조적으로, H329A 돌연변이 단백질은 눈-촉각 디스크의 어느 한 부분에서의 dpp 발현을 유도하지 않았으며, 성체에서의 눈의 중복 또는 표피의 결함을 유도하지 않았다(도 7(O)).
지금까지 기술한 실험은 2일간의 열순환에 이어 성체 구조의 분석을 위해 즉각적인 해부 또는 성체 구조의 분석을 위한 항온에서의 추가의 배양에 적용시킨 다수의 유충 계열을 포함한다. H329A 단백질은 이들 실험에서 거의 활성을 가지 않는 것으로 보이지만, 날개 디스크에서 유도된 변위된 dpp 발현의 작은 패치(도 7(I), 화살표)는 약간의 잔류 활성이 잔존함을 암시하였다. 이 암시는 해부하기 전에 3일간의 순환을 포함하는 유사 실험에서도 나타났다: H329A 단백질은 이 실험에서 약간의 dpp-유도 활성을 나타냈는데, 이것은 아마도 보다 긴 순환 기간중에 축적된 보다 다량의 단백질로 인한 결과로 보인다. 구체적으로 날개 뿐만 아니라 기타 성체 디스크는 낮고 다양한 양의 변위된 dpp 발현을 나타냈다. 모든 경우에서 상기의 발현은 유사하게 시험한 야생형 구성체에 대해 관찰한 것보다 훨씬 더 광범위했으며; 또한 야생형 단백질의 경우 매우 흔하지만 성체 디스크의 형태의 변형은 H329A 단백질의 경우에는 극히 드물었다.그 효능이 야생형과 비교하여 상당히 감소되지만, H329A 단백질은 wg 및 dpp 발현의 초기 배 및 성체 디스크 유도에서 적어도 약간의 활성을 보유하였고; 대조적으로, 야생형 단백질에 의한 효과에 대해 요구된 것보다 훨씬 더 심각한 열충격 조건하에서도 H329A 돌연변이체는 유충의 척추 표피에서 세포 사멸의 재규명과 관련하여 완전히 불활성으로 잔존하였다.
실시예 6
배양된 세포 상청액내로의 N 및 C의 차등 방출
hh 기능의 기묘한 특징은 wg 및 dpp에 대해 신호 작용을 하는 배 및 성체 디스크와 같은 환경에서의 그 외관상 짧은 범위의 작용과, 척추 유충 표피의 패턴화와 같은 다른 환경에서의 보다 장기의 작용이다. 생체 내에서의 두 개의 주요 단백질 생성물의 상기 관찰 및 그 존재는 본원 발명자들이 S2 배양 세포에서 발현되는 N 및 C의 용해도 또는 확산성의 차이를 찾는 것을 용이하게 했다. 도 8(A) 및 (B)는 Ab1(A) 및 Ab2(B)로 형성시킨 Hh 단백질을 발현시키는 형질감염된 S2 세포 배양으로부터 유래한 세포 펠렛(레인 1) 또는 상청액(레인 2)의 면역블롯이다. 각 레인의 샘플은 동일한 부피의 재현탁된 전체 배양액으로부터 취했다. N은 주로 세포 펠렛과 연합된 채로 잔존하는 반면(도 8(A)의 레인 1 및 2 비교), C는 상청액내로 거의 정량적으로 방출되었다(도 8(B)의 레인 1 및 2). U는 N과 C(도 8A 및 8B)의 성질 사이의 분배성질을 나타냈다. 도 8(C)는 다양한 종의 헤파린 결합 활성이 마이크로좀을 사용한 시험관내 해독에 의해 생성됨을 입증한다. 샘플들은 전체 해독 혼합물(레인 1); 헤파린 아가로스 또는 아가로스(대조용) 비드와 항온배양후의 상청액(레인 2 및 4); 및 세척후 헤파린 아가로스 또는 아가로스 비드로부터 용출된 재료(레인 3 및 5)였다. F, U, Nss 및 N 단편은 헤파린 아가로로 항온배양한 반응물에서는 고갈되었으나 아가로스 비드로 항온배양한 것에서는 그렇지 않았으며(레인 2 및 4를 1과 비교), 이어서 동일종은 헤파린 아가로스로부터는 용출되었으나 아가로스 비드로부터는 그렇지 않았다(레인 3 및 5를 레인 1과 비교). 도 8(A) 및 8B는 실제로 상기 단백질들이 세포와 연합된 채로 잔존하는 대부분의 N 단편 및 배양 상청액내로 방출되는 모든 또는 거의 모든 C 단편과 상이한 특성을 가짐을 나타내고 있다.
이 차등 특성에 대해 한가지 가능한 설명은 S2 세포의 표면상의 세포외 매트릭스 단백질과 N 단편의 연합일 수 있다. 따라서, 헤파린 결합이 세포외 매트릭스와 연합하는 단백질의 공통된 성질이기 때문에, 헤파린 아가로스에 대한 상기 두 단백질의 상대 친화도를 검사하였다.
배양된 세포로부터 가용성 N을 얻는 데에는 명백한 난점이 있기 때문에 마이크로좀의 존재하에서의 시험관내 해독을 이용하여 가용성의 표지된 N 및 C를 생성시켰다. 도 8(C)에 도시된 바와 같이, C가 아닌 N은 헤파린 아가로스 비드로 처리하면 해독 추출물로부터 고갈되는 반면, 비변형된 아가로스 비드로 처리하면 어느 단편도 고갈되지 않았다. 또한, C가 아닌 N은 0.1% 트리톤 X-100 및 150 mM NaCl을 함유하는 용액에 의한 광범위한 세척시에 헤파린 아가로스 비드상에 보유되었으나; 대조적으로, 비변형된 아가로스에 의해서는 어느 단편도 보유되지 않았다. C가 아닌 N은 헤파린에 강하게 결합하며, 이 특성은 배양 상청액내로 방출되는 저농도의 N이 세포외 매트릭스에 결합한 결과일 수 있음을 암시한다. 배양 상청액내로의 N 및 C의 차등 방출의 원인이 될 수 있는 또 하나의 메카니즘은 C가 아닌 N에 대한 수용체의 S2 세포에서의 발현일 수 있다. 본원 발명자들의 현재의 데이터로는 이러한 가능성들을 구별할 수 없다.
실시예 7
N 및 C 의 현저한 배 편재화
배양된 세포 상청액내로 N 및 C의 차등 방출은 이들 단편들이 배 내에서 다르게 편재화될 수 있음을 제안하고 있다. 이전에 보고된 hh 단백질 편재화는 N 에피토프에 특이적인 항체 또는 N 과 C를 구별할 수 없는 항체를 이용하였다. 도 9는 hh 전사체의 동일계내 편재화에 의한 배 내에서의 N 및 C 의 차등 편재화를 나타내고 있다. 도 9(A) 는 각각 패널 (9B) 및 (9C) 내에서 Ab1 및 Ab2로 검출된 N 및 C 에피토프의 분포를 비교하여 나타냈다. 주의할 것은 각각의 N 및 C 에피토프의 분포는 각 단편 유니트의 약 1/3 내지 1/2에 걸치는 반면, 상기 전사체는 각 유니트의 약 1/4로 제한된다는 점이다. 도 9(D)에서, hh13E 에 대해 동형접합인 배 내에서의 C 에피토프의 편재화는 Ab2를 이용하여 검출하였다. 손상된 자가단백질 분해 활성을 나타내는 상기 돌연변이주 내의 C 에피토프는 더 제한되며, N의 야생형 편재화와 유사하다. 동형접합 hh13E 배는 동형접합 모액으로부터 표지된 평형유지자를 손실시켜 동정하였다. 모든 배는 9 단계 후반까지 중간에 위치하였다(확장된 배-밴드).
도 9(B)는 동일한 단계(도 9(A))에서 hh 전사체의 단편적으로 편재화된 분포보다 약간 더 넓은 단편적으로 편재화된 분포를 나타내는, N 에피토프에 특이적인 Ab1을 나타내고 있는데, 이는 이들 자료와도 부합되는 것이다. 또는, 더 후속 단계에서 N 에피토프가 다량의 점상 구조물을 축적시키는 것에 대한 관찰도 상기 자료와 일치한다. 항체 염색이 더 약하나, 이후에 표피를 주름지게하고, 이로써 해독을 복잡하게 하는 함입부 및 틈의 형성 이전인 경우, 본 발명자들의 분석은 초기 단계에 집중된다. 또한, Ab2 를 이용하여 여러 가지 고정 및 염색법으로 C-특이성 에피토프를 검출하였다. 상기한 바와 같이, C 에피토프의 검출이 N 에피토프의 검출보다 더 복잡하지만, 본 발명자들은 N 보다 더 넓은 분포임에도 불구하고, 단편적으로 조정된 패턴을 일관되게 관찰하였다(도 9C). 또한, 상기 편재화는 현저한데, 그 이유는 초기 또는 후기 단계에서 C 에피토프가 N의 특성인 점상 구조물에서는 확인되자 않는다는데 있다.
hh13E 돌연변이는 COOH-말단에 보편적으로 존재하는 15 개의 잔기가 결실된, 조기에 절단된 단백질을 암호화한다. 상기 단백질은 자가단백질 분해에서 많은 감소된 효율을 나타내기 때문에, 상기 돌연변이주 바탕액 내에서 C의 분포를 조사하였다. 도 9(D)는 동형접합 hh13E 배(표지된 평형유지자의 부재에 의해 동정됨) 내의 C 에피토프는 야생형 보다 더 견고한 단편적인 패턴으로 분포되는 것으로 확인되었다. 상기 편재화는 N 의 편재화와 유사하며, 따라서 본 발명자들은 보편적으로 나타나는 C 에피토프의 넓은 분포는 합성 위치 근처에 미절단 전구물질의 체류에 의해 hh13E 내에서 변경되는 결론을 얻었다.
실시예 8
활성 헤지호그 단백질의 발생에서 자가 단백질 분해의 역할
신호 전달 이외에, hh 단백질은 내부 위치에서 자가 단백질 분해를 수행하여 생체 내에서 관찰되는 현저한 단백질 종을 생성하였다. 모든 또는 대부분의 아미노산 잔기는 상기 내부 절단의 카르복시-말단 생성물인 C에 대한 자가 단백질 기능 지도를 위해 요구된다. 기능을 위한 자가 단백질 분해의 중요성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 시험관 내에서 hh 단백질의 자가 단백질 분해를 차단하는 단일 잔기 돌연변이(H329A)를 도입하였으며, 상기 단백질의 처리 및 기능은 생체내에서 손상된 것으로 입증되었다. 유사한 수준의 유도된 단백질이 야생형 구성물을 보유하는 균주 또는 돌연변이 구성물의 독립 삽입물을 함유하는 몇몇 균주로부터 검출되었기 때문에(도 5), 야생형에 비해 H329A 단백질의 손상된 기능은 감소된 발현 수준의 감소에 기인하는 것은 아니었다. 자가 단백질 분해의 역할에 대한 추가 증거는 hh13E 돌연변이의 효과로부터 유래하는데, 상기 효과는 시험관 내에서 hh 단백질의 자가 단백질 분해를 감소시키나, 제거하지는 않는다(도 4). 따라서, hh13E 돌연변이는 생체 내에서 중간체 세기의 표현형과 관련되어 있다[J. Mohler의 상기 문헌 참조].
흥미롭게도, 상기 H329A Hh 단백질은 배 신호 전달에서 미약한 활성을 보유하여 에피토프성 wg 발현을 유도하며, 에피포프성 wg 및 dpp 발현의 유도를 위해 성체판 내에서 더 적은 정도로 작용할 수 있다. 배 및 성체 조직 내에서 적어도 몇몇 신호 전달 기능의 체류와는 대조적으로, 애벌레의 등 큐우티클 내에서 세포 운명을 재프로그램할 수 있는 능력에 대해 분석하는 경우, H329 단백질은 완전히 불활성이었다.
H329 단백질이 활성이 있거나 부분적으로 활성이 있는 분석은 보편적으로 하나 또는 많아야 몇 개의 세포 직경을 가로질러 발생하는 단기의 신호 전달을 포함하며; 대조적으로, H329A 단백질은 등 큐우티클의 패턴화, 보편적으로 대부분의 단편을 가로질러 작동하는 장기의 할성에 대해 아무런 효과도 발휘하지 못했다. 장기의 패턴화 활성을 설명하기 위한 이전의 제안은 hh 발현이 이후 패턴화 기능을 수행하는 기타 신호 전달 분자를 유도하는 것을 의미하는 것이었다[참조: 신호 중계 모델; 도 10(A)]. 도 10은 hh 단백질 작용에 대한 신호 중계 모델과 이중 기능 모델을 나타내고 있다. 도 10(A)에서, hh 신호 전달의 장기의 효과는 제 2 신호 전달 분자(X)의 단기 유도를 통해 간접적으로 획득되었다. 그의 생화학적 특성 및 그의 제한된 조직 편재화에 기초하여, N 은 단기 신호를 의미하는 반면, C의 역할은 N의 생성을 위해 요구되는 촉매 기구를 공급하는 것으로 제한된다. 도 10(B)에서, hh 의 긴- 및 단기의 신호 전달 기능은 U 전구물질의 내부 자가 단백질 분해에 의해 유도되는 N 및 C 단백질에 의해 공급된다. N 은 그의 합성을 위한 세포성 위치 근처에 체류하므로써 단기의 신호 전달에 관여하는 반면, C 는 그의 분포에서 덜 제한되며, 장기의 신호 전달 기능을 수행한다. 상기 두 모델에서, 자가 단백질 분해는 완전히 활성인 신호 전달 단백질을 생성하기 위해 필요하다. 본 명세서에 기재된 추가 설명을 참조할 것.
