KR100448298B1

KR100448298B1 - 유전자발현의증진을위한글루코코르티코이드를포함하는약제학적조성물

Info

Publication number: KR100448298B1
Application number: KR10-1998-0701722A
Authority: KR
Inventors: 린드세이 슈와츠; 제니퍼 리 존슨; 버논 나이트
Original assignee: 리서치 디벨럽먼트 파운데이션
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 2004-12-03
Also published as: NZ318272A; EP0848616A4; TW533072B; EP0848616A1; ZA967590B; IL123596A0; RU2203093C2; CA2229345A1; KR19990044474A; US20040043958A1; CN1257750C; CN1198676A; US6656916B1; WO1997009070A1; AU712208B2; AU6971496A

Abstract

본 발명은 약리학적 유효 용량의 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 특정 유전자의 세포 발현을 증가시키기에 충분한 양으로 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 유전자를 상기 동물에게 운반한 후 생물학적 조직내에서 상기 유전자의 세포 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 약리학적 유효 용량의 글루코코르티코이드를 특정 유전자의 세포 발현을 증가시키기에 충분한 양으로 병리생리학적 상태의 치료를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 유전자를 상기 동물의 생물학적 조직내로 운반한 후 상기 유전자의 세포 발현을 증가시킴으로써 사람에 있어서의 병리생리학적 상태를 치료하는 각종 방법을 제공한다.

Description

유전자 발현의 증진을 위한 글루코코르티코이드를 포함하는 약제학적 조성물{Glucocotricoid enhancement of gene expression}

지난 2년 간, 유전적 결함이나 유전자 기능이상으로 인해 야기된 질병을 치료하기 위한 유전자 치료법 개발을 위해 사람을 대상으로 한 임상 시험은 상당히 희망적이고 고무적이었다. 폐에서 현저한 증상을 나타내는 몇몇 질환들, 예를 들면, 낭포성 섬유증 및 폐암이 유전자 치료법의 대상이 되었다. 이들 시험에서는 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 뿐만 아니라 유전자를 세포내로 수송하고 운반해주는 양이온성 지질이 사용되었다. 그럼에도 불구하고, 세포 전이와 이에 따른 유전자 발현 정도가 낮기 때문에, 치료학적 수준의 유전자 발현이 결여될 수도 있다. 더욱이, 바이러스성 벡터에 대하여 진행되는 면역 반응으로 인해 이의 사용이 제한될 수 있다. 양이온성 지질이 운반에 있어서 아데노바이러스 벡터보다 덜 효과적이긴 하지만, 보다 새로운 화학적 디자인을 통해 본래의 디자인에 비해 상당히 개선된 양이온성 지질을 제조하였다. 몇몇 동물 시험과 사람을 대상으로 한 시험에서는 형질감염시 전형적인 양이온성 지질 농도에서 부정적인 부작용이나 면역 반응이 전혀 진행되지 않은 것으로 나타났다.

에어로졸을 이용하여 유전자 치료법을 폐에 적용함으로써 유전자를 표적 조직에 직접적으로 운반할 수 있다. 몇몇 그룹은 에어로졸 운반 및 양이온성 리포좀과 커플링된 리포터 유전자 DNA를 사용한 생체내 동물의 폐의 형질감염을 입증하였다. 이들 연구에서 인지된 두드러진 양상은 독성이 없다는 것과 유전자 발현이 대략 1개월간 지속된다는 것이다. 유전자 발현은 여전히 비교적 낮으며; 심지어 마우스 폐에서 적당한 형질감염을 나타내는 데에도 고도로 정제된 DNA 0.5 내지 12mg 이상이 요구된다. 보고된 바와 같이, 이들 방법에 의한 유전자 치료법은 사람을 대상으로 실행될 수 없을 것이다.

형질감염 효율을 증가시키는 또 다른 접근 방식은 플라스미드 흡수와 표적 조직 내에서 형질감염된 유전자의 발현에 영향을 미치는 요소들을 보다 폭 넓게 이해하는 것이다. 폐 세포에서 유전자 형질감염에 대한 염증의 역활에 관한 최근의 연구 조사 결과, A549 사람 폐암 세포를 pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE로 형질감염시키기 전에 면역 자극인자 리포폴리사카라이드 또는 사이토킨 IL-1β에 노출시키면, β-gal 단백질 수준이 배지로만 처리된 세포에서 관찰된 수준 이하로 감소되는 것으로 밝혀졌다.

선행 기술은 치료학적 수준의 형질감염된 유전자를 운반하는데 효과적인 수단이 제시되지 못하였다는 점에서 결함을 지니고 있다. 본 발명은 당해 분야에서의이와 같은 지속적인 필요성과 요구를 충족시킨다.

발명의 요약

양이온성 지질-DNA 복합체가 세포에 의해 어떻게 취해지는지에 대한 기전이나, 이러한 복합체가 상기 세포 내에서 어떠한 운명을 지녔는지에 관해서는 거의 알려져있지 않다. 특히 만성 폐 염증성 질환이나 기타 면역 과정과 관련된 질환이 있는 환자의 조직에서의 DNA의 흡수 및 지속적인 운반과 발현에 영향을 미칠수 있는 동일계(in situ) 인자들에 관해서는 공지된 바가 더욱 드물다. 본 발명은 세포 배양물에서의 형질감염에 대해서 상당한 효과를 나타내고 생체내에서 유사한 효과를 나타내는 2가지 발견을 입증하고 있다. 첫째, 본 발명은 사이토킨 IL-1β및 면역 자극인자 리포폴리사카라이드(LPS)가 양이온성 지질에 의해 A549 사람 폐암 세포주 또는 1차 랫트 폐 세포 내로 형질감염된 pCMVβ-gal의 형질감염/발현을 억제시킨다는 것을 입증하고 있다. 둘째로, 본 발명은 베클로메타손 디프로피오네이트(BEC)와 같은 국소적인 항염증성 글루코코르티코이드가 IL-1β와 리포폴리사카라이드의 억제 효과를 반전시킬 뿐 아니라 심지어는 처리되지 않은 형질감염된 세포, 즉 리포폴리사카라이드 또는 IL-1β등으로 처리되지 않은 형질감염된 세포에서 관찰된 발현 이상으로 리포터 유전자의 발현을 증진시킨다는 것을 입증하고 있다. 상기 효과는 다른 유형의 스테로이드와는 달리 글루코코르티코이드에 대해서 특이적이지만, 특정의 글루코코르티코이드에 특이적이지는 않다. 이러한 효과는 또한 세포를 또 다른 면역억제제인 사이클로스포린 A로 예비-처리한 경우에는 관찰되지 않기 때문에 항염증제로서의 글루코코르티코이드에 대해서 특이적일 수도있다. 유전자전이(transgene) 활성에 있어서의 글루코코르티코이드-매개된 증진법은 사용된 프로모터, 리포터 유전자 및 양이온성 지질과는 무관하다. 글루코코르티코이드가 리포터 유전자의 발현을 증진시키는 기전은 플라스미드-지질 흡수(uptake)의 증가와는 관련이 없고, 오히려 신규의 단백질 합성을 수반하지 않는 세포내 기전이다. 또한, 1차 랫트 폐 세포를 형질감염시키기에 앞서 리포폴리사카라이드 또는 IL-1β의 부재하에서 국소적인 합성 글루코코르티코이드로 예비처리시키면 β-gal 단백질의 수준이 처리되지 않은 대조군에 비해 증가되었다. 본 발명은 플라스미드 DNA의 글루코코르티코이드-증진된 형질감염의 기전에 관한 연구에 대해 기술하고 있다. 따라서, 본 발명은 생체내 유전자 치료법의 용도와 직접적인 관련이 있다.

본 발명의 한 양태에서는, 유전자의 세포 발현을 증가시키기에 충분한 양의 약리학적 유효량의 글루코코르티코이드를 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 적당한 벡터 내의 상기 유전자를 상기 동물에게 운반한 후 생물학적 조직내에서 상기 유전자의 세포 발현을 증가시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 유전자의 세포 발현을 증가시키기에 충분한 양의 약리학적 유효량의 글루코코르티코이드를 병리생리학적 상태를 치료를 필요로하는 사람에게 투여하는 단계를 포함하여, 유전자를 상기 사람의 생물학적 조직 내로 운반한 후 적당한 벡터 내에서의 상기 유전자의 세포 발현을 증가시킴으로써 사람에 있어서의 병리학적 상태를 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 기타 및 추가의 국면, 양태 및 이점은 서술을 목적으로 제시된 다음과 같은 본 발명의 바람직한 양태에 관한 기술로부터 명백할 것이다.

