{33072 A7 B7 五、發明说明（1) 本發明豐·S 本發明盤 本發明大體與藥物作用、細胞調節及基因療法之領域 有關。更明確說，本發明與糖皮質激素在受陽離子脂類（ 脂質）或脂質體轉染時提升報告基因活性之新發現有關。 相關技藝 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 基因療法之人體臨床試驗作爲基因缺陷或基因調節不 良引起疾病之治療於最近二年業已顯現可能性並獲得推動 〇有許多疾病於肺部出現顯著症候，其業已成爲基因療法 之目標，包括囊性纖維化及肺癌。此等試驗使用或重組還 原病毒或腺病毒載體，以及陽離子脂類，以傳輸並傳遞基 因至細胞0不論如何，細胞轉移與後續之基因表現作用低 ，故而會缺乏治療位準之基因表現作用。再者，對病毒載 體發展出之免疫反應可能限制其等之使用〇雖然陽離子脂 類較腺病毒載體於傳遞時效率較低，較新之化學設計已生 產較原設計大爲改良之陽離子脂類〇許多動物與人類試驗 已顯示，於典型轉染之陽離子脂類濃度，未發展出負面之 副作用或免疫反應0 藉由噴霧使基因療法傳遞到肺部，容許基因被直接傳 遞到目標組織。許多團體已例示使用報告基因DNA耦合至 陽離子脂質體於活有機體內進行動物肺部之噴霧傳遞與轉 染〇此等硏究提及之顯著特色爲沒有毒性且基因表現作用 期間約1個月〇基因表現作用仍相當低；甚至老鼠肺部適 度之轉染需要至少0.5到I2毫克之高純度DNA 〇如所報導 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533072 A7 B7 _________ 五、發明説明（2) ，此等方法之基因療法將不適於人類〇 另一增加轉染效率之處理方式爲對於質粒攝取與影響 標的組織內轉染基因表現作用之因子有較多之了解〇於最 近調查，發炎於肺部細胞基因轉染上之角色，經發現在以 pCMV^Q -gal-DMRIE/DOPE轉染之前，將A549人類肺部癌細 胞暴露於免疫模擬器脂多醣或組織介素IL-1>S，使召-gal 蛋白質之位準減至較該細胞只以培養基處理所見者爲少〇 舊法之不足爲缺乏傳遞治療位準之轉染基因之有效方 法。本發明滿足此一業界長期之需要與希望〇 本發明綜述 經浓部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 有關細胞攝取陽離子脂類DNA複合物之機構，或該複 合物於細胞內之結局所知甚少〇 —旦在組織內，有關會影 響攝取量，或DNA之協調傳遞與表現作用之現場因子所知 更少，尤其對慢性肺部發炎疾病或任何其他免疫程序之病 人〇本發明例示二項發現，於細胞培養物之轉染上具有實 質效果，且於活有機體內具有平行性〇首先，本發明例示 組織介素IL-10與免疫刺激物脂多醣（LPS)抑制由陽離子 脂類轉染至A54 9人類肺部癌細胞系或初生大鼠肺細胞內之 p CM V/? -gal轉染/表現作用。其次，抗炎局部糖皮質激素 如二丙酸氯地米松（beclomethasone dipropionate,BEC) ，逆轉ΙΙ-ΙΘ與脂多醣之抑制效果，且更提升報告基因之 表現作用，其高於較未處理之轉染細胞所見之表現作用， 即未以脂多醣或IL-ΙΘ等處理者〇該效果相對於其他類型 類固醇爲專用於糖皮質激素，但非專用於特殊之糖皮質激 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -5- ¢33072 A7 B7 五、發明説明（3) 素〇此一效果亦專用於抗發炎劑之糖皮質激素，而當細胞 以另一免疫抑制劑之環孢靈A作前處理時見不到此一效果 〇糖皮質激素媒介之轉移基因活性加强，其與所用之啓動 區、報告基因及陽離子脂類無關0糖皮質激素提升報告基 因表現作用之機構不包括增加質粒一脂類之攝取，反而爲 一不包括新蛋白質合成之細胞內機構0此外，初生大鼠肺 細胞於轉染之前，在無脂多醣或IL-1々下，以局部之合成 性糖皮質激素作前處理，提升々-gal蛋白質之位準高過未 處理之對照組者。本發明描述有關以糖皮質激素提升細胞 質DN A轉染機構之硏究〇故而，本發明與基因療法使用於 活有機體內有直接關聯〇 本發明之一具體形式提供一種於一基因以一適當載體 傳遞至一動物後，增加於一生物組織內所述基因細胞表現 之方法，包含步驟爲：對所述動物施與一有藥效劑量之糖 皮質激素，其量足以增加所述基因之細胞表現作用。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於本發明另一具體型式，其提供一種治療人體病狀之 方法，其於一基因傳遞到一需要此等治療之人體生物組織 後，增加於適當載體內所述基因細胞表現作用，包含步驟 爲：對所述人體施與一有藥效劑量之糖皮質激素，其量足 以增加所述基因之細胞表現作用〇 本發明其他及進一步之情形、特色、及優點，從以下 爲揭示目的本發明目前較佳具體型式之詳述，將會變得很 明顯〇 簡要圖說 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 533072 A7 ___ B7 __ 五、發明説明（4 ) 如此，以上綜述之本發明於參考附圖所例示之確定具 體型式，使本發明上述特色、優點與目的以及其他等將清 楚呈現，並於詳細及更明確之說明中可獲得及了解〇此等 圖說構成本專利說明之一部份〇然而，要注意所附圖說爲 例示本發明之較佳具體型式，因此不應視爲限制本發明之 範圍。 圖1顯不脂多醣與IL-lyS抑制於pCMVyQ-gal-陽離子 脂類轉染之A549細胞內召-半乳糖苷_ (/3 -gal)之活性〇 A549細胞爲以培養基、0·5 /X g/ml之脂多醣、或100 U/ml 之重組人類I L- 1 - /3處理4小時。於處理後，各細胞以1 “ g/ml pCMV；S -gal- 4W g DMRIE/D0PE 作轉染。-gal 活 性之測定爲使用專門量測>5 -半乳糖苷酶活性之（CPRG )比 色計微滴定分析〇結果爲代表3次實驗之平均與標準偏差 。