이들 제안은 단기의 신호 전달의 간접적인 결과로서 hh 생성물의 명백한 장기 활성을 합리화하므로써 헤지호그 작용의 일관된 모드를 유지하려는데 있다. 관찰된 분포에 따르면, 상기 모델내의 활성 분자는 N 일 수 있으며, C 의 역할은 N 의 발생을 위해 필요한 촉매 기구를 공급하는 것으로 제한된다.
본 발명자들의 증거는 대체 모델을 제공하는데, 이는 이중 기능 모델(도 10(B))로서, hh 단백질의 장기 및 단기 활성은 생체 내에서 관찰되는 상기 분자의 두가지 현저한 형태인 N 및 C에 의해 수행될 수 있다는 모델이다. 배 내에서 단편적으로 조절된 분포에도 불구하고, hh를 발현하는 S2 세포 및 그의 넓은 부위의 배양 배지내로 C 단편의 거의 정량적인 방출은 C 가 장기의 신호 전달 기능을 수행하거나, 그 기능에 기여할 수 있음을 의미하는 것이다. 한편, N 단편은 주로 S2 세포의 발현 및 헤파린에 대한 결합과도 관련되어 있는데, 이는 외세포성 매트릭스와의 가능한 관계를 의미하는 것이다. N 의 상기 특성 및 단편적으로 제한된 배 분포는 단기의 hh 신호 전달 활성을 수행하기 위한 역할을 암시하는 것이다. 본 발명자들이 테스트한 척추동물의 Hh 단백질은 자가 처리되고, 그들의 신호 서열에 대한 카르복시 말단에 예견된 헤파필 결합 위치를 보유하기 때문에[H. Roelink 등의 상기 문헌 참조], 드로소필라 발생에 대해 본 명세서에서 기술된 이중 기능 모델의 여러 측면은 척추동물 발생에서 hh 단백질 기능에도 적용할 수 있다.
N 에 의한 단기 기능의 수행은 H329A 돌연변이 단백질이 wg 및 dpp의 유도를 위한 신호 전달에서 적어도 부분적인 기능을 보유한다는 관찰과도 부합되는데, 그 이유는 상기 돌연변이가 N 을 보편적으로 발생시키는 단백질의 아미노-말단부에 위치한 잔기를 변경시키지 않기 때문이다. 따라서, 미절단된 H329A 단백질은 카르복시 말단 서열의 존재에 기인하는 상호작용의 친화성에 대한 일부 효과가 존재할 수 있음에도 불구하고, N 을 위한 예견된 수용체와 보편적으로 상호작용하는 모든 잔기를 보유하므로써 H329A 단백질의 감소된 능력을 설명할 수 있다. 대안으로, H329A 단백질의 부분적인 기능은 절단되며, H329A 단백질을 이용하는 시험관내 해독에서 C 에 대한 동일한 이동성에 대해 매우 희미한 밴드를 나타내는 극히 적은 분획으로부터 유도할 수 있다(도 4의 3레인). 또한, C 에 의한 장기 기능의 수행은 본 발명자들의 관찰과 부합하는데, 그 이유는 장기의 신호 전달이 C 단편의 방출을 필요로 하거나, 절단을 위해서라기 보다는 몇몇 기능을 수행하기 위해 H329A 잔기를 필요로할 수 있기 때문이다.
N 이 자연계에 존재하는 구성물로부터 합성되는 경우(야생형 hh), 일차적으로 세포와 연합되나, 배양된 세포 내에서 절단된 구성물로부터 생성된 N 은 주로 배양 배지에 진입한다[도 10(D); Porter 등, Nature, 374:363 (1995)]. 이들 결과로부터 추가로 확인할 수 있는 것은 단편 C에 의한 자가 처리가 세포 표면과 상호작용하는 N 의 정도를 조절하므로써 그의 작용 범위를 조절할 수 있다는 것이다.
실시예9
헤지호그 동족체의 분리
생쥐 및 인간 hh-유사 서열은 문헌[참조: Chang 등, Development, 120 (1994)]의 도 1에서 밑줄 친 서열의 모든 가능한 암호 조합에 대해 퇴화한 프라이머를 이용하는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 분리하였다. PCR 증폭물은 50 ㎕반응물 중에 100 ng 내지 2 ㎍의 게놈 DNA(종의 게놈 크기에 의존함), 2 μM의 각 프라이머, 200 μM의 dNTPs(파마시아), 1X 반응 완충액(뵈링거 만하임) 및 2.5 유니트의 Taq 폴리머라아제(뵈링거 만하임)를 포함하였다. 증폭은 하기와 같이 수행하였다: 94℃ 에서 5분, 75℃에서 Taq 폴리머라아제의 첨가, 그후 94℃에서 1분, 52℃에서 1.5분 및 72℃에서 1분으로 30 사이클을 수행하고, 72℃에서 5분 동안 최종 연장하였다. 모든 PCR 생성물은 서열 결정 전에 p블루스크립트(스트라타젠)으로 클론하였다.
상기 방식으로 수득한 생쥐 클론은 프라이머 단부 사이에 144 염기의 서열을 포함하였으며, [α-32P]dATP로 표지화하고, λZAP 벡터(A. Lanaham으로부터 기부받음)내의 전체 8.5 dcp 배 RNA 및 14.5 dpc 배 뇌로 이루어지는 생쥐 cDNA 라이브러리의 고 강성 스크린 용으로 사용하였다. Hhg-1 에 상응하는 몇몇 클론을 분리하고, 가장 큰, 길이가 2629 bp(pDTC8.0)인 클론은 디데옥시 쇄 종결법[참조: Sanger 등, (1997)] 및 시퀘나아제 v2.0(US 바이오케미칼스)를 이용하는 서열 분석을 위해 선택하였다. 압축은 7-데아자구아노신(US 케미칼스)를 이용하여 해제하였다. 서열 분석은 진웍스 2.0(인텔리제네틱스) 및 맥 벡터 3.5(IBI) 소프트웨어 팩키지를 이용하여 수행하였다.
3개의 생쥐 클론중 하나인 Hhg-1을 프로브로 사용하는 경우, Hhg-1은 8.5 dpc 생쥐 배 cDNA 라이브러리로부터 2.0 kb 클론 및 14.5 dpc 배 cDNA 라이브러리로부터 2.7 kb 클론을 산출하였다. 상기 2.7 kb cDNA 는 거의 전장의 mRNA를 의미하는 것으로 나타났는데, 그 이유는 상기 2.7 kb cDNA가 노던 블로트 상에서 하이브리드화에 의해 검출된 2.7 kb 밴드에 상응하기 때문이다. 상기 cDNA 내의 가장 큰 메티오닌-개시된 개방 해독틀은 437개의 코돈을 포함하며, 틀 내의 하나의 상류 정지 코돈 보다 선재한다. 서열 비교 결과, Hhg-1 에 의해 암호화된 단백질이 개별적으로 특정화된 생쥐 Shh와 동일하나[참조: Echelard 등, Cell, 75:1417-1430 (1993)], 한 가지 다름점은 122번째 잔기가 라이신이 아니라 아르기닌이라는 점이다. 또한, Hhg-1은 쥐 vhh-1 유전자[97%의 아미노산 동일성; Roelink 등, Cell, 76:761-775 (1994)], 닭 소닉 헤지호그[81%의 아미노산 동일성; Riddle 등, Cell, 75:1401-1416 (1993)] 및 제브라피쉬로부터 유래된 Shh[68%의 아미노산 동일성; Krauss 등, Cell, 75:1431-1444 (1993); Roelink 등, Cell, 76:761-775 (1994)]와 밀접하게 상응한다. PCR-생성된 단편인 Hhg-2 및 Hhg-3은 각각 생쥐 헤지호그 유전자의 인디안 및 데저트 부류와 상응한다[참조: Echelard 등, Cell, 75:1417-1430 (1993)].
Hhg-1 개방 해독틀과 2개의 드로소필라 hh 서열의 정열은 모두 3개의 단백질이 그들의 아미노 말단 근처에 소수성 아미노산 서열을 포함하며; 드로소필라 멜라노가스터 단백질 및 생쥐 단백질 내의 소수성 신장부(잔기 64 내지 83)는 절단을 위한 신호 서열로서 효율적으로 작용함을 확인하였다[참조: Lee 등, Cell, 71: 33-50 (1992)]. 드로소필라 신호 서열 둘 다는 그들의 내부 위치가 특이한 반면, 생쥐 유전자의 소수성 신장부는 절단된 신호 서열을 위한 더 통상적인 위치인 아미노 최단부에서 발생하였다. 드로소필라 신호 서열에 대한 N-말단 서열의 일부분이 보존되지만, 이는 기능적 역할을 의미하는 것이고, 생쥐 유전자에는 상기 부위가 결실되어 있다.
Hhg-1 과 hh 카르복시 말단간에 신호 서열에 대한 아미노산 동일성의 전체적인 수준은 46% 였다. 더 상세한 조사 결과, 상기 아미노 말단부(잔기 25 내지 187)는 69%의 동일성을 나타내는 반면, 상기 카르복시 말단부 내의 잔류 잔기는 더 낮은 31%의 동일성은 나타낸다. hh 와 유사하게, Hhg-1 암호화 서열은 3개의 엑손으로 분리되며, 이들 엑손의 경계는 3개의 드로소필라 hh 엑손의 경계와 같이 암호화 서열 내의 동일한 위치였다. 흥미롭게도, 제 2 및 제 3 엑손의 암호화 서열간의 경계는 전체적인 서열 보존의 고 수준에서 저 수준으로의 전이에 가깝게 발생한다. 이들 두 경계의 일치 이들 단백질 내에서 기능적 영역의 가능한 구분을 의미한다. 또한, Hhg-1 암호화 서열 내의 상기 위치는 예견된 단백질 절단 위치와 거의 일치한다.
실시예 10
hh 유전자의 인체 클로닝
2개의 인체 hh 유전자에 대한 부분 서열은 문헌[참조:Chang 등, Development, 120:3339 (1994)] 및 실시예 9(도 11(A) 및 11(B))에 기술된 바와 같이 hh-특이성 퇴화 프라이머를 이용하여 게놈 DNA로부터 PCR 증폭에 의해 유도된 클론의 DNA 서열결정에 의해 수득하였다. hh 암호화 부위로부터 유래한 동일한 프라이머 또는 다른 프라이머 또는 인간 hh 단편을 이용하는 동일한 방법으로 수행한 더 광범위한 스크리닝은 3개 이상(더 많을 수도 있음)의 유전자를 획득하는 것으로 예상되는데, 그 이유는 3개 이상의 유전자가 상기 생쥐 내에서 발견되기 때문이다. 인간 hh 유전자의 이들 단편 및 당업계에 공지되어 있고, 문헌에도 상세히 설명되어 있는 클로닝 방법을 이용하여 완전한 암호화 서열을 획득할 수 있다.
예를 들어, 다양한 인체(예를 들어, 여러 태아 및 장기(낙태아로부터 유래함) 및 특이성 태아 또는 성인 장기(병리학적 또는 검시용으로부터 유래함)으로부터 유래한 기존의 cDNA 라이브러리 또는 RNAs는 상기한 Chang 등의 문헌에 기술된 프라이머 및 상기 인간 단편의 서열로부터 직접 유래한 다른 프라이머를 이용하는 PCR 또는 RT-PCR에 의해 hh 서열의 존재에 대해 테스트하였다. hh 서열을 포함하는 기존의 라이브러리는 직접 스크린하고, 필요에 따라 새로운 라이브러리는 hh 서열을 포함하는 RNA 소스로부터 표준 방법으로 구성하였다. 이들 스크린을 위한 프로브는 모든 명확한 hh 단편의 혼합물이었다. 이어서, cDNA 클론의 서열을 결정할 수 있다. 상기 프로브를 함유하고, N 부위내에 위치하는 대부분의 클론은 완전한 C 암호화 부위를 포함할 것인데, 그 이유는 라이브러리 구성물의 표분 방법은 그들의 3' 말단에서 가장 완전한 cDNA 클론으로 귀착되기 때문이다. 척추동물 및 비척추동물에서 이전에 얻어진 모든 전장 hh-암호화 서열은 단일 RNA로 암호화되는 N 및 C 서열을 포함하였다. 스크리닝을 계속 수행하여 인간 hh 유전자의 모든 단편에 상응하는 완전한 개방 해독 틀이 수득하였다. 구체적으로, 인간 태아 뇌 라이브러리(미국, 캘리포니아, 라졸라에 소재하는 스트라타젠)으로부터 유래한 1.2 x 106 클론은 프로브로서 두 개의 인간 hh 단편(도 11(A) 및 11(B))의 혼합물을 이용하여 스크린닝하였다. 이들 프로브와의 특이 하이브리드화에 의해 29개의 클론을 동정하였다.