본 발명은 일반적으로 약물 작용, 세포 조절 및 유전자 치료법 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 언급하면, 본 발명은 양이온성 지질 또는 리포좀에 의해 형질감염될 때 글루코코르티코이드(glucocorticoid)가 리포터 유전자 활성을 증진시킨다는 새로운 사실의 발견에 관한 것이다.

앞서 언급된 본 발명의 특징, 이점 및 목적 뿐만 아니라, 앞으로 명백해질 기타 국면들이 상세히 이해될 수 있도록 하기 위해, 첨부된 도면에 예시된 본 발명의 특정 양태를 참조로 하여 앞서 간략하게 요약된 본 발명을 보다 특정하게 기술할 수 있다. 본 도면은 본 명세서의 한 부분을 형성하고 있다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 기술하고 있기 때문에, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다는 것을 인지해야만 한다.

도 1은 리포폴리사카라이드와 IL-1β가 pCMVβ-gal-양이온성 지질로 형질감염된 A549 세포에서 β-갈락토시다제(β-gal) 활성을 억제한다는 것을 도시하고 있다. A549 세포를 배지, 리포폴리사카라이드 0.5μg/mℓ또는 재조합 사람 IL-1β100U/mℓ로 4시간 동안 처리한다. 처리 후, 세포를 pCMVβ-gal 1μg/mℓ - DMRIE/DOPE 4μg으로 형질감염시킨다. β-갈락토시다제 활성을 구체적으로 측정해 주는 (CPRG)비색측정용 미세역가 분석을 이용하여 β-gal 활성을 측정한다. 결과는 3회 실험으로부터의 평균치 및 표준편차(SD)를 나타낸다. 폴드-변화(fold-change)는 배지-처리된 샘플에서의 β-gal 활성에 대한 리포폴리사카라이드 또는 IL-1 샘플에서의 β-gal 활성을 나타낸다.

도 2A 내지 도 2B는 글루코코르티코이드가 형질감염된 A549 세포에서 β-gal 활성을 증진시킨다는 것을 도시하고 있다. A549 세포를 글루코코르티코이드로 4시간 동안 처리한다. 도 2A는 10^-7내지 10^-6M의 용량 범위의 상기와 같이 형질감염된 세포의 베클로메타손에 대한 용량 반응을 도시한 것이다. 도 2B는 다른 몇몇 국소적 글루코코르티코이드, 즉 부데소나이드, BUD; 플루니솔라이드, FLUN; 베클로메타손-디프로피오네이트-디라우로일 포스파티딜콜린, 베클로메타손-DLPC가 또한 10^-6M에서 β-gal 활성의 증진을 유도한다는 것을 도시하고 있다. 처리 후, 세포를 pCMVβ-gal 1μg/mℓ -DMRIE/DOPE 4μg으로 형질감염시킨다. 미세역가 분석을 사용하여 β-gal 활성을 측정한다. 결과는 3회 실험으로부터의 평균치 및 SD를 나타낸다. 폴드-변화는 배지-처리된 샘플에서의 β-gal 활성에 대한 글루코코르티코이드-처리된 세포에서의 β-gal 활성을 나타낸다.

도 3은 베클로메타손이 형질감염된 A549 세포에서 β-gal 활성에 대한 리포폴리사카라이드 및 IL-1β의 억제 효과를 반전시킨다는 것을 도시하고 있다. A549 세포를 배지 단독, 베클로메타손(10^-6M), IL-1β(100U/ml) 또는 리포폴리사카라이드(0.5μg/mℓ)로 4시간 동안 처리한다. 처음 4시간 후, 상등액을 제거하고 세포를 배지, IL-1β, 리포폴리사카라이드 또는 베클로메타손으로 4시간 더 설정된 바와 같이 처리한다(즉, 베클로메타손, 리포폴리사카라이드; 처음 4시간 동안 베클로메타손으로 처리하고 두 번째 4시간 동안은 리포폴리사카라이드로 처리한다). 두 번째 처리 후, 세포를 pCMVβ-gal 1μg/mℓ - DMRIE/DOPE 4μg으로 형질감염시킨다. 미세역가 분석을 사용하여 β-gal 활성을 측정한다. 결과는 2회 실험으로부터의 평균치 및 SD를 나타낸다. 폴드-변화는 배지-처리된 세포에서의 β-gal활성에 대한 베클로메타손, 리포폴리사카라이드, IL-1β또는 이들의 조합물로 처리된 세포에서의 β-gal 활성을 나타낸다.

도 4는 베클로메타손이 1차 랫트 폐 세포에서 β-gal 활성을 증진시킨다는 것을 도시하고 있다. 1차 랫트 폐 세포를 효소로 분해된 랫트 폐로부터 분리하여 세포웰 조직 배양 디쉬내에 웰당 1.0 x 10⁵세포수로 플레이팅한다. 세포를 베클로메타손, 리포폴리사카라이드(0.5μg/mℓ) 또는 베클로메타손 + 리포폴리사카라이드(베클로메타손 4시간 + 리포폴리사카라이드 4시간)로 10^-7내지 10^-6M 범위의 농도로 4시간 동안 예비처리한 다음 DNA 3μg 및 DMRIE/DOPE 12μg으로 형질감염시킨다. 48시간 후, CPRG 미세역가 분석을 사용하여 β-gal 활성을 측정한다. 결과는 3회(*2회) 실험으로부터의 평균치 및 SD를 나타낸다. 폴드-변화는 배지-처리된 세포에서의 β-gal 활성에 대한 베클로메타손, 리포폴리사카라이드, 베클로메타손 + 리포폴리사카라이드로 처리된 세포에서의 β-gal 활성을 나타낸다.

도 5A 내지 도 5C는 베클로메타손-매개된 증진이 양이온성 지질, 벡터 프로모터 또는 벡터 리포터 유전자에 제한되지 않고 글루코코르티코이드에 특이적이라는 것을 도시하고 있다. A549 세포를 베클로메타손 또는 기타 스테로이드(도 5B, 스테로이드: 에스트로겐, E2; 프로게스테론, PROG; 콜레스테롤, CHOL)로 4시간 동안 처리한다. 처리 후, 세포를 도 5A에서는 pCMVβ-gal 1μg/mℓ 및 DOSPA/DOPE 3μg/mℓ로 형질감염시키고, 도 5B에서는 pSVβ 1μg/mℓ 및 DMRIE/DOPE 4μg/mℓ으로 형질감염시키거나 pCMVβ-gal 1μg/mℓ 및 DMRIE 4μg/mℓ으로 형질감염시키며,도 5C에서는 pCMVHICAT 1μg/mℓ 및 DMRIE/DOPE 4μg/mℓ으로 형질감염시킨다. β-gal 활성은 미세역가 분석으로 측정한다. 동위원소¹⁴C 아세틸화 형태의 클로람페니콜이 TLC에 의해 분해되고¹⁴C 혼입이 베타스캐너 셋트에 의해 측정되어¹⁴C을 검출하는 TLC 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 분석을 이용하여 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 활성을 측정한다. 도 5A 및 도 5C에서의 결과는 3회 실험으로부터의 평균치 및 SD를 나타낸다. 도 5B에서의 결과는 3회 실험의 대표치이다. 폴드-변화는 배지-처리된 세포에서의 β-gal 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 활성에 대한 베클로메타손 또는 스테로이드로 처리된 세포에서의 β-gal 또는 CAT 활성을 나타낸다.