倍率變化=脂多醣或IL-1樣品內之々-gal活性/培養基 處理樣品內之召_gal活性〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖2顯示糖皮質激素提升轉染之A549細胞內之召-gal 活性ο A549細胞以糖皮質激素處理4小時〇圖2A顯示轉染 之細胞到對氯地米松（Beclomethasone)之劑量反應，劑量 範圍爲從1〇_7到1〇_6Μ 〇圖2B顯示許多其他局部之糖皮質 激素亦引發提升/9 -gal之活性，爲於10 - 6 M : Bud e son ide ，BUD; Flunisolide，FLUN;二丙酸氯地米松一二月桂醒 基磷脂醯膽鹼，氯地米松-DLPC 〇於處理後，各細胞以1 /X g/ml pCMV/3 -gal-4/χ g DMRIE/D0PE 作轉染 〇 /3 -gal 活 性使用微滴定分析作測定。結果爲代表3次實驗之平均與 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -7- 533072 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5) S D 〇倍率變化=糖皮質激素處理細胞內之/3 — g a 1活性/培 養基處理細胞內之/Θ -gal活性〇 圖3顯示氯地米松逆轉脂多醣與11^1/3對轉染之A549 細胞々-gal活性之抑制效果〇 A5 4 9細胞經處理4小時，其 只以培養基、氯地米松（10-6 M)、IL-1/8 (100 U/ml)或脂 多醣（〇 · 5 u g / m 1 ) 〇於最初4小時後，移除上澄液，而細 胞以培養基、I L- 1召、脂多醣或氯地米松作處理，作爲指 定額外之4小時（即如氯地米松、脂多醣；最初4小時爲 氯地米松，其次4小時爲脂多醣）〇於第二處理後，各細胞 以 lwg/ml pCMVp-gal-4/xg DMRIE/D0PE 作轉染 〇 々-gal 活性使用微滴定分析測定〇所示結果爲代表2次實驗之平 均與SDo倍率變化=氯地米松、脂多醣、或合併處理 細胞內之Θ - g a 1活性/培養基處理細胞內之Θ - g a 1活性〇 圖4顯示氯地米松提升初生大鼠肺細胞之^“以活性 〇初生大鼠肺細胞與經酵素消化之大鼠肺分離，而以i，〇 Χΐ〇δ細胞/井平皿培養於細胞井組織培養皿。細胞以濃 度範圍爲10-7至1〇-6Μ之氯地米松、脂多醣（OJ/xg/nn)或 氯地米松+脂多醣（4小時氯地米松+ 4小時脂多醣）前 處理4小時，然後u3ug DNA與12ug DMRIE/D0PE作轉染 。於48小時，以(:^“微滴定分析測定0 _gal活性〇結果爲 代表3(*2)次實驗之平均與SD〇倍率變化=氯地米松、脂 多醣、氯地米松+脂多醣之處理細胞內之Θ -ga 1活性/培 養基處理細胞內之Θ -ga 1活性〇 圖5顯示氯地米松之媒介提升作用非限制於陽離子脂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（210X 297公釐） ----------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 533072 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 類、載體啓動區或載體報告基因，且爲專用於糖皮質激素 〇A549細胞爲以氯地米松或其他類固醇（圖5B，類固醇： 雌激素，E2 ;黃體酿1，PROG ;膽固醇，CHOL)處理爲4小 時〇處理後，各細胞被轉染，於圖5A爲以1/χ g/ml pCMV^ -gal 與 3/xg/ml D0SPA/D0PE，於圖 5B 爲以 1 /xg/ml pSV/3 與 4/xg/ml DMRIE/DOPE 或 1/xg/ml pCMV/3-gal 與 4 ug/ml DMRIE .圖 5C 爲以 1 u g/ml pCMVHICAT|5| 4 /χ g/ml DMRIE/ DOPE -gal活性使用微滴定分析測定。氯黴素乙醯基轉 移酶（CAT)活性爲由TLC氯黴素乙醯基轉移驅分析所測定 ，其中氯黴素之同位素1 4 C乙醯基化形式被TLC所溶解， 而1 4 C滲入量由貝它掃描機組偵測1 4 C所測定。圖5A與圖 5C之結果代表3次實驗之平均與30〇圖58之結果爲代表3 次實驗〇倍率變化=氯地米松或經類固醇處理細胞內之冷 - gal或CAT活性/培養基處理細胞內之氯黴素乙醯基轉移 _活性。 圖6顯示氯地米松於A549細胞內不增加質粒攝取作用 ο A549細胞爲以培養基或氯地米松以指定劑量前處理4小 時，然後以3H-胸腺嘧啶核甘放射標記之pCMV/3 -gal作轉 染〇轉染後二小時，細胞經沖洗，稍微胰蛋白化並以離 心法製粒。然後粒狀物被溶解、再懸浮，及加入液體閃爍 調製液。確定樣品之3 胸腺嘧啶核苷放射標記之pCMV/3 -gal之攝取量（CPM) 〇結果代表4次實驗之平均與標準偏 差，而各實驗點爲經重複進行。倍率變化=氯地米松處理 之CPM /培養基處理之CPM 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 9- ----------^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) f訂 533072 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 圖7顯示經氯地米松提升之報告基因表現作用之動力 學0 A54 9細胞經以10- 6 Μ之氯地米松或培養基處理各種不 同時間 〇 細胞經以 liUg/ml pCMV/8_gal-4/xg DMRIE/D0PE 作轉染〇 /3 -gal活性使用一CPRG微滴定分析作測定。結果 代表2次實驗之平均與SD〇倍率變化=氯地米松處理細胞 內之/3 -gal活性/培養基處理細胞內之冷-gal活性〇 圖8顯示/9 -gal活性之氯地米松媒介提升作用無需蛋 白質合成。細胞爲以培養基或CHX (10 a g/ml)處理30分鐘 〇以培養基前處理之細胞後續以培養基或氯地米松於10- 6 Μ處理4小時〇以CHX前處理之細胞後續以CHX或ΙΟ-6 Μ 氯地米松+ CHX處理4小時〇細胞爲以1 “g/ml之pCMV/3 -gal 與 4 /X g/ml 之 DMRIE/D0PE 作轉染 〇 /9 -gal 活性使用一 CPRG微滴定分析作測定。