둘째, hh 서열을 함유하는 것으로 확인된 RNA 기원은 고정 PCR로부터 유래한 주형으로 사용할 수 있다(또한, 문헌에는 cDNA 단부의 신속한 증폭을 위한 RACE로 기술되어 있음). 개략적으로, 상기 방법은 5' 방향 또는 3' 방향으로 추가의 mRNA 서열을 분리하기 위한 수단을 제공하는데, 단 서열은 내부 출발점으로 공지된 것이어야 한다. 또한, 고정 PCR을 사용하여 cDNA 라이브러리로부터 서열을 분리할 수 있다.
셋째, 게놈 라이브러리는 첫째 기법에 기술된 프로브를 이용하여 스크리닝할 수 있다. 필요에 따라, 인간 hh 엑소 및 암호화 서열은 서열 결정 및 게놈성 클론 내에서 모든 hh 암호화 서열을 확인하기 위한 엑손-포획법에 의해 이전에 분리된 인간 및 생쥐 암호화 서열에 하이브리드화시키므로써 분리하였으며; 이들 암호화 서열은 표준 재조합 DNA 법에 의해 함께 "결합(stitched)"되어 완전한 hh 개방 해독 틀을 생성할 수 있다.
도 12(A) 및 12(B)는 이. 콜리에서 생성된 드로소필라 hh 단백질의 시험관내 절단 반응물 및 이의 균질물로의 정제를 나타내고 있다. 이 단백질은 89 내지 254 잔기가 결실되었으며, 매우 가용성이, 정제도 용이하였다. 또한, 상기 단백질은 N 말단에 부착된 His6 정제 태그를 함유하였다. 상기 단백질의 자가 단백질 분해는 환원제(DTT)의 첨가에 의해 개시되며, 그 결과 생성되는 생성물은 생체 내에서 확인된 C 단편과 상응하였다. 도 12의 패널 A는 DTT 첨가에 의한 개시후 절단의 시간 추이를 나타내고 있다. 패널 B 는 고정된 시간(4 시간) 동안 3배 이상 범위의 농축물의 배양을 나타내고 있는데, 절단된 형태로 전환되는 비율에는 변화가 없었다. 상기한 절단의 농도-의존율은 절단의 분자내 메카니즘을 의미하는 것이다. 패널 C 는 절단된 단편 C의 아미노 말단 서열에 의해 결정된 바와 같은 절단 위치 주위의 서열을 나타내고 있다. 절단 위치는 화살표로 나타냈으며, C 단편의 에드만 분해법으로 서열결정된 실질적인 잔기는 밑줄로 나타냈다. 또한, 패널 C는 모든 공개된 척추동물 hh 서열 + 피쉬 및 제노퍼스로부터 유래한 미공개 서열중 일부의 정렬을 나타내고 있다. 상기 서열은 절단이 발생하는 드로소필라 hh의 부위에 상응하는 것으로 나타났으며, 이는 절단 위치에서 Gly-Cys-Phe 서열의 절대 보존을 예시하는 것이다. 패널 D 는 주형으로 여러 가지 hh 유전자를 사용하는, 이전 실시예에 기술된 바와 같이 시험관내 전사/해독 반응물로 로딩된 SDS-PAGE 겔을 나타내고 있다. dhh 는 드로소필라이고, twhh 및 zfshh 는 제브라피쉬의 트위기-윙클 및 소닉 hh 유전자이고, mshh는 생쥐의 shh/Hgh-1/vhh-1 유전자이다. 해독 혼합물은 35S-표지된 시스테인을 포함하였으며, 자동방사능사진분석법으로 생성된 생성물을 가시화하는데 사용하였다. 주의할 점은 각각의 유전자가 하나의 더 큰 생성물(전구물질 또는 U) 및 두 개의 더 작은 절단 생성물(N 및 C)을 생성한다는 것이다. 더 큰 종은 척추동물 유전자 각각에 대한 C인 반면, 드로소필라 N 은 C 보다 더 큰데, 그 이유는 척추동물내의 개방 해독 틀에 존재하는 신호 서열에 대한 아미노 말단에서 일어나는 60개의 잔기의 존재 때문이다. 상기 패널은 척추동물 hh 단백질이 드로소필라 단백질과 유사하게 처리됨을 나타내고 있다. 패널 E 는 상기 모든 단백질의 후속 라운드가 아닌 제 1 라운드에서 C 단편의 에드만 분해가 방출하는 35S 수를 나타내고 있는데, 이는 상기 모든 hh 단백질의 자가 단백질 분해성 절단 위치가 패널 C 에서 진하게 표시한 보존된 Gly-Cys-Phe 서열의 중심을 형성하는 Cys 잔기의 아미노 말단 측쇄에 대한 아미드 결합이라는 것을 의미한다. 상기 방법은 임의의 기타 hh 족 구성원으로부터 단백질 단편의 조성을 확립하기 위한 일반화할 수 있는 방법이다.
실시예 11
축 중배엽 및 중성 선조 내에서 두 개의 hh 유전자의 차등 발현
5개의 현저한 제브라피쉬 hh-유사 유전자에 상응하는 부분 서열을 분리하고, 이들 유전자중 두 개의 유전자를 위한 완전한 암호화 서열을 배 cDNA 라이브러리로부터 수득하였다. 이들 두 개의 서열중 하나는 제브라피쉬 nhh-I 유전자의 서열과 동일하였으며[참조: Roelink 등, Cell, 76: 761 (1994)], 문헌[참조: Krauss 등, Cell, 75: 1431 (1993)]에 의해 보고된 shh 유전자에 상응하였으며(참조: 도 13의 설명부분); 기타 유전자인 트위기-윙클[참조: Potter, B., The Tale of Mrs. Tiggy-Winkle, The Penguin Group, London (1905)]은 신규한 척추동물 hh를 나타낸다. 상기한 두 개의 유전자를 위한 암호화 서열은 소닉/vhh-1 부류의 생쥐 및 닭 서열에 정열하여 나타냈다(참조: 도 13(B)). 기타 척추동물 hh 동족체와 유사하게, twhh 및 shh 단백질은 소수성 잔기로 이루어진 아미노 말단 신장부를 보유하고 있다. 암호화 서열이 마이크로좀의 존재 하에서 해독되는 경우, 이들 잔기는 절단이 관찰된 이래 신호 신호로서 작용하며; 따라서 척추동물 hh 유전자는 이전에 문헌[참조: Kimmel C.B. & Warga, R.M., Development Biology, 124:269-280 (1987); Warge, R.M., & Kimmel, C.B., Development, 108:569-580 (1990)]에 기재된 드로소필라 hh에 대해 기록된 바와 같이 분비된 단백질을 암호화하는 것으로 나타났다.
첫 번째 4개의 서열은 제브라피쉬 게놈 DNA(J. Pellegrino 로부터 기부받음)로부터 문헌[참조: Chang 등의 상기 문헌]에 기술된 바와 같은 퇴화 프라이머를 이용하는 PCR 로 분리하였다. twhh 및 shh 클론은 프로브로서 첫 번째 세 개의 서열을 이용하여 20 내지 28시간 cDNA 라이브러리(R. Riggleman, K.Helde, D. Grunwald 및 J. Pellegrino로부터 기부받음)로부터 분리하였다. twhh 및 shh용 해독 틀은 각각 추정적인 개시 메티오닌의 상류의 각각 12개 및 16개의 코돈이 밀집되어 있다.
도 13은 단문자 코드로 나타낸, 예견된 아미노산 서열을 나타내고 있다. 도 13(A)는 5개의 현저한 hh-유사 유전자에 대해 일반저인 서열이 제브라피쉬 트위기-윙클(twhh; Potter 1995, 상기 참조)의 상응하는 잔기와 점 지시 동일성을 나타내고 있으며, hh[zfB] 및 hh[zfC]는 더 분기되어 있는데, 이는 신규한 부류를 의미하는 것이다. 도 13(B)는 병아리 및 생쥐로부터 유래한 소닉 lvhh-1 부류의 서열에 정열된 twhh alc shh의 아미노산 서열을 나타낵고 있다[참조: Riddle 등, Cell, 75:1401-1416 (1993); Chang, D.T. 등, Development, 상기 참조; Echelard, Y. 등, Cell, 75:1431-1444 (1993)]. 제브라피쉬 소닉 헤지호그(shh)는 문헌[참조: Roelink 등, Cell, 76: 761-775 (1994)]에 보고된z-vhh-1에 대한 서열과 동일하다. 대부분의 암호화 부위 전체에 걸쳐, 발현 및 확장 서열 동일성에 기초하면, 본 명세서에 보고된 vhh-1 및 소닉 서열은 아마 문헌[참조: Krauss 등, Cell, 75:1431-1444 (1993)]에 기재된 shh와 상응할 것이며, 카르복시 말단 근처에서 현저히 전체 26개의 잔기로 이루어진 신장부를 분지할 것이다. 쥐 vhh-1/소닉 hh[참조: Roelink 등, 상기 참조]는 상기 정열에서 배제하였는데, 그 이유는 그의 서열이 예견된 생쥐 단백질과 97%의 서열 동일성은 보이기 때문이다. 모두 4개의 서열내의 동일한 잔기는 박스내에 나타냈으며, 대시(-)는 정열 내의 갭을 나타낸다. 화살표는 twhh의 예상 신호 서열 절단 위치를 나타낸다[참조: von Heijine, G., Nucleic Acids Res., 14: 4683-4690 (1986)]. 4개의 hh 유전자 모두에 공통적인 아미노 말단 소수성 신장부는 빗금으로 나타냈다. 도 13(C)는 소수성 부위에 대한 카르복시 말단 잔기의 동일성(%)을 나타낸다.
도 14는 제브라피쉬 배 발생중 twhh, shh 및 pax-2의 비교 발현을 나타낸다. 0 내지 36 시간된 배에 대한 전체 적층 동위치 하이브리드화는 안티센스 프로브를 이용하고, 문헌[참조: Tautz 및 Pfeifle, Chronosoma, 98: 81-85 (1989)]에 기술된 방법을 변형시켜 수행하였다. 전사체 편재화는 알칼리 포스파타아제 효소 반응의 갈색 생성물로 확인하였다. 배의 단계화는 문헌[참조: Westerfield, M., The Zebrafish Book, 유진의 오레곤 대학 출판부 (1993)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 전사체는 전체 배에 대한 동위치 하이브리드화에 의해 가시화하였다. 도 14 (A, B)는 단일 후순기 배 내의 twhh 발현을 나타낸다. 도 14(A)는 배면도이고, 동물극은 상부에 있다. 삼각형 형태의 발현은 내배판의 축 중배엽 형성 세포의 특징이다[참조: Statchel, S.E.등, Development, 117:1261-1274 (1993)]. 도 14(B)는 측면도이고, 배의 좌측면(등))상의 더 두꺼운 세포층은 배순이며; 두 개의 화살표는 twhh를 발현하는 내배판 세포와 비발현 외배엽을 의미한다. 전면은 모든 후속 배의 좌측에 있다. 등은 모든 측면도의 상부에 있다. 도 14(C, D)는 twhh를 발현하는 세포를 이용하는 장배형성 말미의 단일 배를 나타낸다(100% 피포). 도 14(D)는 꼬리쪽의 배면이다. 주: 전엽으로 좁아진 추정 꼬리아체내의 염색의 넓은 얼룩이다. 도 14(E, J)는 초기 체절 발생(11.5 시간, 3-4 체절) 배를 나타내며; 안포는 간뇌의 벽으로부터 팽출을 시작하지 않는다. 도 14(E, H, K)는 발생하고 있는 뇌의 측면 사진이다. 도 14(F, I, L)은 발생하고 있는 뇌의 배면도이다. 도 14(E, F, G)는 관수판을 형성하게 될 세포로 이루어진 단일 열 내에서 twhh를 세포의 편재화를 나타낸다. 화살표는 꼬리아체에 대한 twhh를 발현하는 세포의 얼룩을 나타낸다. 도 14(H, I, J)는 shh의 편재화를 나타낸다. 또한, shh 는 융기 내에서 강하게 발현된다. 도 14(J) 는 발생하는 꼬리의 측면도이다. 또는 shh 는 융기 내에서 강하게 발현된다. 도 14(J)는 발생하는 꼬리의 측면도이다. shh 는 바닥판과 척삭을 형성하게될 세포 내에서 발현된다. 도 14(K, L, M)은 초기 안포 형성중 pax-2의 편재화를 나타낸다. 도 14(M)은 또한 twhh 발현을 나타낸다. 도 14(K)는 12 시간(4-5 체절) 배를 나타낸다. 도 14(L)은 12.5 시간(5-6 체절) 배를 나타낸다. 발생하는 안포 내에서 pax-2의 발현은 융기로부터 일정 구배로 떨어져 있다. 주: 장차 중뇌-후뇌 경계에서의 pax-2(*)의 발현. 도 14(M)은 6-7 체절(13 시간) 단계 배 내에서 twhh(화살표) 및 pax-2 발현을 나타낸다. 주: 배 신경 용골(기타 척추동물에서 신경관에 상응함) 내에서 twhh의 차등 발현. 도 14(N-S)는 체절 발생의 말미(22 내지 24 시간)의 배를 나타낸다. 도 14(N, O, P)는 twhh의 편재화를 나타낸다. 도 14(N, O)는 발생하는 뇌를 나타낸다. 주: 간뇌(삼각형으로 가득함) 및 융기(화살표) 내에서 세포 염색의 분리된 군, 및 중뇌와 후뇌 하부의 평판 발현. 상기 바닥판 발현은 축을 따라 꼬리로 이어진다. 도 14(N)은 측면도이다. 도 14(O)는 배면도이다. 도 14(P)는 꼬리의 배면도이다. 발현은 평판으로 제한된다. 도 14(Q, R, S)는 shh의 편재화를 나타낸다. 도 14(Q, R)은 발생하는 뇌를 나타낸다. 도 14(Q)는 측면도이며, 이포 내에서의 pax-2 발현은 나타낸다. 도 14(R)은 배면도이며, 융기(화살표) 및 신경 용골 내에서의 발현을 나타낸다. 도 14(S)는 꼬리의 측면도이며, 발현은 바닥판 내에서 가장 강하며, 척삭 내에도 여전히 존재한다(이것은 문헌[참조: Krauss 등, 상기 참조]에 기술된 사실과는 상반되는 것이다). 약어 설명: e-외배엽; h-내배판; tb-꼬리아체; c-눈; ov-안포; ot-이포; fp-평판; nc-척삭; *-중뇌-후뇌 경계 또는 pax-2 표지된 예상 중뇌-후뇌 경계; t-종뇌.