도 6은 베클로메타손이 A549 세포에서 플라스미드 흡수를 증가시키지 않는다는 것을 도시하고 있다. A549 세포를 배지 또는 특정 용량의 베클로메타손으로 4시간 동안 예비처리한 다음,³H-티미딘-표지된 pCMVβ-gal로 형질감염시킨다. 형질감염시킨지 2시간 후, 세포를 세척하고, 가볍게 트립신으로 처리한 다음 원심분리시켜 펠렛화한다. 이어서, 펠렛을 용해시키고, 재현탁한 다음 액체 신틸레이션 칵테일을 가한다. 샘플당³H-티미딘-표지된 pCMVβ-gal 흡수(CPM)를 측정한다. 결과는 4회 실험으로부터의 평균치 및 표준편차를 나타내고 각 실험은 2회 수행한다. 폴드-변화는 배지로 예비처리된 CPM에 대한 베클로메타손 예비처리된 세포의 CPM을 나타낸다.

도 7은 베클로메타손-증진된 리포터 유전자 발현의 역학(kinetics)을 도시하고 있다. A549 세포를 10^-6M 베클로메타손 또는 배지로 다양한 경과 시간 동안 처리한다. 세포를 pCMVβ-gal 1μg/mℓ - DMRIE/DOPE 4μg으로 형질감염시킨다. CPRG 미세역가 분석을 사용하여 β-gal 활성을 측정한다. 결과는 2회 실험으로부터의 평균치 및 SD를 나타낸다. 폴드-변화는 배지-처리된 세포에서의 β-gal 활성에 대한 베클로메타손-처리된 세포에서의 β-gal 활성을 나타낸다.

도 8은 단백질 합성이 베클로메타손-매개된 β-gal 활성 증진에 요구되지 않는다는 것을 도시하고 있다. 세포를 배지 또는 CHX(10μg/mℓ)로 30분 동안 처리한다. 배지로 예비처리된 세포를 연속적으로 배지 또는 10^-6M 농도의 베클로메타손으로 4시간 동안 처리한다. CHX로 예비처리된 세포를 연속적으로 CHX 또는 10^-6M 농도의 베클로메타손 + CHX로 4시간 동안 처리한다. 세포를 pCMVβ-gal 1μg/mℓ및 DMRIE/DOPE 4μg/mℓ으로 형질감염시킨다. CPRG 미세역가 분석을 사용하여 β-gal 활성을 측정한다. 결과는 2회 실험으로부터의 평균치 및 SD를 나타낸다. 폴드-변화 BEC는 배지-처리된 세포에서의 β-gal 활성에 대한 베클로메타손-처리된 세포에서의 β-gal 활성을 나타낸다. 폴드-변화 베클로메타손 + CHX는 CHX-처리된 세포에서의 β-gal 활성에 대한 베클로메타손 + CHX-처리된 세포에서의 β-gal 활성을 나타낸다.

도 9는 베클로메타손이 A549 세포에서 정지상태의 mRNA 수준을 증가시킨다는것을 도시하고 있다. A549 세포를 10^-6M 베클로메타손 또는 배지로 4시간 동안 처리한다. 세포를 pCMVβ-gal 1μg/mℓ 및 DMRIE/DOPE 4μg/mℓ으로 형질감염시킨다. 형질감염 후 특정 시간(hr)에 총 RNA를 수거하고, 다음에 기술된 바와 같은 RS-PCR을 이용하여 cDNA로 전환시키고 특이적 β-gal 메시지를 증폭시킨다. RS-PCR 샘플을 1% TAE 아가로즈 겔 상에 용해시킨 다음 나일론 필터로 옮긴다. 필터를³²P-표지된 β-gal 프로브와 하이브리드화한다. 필터를 베타스캐너로 분석하고 적당한 크기의 밴드를 계수한다. 폴드-변화는 배지-처리된 세포에서의 β-gal CPM에 대한 베클로메타손-처리된 세포에서의 β-gal CPM을 나타낸다.

본 발명에 있어서, 다음 약어가 사용될 수 있다: 리포폴리사카라이드: 살모넬라 티피뮤륨 리포폴리사카라이드; IL-1β: 인터루킨-1-β ; GC: 글루코코르티코이드; E2: 에스트라디올; PROG: 프로게스테론; CHOL: 콜레스테롤; BUD: 부데소나이드; BEC: 베클로메타손 디프로피오네이트; FLUN: 플루니솔라이드; DLPC: 디라우로일 포스파티딜콜린; β-gal: 에스케리키아 콜라이 베타-갈락토시다제; CAT: 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제; DMRIE/DOPE: N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데시톡시)-1-프로파나미늄 브로마이드 디올레오일 포스파티딜에탄올아민; DOSPA/DOPE: 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민카복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄 트리플루오로아세테이트: 디올레오일 포스파티딜에탄올아민; DMEM: 둘벡코 최소 필수 배지; FBS: 태 송아지 혈청; CHX: 사이클로헥시미드; RS-PCR:RNA-특이적 폴리머라제 쇄 반응; CPRG: 클로로페노르화-β-D-갈락토피라노사이드; cAMP: 사이클릭 아데노신 모노포스페이트; CREB: cAMP 반응성 인자 결합 단백질.

본 발명은, 유전자의 세포 발현을 증가시키기에 충분한 양의 약리학적 유효량의 글루코코르티코이드를 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 유전자를 상기 동물에게 운반한 후 세포 내에서의 상기 유전자의 세포 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 유전자의 세포 발현을 증가시키기에 충분한 양의 약리학적 유효량의 글루코코르티코이드를 병리생리학적 상태의 치료를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 유전자를 상기 동물의 생물학적 조직 내로 운반한 후 상기 유전자의 세포 발현을 증가시킴으로써 사람에 있어서의 병리생리학적 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 임의의 글루코코르티코이드가 본 발명의 방법에 사용될 수 있으나, 사이클로스포린 A-처리된 세포에서는 당해 효과가 관찰되지 않았기 때문에 모든 항염증제가 사용될 수 있는 것은 아니다. 유용한 글루코코르티코이드의 대표적인 예로는 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 베타메타손, 부데소나이드, 플루니솔라이드 및 덱사메타손이 있다. 이러한 글루코코르티코이드는 합성 또는 비합성 글루코코르티코이드일 수 있다. 일반적으로, 글루코코르티코이드는 종류에 따라 효능상 차이가 존재하기 때문에 어떠한 글루코코르티코이드를 사용였으며, 생리학적 또는 약리학적 용량이 운반되어야 하는지의 여부에 따라서 약 0.6mg/kg 내지 약 50mg/kg의 용량으로 투여한다. 본 발명의 방법에 있어서, 글루코코르티코이드는 지질 가용성 형태이거나, 에탄올 가용성 형태이거나 또는 수용성 형태일 수 있으며, 이들 중 어떠한 것도 리포좀 내로 봉입될 수 있다.

일반적으로, 글루코코르티코이드는 이의 능력을 최적화시켜 운반된 유전자의 활성을 증진시키는 형식으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자를 운반함과 동시에, 상기 유전자를 운반하기에 앞서 또는 상기 유전자를 운반한 후에, 글루코코르티코이드를 투여할 수 있다. 투여 경로는 당해 기술 분야에서 바람직한 어떠한 것일 수 있으며, 이의 예로는 에어로졸, 정맥내, 복강내 투여 등이 있다.

본 발명의 방법은 유전자가 운반되는 생물학적 조직에 상관없이 효능이 있다. 예를 들면, 특정 유전자의 활성은 이러한 유전자가 간, 백혈구, 폐, 위장관, 신장, 골격근, 평활근, 신경학적 조직, 피부 세포, 암 세포, 눈, 골수 및 종양과 같은 조직에 운반되는 경우에 증진될 수 있다.

상기 유전자의 운반은 어떠한 경로를 통해서도 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자를 주사, 경구 투여, 경피 또는 에어로졸 투여를 통해 운반할 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, 글루코코르티코이드를 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이 중성 또는 하전된 리포좀 내에 봉입시킬 수도 있다. 또 다른 방법으로는, 상기 유전자를 에탄올과 같은 용매에 용해시킬 수도 있다.