結果代表2次實驗之平均與SD 〇 BEC之倍率變化=氯地米松處理細胞內之/3 -gal活性/培 養基處理細胞內之々-gal活性〇氯地米松+ CHX之倍率變 化=氯地米松+ CHX處理細胞內之θ-gal活性/CHX處理 細胞內之/5 - g a 1活性。 圖9顯示氯地米松提升A549細胞內穩定狀態之mRNA位 準〇A549細胞以ΙΟ-6 Μ之氯地米松或培養基處理4小時〇 細胞爲以 l/xg/ml pCMV/3-gal 加 4/ig/mI DMRIE/D0PE 作轉 染。於轉染後之設定時間（數小時），全部RNA予以收取 ，轉換成cDNA，而特定之/5 - gal訊息被RS-PCR放大，如下 所述〇 RS-PCR樣品溶解於百分之1之TAE瓊脂糖凝膠，並 轉移至尼龍濾料〇濾料經雜化成一32P-放射標記之々-gal 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -10- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 參衣 Τ. 、 1&11 ϋϋ ϋϋ ϋ··— · 、τ 533072 A7 B7 五、發明説明（8 ) 探體〇過濾器經以貝它掃描機作分析，並計算適當尺寸之 頻帶。倍率變化=氯地米松處理細胞內之/5 -gal CPM/培 養基處理細胞內之ζβ-gal CPMo 本發明詳沭 本發明中使用以下簡寫：脂多醣：鼠傷寒桿菌脂多醣 ;IL-:白細胞間素-1-0 ; GC :糖皮質激素；E2 :雌 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 二酮；PROG :黃體酿；CH0L :膽固醇；BUD : Budesonide ；BEC :二丙酸氯地米松；FLUN : f luni so 1 i de ； DLPC : 二月桂醯基磷脂醯膽鹼；/9 -gal :大腸桿菌召半乳糖苷廳 ;CAT :氯黴素乙醯基轉移_ ; DMRIE/D0PE:N-(2-羥乙基 )-N，N-二甲基-2,3-雙（四癸基氧基卜1-丙銨溴化物二油 醯基磷脂基乙醇胺；D0SPA/D0PE: 2,3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧醯胺基）乙基]-Ν,Ν-二乙基-1-丙銨三氟乙酸酯 :二油醯基磷脂基乙醇胺；DMEM: Dulbecco氏最低必需培 養基；FBS :胎牛血清；CHX :環己醯亞胺；RS-PCR: RNA 專一性聚合_鏈反應；CPRG :氯酚紅-D-半乳枇喃糖苷 ;cAMP :環腺瞟昤核苷單磷酸；CREB : cAMP反應性元素結 合用蛋白質〇 本發明目的爲一種於一基因傳遞到一動物後，於細胞 內增加所述基因細胞表現作用之方法，包含步驟爲：對所 述動物施與一有藥效劑量之糖皮質激素，其量足以增加所 述基因之細胞表現作用0 本發明又一目的爲一種治療人類病狀之方法，其於一 基因傳遞到一需要此等治療之動物生物組織後，增加所述 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -11- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 533072 Α7 Β7 五、發明説明（9) 基因之細胞表現作用，包含步驟爲：對所述動物施與一有 藥效劑量之糖皮質激素，其量足以增加所述基因之細胞表 現作用〇 一般言，任何糖皮質激素可被用於本發明之方法但顯 然並非任何之抗發炎劑，因爲於環孢靈^冶療之細胞未見 到效果〇有效用糖皮質激素之代表性範例包括氫化可體松 、强體松、去氫皮質脂醇、氟羥脫氫皮質脂醇、倍他米松 、budesonide、flunisolide與地塞米松。糖皮質激素可 爲合成或爲非合成之糖皮質激素。一般而言，糖皮質激素 施加劑量爲從約0.6 mg/kg到約50 mg/kg，視何種糖皮質 激素（當存在藥效差異時）及是否生理或藥理劑量將予傳 遞而定。於本發明之方法，糖皮質激素可爲脂溶性形式、 乙醇溶性形式或水溶性形式，其任一者可納於脂質體內〇 一般而言，糖皮質激素可以使糖皮質激素之能力最佳 化之方式被施加，以提升被傳遞基因之活性〇譬如，糖皮 質激素可於所述基因傳遞同時，所述基因傳遞之前，或所 述基因傳遞之後被施加〇投施路徑可爲任何業界所需者， 包括噴霧、靜脈內、腹膜內等〇 不論基因被傳遞之生物組織，本發明之方法皆爲有效 0譬如，若一基因被傳遞至譬如肝、白血球、肺、腸胃道 、腎、骨骼肌，平滑肌、神經組織、皮膚細胞、癌細胞、 眼睛、骨髓及腫瘤等組織，基因之活性可被提升〇 基因之傳遞可藉由任何路徑〇譬如，基因可以注射、 口服施樂、皮膚或噴霧施藥作傳遞〇於另一具體型式，糖 I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇><297公釐） -12- ----------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?! 533072 Α7 Β7 五、發明説明（i〇 ) 皮質激素可囊封於脂質體內，中性或荷電，如業界所周知 〇或者，基因可溶解於一溶劑，譬如乙醇0 不論任何動物，或爲人類或非人類，本發明之方法皆 爲有效〇即，雖然本發明方法之主要用途爲於人類，對業 界技術熟練人員而言各種獸醫用途將很顯然。 於本發明方法中，基因可以一已知方法作轉染0 —基 因轉染到一生物組織內之方法之範例代表包括病毒轉染、 陽離子脂類轉染，及靶射基因療法，後者使用一受體與一 陽離子胺類，譬如聚-L-離胺酸。