twhh 및 shh 발현 패턴의 비교[참조: Krauss 등, 상기문헌]에 의해 시기, 주둥이-꼬리 신장 및 조직 제한 등의 현저한 차이에도 불구하고, 상기 유전자 둘 다는 중심선 구조 내에서 주로 발현됨을 확인하였다. twhh의 발현은 배면 중배엽 내의 장배형성 중에 최초로 확인되었다(도 14(A, B)); 이 발현은 제노퍼스에서 스페만의 형성체와 유사한 구조인 배선의 아군에 상응하는 밴드 내에서 발생하였다[참조: Stachel 등, Dev., 117:1261-1274 (1993); Ho., R., Seminars in Developmental Biology, p3 (1992)]. 수렴 및 확장 운동과 조화를 이루어, 상기 twhh 발현 밴드는 중심 평면을 따라 짧아지며, 초기 배 축을 따라 신장하여 장배형성의 말미에 상기 발현은 축 전체에서 발생하였다(도 14(C, D)). 체절 발생의 초기에, twhh RNA는 몸 전체에 걸쳐 추정적인 복부 신경 조직을 제한하는 것으로 밝혀졌으며(도 14(E, F, G)), 이의 유일한 예외가 꼬리아체내 또는 근처의 세포였다. twhh의 신경 제한과는 대조적으로, shh 는 추정 신경 세포 및 척삭 세포 둘 다에 위치하였다(도 14(J)).
체절발생이 진행됨에 따라, shh 및 twhh의 복부 중심선 발현은 대부분의 예상 전뇌에서 감소되었으나, 예상 간뇌의 평판 내의 중심선 세포의 이전 반점 내에는 강한 상태로 존재하였다(twhh에 대해 도 14(E, F); shh에 대해 도 14(H, I)). 후에 상기 반점은 융기(간뇌의 전엽 신장부)를 형성할 것이다[참조: Schmitt, E.A. 및 Doeling, J.D., J. Comp. Neur., 344: 532-542 (1994)]. 발생하는 눈 경상부에 대해 중간 또는 꼬리쪽인 상기 구조는 본 발명자들이 눈 발생을 위한 초기 패턴화활성의 중심으로서 제안한 그 위치였다(하기 참조). 체절발생의 말미에, shh 전사체가 이 단계에서 척삭 내에 및 36시간 발생시(도 14(S); 차후 단계는 도시하지 않음)에 검출가능함에도 불구하고, twhh 및 shh 둘 다는 바닥판 내에서 강하게 발현되었다(도 14(P, S)). 또한, 28 시간에, twhh 전사체는 발생 33 시간에 shh에 대해 보고된 바와 같이[참조: Krauss 등, 상기 문헌], 첫째 아가미 호(도시하지 않음)내의 작은 세포 클러스터에서도 발견되었다.
twhh 와 shh 발현의 차이는 체절발생의 초기에서부터 명백한데, 그 이유는 twhh RNA는 선(shield) 단계 만큼 초기에 검출할 수 있는 반면, shh 는 약 60% 피포 이후에 최초로 검출할 수 있기 때문이다[참조: Krauss 등, 상기 문헌]. 또한, twhh 전사체는 발생 초기의 신경 조직으로 제한되며, 척삭에서는 절대 검출되지 않았다(도 14(G)와 도 14(J)를 비교해볼 것). 차후 발현의 차이점은 간뇌와 중뇌 내구별되는 주둥이-꼬리 제한 및 융기 내의 twhh의 더 약하며, 더 많은 제한된 발현을 포함하여(도 14(N)과 도 14(Q)를 비교할 것), 뇌의 twhh 발현의 후 영역이 shh영역의 아군을 구성하는 것으로 보여진다. 또한, twhh가 아닌 shh 는 발생하는 지느러미아체 내에서 발현되었다[참조: Krauss 등, 상기 문헌]. 제브라피쉬와 기타 척추동물 내에서 hh 동족체에 대해 이전에 보고된 발현 패턴과 shh 와 twhh 발현 패턴의 비교는 shh가 소닉/vhh-1 부류의 제브라피쉬 동족체인 반면, twhh는 척추동물 hh의 신규의 부류인 것으로 나타났다.
실시예 12
제브라피쉬 배발생중 에피토프성 hh 발현의 발생 결과
발생에서 hh 생성물의 가능한 역할에 대한 지식을 구하고자, 합성 twhh 및 shh mRNA를 1 내지 8개의 세포 배에 주입하였다. 상기 방법은 모자이크를 산출하였으나, β-갈락토시다아제를 암호화하는 대조용 mRNA에 대해 결정한 바와 같이, 발현은 꽤 균일한 패턴이었다(도시하지 않음). 발현의 균일성은 초기 제브라피쉬 배의 운명 지도화 연구와 잘 일치하였으며[참조: Kimmel & Warga, 상기 문헌; Warga & Kimmel, 상기 문헌; Heide 등, Science, 265:517-520 (1994)], 이는 장배형성 이전의 절단중에 할구가 광범위한 세포 혼합을 겪음을 의미한다. 본 발명자들은 발현의 모자이크 형성이 hh 주입된 배의 표현형에 거의 영향을 미치지 않으며, 이는 hh 유전자 생성물의 분비에 기인할 수 있는 것으로 생각하였다.
합성 twhh 및 shh mRNA(hh RNA)를 주입한 배는 lacZ mRNA를 주입한 대조용 배와 비교하는 경우 많으나, 매우 재생할 수 있는 비정상성을 나타냈다. 하기하는 바와 같이 이들 비정상성은 주로 뇌와 눈에서 결점이 된다. 에피토프성 twhh 및 shh 발현이 정성적으로 유사함에도 불구하고, 발생율과 엄정함은 twhh RNA 의 경우 더 컸다[참조: 도 15 및 16]. 이들 두 유전자에 의해 발현되는 단백질은 정성적으로 유사한 생물학적 활성을 나타내지만, 그 능력 면에서 명백한 차이가 존재한다.
도 15는 제브라피쉬 발생에 대한 에피토프성 hh 의 효과를 나타낸다. 야생형 제브라피쉬인 다니오 레리오(Danio rerio)(엑크윌 워터라이프 리소스)를 28.5℃에서 유지하고, 이어서 몇몇 배를 실온에서 밤새 배양하였다. 1 내지 8 세포 단계에서 twhh, shh 또는 lacZ RNA 를 제브라피쉬 배에 주입하고, 발생 28 시간에 조사하였다. 도 15(A 내지 C)는 중뇌-후뇌부의 배면도이며; 전엽부는 좌측에 있다. 도 15(A)는 lacZ이고, 도 15(B)는 twhh 이고; 도 15(C)는 shh 이다. 도 15(D 내지 F)는 전뇌 부위의 전면 눈 부분이괴; 전엽부는 상부에 있다. 도 15(D)는 lacZ이고, 도 15(E)는 twhh 이고; 도 15(F)는 shh 이다. 도 15(G 내지 I)은 눈 부위의 측면도이며; 전엽부는 좌측에 있다. 도 15(G)는 lacZ이고, 도 15(H)는 twhh 이고; 도 15(I)는 twhh 이다. 대부분의 hh-주입된 배에 의해 형성되는 꼬리쪽 수준에서의 추정 뇌, 척삭, 체절 및 신경 용골은 축의 전체적인 수축 및 배면 만곡을 제외하고는 전체적으로 정상으로 나타났다. 소수의 hh-주입된 배(15%는 도시하지 않음)는 부분적으로 양분된 축은 나타내는데, 이는 복제된 축 중배엽 및 평행한 신경 용골들(각각의 신경 용골은 복부 중심선 세포 및 일부 이축 대칭성 측면 세포(도시하지 않음)를 함유함)을 함유하였다. 본 발명자들은 이들 축 결합에 대한 주요 원인을 밝히지 않았지만, 후기 장배형성 단계의 배 분석 결과, 양분이 피포 및 수렴 현상에서의 어려움때문일 수 있는 것으로 생각하였다. 약어: mv-중뇌실; rv-능뇌실; *-중뇌-후뇌 경계; ot-이포; tv-제 3 뇌실(간뇌실); r-망막 또는 망막 유사 구조; l-수정체 또는 수정체 유사 구조; pe-착색된 망막 상피.
뇌 및 기타 입 신경 유도체의 형태학적 결함은 hh-주입된 배에서는 높은 빈도로 발생하였다. 발생의 28 시간에 명백한 상기 물고기 뇌의 3개의 뇌실-능뇌실, 중뇌실(도 15(A)) 및 간뇌실(제 3 뇌실; 도 15(D))-은 명백한 루멘의 존재에도 불구하고, hh-주입된 배에서는 형성되지 않았다(도 15(B, C); 도 15(E, F)).
또한, 중뇌-후뇌 경계에 존재하는 현저한 수축은 보편적으로 존재하지 않는다(참조: 도 15(A)와 도 15(B, C)의 비교). 상기 수축은 보편적으로 중뇌-후뇌 경계[참조: Krauss 등, 상기문헌; Krauss 등, Development, 113: 1193-1206 (1991)]의 밴드 내에서 발현되는 pax-2의 기능[참조: Krauss 등, Nature, 353:267-270 (1991); Krauss 등, Nature, 360: 87-89 (1992)]을 필요로 한다. 그러나, 상기 경계에서의 pax2 발현은 hh 주입에 의해 파괴되지 않으며, 이는 상기 표현형이 입-꼬리 정보의 파괴에 기인하는 것는 아니라는 것을 의미한다.
또한, 눈 발생의 결함은 hh RNA를 주입한 배 내에서 높은 빈도로 발생한다. 따라서, 28 시간에서 정상적인 제브라피쉬 눈은 수정체와 착색된 망막 상피를 보유하는 반면(도 15(D, G)), hh-주입된 배는 보통 수정체가 발생되지 않으며, 망막 착색도 없다(도 15(I)). 만족스럽지 못하게 발생된 눈은 단순한 발생의 지연으로 인한 것은 아닌 것으로 나타났는데, 그 이유는 주입된 배 내의 다른 위치에서의 착색이 그의 정상적인 시간 추이에 따라 나타나기 때문이다. 발생 3일에 조사한 바에 따르면, hh RNA 주입의 결과는 눈의 완전한 비발생 내지 망막의 하부가 없는 눈을 부분적으로 형성하는 범위의 결함을 포함한다.
hh RNA 주입에 기인한 눈 표현형은 제브라피쉬 및 제노퍼스 라에비스 배를 레티노산으로 처리하므로써 생성된 표현형과 유사하였다. 제노퍼스에서, 눈의 감소에서 눈의 부재까지의 범위의 표현형은 망막 주름(복제된 눈과 유사함) 및 다수의 작은 눈[참조: Manns, M. & Fritzsch, B., Neurosci. Lett., 127: 150-154 (1991)]을 가진 눈을 나타낸다. 제브라피쉬에서, 장배형성중 레티노산에 노출시키면, 눈의 형성을 방해하는 반면[참조: Holder, N. & Hill, J., Development, 113: 1159-1170 (1991)], 눈 원시세포 형성중에 노출시키면, 복제된 망막 및 잔여 수정체의 형성을 유도한다[참조: Hytatt 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8293-8297 (1992)]. 병아리 사지 발생에 대한 레티노산의 패턴화 효과는 내인성 소닉 hh 유전자의 엑토피성(제위치가 아님) 활성화를 통해 중재되는 것으로 나타났다[참조: Riddle 등, 상기 문헌]. 엑토피성 hh 발현에 관한 이들 결과는 척추동물 눈에서 레티노산 처리의 패턴화 효과의 기초가 되는 유사한 메카니즘의 가능성을 의미하는 것이다.