본 발명의 방법은 사람이나 사람이 아닌 어떠한 동물에도 효능이 있다. 즉, 본 발명의 방법이 사람에게서 1차적인 유용성을 지니긴 하지만, 당해 분야의 숙련인은 각종 수의학적 용도로 사용할 수 있다는 것을 명백히 인지할 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 유전자는 공지된 방법으로 형질감염시킬 수 있다.유전자를 생물학적 조직내로 형질감염시키는 대표적인 방법의 예로는 바이러스 형질감염, 양이온성 지질 형질감염, 및 폴리-L-리신과 같은 양이온성 아민과 수용체를 이용하는 표적화된 유전자 치료법이 있다. 사실상, 어떠한 유전자의 활성도 그것이 재조합 유전자, 본래 유전자, cDNA 또는 올리고머이든지 간에 본 발명의 방법을 사용하여 증진될 수 있다. 글루코코르티코이드는 프로모터에서 또는 해독에 앞선 몇몇 세포 조절 단계에서 벡터의 활성을 증진시킨다.

다음 실시예는 본 발명의 각종 양태를 예시하고자 제시된 것이며 이로써 본 발명이 어떠한 형태로든 제한되지는 않는다.

실시예 1

세포 및 세포 배양

A549를 ATCC로부터 획득한다. A549를 둘벡코 최소 필수 배지(DMEM, GIBCO-Life Technology) + 한정된 태 송아지 혈청(FBS, Hyclone), 200mM L-글루타민 및 젠타마이신 50μg/mℓ을 함유하는 10% 저급 리포폴리사카라이드에 유지시킨다. 대부분 형질감염시킨 후, 세포를 12웰 클러스터 디쉬(cluster dish; Corning) 내에 3 x 10⁴세포수/ml로 플레이팅한다. 이러한 농도의 세포는 세포 전이후 24시간 쯤에 대략 30% 컨플루언스(confluence)의 단층을 제공한다.

1차 랫트 폐 세포를 다음과 같이 준비한다. 다자란 스프라그-돌리 암컷 랫트로부터 폐를 수거한 다음 미세하게 분쇄한다. 이로써 분쇄된 폐를 한크 발란스된염 용액(Hank's balanced salt solution) 중의 0.5x 트립신 용액에 1시간 동안 재현탁시킨 다음, 10% 태 송아지 혈청(FBS)을 함유하는 둘벡코 최소 필수 배지(DMEM)중에 콜라게나제(C. perfringens, IV, Sigma Chemical) 100U/ml, DNase I(Sigma) 100U/ml을 함유하는 용액에 재현탁시킨다. 조직을 37℃에서 1.5시간 동안 록커(rocker)상에서 배양한다. 분리된 세포를 수개의 층이 있는 멸균 거즈 내로 여과시키고 6웰 클러스터 디쉬(Corning)내에 DMEM + 10% FBS 중에서 웰당 1.0 x 10⁶세포수로 플레이팅한다. 세포를 형질감염시키기에 앞서 가습된 37℃ 및 5% CO₂배양기에서 13 내지 24시간 동안 배양한다.

실시예 2

화학물질 및 시약

사이클로헥시미드, 리포폴리사카라이드(리포폴리사카라이드, S. Typhimurium), 부데소나이드(BUD) 및 플루니솔라이드(FLU)를 또한 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO)로부터 구입한다. 모든 글루코코르티코이드를 무수 에탄올에 용해시킨다. 베클로메타손 디프로피오네이트는 오리온 파르마슈티칼즈(Orion Pharmaceuticals, Kuopio, Finland)로부터 제공된 것이다. 베클로메타손 0.5mg과 DLPC 25mg을 37℃에서 3급 부탄올에 용해시킴으로써 중성 리포좀 내의 베클로메타손, 디라우로일 포스파티딜콜린(DLPC, Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL)을 만든다. 이어서, 샘플을 에탄올과 드라이 아이스에 섬광 동결시키고 동결건조시킨다. 리포좀을 멸균성의 내독소가 없는 물에서 재구성시킨다. 사람 재조합 IL-1β를 젠자임 코포레이션(Genzyme Corp.: Cambridge, MA)로부터 구입한다.

실시예 3

cDNA

젠자임 코포레이션으로부터 pCMVβ-gal과 pCMVHICAT를 획득하고 pSVβ는 클론텍(CA)으로부터 구입한다. 플라스미드 DNA를 추출하고 퀴아젠 칼럼 정제 시스템(Qiagen, Chatsworth, CA)을 사용하여 정제한다. E-TOX 칼럼(Sterogene, CA)을 사용하여 플라스미드 제제로부터 대부분의 리포폴리사카라이드를 제거한다. Biowthitaker/Microbiological Associates(Bethesda, MD)로부터의 LAL 키트를 사용하여 플라스미드를 대상으로 내독소에 대해 평가한다. A₂₆₀판독을 이용하여 DNA 농도를 측정하고 유사한 농도의 플라스미드 정제된 DNA와 CsCl₂-정제된 DNA를 비교한다. 260mm에서의 흡광도 OD 단위 1은 DNA 50μg/mℓ에 상당한다.

실시예 4

지질

2,3 디올레일옥시-N-[2(스퍼민카복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)(DOSPA/DOPE, 리포펙타민)은 GIBCO/BRL로부터 구입한다. N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데시톡시)-1-프로판아미늄 브로마이드(DMRIE)/DOPE 는 젠자임 코포레이션(Framingham, MA)으로부터 구입한다.

실시예 5

DNA-양이온성 리포좀 제조

DNA-지질 비율을 다음과 같이 최적화한다. 플라스미드 cDNA(2.5μg)을 수중에서 각종 농도의 양이온성 지질과 합하여 DNA:지질 비율의 패널을 만든다. DNA-지질 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양하고 상기 복합체를 1X 트리스-아세테이트(40mM)-EDTA(2mM)(TAE) 완충액 중의 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동시켜 분리한다. 모든 DNA가 지질에 의해 결합되어 본래의 겔에 보유되는 DNA:지질의 농도를 최적의 비율로 간주한다. 다음에 기술된 바와 같은 A549 세포의 형질감염에 의해 비율을 확인한다. 최적의 DNA:지질 비율은 각각의 지질 및 플라스미드 조합, 및 DNA와 지질의 각 배취간에 대해 확인한다. DOSPA/DOPE의 경우 최적의 DNA:지질 중량비는 1μg DNA: 3μg 지질이며 DMRIE/DOPE의 경우에는 1μg DNA: 4μg 지질이다.

실시예 6

형질감염

모든 형질감염을 OPTIMEM(GIBCO-Life Technologies)에서 수행한다. pCMVβ-gal 1μg을 OPTIMEM 1ml 중의 DMRIE/DOPE 4μg 또는 DOSPA/DOPE 3μg와 합하고 실온에서 15분 동안 배양한다. 세포 단층을 혈청이 없는 배지에서 2회 세척한 다음 형질감염 혼합물 1ml로 덮고 가습된 5% CO₂에서 37℃하에 2.5시간 동안 배양한다. DNA-리포좀 오버레이(overlay)를 DMEM + 10% FBS로 대체하고 세포를 48시간 동안배양한다. 세포 용해물을 수거하고 제조업자의 지시에 따라서 총 단백질에 대해 분석하고(BCA 분석, Pierci Chemical, Rockfield, IL), 기술된 (CPRG) 분석(Boerhinger-Mannheim, Germany)으로서 클로로페노르화-β-D-갈락토피라노사이드 비색측정용의 미세역가 분석을 사용하여 β-갈락토시다제 활성을 측정한다. 구체화된 경우, 세포 단층을 PBS로 세척한 다음 2% 포름알데히드-0.2% 글루타르알데히드로 고정시키고 20mM 칼륨 페리시아니드, 20mM 칼륨 페로시아니드 및 2mM 염화마그네슘 중에서 X-gal(40μg/mℓ, 5'-3' Inc. Boulder, CO)로 염색한다.