實際上，不論是重組基 因、天然基因、cDNA或寡合物，任何基因之活性可使用立 即方法被提升〇糖皮質激素提升啓動區或轉譯前部份細胞 調節步驟之載體活性0 以下提供各範例目的爲例示本發明各種具體型式，而 非在任何形式方面限制本發明0 範例1 細胞與細朐培養 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A54 9爲從ATCC獲得〇 A549經保持於Dulbecco最低必需 培養基（DMEM，GIBCO-Life Technologies)加上 10% 之低 脂多醣含量之合成胎牛血清（FBS，Hycl〇ne)，200 mM L-麩胺酸與5〇ug/mI良他黴素。對大部份轉染而言，細胞爲 以3χ 104細胞/ ml平皿培養於12個多井皿（Corning) 〇此 一細胞濃度於細胞轉移2 4小時後提供約3 G %會合之單細胞 層〇 初生大鼠肺部細胞如下製備0肺爲從sPrasue-Dawley 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -13 - 533072 A7 B7 五、發明説明（11 ) 雌成鼠收取並切細碎〇切碎之肺再懸浮於一溶液中1小時 ，其爲Hank’s平衡鹽溶液中加有0.5X胰蛋白酶之溶液， 然後再懸浮於另一溶液中，其爲於Du 1 bee co最低必需培養 基（DMEM)中含有 100 U/ml 之膠原晦（C.perfringens， IV ’ Sigma Chemical)，100 U/m之DNase I(Sigma)，以及 10% 之胎牛血清（FBS)。組織於371〇震動器內培育1·5小時。 分解細胞經多層無菌紗布過濾，並平皿培養於6個多井皿 (Corning)內，其爲以 1.0Χ106細胞/ 井，於DMEM+ 10% FBS內。細胞於轉染之前於371〇之5 %二氧化碳潮濕培養 器內培養13-24小時〇 範例2 化學藥品與試劑 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
環己醯亞胺，脂多醣（脂多醣，鼠傷寒桿菌）〇 BUD 與FLUN亦購自密蘇里州聖路易市Sigma Chemical公司〇所 有糖皮質激素被溶解於絕對乙醇中〇二丙酸氯地米松爲由 芬蘭Kuopio市之Orion Pharmaceuticals公司贈與。氯地 米松，中性脂質體形式，二月桂醯基磷脂醯膽鹼（DLPC, 阿拉巴馬州伯明翰市之Avanti Polar Lipids公司）之作 成爲溶解0,5 mg之氯地米松與25mg之DLPC於37 °C之三級丁 醇0然後樣品於乙醇與乾冰中急速冷凍並脫水〇脂質體於 無菌、無內毒素之水中再組成。人體重組體IL-1；S爲購自 Genzyme公司（麻省康橋市）〇 範例3 cDNA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _14 — 533072 Α7 Β7 五、發明説明（I2) pCMV/S -gal 及 pCMVHICAT 爲從 Genzyme 公司獲得，而 pSV/3係購自Clontech (加州）〇質粒DN A係使用Q i a g e η 管柱純化系統（加州Chatsworth市Qiagen公司）萃取並純 化。大部份之脂多醣自質粒製備中移除，其使用E-T0X管 柱（加州Sterogene公司）〇質粒係使用Biowhitaker / 微生物協會（馬里蘭州Bethesda市）之LAL裝備作內毒素 評估〇 DNA濃度爲由A2 6 〇讀數決定，並比較質粒純化DNA 之類似濃度與經CsCl2純化DNA者。於260 nm之一 0D單位 吸收度等於50 /X g/ml之DNA 〇 範例4 脂類 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2,3-二油基氧基4-[2-(精胺羧醯胺基）乙基]^,心 二乙基-1-丙銨三氟乙酸酯（D0SPA)、二油醯基磷脂基乙 醇胺（DOPE) (D0SPA/D0PE，Lipofectamine)爲購自 GIBC0/ 81(1^〇^(2-羥乙基）4,1^二甲基-2,3-雙（四癸基氧基）-1-丙銨溴化物（DMRIE)/D0PE係得自Genzyme公司（麻省佛 拉明翰市）〇 範例5 DNA-陽離子脂質體製備 DNA-脂類比値爲如下予最佳化〇質粒cDNA (2·5/χ g) 與水中各種濃度之陽離子脂類結合，以產生一組DNA :脂 類比値。讓DN A -脂類混合物於室溫培育15分鐘，而各複合 物藉電泳予以解離，其係於lXTris-醋酸鹽（40 mM)-EDTA (2 mM) (TAE)緩衝液中1 %瓊脂糖凝膠內進行〇 DNA :脂 本紙張尺度ΐΐΐί!中國國家標準（CNS ) A4規格(210X 297公釐） -15- 533072 A7 B7 五、發明説明（13) 類之濃度視爲最佳比値，其所有DNA被脂類結合，因而保 持於凝膠源內〇各比値爲由A5 49細胞之轉染確認，如以下 說明〇最佳DNA :脂類比値爲對各脂類與質粒組合，以及 於各批次DNA與脂類間作確認。對DO SPA/DOPE而言，最佳 DNA :脂類重量比値爲1 /X g DNA : 3 /X g脂類，而對DMRIE/ DOPE爲 1“ g DNA : 4“ g脂類 〇 範例6 轉染 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所有轉染爲於 OPTIMEM (GIBCO-Life Technologies) 中進行。1/x g 之 pCMV/3 -gal與 4“ g之 DMRIE/DOPE 或 3/χ g 之 DOSPA/DOPE結合於1 ml之OPTIMEM內，並於室溫培育15分 鐘。單細胞層於無血清培養基內清洗兩次，然後覆以1 m 1 之轉染混合物，並於37°C潮濕之5 %二氧化碳中培育2.5 小時〇 DNA-脂質體覆層以DMEM加10% FBS取代，而細胞培 育4 8小時。