실시예 13
안포 내에서의 hh 발현은 단부 운명 대신 인접 운명을 특정화한다.
눈 발생에서 hh의 역할을 규명하기 위해, 본 발명자들은 안포 내에서 엑토피성 hh 발현의 효과를 조사하기 위한 위치 마커로서 사용한 pax-2 및 pax-6[참조: Krauss 등, EMBO J., 10:3069-3619 (1991); Pitischel 등, Development, 114: 643-651 (1992)]를 이용하였다. 안포이 제브라피쉬 전뇌의 측벽으로부터 팽출됨에 따라[참조: Schmitt, E.A. & Dowling, J.D., J. Comp. Neur., 344: 532-542 (1994)], pax-2는 안포의 전엽부 및 후엽부 내에서 가장 높은 수준의 RNA로 구배 발현되었다[참조: Krauss 등, 상기문헌; 도 14(K, L, M)]. 상기 pax-2 발현 구배의 최고점 바로 인접한 위치는 융기라고 칭하는 간뇌 부위이며[참조: Schmitt & Dowling, 상기문헌], 여기서 pax-2가 아닌 twhh 와 shh 는 강하게 발현되었다(도 14(E, F, H, I, M)). 따라서, 안포 내에서 pax-2 발현의 농도 구배는 융기 내의 twhh 및 shh 발현에 인접한 위치에서 그의 최고점으로부터 하향 기울기로 나타난다. pax-2 발현의 패턴 상에서 안포 내에서 발생 운명의 겹침[참조: Schmitt 등, 상기문헌]은 pax-2 RNA의 구배가 장래 눈의 인접/단부 축을 미리 결정함을 의미하는 것이다.
엑토피성 hh 는 pax-2, pax-6 및 F-스폰딘의 발현을 변경시켰다. 제브라피쉬 배는 1 내지 8 세포 단계에서 twhh 또는 shh RNA를 주입하였으며, pax-2, pax-6 또는 F-스폰딘 발현 패턴은 전체 적층 동위치 하이브리드화법으로 조사하였다. lacZ RNA를 주입한 대조용 배는 매 경우마다 수행하였으며, 야생형 발현 패턴을 나타냈다. 배 단계에서, 안포의 전엽-후엽 축은 장래 눈의 인접-단부 축과 상응하였다. 다음 발생 시간 동안, 안포의 후엽 가장자리는 간뇌로부터 분리될 것이다[참조: Schmitt 및 Dowling, Comp. Neur., 344: 532-542 (1994)].
twhh 또는 shh RNA중 어느 하나의 주입은 안포가 팽출을 시작함에 따라 상기 안포의 인접-단부 및 등축-배축 둘 다를 따라 pax-2 발현의 균일한 개시를 야기시켰다. 엑토피성 pax-2 발현은 눈 내에서 정상적인 pax-2 발현이 개시됨과 동시에 나타났으며, 몇몇 경우 안포사이의 간뇌 내에서도 확인되었다. 체절발생의 말미에서, pax-2가 정상적으로 안경으로 제한되는 시기에 hh-주입된 배 내의 pax-2 RNA는 안포의 가장 먼 부위를 제외하고, 모든 부위 내에서 확인되었다.
눈 발생을 위해 결정적인 전사 인자를 암호화하는 pax-6의 발현에 대한 엑토피성 hh의 효과도 연구하였다. 제브라피쉬 발생 22 시간에, pax-6은 수정체 및 대부분의 시배 단부 내에서 정상적으로 발현되었다[참조: Krauss 등, 상기문헌; Puschel 등, Development, 114:643-651 (1992)]/. hh-주입된 배에서, 많은 배가 대부분의 단부 세포 내에서 pax-6 발현을 유지함에도 불구하고, pax-6은 안포 내에서 억제되었다. 위치 확인 마커로서 pax-2 및 pax-6에 관해, 안포 내에서의 hh 발현은 인접 운명을 유도하고, 단부 운명을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
안포의 단부는 pax-2 및 pax-6 유전자 발현 둘 다에서 hh-유도된 변화에 대해 가장 저항성이 있다. 차후의 회전 때문에, 상기 안포의 단부는 성숙한 눈의 배면부를 형성할 것이며[참조: Schmitt 등, 상기참조]; 흥미롭게도, 이는 중간 표현형을 갖는 주입후 3일된 배 내에서 유지된다.
pax-6 유전자 내의 상처는 인간에서는 무홍채증[참조: Ton 등, Cell, 67: 1059-1074 (1991); Glaser 등, Nat. Genetics, 2: 232-239 (1992)]; 생쥐에서는 소안(小眼)[참조: Hill 등, Nature, 354: 522-525 (1992)]; 및 드로소필라에서는 무안(無眼) 돌연변이[참조: Quring 등, Science 265: 785-789 (1994)]로 나타나는데; 따라서, pax-6 기능은 드로소필라 및 포유동물에서 눈 발생을 위해 반드시 필요한 것으로 나타났다. 본 발명자들은 hh-암호화된 활성이 척추동물 눈 발생에서 일정 역할을 수행하는 것에 대해 논의하였는데, 이는 척추동물과 곤충 사이에 추가의 분자 유사물을 제안하는 것인데, 그 이유는 드로소필라 눈 발생에서 hh의 역할이 잘 확립되어 있기 때문이다[참조: Mohler 등, 상기문헌; Ma 등, 상기문헌; Heberlein 등, 상기문헌; Lee 등, 상기문헌]. 드로소필라 눈 발생에서 hh 및 pax-6 발현의 역 및 비중첩 패턴[참조: Ma 등, 상기문헌; Quiring 등, Science, 265: 785-789 (1994)]은 hh에 의한 pax-6 억제 가능성을 의미하는 것이나, 척추동물 및 드로소필라 눈 발생에서 유사한 메카니즘에 의한 hh 기능은 추가 연구를 필요로하는 의문의 여지가 있는 문제이다.
생쥐에서, pax-6 단백질의 양은 정상적인 눈 발생에 결정적인 역할을 한다[참조: Hill 등, 상기문헌]. 소안 이형접합체는 더 약한 표현형을 가진 hh-주입된 배에서와 같이 비정상적으로 작은 수정체를 발생시킨다[참조: Hogan 등, J. Embryol. Exp. Morph., 97: 95-110 (1986); Hogan 등, Development, 103 Suppl. 115-119 91988)](도 14(F)). 발생 3일째에 hh-주입된 다수의 배에서와 같이 수정체가 결핍된 소안 이형접합체가 생성되며, 동물은 출생시에 눈이 없게 된다. 이러한 유사성은 hh-주입된 제브라피쉬에서 관찰된 많은 후기 눈 결함이 눈 발생중에 pax-6의 부분적인 또는 완전한 억제에 기인할 수 있다.
실시예 14
hh 전뇌 발현의 유전적 제거는 안포내의 인접 운명의 상실을 초래한다.
twhh 및 shh 발현 패턴(도 14) 및 엑토피성 hh 발현의 효과(도 15)는 눈 발생에서 shh 및 twhh에 정상적인 역할과 일치하였다. 실제로 hh 활성이 눈 발생중에 인접 운명을 촉진하는 정상적인 역할을 수행하는 경우, hh 활성의 제거는 인접 운명의 상실을 초래하는 것으로 예상할 수 있을 것이다. 단안(單眼)체 돌연변이에 대한 동종접합성 배에서, 복면 신경 구조는 형성되지 않으며, 발생하는 눈은 중심선에서 융해되어 단안의 배를 산출한다[참조: Hatta 등, Nature, 350: 339-341 (1991)]. 단안체 돌연변이주에서 복면 구조의 상실은 본 발명자들이 관찰한 twhh 및 shh 가 발현되는 부위를 포함하는데, 이에 따라 본 발명자들은 hh 발현에 대한 단안체 돌연변이의 효과를 조사하였다.
cycb16[참조: Hatta 등, Nature, 350: 339-341 (1991)], 이형접합 성체(R. Riggleman으로부터 기부받음)은 산란시켰으며, 그들의 자손는 전체 적층 동위치 하이브리드화법으로 분석하였다. pax-2 및 twhh 또는 shh RNAs의 검출은 cyc 돌연변이 또는 그들의 야생형 동포에 대한 동형접합성 배 내에서 이루어졌다. 단지 twhh RNA는 cyc 배의 추정 꼬리아체(카렛) 내에서 발현하였다. 문헌[참조: Krauss 등, Cell, 상기문헌]에 보고된 바와 같이, shh의 신경 발현은 cyc 배 내에서 사라졌다. 강한 pax-2 발현은 cyc 돌연변이 배 내에서 현저히 감소된 야생형 배의 안포 내에서 관찰되었다.
단안체 배 내의 twhh는 단지 추정 꼬리아체의 작은 세포 반점에서 발견되었으며, 신경 발현은 어떤 후기 단계에서도 발견되지 않았다. 또한, shh의 신경 발현은 척삭 내에서의 발현이 재결합됨에도 불구하고, 눈 돌연변이체에서 상실되었다[참조: Krauss 등, 상기문헌; 도시하지 않음).
눈 돌연변이는 발생하는 배 내에서 hh-발현 세포를 제거하기 때문에, 상기 돌연변이를 유전적 도구로 사용하여 눈 발생에서 hh 기능에 대한 요구조건을 조사할 수 있다. 문헌[참조: Iiatta 등; Hatta 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2061-2065 (1994)]에 따르면, 최근 pax-6 발현이 pax-6을 정상적으로 발현하지 않는 복면 중심선 세포의 상실에 기인하여 중심선에서 융합되고, 또한 눈 돌연변이체 배의 융합된 눈 내에서 pax-2 발현은 감소되는 것을 밝혀냈다. 본 발명자들은 안포가 초기에 형성되는 경우 상기 관찰을 초기 단계에 확장시켰으며, pax-2 발현은 약해지고, 눈 돌연변이체내의 안포내에서 확장되지 않음을 발견하였다. 엑토피성 hh 발현 결과와 함께, 이들 관찰은 활성이 촉진하는 hh 신호전달이 안포 내에서 인접 운명의 유도를 위해 필요한 것임을 의미한다.
상기 모델에서, 본 발명자들은 융기가 hh 활성의 편재화된 소스를 제공하므로써 발생하는 제브라피쉬 눈을 위한 인접 패턴화 중심으로서 작용함을 제안하였다.
실시예 15
hh 활성은 발생하는 뇌를 복면화(ventralize)한다.
이전의 연구를 통해 신경 튜브의 복면 패턴화에서 바닥판과 척삭으로부터 유래되는 신호의 중요한 역할이 확립되었다[참조: Jessell, T.M.,& Dodd, J., Cell, 69:95-110 (1992)]. 예를 들어, 문헌[참조: Goulding 등, Development, 117: 1001-1016 (1993)]에 따르면, 최근 척삭 및 바닥판 이식편이 정상 신경관 내에서 정상적인 pax-6의 측면 발현을 억제할 수 있는 것으로 확인되었다. 최근의 다른 연구는 적어도 몇몇 관점에서 복면 신경관 패턴화에 연루된 hh 활성을 다루고 있으며[참조: Echelard 등, Cell, 75: 1417-1430 (1993): Krauss 등, 상기문헌; Roelink 등, 상기문헌]; 결과적으로, 본 발명자들은 뇌 내에서 pax-6 발현에 대한 hh-주입된 배의 효과를 조사하였다.