실시예 7

DNA-지질 흡수(uptake) 연구

³H-TdR(³H-TdR, 74GBq/mmol, Amersham) 1mCi을 밤새 배양된 에스케리키아 콜라이의 pCMVβ-gal-형질전환된 DH5α 균주 배양물 25ml에 가함으로써³H-티미딘-표지된 pCMVβ-gal 플라스미드를 제조한다. 제조업자의 지시에 따라서 퀴아젠(Qiagen) 팁 칼럼(100μg 크기, Chatsworth, CA)을 사용하여 표지된 플라스미드를 분리한다. 표지된 DNA의 포화가능한 결합을 다음과 같이 측정한다.³H-TdR-표지된 DNA 1μg부터 0.125μg까지의 일련의 희석액을 A549 세포에 가하고 2, 6 또는 24시간 동안 배양한다. 단층을 세척하고 1X 트립신으로 세정하고 가볍게 트립신으로 처리한 다음 원심분리시켜 펠렛화 한다. 펠렛을 용해 완충액(0.1M 트리스 및 0.5% 트리톤 X-100) 100μℓ에 용해시키고, 액체 신틸레이션 칵테일을 가하고(BCS,Amersham)³H-플라스미드 표지를 액체 신틸레이션으로 정량한다. 흡수 실험을 위해, A549 세포를 글루코코르티코이드 또는 배지로 4시간 동안 예비처리한다. 세포를 포화가능한 농도의³H-표지된 플라스미드 + 지질로 2.5시간 동안 처리한다. 상기 기술된 바와 같이 흡수를 측정한다.

실시예 8

RNA-특이적 PCR(RS-PCR)

RS-PCR을 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이 수행한다. 간략하게 언급하면, 세포를 10^-6M의 베클로메타손으로 예비처리하고 앞서 기술된 바와 같이 형질감염시킨다. 배양을 완료한 후, 0.75M 나트륨 시트레이트 및 1% 사르코실을 함유하는 산성화된 구아니디늄 이소티오시아네이트(Fluka Chemical)을 사용하여 세포를 용해시킨다. RNAeasy 시스템(Qiagen, Chatsworth, CA)을 사용하여 RNA을 수거한다. A₂₆₀으로 총 RNA 양을 결정하고 RNA 0.5μg을 겔 상에서 전개시켜 RNA 정체를 결정한다. 총 RNA 0.3μg을 사용하여, 올리고 dT를 프라이머 T30D20-gal(GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATACACCTCGCGGAAACCGACAT)로 대체하면서 MMLV 역 전사효소(GIBCO, Life Technologies)을 이용하여 cDNA를 제조한다. 상기 프라이머는 mRNA의 3' 말단에 상보적인 20개 염기쌍과 30개의 무관한 염기를 함유한다. 또한, 각 반응에 트레이서로서³²P α-dCTP 2.5μCi를 가한다. 반응물을 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 배양이 완료되면, 퀴아퀵(Qiaquick) 스핀 PCR 정제키트(Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 DNA-RNA 하이브리드를 수거하여 프라이머 및 혼입되지 않은 동위원소를 제거한다. cDNA 1μℓ를 한쌍의 니트로셀룰로즈 필터에 스폿팅하고 LSC로 계수한다.

PCR을 위해, 25,000 CPM을 각 샘플에 사용한다. 그렇지 않으면 PCR을 기술된 바와 같이 수행한다. PCR 칵테일은 500mM KCl, 50mM 트리스-HCl, pH 9.0, 50mM NaCl, 10mM MgCl₂, 200u M dNTPS 및 1단위 Taq DNA 폴리머라제(Promega, Madison WI)을 함유한다. 프라이머: 5β-gal(GAGAATCCGACGGGTTGTTACT) 및 T30-gal (GAACATCGATGAACAAGCTTAGGTATCGATA)(이는 T30D20-gal 올리고머의 말단 30개 뉴클레오티드를 나타낸다)를 1.25μM의 농도로 사용한다. 이와 같은 프라이머와 주형의 조합에 대해 PCR 사이클링을 최적화한다(33회 사이클). PCR의 완료시, 생성물을 1% TAE 아가로즈 겔 상에서 용해시킨 다음 나일론 필터에 블롯팅한다. 필터를³²P-표지된 pCMVβ-gal 프로브와 밤새 하이브리드화하고 세척하여 하이브리드화되지 않은 생성물을 제거한다. 블롯을 베타젠 베타스캐너 상에서 평가하고 정확한 크기의 밴드에 대한 CPM을 측정한다.

실시예 9

형질감염 효능에 대한 세균 리포폴리사카라이드 및 인터루킨-1-β의 효과

세균 세포 내에서의 리포폴리사카라이드는 사이토킨 생성 및 세포 보충을 포함하는 일련의 상황을 유발시킬 수 있는 강력한 면역조절인자이다. 선행 연구에서는, A549 세포가 IL-1βmRNA(리포폴리사카라이드)를 상향 조절할 뿐만 아니라 IL-8mRNA(IL-1β)를 유도함으로써 리포폴리사카라이드와 IL-1β모두에 대해서 반응하는 것으로 나타났다.

본 발명에서는, A549 세포를 IL-1β100U/ml 또는 리포폴리사카라이드 0.5μg/mℓ으로 4시간 동안 처리한 다음 pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE으로 형질감염시킨다. 도 1에 도시된 바와 같이, IL-1β와 리포폴리사카라이드 모두는 배지-처리된 A549 세포에 비해 β-gal 활성이 상당히 저하되었다.

실시예 10

pCMVβ-gal-양이온성 지질-형질감염된 A549 세포에서 β-갈락토시다제 활성을 증진시키는 국소적 글루코코르티코이드

A549 세포를 형질감염시키기에 앞서 10^-7내지 10^-6M 용량의 합성된 국소적 글루코코르티코이드인 베클로메타손 또는 배지로 4시간 동안 예비처리한다. 5 x 10^-7M 내지 10^-6M 범위의 베클로메타손을 사용하는 경우에는 2 내지 4배의 증진이 지속적으로 관찰되는 반면, 10^-7M에서는 단지 약간의 증진이 관찰되었다(도 2A). 또한, 부데소나이드, FLUN 및 중성의 리포좀 형태의 베클로메타손, 베클로메타손-DLPC와 같은 기타 국소적 스테로이드도 또한 A549 세포에서 β-gal 활성을 증진시켰다(도 2B). 10^-6M 농도의 베클로메타손-DLPC은 또한 에탄올중의 부데소나이드 또는 베클로메타손과 유사한 정도로 β-gal 활성을 증진시켰는데(도 2A), 이는 리포좀 부분이 상기와 같은 효과를 방해하지 않는다는 것을 나타내고 있다. FLUN은 일관되게 증진효과가 덜한 것으로 입증되었는데, 이는 상기 글루코코르티코이드의 효능과 일치한다.

실시예 11

IL-1β와 리포폴리사카라이드에 의한 유전자 발현의 억제를 반전시키는 글루코코르티코이드-처리

베클로메타손은 상기 2가지 면역조절인자의 바람직하지 못한 효과를 반전시키는 것으로 여겨진다. 이러한 현상을 더욱 구체적으로 입증하기 위하여, A549 세포를 pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE로 형질감염시키기 전에 10^-6M 베클로메타손으로 4시간 동안 예비처리한 다음 리포폴리사카라이드 또는 IL-1β로 4시간 동안 처리한다. 앞서 나타낸 바와 같이, IL-1β와 리포폴리사카라이드는 β-gal 발현 정도를 억제 시켰으며 베클로메타손은 β-gal 활성을 2.5배 정도 증진시켰다. 베클로메타손으로 예비처리된 다음 IL-1β또는 리포폴리사카라이드(베클로메타손, 리포폴리사카라이드; 베클로메타손, IL-1β)로 처리된 세포에서는 β-gal 발현이 처리되지 않은 세포에서 관찰된 것보다 2배 초과되었으며, "베클로메타손으로만" 예비처리된 세포의 수준에 접근하였는데, 이는 베클로메타손이 IL-1β또는 리포폴리사카라이드의 억제 효과를 차단한다는 것을 제시해준다.

유전자 치료법의 대상이 되는 수 많은 환자는 만성적인 그램 음성 세균에 감염될 수 있기 때문에, 리포폴리사카라이드와 IL-1β의 억제 효과가 유전자 또는 베클로메타손을 운반하기 전에 아마도 가장 잘 적합한 것일 것이다. β-gal 발현에대한 베클로메타손의 증진 효과가 IL-1β또는 리포폴리사카라이드 예비처리된 세포에서 β-gal 활성의 억제를 극복할 수 있는지의 여부를 측정하기 위하여, A549 세포를 pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE로 형질감염시키기 전에 IL-1β또는 리포폴리사카라이드로 4시간 동안 예비처리한 다음, 베클로메타손으로 4시간 동안 처리한다(IL-1β, BEC; 리포폴리사카라이드, BEC).