細胞溶解物予收取，並依製造商之指示（BC A 分析，伊州Rockfield市Pierce Chemical公司）作總蛋 白質分析，而/8 -半乳糖活性爲使用氯酚紅-/3 -D-半 乳^派喃糖比色計微滴定分析作測定，如所述爲（CPRG )分析 (德國Boerhinger-Mannheim公司）〇凡經指定，單細胞 層即係以PBS清洗，然後以2 %之甲酲一 0 · 2 %之戊二醛 固定，而以於2〇mM之鐵氰化鉀、20mM之亞鐵氰化鉀與2 mM 氯化鎂中之X-gal (40 “ g/ml，柯州Boulder市5,- 3’公 司）染色〇 範例7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 533072 A7 B7______ 五、發明説明（I4) dna細脂類攝取硏究 3H—胸腺嘧啶核甘所標記pCMVP -gal質粒之製備爲將 lmCi之 Μ-TdR (3H-TdR， 74 GBq/mmol， Amersham 公司） 加入25ml大腸桿菌pCMVB-gal -轉換之DH5a菌種過夜培養 物。加標記質粒爲按製造商之指示使用Qiageri尖細管柱（ 1 〇 〇 iU g大小，加州Chatsworth市）分離之。加標記DNA之 可飽和結合決定如下。一系列之稀釋液，從1/X g至〇·125 U g之3 H-TdR放射標記DNA加入A549細胞，並培育2、6或 24小時〇單細胞層經清洗，以1 X胰蛋白_沖洗，稍予胰 蛋白_化並以離心法將細胞製粒。粒狀物經於10 0 w 1之 溶解緩衝液（0,1M TRIS及0·5 %Triton X-100)內溶解 ，加入液體閃爍調製液（BCS，Amer sham)， 而加標記之3H 質粒以液體閃爍測定。就攝取實驗而言，A5 4 9細胞用糖皮 質激素或培養基前處理4小時〇細胞以可飽和濃度之3 Η標 記質粒加脂類處理2 . 5小時〇攝取量測定如上〇 範例8 RNA 專一性 PCR( RS-PCR) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 所述RS-PCR之進行爲業界所周知。簡言之，細胞爲以 ΙΟ-6 Μ之氯地米松作前處理，並如上述作轉染〇於培育完 畢後，細胞使用酸化銀異硫氰酸（Fluka Chemical公司） 予以溶解，其包含0.75 Μ檸檬酸鈉與1 %之sarkosylo用
RNAeasy 系統（加州 Chatsworth 市 Qiagen 公司）收取 RNA 。總RNA量由A2 6 〇測定，而0 · 5 “ g之RNA於凝膠上作業以 確定RNA完整性〇使用〇 · 3 /X g之總⑽A時，cDNA係用MMLV 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） — 17- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 533072 Α7 Β7 五、發明説明（15) 反向轉錄（GIBCO，Life Technologies)製備之，而以引子 T30D20-gal (GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATACACCTC-GCGGAAACCGACAT)替代寡dT〇此一引子含有20個鹼基對互 補於mKNA之3’端及30個無關鹼基〇此外，各反應加入2.5 U Ci之32Pa -dCTP作爲追蹤劑。各反應爲於3 7°C培育1小 時0當培育完成時，DNA-RNA雜化物用Qiaquick旋轉PCR 純化裝備（加州Chatsworth市Qiageri公司）收取之，以去 除引子與未結合之同位素。置放1/χ 1之cDNA以複製硝化纖 維濾料，並以LSC計數〇
對PCR而言，2 5,00 0 CPM被用於各樣品〇 PCR爲如所 述另外進行〇 PCR調製液含有500mM KC1、50mM TRIS-HC1 (pH 9,0) 、50 mM NaCl、10 mM MgCI2、200“M dNTPS 及1 Taq單位之DNA聚合_ (威州Madison市Promega公 司）〇 引子： 5/5 -gal (GAGAATCCGACGGGTTGTTACT)及 T30-gal (GAACATCGATGAACAAGCTTAGGTATCGATA) f ^ {X ^ T30D2〇-gal寡聚物之末端30個核苷酸，係以1·25/χ M濃度 使用o PCR循環對此一引子與模板之組合（33個循環）予 最佳化。於PCR完成時，生成物被溶解於1 %之TAE瓊脂 糖凝膠，然後吸印於尼龍濾料上。濾料爲經與3 2 P-標記之 pCMV/3 -gal探體過夜雜化，並經清洗以移除未雜化計數〇 印跡於B e t a g e η貝它掃描機上評估，並測定正確大小區帶 之 CPM 〇 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 一 18- ϋϋ ·ϋ- ϋϋ .Hi· ϋϋ —ϋ -ϋϋ ·ϋϋ ϋϋ .HI· m Hi TJ m m· ·ϋϋ ·ϋι ϋ·^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 533072 A7 B7_ ____ 五、發明説明（I6) 範例9 細菌酯冬糖與白細胞間素-1 _ >6 對轉染效率之影響 於細菌細胞內之酯多糖爲一潛在之免疫調節劑，可觸 發包括組織介素製造與細胞補充之一連串事件〇以前之硏 究中，A549細胞顯示藉由IL-1/S mRNA (脂多醣）之向上 調節以及IL-8 mRNA (IL-10)之誘導對脂多醣與IL-1 二者反應〇 本發明中，A549細胞係以100 ϋ/ml IL-l-P或0.5“g /ml脂多醣處理4小時，然後以pCMVp-gal-DMRIE/DOPE 轉染。如圖1所見，相對於培養基處理之A54 9細胞，IL-1 -/8 與脂多醣二者皆顯著降低/Θ -ga 1之活性〇 範例1 〇 局部糖皮質激素提升A54 9細朐內所轉染pCMV >8 -gal-陽離 子脂類中之>6 -半乳糖苷酿活性 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A549細胞於轉染之前，以劑量範圍於1〇-7至10“ Μ間 之合成、局部糖皮質激素氯地米松或培養基前處理4小時 〇以5Χ10〃Μ至1〇-6 Μ範圍之氯地米松見到一致之2-4倍 提升，而於1卜7 Μ (圖2Α)僅見到稍許提升。