발생 22일의 제브라피쉬에서, pax-6은 간뇌의 배면-측면 부위 및 바닥판과 인접 세포를 제외한 후뇌와 척수의 복면-측면 영역에서 발현되었다[참조: Krauss 등, 상기참조; Puschel 등, 상기참조]. 상기 발현 패턴은 간뇌 및 후뇌에서의 twhh 와 shh의 발현 패턴과 상반되었다(도 14(Q)와 14(I)의 비교). hh RNA 주입은 간뇌의 더 복면인 영역 내에서 pax-6을 억제하는 반면, 더 배면인 영역에서의 발현은 지속되었다. 또한, pax-6 발현은 능뇌절 1, 2 및 4에서 복면으로 현저히 감소되었으며, 몇몇 경우에는 이들 능뇌절에서 완저히 소멸되었다. 정상적인 배 내에서 엑토피성으로 발현된 hh 및 pax-6의 억제 효과는 인접 hh 발현 세포에 의한 pax-6의 억제에 기인하는 것이었다.
pax-6 발현의 부재는 복면 중심선의 특징이기 때문에, 측면 위치에서의 pax-6의 억제는 복면화를 의미하는 것이다. 결과적으로, twhh는 바닥판 마커인 F-스폰딘의 유도 분석을 위해 배 내에 주입하였다[참조: Riddle 등, 상기문헌]. 상기한 바와 같이, 엑토피성 twhh는 중뇌 및 전엽 후뇌의 더 배면 수준에서 F-스폰딘 발현을 유도하였다. pax-6 및 F-스폰딘의 발현에 대한 hh의 효과는 뇌의 복면화를 의미하는 것이다. 측면 세포에 의해 확인된 복면 세포 동정의 채택은 복면 세포의 포 불형성을 설명할 수 있다.
twhh의 복면화 활성은 닭, 제브라피쉬 및 쥐의 shh/vhh-1 부류의 유전자에 대해 이전에 보고된 사항을 확인시켜주며, 확장해준다[참조: Echelard 등, 상기문헌; Krauss 등, 상기문헌; Roelink 등, 상기문헌]. 그러나, 중심선 신경 선조에 대한 tehh의 초기 제한은 이것이 바닥판 유지 및 팽창의 순일발생 메카니즘에서 특정 역할을 수행할 수 있음을 의미하는 것이다[참조: Placzek 등, Dev., 117:205-218 (1993)]. 제브라피쉬에서, 단안체 숙주 내에서 야생형 세포는 바닥판을 형성하기 위해 인접 세포에 기여 및 유도할 수 있으나, 단지 이식된 세포가 척삭이 아닌 신경 세포를 증식시키는 경우에 한한다[참조: Hatta 등, Nature, 350: 339-341 (1991)]. 본 발명자들은 단안체 돌연변이체엣서, twhh의 중심선 발현은 상실되는 반면, shh 발현은 척삭 내에서 유지됨을 확인하였다(도 18: shh 를 위한 Krauss 등, 상기문헌]; 이와 함께 이들 결과는 단안체 돌연변이체 내에서 순일발생 바닥판 신호의 상실은 twhh 유전자에 의해 암호화될 수 있음을 의미한다. 병아리 및 쥐에서, 바닥판은 척삭 내에서 shh/vhh1의 계속된 발현에도 불구하고, 척삭에 의한 바닥판 유도 특성의 상실후 긴 시간이 지난 후에도 자가 유도 가능성을 유지하였다[참조: Roelink 등, 상기 문헌; Placzek 등, 상기문헌; Yamada 등, Cell, 73:673-686 (1993)]. 다른 척추동물 내에서 tehh 부류의 동족체가 보고되지 않았음에도 불구하고, twhh 의 발현과 더 유사한 패턴으로 기타 hh 동족체의 발현은 이들 불일치를 설명하는데 도움이 될 수 있다.
실시예 16
twhh-암호화된 전구물질로부터 유래하는 2개의 현저한 신호 전달 단백질
드로소필라 내의 내인성 hh 단백질은 생체 내에서 더 낮은 수준으로 발생하는 더 큰 전구물질(미절단에 대해 U)의 자가 단백질 분해에 의해 유도된 아미노- 및 카르복시-말단 단편(각각 N 및 C)으로 현저히 저장되어 있다[참조: Lee 등, 상기문헌]. 아미노 말단 영역 내의 결정기는 자가 단백질 분해 활성에 불필요한 것으로 보여지는 반면, 카르복시 말단 영역에 영향을 미치는 돌연변이는 자가 단백질 분해를 차단할 수 있고, 생체 내에서의 활성을 감소시킬 수 있다[참조; Lee 등, 상기문헌]. 상기 자가 단백질 분해는 329번 위치에 정상적으로 존재하는 히스티딘을 알라닌을 치환하므로써 차단된다. 상기 히스티딘은 모든 공지된 hh 유전자의 정열에서 절대 변경되지 않는 것이며, 그의 서열은 자가 단백질 분해에서 촉매적 역할을 수행하는 것을로 생각된다.
도 17은 제브라피쉬 트위기-윙클 헤지호그 유도체를 나타낸다. 도 17(A)는 여러 가지 twhh 개방 해독틀의 약화를 나타낸다. SS(어두운 부분)은 이들 단백질의 분비를 위한 N-말단 신호 서열로 생각되며, 각각의 개방 해독틀의 최초 27개의 아미노산을 포함한다. 화살표는 자가 단백질 부해의 예상되는 절단 위치를 나타내고 있다. 아미노산 잔기 수는 도 13(B)에 따른 것이다. 검은색 삼각형은 twhh 개방 해독틀의 정상적인 종결 코돈을 의미한다. 구성물 UHA 은 자가 단백질 분해를 차단하는 돌연변이를 포함한다[참조: 273번째 잔기인 히스티딘은 알라닌으로 변경된다; Lee 등, 상기문헌]. 구성물 U356HA 는 357번째 아미노산 잔기 대신에 종결 코돈 뿐만 아니라 UHA 내의 H273A 돌연변이를 포함한다. 구성물 N은 단지 twhh의 최초 200개의 아미노산을 암호화한다. 구성물 C는 결실된 잔지 31-197에 대한 코돈을 보유한다. 도 17(B)는 도 17(A)에서 도식적으로 나타낸 발현 구성물의 시험관내 해독을 나타낸다. 구성물은 시험관 내에서 35S 메티오닌의 존재 하에서 해독하였으며, SDS-PAGE 후에 방사선사진법으로 분석하였다. 단백질 생성물은 좌측에 도식적으로 나타냈다. 레인 1 및 6: 전장(USS) 단백질의 자가 단백질 분해는 2개의 단편, 즉 N-말단 단편(NSS) 및 C-말단 단편(C)을 생성하였다. 레인 2: 구성물 UHA 는 단지 자가 절단에 의한 USS twhh와 함께 동시이동하는 twhh 단백질의 미절단 형태를 생성하였다. 레인 5: 구성물 C는 근접하여 함께 이동하는 두 개의 밴드로 관찰할 수 있는 처리된 형태 및 처리되지 않은 형태를 암호화한였다. 하단부의 밴드는 USS(△31-197)의 자가 단백질 분해에 의해 생성되는 C 단백질이었다. 모든 구성물은 RPCR 법을 이용하는 발현 구성물 T7TStwhh(도 15)의 시험관내 돌연변이 유발에 의해 생성되었다. 모든 구성물의 서열은 디데옥시 서열결정법으로 확인하였다. 시험관내 해독은 제조자(프로메가)의 지시에 따라 수행하였다.
또한, shh, twhh 및 생쥐-shh/Hhg-1 에 의해 암호화된 척추동물 hh 단백질은 자가 단백질 분해를 수행하여 더 큰 단일 전구물질로부터 2개의 더 작은 종을 산출하였다[참조: Lee 등, 상기문헌; Chang 등, 상기문헌; 도 17(B)의 레인 1 및 6]. 무변 히스티딘을 알라닌으로 변이시키므로써 자가 단백질 분해로 절단되지 않는 twhh 단백질(UHA)의 한 형태를 암호화하는 구성물을 생성하였다. 또한, 본 발명자들은 난센스 코돈을 도입하였으며, 암호화 서열의 단편을 결실시키므로써 twhh의 아미노 또는 카르복시 말단 영역을 생성하는 구성물을 생성하였으며[참조: 각각 N 및 C; eh 17(B)의 레인 4 및 5; 구성물은 도 17(A)에 도식적으로 나타냈다]. 이들 단백질을 분비 경로에 표적화하기 위해, 모든 구성물은 정상적인 twhh 신호 서열을 보유하였다.
이들 구성물로부터 전사된 합성 mRNA 는 주입하고, 처리의 역할을 조사하고, 개개의 단백질 단편의 활성을 분석하였으며; 그 결과는 하기 표 1에 요약하였으며; 도 15에 제시된 활성을 기초로하였다. 이들 실험으로부터 얻은 가장 현저한 결론은 N 및 C 둘 다 활성을 나타내며, 이들 활성은 구별할 수 있다는 것이다. 따라서, N 및 C 둘 다 발생하는 눈 에서 엑토피성으로 pax-2를 활성화하므로써 내부 주입 조절을 제공할 수 있음에도 불구하고, 단지 N 만이 pax-6을 효율적으로 억제할 수 있었다(도 16). 또한, 수정체 발생에 대한 차후의 효과는 N 에 대해 극단적인 것이었으며, 이는 그의 생쥐 내에서 돌연변이성 표현형에 의해 제안된 수정체 발생 중의 pax-6의 역할과 부합되는 것이었다[참조: Ton, C.C. 등, Cell 67: 1059-1074 (1991); Glaser, T., 등, Nat. Genetics 2:232-239 (1992); Hill, R.E. 등, Nature 354: 522-525 (1991); Hogen, B.L. 등, J. Embryol. Exp. Morph., 97:95-100 (1986); 및 Hogan, B.L. 등, Development, 103 Suppl.: 115-119 (1988)].
델타 N-C의 활성을 고려하면, 이들 실험에서 델타 N-C 및 이의 단편에 이해 억제되는 내인성 hh 유전자의 활성을 인식하는 것이 중요하다(추가 기술된 실시예 18 및 도 18).
미절단 UHA 단백질은 단지 pax-2 유도에서 C 보다 다소 덜 활성이었으나, pax-6은 효율적으로 억제할 수 없었다(도 16). 후자는 특히 현저한데, 그 이유는 UHA 단백질(U356HA; 도 17(A, B))은 N과 현저히 다르지는 않은 활성을 보유하기 때문이다(도 16). 따라서, 자가 단백질 분해 및 pax-2 유도를 위해 중요한 결정기를 보유하는 것 이외에, 상기 C-말단은 미말단 hh 단백질과의 관계에서 N-말단 기능에 대한 억제성 영역을 포함한다. 또한, C-말단은 분자간 메카니즘에 의해 N 작용을 억제할 수 있다[참조: Lai 등, 상기문헌]. C 내의 이와 같은 억제성 영역의 존재는 자가 단백질 분해가 조절될 수 있는 경우, 이러한 조절이 생체 내에서 hh의 활성을 조절할 수 있음을 의미한다. 이러한 가능성은 생성된 가능한 hh 활성을 이해하기 위해 임의의 특정 패턴화 중심 내에서 발현된 hh 단백질의 처리된 상태를 확인하는 것에 대한 중요성을 강조하는 것이다.
실시예 17
초기 눈 및 뇌 패턴화에서 hh 신호 전달 단백질의 이중 역할
눈 및 뇌 패턴화에서 N 및 C 의 정상적인 역할의 이해에 있어서, 드로소필라 hh 유전자의 N 및 C 유도체는 일부 단서를 제공할 수 있다. 드로소필라 N 유도체는 단편적으로 줄이쳐진 패턴으로 합성하는 그의 배의 위치에 가깝게 유지되어 있으며[참조; Tabata 및 Kornberg, Cell, 76:89-102 (1994); Taylor 등, Mech. Dev., 42: 89-96 (1993)], 배양된 세포 내에서 발현되는 경우, 세포와 관련되어 있으며, 시험관 내에서 헤파린 아가로오즈에 의해 효율적으로 결합되어 있는데, 이러한 사실들은 외세포성 매트릭스 연합의 가능성을 시사하는 것이다. 대조적으로, C-말단 단편은 헤파린 아가로오즈에 의해 효율적으로 결합되어 있지 않으며, 거의 정량적으로 발현하는 배양된 세포의 배양 상청액내로 방출되며, 단지 확산에 의해 배 내에 편재화된다. 단편 개개의 활성을 분석할 수 없음에도 불구하고, 드로소필라 N 및 C의 생화학적 차이 및 조직 분포는 드로소필라 발생중 hh와 관련된 기능의 단기 및 장기를 설명할 수 있다.
제브라피쉬 N 및 C의 조직 분포가 알려지지 않았음에도 불구하고, 엑토피성 발현 분석에서 그들의 활성은 hh, pax-2 및 pax-6의 정상적인 발현 패턴과 관련하여 고려하는 경우, 단기 및 장기의 기능이다. 안포 내에서 pax-2 발현의 정상적인 구배는 그의 최대 구배로부터 융기 내의 hh 발현 위치까지 실질적인 거리로 확장되며; 따라서 pax-2를 활성화시킬 수 있는 엑토피성 C의 능력(이는 드로소필라 내에서 C의 분포와 일치한다)은 제브라피쉬 C가 장기 기능을 수행할 수 있음을 의미하는 것이다. 대조적으로, 내인성 pax-6 발현의 억제는 단기 기능인 것으로 보여지는데, 그 이유는 pax-6 발현이 내인성 hh 발현에 근접하여 발생하기 때문이다. pax-6의 효율적인 억제는 N 을 생성하는 구성물의 속성이며, N에 대한 단기 기능은 드로소필라 내에서 N의 분포와도 일치하는 것이다.
hh-의존성 활성의 두 형태는 hh-해독된 배양 세포에 대해 보고되었다. 그중 한 형태는 명백한 바닥판 마커의 접촉-의존성 유도이고[참조:Roelink, H. 등, Cell 76: 761-775 (1994)]; 체질형성전 중배엽내의 경절(硬節) 마커의 2차 유도는 확산가능하며, 장기로 작용한다.