도 3은 세포를 IL-1β또는 리포폴리사카라이드로 처리해서 억제 과정이 이미 확립된 경우일지라도(리포폴리사카라이드, IL-1β단독의 경우 참조), 베클로메타손 디프로피오네이트 처리는 β-gal 활성을 회복시킬 뿐만 아니라 배지로 처리되고, 형질감염된 세포에서 관찰된 것 이상으로 β-gal 활성을 여전히 증가시킨다는 것을 보여주고 있다. IL-1β또는 리포폴리사카라이드로 예비처리시킨 다음 베클로메타손으로 처리된 세포에서의 β-gal 활성 수준은 베클로메타손으로만 예비처리된 세포에서 관찰된 β-gal 활성 증진 수준을 달성할 수는 없었는데, 이는 IL-1β또는 리포폴리사카라이드-유도된 억제 활성의 몇몇 국면이 여전히 유지되고 있다는 것을 제시해준다. 따라서, 본 발명은 감염이 진행되고 있는 동안일지라도 베클로메타손 치료는 DNA-양이온성 지질에 의한 유전자 형질감염을 개선시킨다는 것을 증명해보이고 있다.

실시예 12

글루코코르티코이드-매개된 리포터 유전자 활성 증진의 특징화

글루코코르티코이드에 의한 β-gal 활성 증진이 보다 보편화된 현상인지 아닌지의 여부를 측정하기 위하여, 1차 랫트 폐 세포를 분리하고 pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE로 형질감염시키기에 앞서 배지 또는 글루코코르티코이드로 4시간 동안 예비처리시킨다. 도 4의 랫트 세포의 몇몇 상이한 제제로부터의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 2배 증진된 β-gal 활성을 나타내는 것으로 관찰된다. 1차 랫트 폐 세포는 A549 세포보다 베클로메타손에 대해 더 민감한 것으로 여겨지는데, 이때 β-gal 활성의 최적의 증진 효과는 10^-7M에서인 것으로 밝혀졌다. A549 세포에서와 유사하게, 리포폴리사카라이드는 β-gal 활성을 억제했다. 또한, 베클로메타손으로 예비처리한 다음, 리포폴리사카라이드로 자극시키면 β-gal 활성이 배지로 처리된 세포 수준으로 회복되었으며; 대조군에 비해 약간의 증진이 이루어졌다. 따라서, 글루코코르티코이드는 또한 1차 랫트 폐 세포의 이종 집단 내에서 β-gal 활성에 대한 리포폴리사카라이드의 억제 효과를 반전시켰는데, 이는 글루코코르티코이드가 생체내에서 유사한 세포 유형의 형질감염을 증진시킬 수도 있다는 것을 제시해준다.

글루코코르티코이드 효과가 양이온성 지질인 DMRIE/DOPE에 대하여 특이적이지 않는데, 이는 β-gal 발현이 베클로메타손으로 예비처리된 다음 pCMVβ-gal 및 또 다른 양이온성 지질인 DOSPA/DOPE로 형질감염된 세포에서도 증진될 수 있기 때문이다(도 5A). 더욱이, 이러한 효과는 벡터 내의 CMV 프로모터에 대해서 특이적이지 않는데, 이는 A549 세포를 베클로메타손 디프로피오네이트로 예비처리한 다음 SV40 프로모터를 함유하는 벡터인 pSVβ-DMRIE/DOPE로 형질감염시키는 경우에 글루코코르티코이드-매개된 증진이 관찰되기 때문이다(도 5B). 최종적으로, 유전자 발현의 글루코코르티코이드-매개된 증진은 리포터 유전자 β-gal에만 제한되는 것은 아닌데, 이는 리포터 유전자가 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)인 경우에도 유사한 결과가 관찰되기 때문이다(도 5C).

다른 스테로이드도 역시 β-gal 활성을 증진시킬 수도 있다는 가능성을 배제하기 위하여, A549 세포를 양이온성 지질인 DMRIE/DOPE를 사용하여 pCMVβ-gal 또는 pSVβ로 형질감염시키기에 앞서 각종 용량의 에스트로겐(에스트라디올), 프로게스테론, 콜레스테롤 또는 베클로메타손으로 4시간 동안 처리한다. β-gal의 증진은 베클로메타손으로 처리된 세포에서만 관찰되는데, 이는 A549에서의 증진 효과가 글루코코르티코이드-특이적이라는 사실을 나타낸다(도 5B). 또 다른 지질, 프로모터 또는 리포터를 사용한 베클로메타손-매개된 증진의 용량 반응성 역시 A549 세포에서 pCMVβ-gal + DMRIE/DOPE를 사용하여 관찰된 것과 유사한데, 이때 5 x 10^-7내지 10^-6M 농도가 최대로 증진된 리포터 유전자 활성을 가져다 준다.

이와 같은 본 발명의 연구에 관한 조합된 결과는 세포 상에서의 글루코코르티코이드와 관련된 상기 효과는 보편적인 현상이며 특정 글루코코르티코이드, 리포터 유전자, 프로모터, 지질 또는 세포주에 대해 특이적이지 않다는 것을 입증해준다. 이러한 효과가 1차 폐 세포에서는 용량 의존성인데, 이는 베클로메타손에 대한 보다 큰 민감성을 나타내는 것이다. 상기 효과가 특정 글루코코르티코이드에 대해 특이적이지 않기 때문에, 에탄올에 용해된 베클로메타손을 본원에서 기술된 다른 연구에 사용한다.

실시예 13

베클로메타손 디프로피오네이트-매개된 리포터 유전자 발현 증진의 기전: 벡터 흡수(uptake)

리포터 유전자 발현 증진에 대한 하나의 가능성은 벡터 흡수의 증진이다. 이러한 가능성은 2가지 방법으로 다를 수 있다: 즉, β-gal 염색된 세포수와 활성간의 관계를 측정하는 것과 방사선 표지된 플라스미드-양이온성 지질 흡수를 측정하는 것이다.

염색된 세포의 경우, A549 세포의 한쌍의 세포 배양물을 베클로메타손 디프로피오네이트 또는 배지만으로 4시간 동안 처리한 다음, DMRIE/DOPE을 사용하여 pCMVβ-gal로 형질감염시킨다. 48시간째에, 한 셋트의 배양물을 용해시켜 β-gal 활성을 측정하는 반면, 다른 셋트의 배양물은 중성의 완충 포르말린으로 고정시키고 β-gal으로 염색시킨다(각 처리에 대해 한쌍의 웰). 염색된 세포를 1 x 1cm²면적에서 계수한다. 표 I로부터 알수 있는 바와 같이, β-gal 활성이 β-gal 분석에서는 증가된 반면, β-gal에 대해 염색된 세포수는 배지-예비처리된 세포와 베클로메타손 디프로피오네이트 예비처리된 세포 간에 유사한데, 이는 β-gal 발현 증진이 보다 많은 수의 세포가 플라스미드를 흡수하는 것에 기인된 것은 아니라는 것을 제시해준다.

[표 I]

염색 기술이 플라스미드 흡수 증가를 검정할 수 있을 정도로 충분히 민감하지 않기 때문에, 이러한 의문은 베클로메타손-처리된 세포 또는 배지-처리된 세포에서의 방사선표지된 플라스미드의 흡수를 비교함으로써 접근한다. 상기 플라스미드가 기본적으로 상기 표지화에 의해서 변형되지 않는다는 것을 보장하기 위해서, 플라스미드 제조 동안 세균성 배양물에³H-티미딘을 가함으로써 상기 플라스미드를 대사적으로 표지시킨다(상기 참조). 이와 같이 표지된 재료에 대한 흡수 역학과 포화가능한 결합을 측정한 후, A549 세포를 몇몇 농도의 베클로메타손 디프로피오네이트로 4시간 동안 처리한 다음³H-표지된 DNA-DMRIE/DOPE로 형질감염시킨다. 2시간 째에, 세포를 트립신 처리하고, 용해시키고 LSC를 이용하여 방사선표지된 플라스미드의 흡수를 측정한다. 도 6에 제시된 결과는 염색에 의해 관찰된 것을 확인시켜주는데; 베클로메타손은 흡수를 증진시키는 것으로 여겨지지 않기 때문에, 베클로메타손은 몇몇 다른 기전에 의해 β-gal 활성을 증진시키는 작용을 해야만 한다.