此外，其他 局部類固醇譬如budesonide、FLUN及氯地米松之中性脂質 體形式（氯地米松- DLPC)，亦提升A549細胞內/S-gal之 活性（圖2b) 〇氯地米松- DLPC於10 - 6 Μ亦亦提升/6 -gal 活性，達類似乙醇中b ud e s ο n i d e或氯地米松之程度（圖2 A )，顯示脂質體部份不干擾此一效果o FLUN之一致證實提 升效果較小，此與糖皮質激素之藥效一致〇 $紙張尺度適用中國國家標^(<^^)八4規格（210父297公釐） ~^ -19- 533072 A7 ______B7 五、發明説明（17 ) 範例11 皮質激素處理使IL-1-θ與脂多醣基因表 —-------^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 逆轉 訂 氯地米松似已將此二免疫調節劑之不合宜效果逆轉0 爲更明確證實此一現象，A549細胞以1〇_6 Μ氯地米松前處 理4小時，繼而於pCMV/8-gal-DMRIE/DOPE轉染之前以脂 多醣或IL-1-冷處理4小時。如前所見，丨^:^及脂多醣 抑制/β -gal表現作用之程度，而氯地米松以2.5倍提升/5 -gal活性〇於細胞內，用氯地米松前處理，然後以IL_1/S 或脂多醣（氯地米松、脂多醣；氯地米松、IL-1召）處理 ，/S - g a 1表現作用超過未處理細胞內所見者2倍而接近、、 氯地米松單項〃所前處理細胞之位準，暗示氯地米松阻斷 IL-或脂多醣之抑制效果〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由於許多基因療法之標的病患可能具慢性格蘭陰性細 菌感染，脂多醣與之抑制效果於傳遞基因或氯地米 松之前將極可能出現。爲確定氯地米松對/δ -gal表現之提 升效果是否會克服脂多醣或IL-10前處理細胞對/3 -gal活 性之抑制，A54 9細胞乃用脂多醣或IL-1/?前處理4小時， 然後在用 pCMVP-gal-DMRIE/DOPE (IL-lf、BEC ;脂多 醣、BEC )轉染之前，用氯地米松處理4小時〇 圖3顯示即使在以脂多醣或I L-1々處理細胞而使抑制 程序早已建立時（參閱僅爲脂多醣、IL_ if者），二丙酸 氯地米松處理不僅回復召-g a 1活性，且仍然將々-g a 1活性 增高至超過於培養基所處理、轉染之細胞內所見者0脂多 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29_7# ) 533072 A7 B7 五、發明説明（18 ) 醣或IL-l^前處理、然後氯地米松處理之細胞內之々-gal 活性位準，未完全達到僅以氯地米松前處理之細胞內所見 提升yS -gal活性位準，暗示保有脂多醣或IL-1/3所誘導抑 制活性之某些方面。因此，本發明證實縱使於現行傳染期 間，氯地米松處理改善DNA-陽離子脂類之基因轉染〇 範例1 2 對糖皮質激素所媒介報告基因活性提升作用之定性 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲確定糖皮質激素之Θ -ga 1活性提升是否爲較概括之 現象，初生大鼠肺細胞經隔離並於以pCMV/3 -gal-DMRIE/ DOPE作轉染之前，用培養基或糖皮質激素前處理4小時〇 如於圖4所見，由許多不同大鼠細胞製備之複合結果見到 /5 -gal活性之2倍提升〇初生大鼠肺部細胞較Α549細胞顯 現對氯地米松更爲敏感，而/8 -gal活性之最佳提升於1〇-7 Μ發現〇類似於A54 9細胞所觀察者，脂多醣抑制冷-gal活 性。又，氯地米松前處理繼以脂多醣刺激，將/Θ -gal活性 回復至培養基前處理細胞所具者；提升現象稍高於對照組 。因此，糖皮質激素亦逆轉脂多醣對異種族群之初生大鼠 肺細胞/Θ -ga 1活性之抑制，暗示糖皮質激素亦可提升類似 活有機體細胞類型之轉染〇 糖皮質激素之效果非專屬於陽離子脂類之DMR I E / DOPE ，因以氯地米松前處理、然後以pCMV/3 -gal及D0SPA/D0PE (另一陽離子脂類）轉染之細胞內，Θ - g a 1表現作用亦被 提升（圖5A) 〇此外，該效果非專屬於載體內之CMV啓動 區，因當A 54 9細胞以二丙酸氯地米松前處理、並以一含有 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29^^ ) 533072 A7 ___ B7 五、發明説明（19 ) SV40啓動區之載體pSV/3-DMRIE/DOPE轉染時，觀察到糖皮 質激素媒介提升作用（圖5B) ◦最後，基因表現作用之糖 皮質激素媒介提升作用非限定於報告基因召-gal ,因當報 告基因爲氯黴素乙醯基轉移_時見到類似結果（圖5 C) 〇 爲排除其他類固醇亦可能增大/3 - g a 1活性之可能性， A549細胞在以pCMV/3 -gal或使用陽離子脂類DMRIE/D0PE之 pSVA轉染之前，以不同劑量之雌激素（雌脂二醇）、黃 體酮、膽固醇或氯地米松處理4小時〇 /3 -gal之提升只在 氯地米松處理細胞內見到，顯示於A549內，該提升效果爲 專屬於糖皮質激素（圖5B) 〇使用替代脂類、啓動區或報 告基因之氯地米松媒介提升作用之劑量反應類似於pCMV/3 -gal加上DMRIE/D0PE在A549細胞內所見者，而5 χ ίο-?到 1〇~6 Μ產生最大之提升報告基因活性〇 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之此等合併硏究結果證實此一糖皮質激素對細 胞作用之有關效果爲一般現象，而非專屬於一特殊之糖皮 質激素、報告基因、啓動區、脂類或細胞系〇該效果於初 生肺細胞爲劑量相關’證實對氯地米松之較大敏感性〇由 於該效果非專屬於特殊之糖皮質激素，故本文中所述硏究 之其餘部份爲使用溶解於乙醇中之氯地米松〇 範例1 3 報告基因表現作用之二丙酸氯地米松媒介揋升機構： 載體攝取 提升報告基因表現作用之一可能性爲增加載體攝取〇 此種可能性以二方式提出：確定相對於活性之Θ -ga 1染色 ^氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29J含嚷） 533072 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______________ ΒΊ 五、發明説明（2” 細胞數，以及放射標記一質粒一陽離子脂類攝取量◦ 對染色細胞言，A54 9細胞之複製細胞培養物僅以二丙 酸氯地米松或培養基處理4小時，然後以使用DMRIE/DOPE 之pCMV/3 -gal轉染〇於48小時，將一組培養物溶解並測定 Θ -ga 1活性，同時另一組以中性緩衝福爾馬林固定並以/3 -gal染色（各次處理均用複製井）〇染色細胞於1X1 cm2 面積內計數。