실시예 18
제노퍼스 hh의 특정화
1. 재료 및 방법
전장 제노퍼스 헤지호그를 암호화하는 cDNAs 또는 분비성 리더 서열에 연결된 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 암호화하는 cDNAs를 시험관 내에서 전사시켜 해독가능한 mRNA를 산출하였다. 합성 mRNA 및 대조용 mRNA를 난할기 제노퍼스 배의 동물극에 주입하였으며, 이는 동물 캡 외이식편이 난할기 제노퍼스 배의 상부 1/4로 제조될 때 포배기로의 발생을 가능하게 하였다. 이어서, 이들 포배관 이식편은 형질전환 성장 인자 베타 족 구성원인 재조합 인간 액티빈 A의 존재 또는 부재하의 생리적 염수내에서 시험관내 배양하였다. 모든 외이식편은 대조용 배가 신경배기로 성장할 때 까지 또는 올챙이 기까지 성장할 때 까지 발행할 수 있었다. 액티빈 처리한 포배관은 중배엽 및 신경 세포 형태로 분화하였다. 따라서, 문제는 헤지호그 또는 이의 단백질 분해 유도체가 상피가 되지 못하도록 세포 분화를 변화시켜, 다른 세포 형태로 분화되는 것이다. 두 번째 문제점은 헤지호그가 액티빈과 작용하여 인자 자체에 대한 조직의 정상적인 반응을 변경시킬 수 있다는 점이다.
이어서, 외이식편을 당업계에 공지된 방법으로 추출하여 mRNA를 산출하고, 이를 주형으로 사용하고, 역전사효소를 이용하여 cDNA를 산출하였다. 이어서, 상기 cDNA는 특정 유전자를 위한 PCR 용 여러 가지 프라이머 세트, 역전사 효소-폴리머라아제 연쇄 반응 또는 RT-PCR 과 함께 주형으로 사용하였다. 이는 상기 외이식편내에 존재하는 mRNA의 존재 및 수준에 대해 진단할 수 있는 방사성 생성물의 특정 증폭으로 귀결된다. 샘플을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 이를 X-선 필름에 노출시켜 도면에 나타낸 밴드를 산출하였다. 따라서, 더 어두운 밴드는 특정 mRNA의 더 높은 수준과 상응하였다.
도 18(A) 및 18(B)는 헤지호그가 뇌하수체 및 전엽 뇌 유전자를 유도하고, 액티빈과 상호작용할 수 있거나, 외이식된 배 조직 내에서 이들 유전자의 발현을 증가시키기 위해 액티빈에 의해 유도된 노긴 및 폴리스타틴 같은 신경 유도체와 함께 상화작용할 수 있음을 나타내고 있다. 모든 홀수 레인은 RT-PCR 반응에서 역전사 효소를 사용하지 않은 것이며, 음성 대조용이다. 모든 짝수 레인은 상기 효소를 사용하였으며, 따라서 mRNA에 대한 특정 밴드를 나타내고 있다. 패널 A에서, 레인 1 내지 2는 액티빈 처리한 대조용 포배관이며, 레인 7 내지 8은 액티빈으로 처리한 헤지호그-발현 포배관이며, 레인 9 내지 10은 액티빈으로 처리한 프로락틴-발현 포배기이며, 포배관에서 분비된 단백질을 단순히 발현하기 위한 대조용으로 작용하였다. 상기 분석에 사용된 프라이머는 각 패널의 좌측에 나타냈다. 즉, XAG 1은 교질선 마커이고, XANF1B는 뇌하수체 마커이고, krox 20은 능뇌절-특이성 후뇌 마커이고, HIHbox 6은 후엽 후뇌 마커이고, NCAM은 일반적인 신경 마커이고, 액티빈은 중배엽 유도를 위한 대조용이고, 신장 인자는 모든 짝수 레인이 cDNA가 존재하는 것을 나타내기 위한 양성 대조용이다.
XANF1B 표지된 패널은 뇌하수체 유전자를 검출하였다. 레인 4(패널 A)는 헤지호그가 상기 뇌하수체 마커를 유도하고, 따라서 헤지호그가 없는 대조용 외이식편(레인 2)과 비교하는 경우, 상기 유전자를 발현하지 않는 포배관 외식편내의 뇌하수체 세포 형태를 유도함을 나타내고 있다. 레인 6은 헤지호그 부재하에서 액티빈으로 처리한 외이식편이 뇌하수체 유전자를 발현하는 것을 나타내고 있다. 레인 8은 헤지호그 및 액티빈 둘 다로 처리한 외이식편이 가장 높은 수준의 뇌하수체 유전자를 생성함을 나타내고 있다. 레인 10은 상기 헤지호그의 효과가 특이적임을 입증하고 있는데, 그 이유는 다른 분비된 단백질인 프로락틴은 상기한 바와 같은 뇌하수체 유전자의 상승된 수준을 유도하지 않기 때문이다.
OTX-A 표지된 패널은 상기 전엽 뇌 유전자를 검출하였다. 레인 4( 및 도 20의 6)는 헤지호그가 상기 신경-특이성 유전자를 유도할 수 있음을 나타내고 있다. 레인 8은 상기 신경 유전자의 수준이 헤지호그 단독 처리(레인 4) 또는 액티빈 단독 처리(레인 6)한 조직과 비교하는 경우, 헤지호그 및 액티빈 둘 다로 처리한 조직 내에서 가장 높다는 것을 나타내고 있다. 재론하면, 상기 효과는 헤지호그에 특이적인데, 그 이유는 프로락틴(레인 10)은 상기 유전자의 상승된 발현을 유도하지 않기 때문이다. XAG-1 표지된 패널은 교질선-특이성 유전자를 검출하였으며, 레인 4는 헤지호그는 높은 수준으로 상기 유전자를 유도하는 것을 나타내고 있다.
도 18(B)에서, 배는 N 또는 △N-C을 주입하였으며, 몇몇 동물 뇌관 외이식편은 배양전에 동포 배가 꼬리아체 단계에 이를 때 까지 액티빈으로 처리하였다. 레인 1과 2: 미주입된 배로부터 유래한 대조용 동물 뇌관. 레인 3과 4: 비주입된 배로부터 유래한, 액티빈으로 처리한 대조용 동물 뇌관. 레인 5와 6: N을 주입한 배로부터 유래한, 액티빈으로 처리한 대조용 동물 뇌관. 레인 7과 8: △N-C를 주입한 배로부터 유래한, 액티빈으로 처리한 동물 뇌관. N은 액티빈-처리한 외이식편 내에서 X-bhh(참조: B)의 활성과 유사한 활성을 나타내는 반면, △N-C 는 정반대의 효과, 즉 전엽 신경 마커 발현을 감소시키고, 후엽 신경 마커 발현을 증가시켰다. 도 18(B)에서 확인할 수 있는 바와 같이, N 은 X-bhh와 유사하게 행동하는데, 그 이유는 N 이 대조용 액티빈-처리된 동물 뇌관(레인 4)과 비교하는 경우, 상승된 수준의 XANF-2 및 Otx-A(레인 6)을 유도하기 때문이다. 또한, N 은 X-bhh의 주입후에 관찰된 바와 같이 더 후엽인 마커, 예를 들어 krox-20 및 X/Hbox-6의 발현을 감소시켰다. N의 활성과는 대조적으로(도 4(C)의 레인 6), △N-C 는 미주입 대조용(레인 4)과 비교하는 경우, 액티빈-처리한 동물 뇌관 내에서 전엽 신경 유전자 XANF-2 또는 Otx-A의 발현을 감소시켰(도 4(C)의 레인 8). 또한, △N-C 는 En-2 및 X/Hbox-6과 같은 더 후엽인 마커의 발현을 증가시켰다.
도 19는 X-bhh가 내인성 신경 유도제의 영향 하에서 외이식편의 신경 유전자 발현의 전후엽 패턴을 변경시킴을 나타내고 있다. 도 19(A): 켈러 샌드위치[참조: Keller 및 Danilchik (1988); Doniach 등 (1992); Doniach 가 재작성 (1993)]의 제조를 위해 주입된 배로부터 유래한 배면 외이식편의 분리. 도 19(B): 미주입된 배(레인 1과 2) 및 X-bhh 주입된 배(레인 3과 4)로 제조한 켈러 샌드위치, 총 RNA는 대조용 배가 단계 20에 이르는 경우, 분리하였으며, RT-PCR을 사용하여 XAG-1 및 신경 마커의 발현을 분석하였다. XAG-1은 교질선 마커이며, XANF-2는 전엽 뇌하수체 마커이며, Otx-A는 전뇌 마커이며, En-2는 중뇌-후뇌 경계를 정하며, Krox-20 은 후뇌의 능뇌절 3과 5를 나타내며, XlHbox-6은 척수 마커이다. N-CAM은 발현이 전후엽 축을 따라 제한되지 않는 일반적인 신경 마커이다. EF-1α 대조용은 필적할만한 RNA 양이 각각의 세트 내에서 분석됨을 입증하였다. 주: XAG-1의 발현 및 전엽 신경 마커는 X-bhh 처리에 의해 자극되는 반면, 후엽 신경 마커의 발현은 억제되었다.
도 20은 헤지호그 단백질의 N 및 C 영역의 차등 활성을 나타내고 있다. 상기 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, 홀수 레인은 음성 대조용 레인이고, 양수 레인은 상기한 바와 같은 마커에 대한 특이성 유전자 발현을 나타내고 있다. 헤지호그의 N 영역은 Xhh1208(레인 8)이라 칭하는 구성물 내에서 발현되었으며, C 영역은 Xhh1 델타 27-208(레인 10)이라 칭하는 구성물 내에서 암호화되었다. 상기 구성물 Xhh11-1270A(레인 12)는 특이적으로 돌연변이되어 자가처리를 불가능하게 하였다. 상기한 바와 같은 유전자를 유도할 수 있는 N 및 C 영역의 능력은 대조용 포배관 외이식편(레인 4), 양성 대조용으로서 전체 배(레인 2), 음성 대조용으로서 돌연변이된 헤지호그를 발현하는 포배관 외이식편(레인 14), 전체 헤지호그 1을 발현하는 포배관(레인 6) 및 독립적인 신경 유도제인 노긴으로 처리한 포배관 외이식편(레인 16)(미국, 버클리에 소재하는 캘리포니아 대학의 리차드 하를랜드가 발견함)과 비교하였다.
교질선 마커 XAG-1에 대해 첫 번째 패널을 조사하므로써 손상되지 않은 헤지호그(레인 6) 및 N 영역(레인 8) 및 처리 결함이 있는 헤지호그(레인 12)는 교질선을 유도함에 있어서 C 영역(레인 1) 보다 훨씬 더 양호함을 학인하였다. 두 번째 패널을 조사하므로써 C 영역(레인 10)이 뇌하수체 유전자인 XANF1B 의 유도에 있어서 N 영역(레인 8) 보다 더 양호함을 확인하였다. 상기 A 지점에서 N 영역은 XAG-1 마커를 더 양호하게 유도하기 때문에, 상기 두 가지 결과를 종합하여 판단해 보면, N 및 C 영역은 구분할 수 있는 활성을 보유한다는 점을 명백히 확인할 수 있다. 남아있는 패널을 조사하므로써 정상적인 헤지호그(레인 6)의 기술된 모든 활성은 N 및 C 영역의 활성으로 정의할 수 있음을 확인하였다.
전뇌 유전자 otx-A 에 대해 세 번째 패널을 조사하므로써, N 영역(레인 8) 및 C 영역(레인 10) 둘 다 유사한 수준으로 상기 유전자를 유도하나, 처리 결함이 있는 헤지호그(레인 12)는 N 또는 C 영역중 어느 것 보다 더 양호하게 상기 유전자를 유도하였다.
이 도면(NCAM)의 네 번째 패널(뿐만 아니라 도 18 패널 EN-2, krox20, XIHbox6 및 NCAM)을 조사하므로써, 헤지호그가 이들 더 전엽의 신경 유전자를 유도하지 않음을 확인하였다. 노긴(레인 16)이 뇌하수체 및 전뇌 유전자를 유도할 수 있고, 헤지호그가 유도하지 않는 일반적인 신경 유전자(NCAM)도 유도한다는 것은 명백한 사실이다. 이는 헤지호그가 신경 유도제인 노긴으로부터 유래한 명백한 활성이며, 신경 유전자를 유도하기 위한 더 제한된 능력을 보유함을 명백히 확인하였다.
제노퍼스 배 내에서의 실험은 전장 헤지호그 RNA를 주입하고, C 영역 특이성 항체를 이용하는 면역 침전에 의해 수행하였는데, 이 실험으로 전장 헤지호그가 척추동물 체내에서 처리되며, 이것은 드로소필라 내에서의 초기 실험에서 밝혀진 자료와도 부합되는 것임을 확인하였다. 따라서, 헤지호그 N 및 C 영역의 검출에 대한 이의 유용성은 상기 영역들이 척추동물 내에서 헤지호그 처리를 통해 나타난다는 사실에 기초하였다. 또한, 헤지호그 처리가 생체 내에서 발생한다는 지식에 의해 N 영역과 C 영역중 어느 영역이 독립적인 활성을 보유하는가 라는 의문을 자연적으로 갖게되었다.