실시예 14

형질감염된 β-gal 발현이 GC-매개된 증진의 역학

글루코코르티코이드-유도된 β-gal 활성 증진의 진행 시간 과정을 규정하기위하여, A549 세포를 각종 기간 동안 배지나 10^-6M 농도의 베클로메타손으로 예비처리하여 이러한 효과의 역학을 측정한다. 도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, β-gal 형질감염의 증진을 관찰하기 위해서는 최소 3 내지 4시간 동안 베클로메타손에 노출시켜야만 한다. β-gal 활성 증진은 8시간 예비처리함으로써 최대화되고 관찰된 24시간 동안 최대로 유지되었다. 3 내지 4시간 예비 배양 요구 및 플라스미드 흡수 실험은 세포 표면 현상 보다는 세포내 합성 단계가 오히려 베클로메타손 증진된 β-gal 반응을 매개하는데 연관이 있을 수 있다는 것을 제시해준다.

실시예 15

글루코코르티코이드-매개된 벡터 활성 증진의 세포내 작용

벡클로메타손-매개된 β-gal 활성의 증진이 단백질 합성을 필요로하는지의 여부를 증명하기 위하여, 단백질 합성 억제인자 사이클로헥시미드(CHX)를 사용한다. A549로 명명된 세포 배양물을 배지 또는 CHX로 예비처리하여 단백질 합성을 차단한다. 30분 후, 배지-처리된 세포 배양물을 배지 또는 베클로메타손으로 처리한다. 미리 CHX-처리된 배양물을 배지+CHX 또는 베클로메타손+CHX로 4시간 동안 추가 처리한다. 모든 세포를 pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE로 형질감염시키고 β-gal 활성을 48시간 후에 측정한다.

도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, CHX는 아마도 β-gal 단백질 합성을 차단함으로써(pCMVβ-gal 존재 및 CHX 부재를 비교하여) 대조군 세포에서 β-gal 활성을 적절히 억제한다. 이와는 대조적으로, 베클로메타손-매개된 β-gal 활성 증진은베클로메타손+CHX로 처리된 세포에서 여전히 관찰되었다. 사실상, 베클로메타손 매개된 β-gal 활성 증진은 CHX의 존재하에서 상당히 더 크다. 이들 결과는 베클로메타손이 β-gal 활성을 증대시키는데 단백질 합성이 요구되지는 않는다는 것을 보여준다.

실시예 16

A549 세포에서 pCMVβ-gal mRNA 수준에 대한 BEC 효과

β-gal 유전자 발현 역학을 정립하기 위하여, A549 세포를 pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE로 형질감염시킨다. 형질감염을 완료한 후(2.5시간) 각종 시간, 2, 3, 7, 11 및 24시간에 총 RNA를 수거한다. mRNA는 2시간 정도로 검출가능하고 시험된 전체 시간 동안 높게 유지되었다(데이타가 제시되지 않음). β-gal 유전자 발현 역학을 정립하면, A549 세포를 배지 또는 10^-6M 베클로메타손으로 4시간 동안 예비처리한 다음, pCMVβ-gal으로 2.5시간 동안 형질감염시킨다. 총 RNA를 T=0, 2, 3 또는 24시간에 수거한 후, mRNA 수준을 RS-PCR로 측정한다. mRNA 수준이 베클로메타손-처리된 세포에서 뿐만 아니라 처리되지 않은 세포에서 T=2시간(각각 38배 및 18배 유도), T=3시간 및 T=24시간에 높긴 하지만, 베클로메타손 디프로피오네이트 처리된 세포에서는 정지상 mRNA 수준이 한정되게 증가되는 것으로 검정되었다(도 9). 이러한 결과는 전사가 증가되었거나 mRNA가 글루코코르티코이드에 의해 세포질에서 안정화되었다는 것을 입증해준다.

본 발명은 글루코코르티코이드가 양이온성 지질-매개된 형질감염에 의해 세포 내로 형질감염된 리포터 유전자의 발현을 증진시킨다는 것을 입증해준다. 이러한 글루코코르티코이드 효과는 특정의 양이온성 지질, 벡터 프로모터, 벡터 리포터 유전자 또는 세포 유형에 의존적이지 않다. 대신, 이러한 글루코코르티코이드 효과는 클루코코르티코이드와 관련된 일반적인 현상인데, 이는 에스트로겐, 프로게스테론 또는 콜레스테롤과 같은 기타 스테로이드는 β-gal 유전자를 유도하는 2개의 프로모터 중의 어떠한 것을 사용해서도 리포터 유전자 발현을 증진시키지 않기 때문이다. 글루코코르티코이드는 세포에 의한 플라스미드 흡수를 증가시킴으로써 작용하는 것으로 여겨지지는 않지만, 몇몇 방식으로 리포터 유전자의 발현을 증진시킨다. 유전자 발현 증진을 관찰하기 위해서는 글루코코르티코이드를 최소한 3 내지 4시간 동안 노출시켜야만 한다. 베클로메타손 증대된 리포터 유전자 활성을 위해 새로운 단백질 합성이 요구되지는 않으며 CHX는 베클로메타손 디프로피오네이트의 부재하에서는 유전자 발현을 증가시키지 않는데, 이는 CHX의 존재하에서 관찰된 과유도(superinduction)가 글루코코르티코이드-특이적일 수 있다는 것을 제시해준다.

이러한 글루코코르티코이드 효과는 사람 폐암 세포주인 A549 뿐만 아니라 1차 랫트 폐 세포 분리물에서도 관찰된다. 글루코코르티코이드-유도된 β-gal 활성 증가가 pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE로 형질감염된 COS-1 몽키 신장 세포에서는 관찰되지 않았다. 이는 COS-1 세포에는 글루코코르티코이드에 대한 수용체가 결핍되어 있거나 반응성 증진과 연관된 기타 몇몇 글루코코르티코이드-민감성 세포내 인자가 결핍되어 있기 때문일 수 있다. 상기 글루코코르티코이드 효과에 대해 반응하지 않는 세포주는 이러한 반응성의 정확한 성질을 명료하게 밝히는데 유용할 수 있다.

아마도, 베클로메타손을 10^-6M 농도로 사용하지 않고 대신 10^-7M 농도로 사용하는 경우(10^-6M 농도는 1차 랫트 폐 배양물에서 10^-7M 보다 덜 유효하다)에는 리포폴리사카라이드의 존재하에서 베클로메타손에 의해 보다 큰 β-gal 활성 증진이 관찰될 수도 있다(도 4). 이러한 변화는 중간 농도 5 × 10^-7M와 함께 검사되고 있다.

사용된 플라스미드 제제 및 대부분의 실험실에서 만든 실질적으로 기타 모든 플라스미드 제제 내에 리포폴리사카라이드가 존재하였다. 플라스미드로부터의 리포폴리사카라이드의 제거는 유전자 치료를 임상적으로 사용할 때 극복해야할 필요가 있는 장애이다.

리포폴리사카라이드가 플라스미드내에 있는지 또는 염증이 생긴 폐에 이미 존재하는 지의 여부, 리포폴리사카라이드 또는 IL-1β의 억제 효과를 반전시키는 베클로메타손의 능력, 및 가능하게는 기타 사이토킨 또는 면역 과정이 임상적 유전자 치료에 있어 상당히 중요하다.

글루코코프티코이드-매개된 리포터 유전자 발현 증진의 기전이 이제 막 밝혀지기 시작하였다. 글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 농도, 세포 유형, 및 표적 유전자 또는 세포내 부위에 의존적인 수 많은 조절 특성을 지니는 것으로 밝혀졌다. 글루코코르티코이드는 면역 반응을 조절할 수 있으며 글루코코르티코이드에 의해 하향-조절되는 것으로 공지된 유전자로는 IL-1β유전자, TNF-α, 세포내 부착 분자-1(ICAM-1) 뿐만 아니라 콜라겐 및 스트로멜리신과 같은 세포외 매트릭스를 구성하고 있는 구조 유전자가 있다. 글루코코르티코이드는 IL-1β유전자에 대해서 관찰된 바와 같이 유전자 전사를 감소시키는 것과 같은 몇몇 상이한 기전에 의해 유전자를 조절하는 것으로 밝혀졌지만 글루코코르티코이드는 또한 후-전사 단계에서 IL-1β발현에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.