如表I中所見，當/8 -gal活性於乃-gal分析 中增加時，於培養基前處理細胞與二丙酸氯地米松前處理 細胞間之/8 -gal染色細胞數目近似，暗示提升之0 -gal表 現作用非因較大數目之質粒攝取細胞所致〇 表 I 處理 倍率變化 X一GAL染色 DNA-DMRIE/D0PE 1 BEC，10-6M， 1·5 土 0·7 DNA-DMRIE/DOPE 由於染色技術可能不夠敏感以容許偵測增加之質粒攝 取量，此一問題之處理爲藉由比較氯地米松處理或培養基 處理細胞內放射標記質粒之攝取量〇爲確保質粒基本上未 受該標記工作而改變，質粒係藉於質粒製備期間添加3 H-胸腺嘧啶核苷至細菌培養物予代謝性標記（見上文）〇於 確定已標記物質攝取之可飽和結合與動力後，A5 4 9細胞以 多種濃度之二丙酸氯地米松處理4小時，然後以3 標記之 〇0__111£/00?£轉染〇於2小時，細胞予胰蛋白質_化、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） -23- (請先閱讀背面之注意事- J· 項再填· 裝-- :寫本頁) 倍率變化 /3 -GAL活性 1 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 533072 Α7 Β7 五、發明説明（21 ) 溶解，並藉LSC確定放射標記質粒之攝取量〇圖6中所示 結果確認藉由染色所見者；氯地米松顯不提升攝取量，故 而氯地米松作用必然藉其他機制作用以提升/0 -ga I活性〇 範例1 4 轉染A -gal表現作用之糖皮質激素媒介提升動力學 爲定義糖皮質激素所誘導冷-ga 1活性提升之時程，以 培養基或10-6 Μ氯地米松前處理A54 9細胞達不同之時長， 以確定此一效果之動力學。如圖7中所得見，氯地米松暴 露最少需要3-4小時，俾見到提升之/3 -gal轉染作用〇 Θ -g a 1活性提升藉前處理8小時達最大，而於監控之2 4小時 維持最大〇 3 - 4小時之前期培育要求加上質粒攝取實驗， 暗示在媒介氯地米松所提升/8 -gal反應方面可能涉及一細 胞內合成步驟，而非屬細胞表面事件〇 範例1 5 糖皮質激素所媒介載體活忤揋升之細胞內作用 爲證實氯地米松所媒介/3 -ga 1活性之提升是否需要蛋 白質合成，故採用環己醯亞胺（CHX )蛋白質合成抑制劑〇 於蛋白質合成中以培養基或CHX前處理指定之A5 4 9細胞培 養物以造成阻斷〇 30分鐘後，用培養基或氯地米松處理經 培養基處理之細胞培養物〇已經CHX處理者以med+ CHX或 氯地米松+ CHX額外處理4小時〇所有細胞均用？01\^/5-g a 1 - D M R I E / D 0 P E轉染，並於4 8小時後測定/5 - g a 1活性〇
於圖8中可見，CHX適度抑制對照組細胞內>5 -gal活 性，最有可能係因阻斷Θ - g a 1蛋白質之合成（比較P C Μ V /S 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ~24~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Τ 533072 A7 ----___ B7 五、發明説明（22 ) -g a 1加及減C HX ) 〇相較之，氯地米松媒介之Θ _ g a〗活性 提升現象仍可於經氯地米松+ CHX處理之細胞內見到〇事 實上，氯地米松媒介之冷-gal活性提升有CHX存在時甚至 更大0此等結果證實氯地米松將/Θ -ga 1活性增大並不需要 蛋白質合成〇 範例1 6 MCJ A549細朐內pCMV/j-gal mRNA位準之影響 爲建立/3 -gal基因表現作用之動力學，用PCMV/3 -gal - DMRIE/DOPE將A549細胞轉染。於轉染完畢（2.5小時） 後之各不同時間，以T = 2、3、7、11及24小時收取總RNA 〇 mRNΑ在2小時爲可偵測出，並在整個檢查時段內保持高 値（資料未顯示）〇召-gal基因表現作用之動力學一旦建 立，A54 9細胞用培養基或10-6 Μ氯地米松前處理4小時， 然後用pCMV/Θ -gal轉染2 . 5小時〇總RNA於時間Τ = 0、2、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 3或24小時收取，其後藉RS-PCR測定mRNA位準。當mRNA位 準於未處理及用氯地米松處理之細胞內在T = 2小時（分別 爲38及18倍誘導作用）、Τ = 3與Τ = 24小時呈高値時，在二 丙酸氯地米松處理細胞內偵測到定量增高之穩定狀態mRN A 位準（如圖9所示）〇此等結果證實糖皮質激素於質粒中 使轉錄作用增加或使mRN Α穩定〇 本發明證實糖皮質激素因陽離子脂類媒介之轉染作用 而提升所轉染入細胞內之報告基因之表現作用〇該糖皮質 激素之效果無關特定之陽離子脂類、載體啓動區、載體報 告基因或細胞類型0反而，該糖皮質激素效果爲一與糖皮 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X227# ) 533072 Α7 Β7 五、發明説明（23 ) 質激素有關之一般現象，因爲其他類固醇譬如雌激素、黃 體酮或膽固醇以二啓動區中任一者驅動Θ -gal基因並不提 升報告基因表現作用〇糖皮質激素似不因增加細胞之質粒 攝取量而發揮作用，但以某些方式提升報告基因之表現作 用0爲見到基因表現作用提升，最少需要暴露於糖皮質激 素3-4小時〇新蛋白質合成並非以氯地米松增大報告基因 活性所必需，且CHX在無二丙酸氯地米松時不增加基因表 現作用，暗示在有CHX時所見之超誘導作用可能爲糖皮質 激素專一性。 