도 18의 결과는 그들이 뇌하수체 유전자 및 전엽 뇌 유전자 유도에서 헤지호그의 활성이 성장 인자인 TGFβdp 의해 증강될 수 있음을 확립하는한 신규한 것이다. 상기 증강은 도 20에 기술된 N 및 C 영역에 적용될 것 같은데, 그 이유는 분석된 유전자가 동일하기 때문이다. 상기 증강은 상기한 바와 같은 노긴 및 폴리스타틴을 포함하나, 이로 제한되지 않는 TGFβ류에 의해 유도된 신경 유도 인자와 상승작용하는 hh 에 기인하는 것이다.
도 20의 자료는 몇가지 중요한 사실을 제공한다. 첫째, 상기 자료는 N 및 C영역이 상기 N 및 C 활성은 손상되지 않은 헤지호그 단백질의 관찰된 모든 활성를 설명하기 위해 함께 제공된 다소 중첩되는 활성을 보유하고 있음에도 불구하고, 다르다는 것을 나타내고 있다. 따라서, 헤지호그를 이용하는 임의의 임상적 또는 진단 용도는 상기 N 또는 C 영역에 의해 개선될 수 있는데, 그 이유는 일반적으로 사람은 임상적 작용을 위한 활성을 보유하는 최소량의 단백질을 사용하는 것을 원할 것이고, 상기 N 또는 C 영역이 유해한 면역 반응 또는 기타 유해한 부작용을 덜 촉발시킬 것이기 때문이다. 둘째, 상기 자료는 C 영역이 N 영역 보다 더 양호하게 뇌하수체 유전자 발현을 유도하는 것을 나타내고 있는데, 그 이유는 C 영역이 손상되지 않은 헤지호그 또는 N 영역 보다 교질선을 덜 유도하기 때문이며, 이는 곧 C 영역이 가능한한 특이적으로 뇌하수체의 발생 또는 발현을 증강시키기를 바라는 임상적 상황에 유용하다는 것을 의미한다. 뇌하수체는 다수의 호르몬의 근원이기 때문에, 뇌하수체 세포 증식 및 활성을 증가시키기 위한 임의의 처리는 가능한한 부작용이 적은 것이 바람직하며, 따라서 C 영역이 증강된 뇌하수체 세포 증식 및 기능을 증강시키는 치료에 적합한 후보이다. 셋째, 노긴의 연구와 관련하여, 도 20은 헤지호그 및 노긴 둘 다 뇌하수체 유전자 발현을 유도할 수 있는 한편, 헤지호그가 더 특이성인데, 그 이유는 헤지호그가 일반적인 신경 마커인 NCAM을 유도하지 않는데 반해, 노긴은 NCAM 뿐만 아니라 뇌하수체도 유도하기 때문이라는 사실을 명백히 나타내고 있다. 넷째, 처리되지 못하도록 돌연변이된 헤지호그(레인 12)는 전장 및 야생형 헤지호그(레인 6) 만큼 뇌하수체 유전자를 발현시키기 위한 활성을 보유하나, 처리 결함이 있는 헤지호그는 전뇌 마커 otx-A를 더 양호하게 유도한다. 따라서, 특이성 세포 형태를 유도하기 위한 헤지호그의 몇몇 임상적인 적용에서, 이는 처리 결함이 있는 헤지호그가 정상적이 헤지호그와 비교하여 더 뛰어날 수 있다는 것이다.
도 21은 △N-C 가 동물 뇌관 외이식편 내에서 X-bhh 및 N 활성을 방해함을 나타내고 있다. 여러 가지 RNAs를 배에 주입하고, 동물 뇌관 외이식편을 동포 배가 꼬리아체에 이를 때(25 기) 까지 배양하고, 그때 교질선 마커 XAG-1 및 대조용 RNA, EF-1α의 발현을 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 레인 1과 2: 미주입된 배로부터 유래한 대조용 동물 뇌관. 레인 3과 4: 비주입된 배로부터 유래한, X-bhh 및 프로락틴 RNAs로 처리한 동물 뇌관. 레인 5와 6: X-bhh 및 △N-C을 주입한 배로부터 유래한 동물 뇌관. 레인 7과 8: N 및 프로락틴 RNAs를 주입한 배로부터 유래한 동물 뇌관. 레인 9 및 10: N 및 △N-C 둘 다를 주입한 배로부터 유래한 동물 뇌관. 상기 N 및 X-bhh 실험은 개별적으로 수행하였으며, 따라서 레인 3 내지 6의 절대 수준은 레인 7 내지 10의 절대 수준과 비교할 수 없다. 주: X-bhh 또는 N에 의한 XAG-1 발현의 유도는 △N-C 의 동시주입에 의해 감소하였다.
X-bhh의 내부 결실(△N-C)은 외이식편 내에서 X-bhh 및 N의 활성을 차단하였으며, 배 내에서 배면 전엽 구조를 감소시켰다. 증가된 hh 활성은 전엽 신경 유전자의 발현을 증기시키고, △N-C는 배면 전엽 구조를 감소시키기 때문에, 이들의 상보적 자료는 신경 유도 및 전후엽 패턴화의 hh 에 대한 역할을 지지한다.
△N-C는 X-bhh의 28 내지 194번 아미노산이 결실된 것이다. 일차 해독 생성물은 1 내지 23번 아미노산을 제거하는 신호 서열 절단 및 자가 단백질 분해를 겪을 것으로 예상된다. 드로소필라 hh 내에서의 절단 위치[참조: Porter 등, Nature, 374: 363 (1995)]에 기초하면, 자가 단백질 분해는 X-bhh 198 내지 409 아미노산 뿐만 아니라 예상된 7개의 아미노산 폴리펩티드, 즉 24 내지 27번 아미놋산 및 195 내지 197번 아미노산으로 이루어진 C 영역을 생성할 것이다[참조: Lai 등, Development 121: 2349 (1995)]. 신경 마커 상에서 △N-C의 효과 분석은 노던 블로트 분석 및 동위치 하이브리드화법을 포함하는 표준 방법으로 수행하였다[참조: Lai 등, 상기문헌(본 명세서에 참고로 인용함)].
△N-C는 교질선 마커 XAG-1을 유도하지 않음에도 불구하고, 액티빈 처리된 동물 뇌관 내에서 전엽 외배엽성 및 신경 마커의 발현을 감소시킨다. 따라서, △N-C는 신경 패턴화에 영향을 줄 수 있는 능력을 보유하고 있다. 또한, △N-C는 액티빈 처리된 동물 뇌관 내에서 후엽 신경 마커의 증가를 촉진한다. △N-C와 N 또는 전장 X-bhh의 1:1 혼합은 동물 뇌관 분석에서 교질선의 유도의 현저한 억제를 유도하는데, 이는 △N-C가 X-hh를 방해한다는 가설을 지지하는 사실이다.
본 발명에 따라 헤지호그로부터 유래된 2개의 신규한 폴리펩티드와 이들 폴리펩티드를 이용하여 신경원 세포의 증식 분화를 조절하는 방법이 제공된다.
[서열표]
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 더 존스 홉킨스 유니버시티 스쿨 오브 메디신 등.
(ii) 발명의 명칭 : 신규한 헤지호그 유래의 폴리펩티드
(iii) 서열의 수 : 20
(iv) 서신 주소:
(A) 수신인 : 피시 앤드 리차드슨 피.시.
(B) 스트리트 : 스윗 1400, 익세큐티브 스퀘어 4225
(C) 도시 : 라 졸라
(D) 주 : 캘리포니아
(E) 국가 : 미국
(F) ZIP : 92037
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.30
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 : PCT/US95
(B) 출원 일자 : 1995. 12. 4
(C) 분류 기호:
(viii) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 리사 에이. 헤일리
(B) 등록번호 : 38,347
(C) 참조번호 : 07265/043WO1
(ix) 통신 정보 :
(A) 전화 : 619/678-5070
(B) 팩스 : 619-678-5099
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 양형태
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : CDS
(B) 위치 : 1..142
(xi) 서열 : 서열 번호 1:
[서열 1]
Figure pct00001
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 144 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 양형태
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : CDS
(B) 위치 : 1..142
(xi) 서열 : 서열 번호 2:
[서열 2]
Figure pct00002
(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 3:
[서열 3]
Figure pct00003
(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 4:
[서열 4]
Figure pct00004
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 5:
[서열 5]
Figure pct00005
(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 6:
[서열 6]
Figure pct00006
(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 7:
[서열 7]
Figure pct00007
(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 8:
[서열 8]
Figure pct00008
(2) 서열 번호 9 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 9:
[서열 9]
Figure pct00009
(2) 서열 번호 10 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 10:
[서열 10]
Figure pct00010
(2) 서열 번호 11 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 11:
[서열 11]
Figure pct00011
(2) 서열 번호 12 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 12:
[서열 12]
Figure pct00012
(2) 서열 번호 13 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 13:
[서열 13]
Figure pct00013
(2) 서열 번호 14 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 8 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 14:
[서열 14]
Figure pct00014
(2) 서열 번호 15 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 8 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 15:
[서열 15]
Figure pct00015
(2) 서열 번호 16 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 8 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 16:
[서열 16]
Figure pct00016
(2) 서열 번호 17 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 416 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 17:
[서열 17A]
Figure pct00017
[서열 17B]
Figure pct00018
(2) 서열 번호 18 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 418 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 18:
[서열 18A]
Figure pct00019
[서열 18B]
Figure pct00020
(2) 서열 번호 19 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 425 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 무관함
(D) 형태 : 양형태
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 19:
[서열 19A]
Figure pct00021
[서열 19B]
Figure pct00022
[서열 19C]
Figure pct00023
(2) 서열 번호 20 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 437 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 20:
[서열 20A]
Figure pct00024
[서열 20B]
Figure pct00025
[서열 20C]
Figure pct00026

Claims (31)

  1. 헤지호그 단백질의 아미노 말단 아미노산으로부터 유래한 아미노산 서열을 보유하고, 카르복시 말단에 천연 헤지호그 폴리펩티드의 카르복시 말단 단편의 단백질 분해 활성에 의해 특이적으로 인식되는 G↓CF 절단 위치를 보유하는 것을 특징으로 하는 거의 순수한 폴리펩티드.
  2. 제 1 항의 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  3. 제 2 항에 있어서, 제 1 항의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하고, 제 1 항의 폴리펩디드와 면역반응하는 항체에 대한 하나 이상의 에피토프를 보유하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  4. 제 2 항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  5. 제 4 항의 발현 백터를 함유하는 숙주 세포.
  6. 제 1 항의 폴리펩티드에 결합하고, 제 1 항의 폴리펩티드의 면역반응성 단편에 결합하는 항체.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 항체가 다중클론 항체인 항체.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체인 항체.
  9. 헤지호그 단백질의 카르복시 말단 아미노산으로부터 유래한 아미노산 서열을 보유하고, 아미노 말단에 천연 헤지호그 폴리펩티드의 카르복시 말단 단편의 단백질 분해 활성에 의해 특이적으로 인식되는 G↓CF 절단 위치를 보유하는 것을 특징으로 하는 거의 순수한 폴리펩티드.
  10. 제 9 항의 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  11. 제 10 항에 있어서, 제 9 항의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하고, 제 9 항의 폴리펩디드와 면역반응하는 항체에 대한 하나 이상의 에피토프를 보유하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  12. 제 10 항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  13. 제 12 항의 발현 백터를 함유하는 숙주 세포.
  14. 제 9 항의 폴리펩티드에 결합하고, 제 9 항의 폴리펩티드의 면역반응성 단편에 결합하는 항체.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 항체가 다중클론 항체인 항체.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체인 항체.
  17. 신경 세포와 헤지호그 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 신경 세포의 증식 또는 분화를 조절하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 헤지호그 폴리펩티드가 제 1 항의 폴리펩티드인 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 헤지호그 폴리펩티드가 제 9 항의 폴리펩티드인 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 조절이 증식 또는 분화의 유도인 방법.
  21. 제 17 항에 있어서, 상기 신경 세포가 거의 바닥판 신경 세포로부터 유래하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 신경 세포가 운동 신경인 방법.
  23. 제 17 항에 있어서, 상기 신경 세포가 척추동물 신경세포인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 척추동물이 인간인 방법.
  25. 제 17 항에 있어서, 상기 세포와 TGF-β류를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 TGF-β가 액티빈인 방법.
  27. 제 17 항에 있어서, 상기 세포와 신경 유도제를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 신경 유도제가 노긴, 폴리스타틴 및 뉴로트로핀으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 제 9 항의 폴리펩티드의 단백질 분해 영역을 포함하는 제 1 폴리펩티드, 상기 제 1 폴리펩티드에 의해 인식되는 절단 위치 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 자가 단백질 분해성 융합 단백질.
  30. 제 29 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  31. 제 9 항의 폴리펩티드의 단백질 분해 영역 및 상기 단백질 분해 영역에 의해 인식되는 절단 위치를 포함하는 제 1 폴리펩티드를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드와 제 2 폴리펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 자가 단백질 분해성 융합 단백질의 제조 방법.
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