글루코코르티코이드는 또한 유전자 발현을 상향 조절한다. 글루코코르티코이드와 상호작용한 후의 글루코코르티코이드 수용체는 조절 요소, 즉 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)로서 공지된 특이적 DNA 서열과 직접적으로 결합된다. 글루코코르티코이드-반응성 유전자 프로모터에 있어서, GC-글루코코르티코이드 수용체 복합체의 결합은 유전자의 전사를 상향 조절해준다. 또 다르게는, 글루코코르티코이드 수용체는 글루코코르티코이드 수용체의 부재하에서 유전자 전사를 활성화시켜 주는 c-fos 또는 c-jun과 같은 기타 전사 인자와 결합하는 것으로 밝혀졌다. 글루코코르티코이드-수용체-c-fos 또는 c-jun 결합에 의해 c-fos 또는 c-jun는 반응성 유전자를 활성화하는데 이용될 수 없다.

본 발명에서는, 서열의 유전자 은행을 조사한 결과 사용된 프로모터 중의 어떠한 것도 보다 통상의 GRE를 갖지 않는 것으로 판정되었다. 글루코코르티코이드-매개된 mRNA-특이적 엔도뉴클레아제의 억제로 인해 메신저 RNA 반감기가 증가하였지만, CHX는 베클로메타손의 부재하에서는 유전자 발현을 과유도하지 않기 때문에, 이러한 엔도뉴클레아제의 억제는 또한 글루코코르티코이드에 대해 약간의 특이성을 지니고 있어야만 한다. 또 다르게는, 전사나 해독을 증진시키는 조인자, 즉 새로운 단백질 합성이 불필요한 조인자가 글루코코르티코이드에 의해 양성적으로 조절될 수 있기 때문에, 리포터 유전자 단백질의 생산이 증진된다.

류(Liu) 등의 최근 연구에서는 덱사메타손(DEX)이 소마토스타틴(somatostatin) 프로모터의 단편과 커플링되는 경우에는 상기 덱사메타손이 리포터 유전자 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 이 기전은 프로모터 내의 전통적인 GRE와 연관이 없는 것으로 나타났지만, 대신 글루코코르티코이드 수용체는 또다른 전사 요소인 cAMP 조절 요소(CRE)와 결합하는 것으로 공지된 cAMP 조절 요소 결합 단백질(CREB)과 협력적 활성(cooperative activity)을 나타내었다. cAMP와 단백질 키나제 A 모두가 Dex-매개된 리포터 유전자 활성 증진과 연관이 있다. PEPCK 유전자에 대해서도 유사한 상황이 나타났는데; 글루코코르티코이드가 전사를 상향 조절하고 cAMP가 전사를 증대시켰다. 본 발명에 있어서, 본원에서 나타낸 글루코코르티코이드 효과는 단일 프로모터 영역에 대해서 특이적이지 않다. 즉, 글루코코르티코이드는 SV40 프로모터 또는 CMV 프로모터를 갖는 벡터로부터의 β-gal 활성을 증진시켰다. 이들 프로모터 모두가 이들의 프로모터에서 유사한 CRE 서열을 지닌 것 같지는 않으나 이러한 가능성이 공지된 바는 없다.

또 다른 연구에서는 형질감염된 유전자 발현에 대한 세포 증식의 양성적인 효과가 나타났다. 본 발명에서 관찰된 바와 유사하게, 리포터 유전자 흡수 증가가 관찰되지는 않았지만, 세포 손상에 의해 증식하도록 자극된 세포에서는 루시퍼라제 활성의 10배 증가가 관찰되었다. A549 또는 폐 세포가 전체 48시간의 배양시간 동안 1og 성장상이 되도록 상기 세포들의 세포 밀도를 설정하였기 때문에, 글루코코르티코이드가 본 발명의 연구에서 세포 증식을 유도할 수 있을 것 같지는 않다.

글루코코르티코이드는 수년간에 걸쳐 임상적으로 사용되어 왔으며 안전하고유효한 것으로 고려된다. 만성적 폐 염증 질환이 있는 환자는 에어로졸로서 운반된 글루코코르티코이드로의 국소 치료에 대한 좋은 대상자이다. 또한, 글루코코르티코이드 치료는, 특히 이러한 치료가 질환 초기에 이루어지는 경우에, 낭포성 섬유증에 걸린 환자의 전반적인 폐 기능을 개선시켜주는 것으로 밝혀졌다.

글루코코르티코이드의 안전성과 비용이 많이 드는 DNA와 양이온성 지질 제제로 이루어지는 유전자 치료 비용을 고려하고, 다량의 DNA-지질을 반복적으로 운반하는 것과 관련한 부작용을 고려하는 것은 유전자 치료 뿐만 아니라 글루코코르티코이드의 분자 생물학 측면 모두에 있어서 본 발명을 보다 흥미롭게 한다.

본 명세서에서 언급된 어떠한 특허 문헌이나 공보도 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련인 수준을 나타낸다. 이들 특허문헌과 공보들은 각각의 공보가 구체적이고도 개별적으로 참조문헌으로 삽입된다고 나타내는 경우와 동등한 수준으로 본원에 참조문헌으로 삽입된다.

당해 분야의 숙련인은 본 발명이 주제를 수행하고 언급된 목적과 잇점을 수득할 수 있도록 잘 기술되었다는 사실을 용이하게 인지할 것이다. 본원에 기술된 방법, 과정, 처리, 분자 및 특정 화합물과 함께 본 실시예는 본 발명의 대표적인 바람직한 양태이며, 이는 단지 예시적인 것이며 이로써 본 발명의 범위가 제한되어서는 않된다. 본원 청구의 범위에 의해서 한정되는 바와 같은 본 발명의 범위 및 요지 내에서 각종 변화 및 기타 용도가 이루어질 수 있다는 것을 당해 분야의 숙련인은 인지할 것이다.

Claims

글루코코르티코이드 반응 요소를 갖지 않는 프로모터의 조절하에 유전자를 포함하고 이를 동물의 폐 조직내에서 발현시킬 수 있는 에어로졸화된 양이온성 지질:벡터 복합체; 및

상기 유전자의 세포 발현을 증가시키기에 충분한 양의 약리학적 유효량의 에어로졸화된 글루코코르티코이드를_포함하는, 동물의 폐 조직내로 운반된 유전자의 세포 발현을 증가시키기 위한 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 베타메타손, 부데소나이드, 플루니솔라이드 및 덱사메타손으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 약 0.1mg/kg 내지 약 50mg/kg의 용량으로 포함되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 지질 가용성 형태, 에탄올 가용성 형태 및 수용성 형태로 이루어진 그룹중에서 선택된 형태인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 지질:벡터 복합체의 투여와 동시에,지질:벡터 복합체의 투여에 앞서, 또는 지질:벡터 복합체의 투여 이후에 투여되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 동물이 사람과 사람이 아닌 동물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 합성 및 비합성 글루코코르티코이드로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 유전자가 재조합 유전자, 본래 유전자, cDNA 및 올리고머로 이루어진 그룹중에서 선택되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 플라스미드 또는 바이러스 벡터내에 함유된 유전자의 발현 및/또는 활성을 증진시키는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 프로모터의 활성을 증진시키는 약제학적 조성물.
글루코코르티코이드 반응 요소를 갖지 않는 프로모터의 조절하에 위치하는 유전자로서, 당해 유전자의 투여가 동물의 병리생리학적 상태를 치료할 수 있는 유전자를 포함하고 이를 동물의 폐 조직내에서 발현시킬 수 있는 에어로졸화된 양이온성 지질:벡터 복합체, 및

동물의 폐 조직내에서 발현이 증가되면 당해 동물의 병리생리학적 상태의 치료를 향상시키는 당해 유전자의 세포 발현을 증가시키기에 충분한 양의 약리학적 유효량의 에어로졸화된 글루코코르티코이드를_포함하는, 동물의 폐 조직내로 운반된 유전자의 세포 발현을 증가시킴으로써 당해 동물의 병리생리학적 상태의 치료를 향상시키기 위한 약제학적 조성물.