糖皮質激素效果見於A54 9 (—種人類肺部癌細胞系及 初生大鼠肺細胞隔離種群）內。糖皮質激素導向之/Θ -gal 活性增加並不見於用pCMV；S-gal-DMRIE/DOPE轉染COS-1 猴腎細胞內〇 C0S-1細胞有可能缺乏糖皮質激素之受體， 或缺乏一些涉及提升反應之其他糖皮質激素敏感性細胞內 因子〇對糖皮質激素效果不反應之細胞系可能有用於澄清 此一反應之準確性質〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 最有可能爲當使用1〇-7 Μ氯地米松濃度取代ΙΟ-6 Μ濃 度時（後者於初生大鼠培養物內較10· 7 效果低）時， 會於有脂多醣存在下見到氯地米松使β 1活性有較大之 提升（圖4 )〇此一修改與中間濃度5X10-7 Μ—併檢查。 脂多醣存在於所用之質粒製品中，且實際存在於大部 份實驗室所製之其他每一質粒製品中0自質粒移除脂多醣 乃一項障礙，需於臨床使用基因療法時予以克服。 不論脂多醣是在質粒中或發現先存在於發炎之肺中， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 29上g ) 533072 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
五、發明説明（24 ) 氯地米松使脂多醣或IL-1々及其他可能組織介素或免疫程 序之抑制效果逆轉之能力對診所內基因療法應極爲重要〇 糖皮質激素所媒介報告基因表現作用之提升機制僅正 始予闡述〇糖皮質激素業已顯示具有許多與糖皮質激素濃 度、細胞類型、以及靶射基因或細胞內位點相關之調節特 性〇糖皮質激素可能對免疫反應賦予調節作用；已知受糖 皮質激素向下調節之基因包括IL-1/3基因、TNF-α、細胞 內黏連分子-1 (ICAM-1)以及構成細胞外基質譬如膠原與 基質溶素之構造基因〇糖皮質激素已顯示藉若干不同之機 制調節基因，譬如於IL-1/3基因所見之降低基因轉錄作用 ，但糖皮質激素亦影響後轉錄步驟中之IL-13表現作用。 糖皮質激素亦向上調節基因表現作用。糖皮質激素受 體在與糖皮質激素交作之後，直接結合於調節元素，亦即 一稱爲糖皮質激素反應元素（GRE)之特定DNA序列〇在一 糖皮質激素反應性基因啓動區內，GC-糖皮質激素受體複 合物之結合將基因之轉錄向上調節0另法，糖皮質激素受 體業已顯示結合於其他轉錄因子，譬如c-fos_c_jun，後 者於不存在糖皮質激素受體時激活基因轉錄作用0藉由糖 皮質激素一受體一 c-f os或c-jun聯合，c-f os、c-jun不 能用於激活反應性基因。 在本發明中，所用啓動區無一*具有較常見之GRE ’如 由基因序列銀行搜尋之結果所確定◦由於糖皮質激素所媒 介mRNA專一性核酸內切_之抑制作用，信使RNA半生期可 能被延長，但由於CHX於不存在氯地米松時不超誘導基因 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297JHJ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •衣· 、·!! d 533072 A7 B7____ 五、發明説明（25 ) 表現作用，故核酸內切_之抑制作用必然亦對糖皮質激素 具有一些專一性〇另法，一種提升轉錄或轉移作用之輔因 子（一種不需要新蛋白質合成之輔因子）可能被糖皮質激 素正調整，如此提升報告基因蛋白質之生成0
Liu等人最近之硏究顯示地塞米松（DEX)在被耦合到 抑生長素啓動區之一片段時將報告基因之活性增大0該機 制經顯示無涉啓動區內之典型GRE ，反之，糖皮質激素受 體顯出與一蛋白質（c AMP調節元素結合用蛋白質（CREB)) 之協同活性，該蛋白質已知與另一轉錄元素（cAMP調節元 素（CRE))結合〇 cAMP與蛋白質激酶A二者皆與DEX所媒 介報告基因活性之提升有關。一類似情況已然就PEPCK基 因加以顯示；糖皮質激素向上調節轉錄作用而cAMP增大轉 錄作用。本發明中，本文所示糖皮質激素效果非專屬於單 一啓動區區域。亦即，糖皮質激素提升來自具有SV40啓動 區或有CMV啓動區之載體之Θ -gal活性〇此二啓動區不像 會在其等之啓動區內皆具有類似之CRE序列，但此種可能 性則不明〇 經漓部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 另一項硏究顯示細胞增殖對已轉染基因表現作用之正 性效果〇類似於本文中所見者，未觀察到報告基因攝取量 之增加，但於因細胞損害所刺激以增殖之細胞中見到螢光 素廳活性增加1 0倍〇於本案之硏究中，糖皮質激素不可能 誘導細胞增殖，因爲A549或肺細胞之細胞密度爲使細胞於 整個48小時之培育期處於對數生長階段〇 糖皮質激素於診所內使用多年，並視爲安全且有效 本紙張尺度適用中關家標準（CNS ) M規格⑺ox29?公釐） ~ --- 533072 A7 B7___ 五、發明説明（26 ) 具有慢性肺部發炎疾病之病患爲以噴霧傳遞糖皮質激素作 局部治療之良好候選0此外，糖皮質激素治療於具有囊腫 性纖維症病患業經顯示改善整體肺部功能，尤以在病程之 早期給予治療爲然c 糖皮質激素之安全性及基因療法之成本（包含昂貴之 DNA及陽離子脂類製品）考量，以及大量DNA-脂類重複傳 遞之潛在副作用考量，使本發明更受注意，以基因療法以 及糖皮質激素分子生物學二者而言皆然。 任何在本說明書中所提及之專利及刊物乃指示本發明 相關業界熟練人士之技術位準。此等專利及刊物均在相同 程度上以指述方式納入本文，猶如每一發表均予特別且各 自指示爲以指述方式納入〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 業界熟練人士將迅即認知本發明極適合實施各目標並 獲得所述之結果及利益以及其所固有者。目前各實例以及 其中所述方法、程序、處理、分子、以及特定化合物均在 目前代表較佳之具體形式，係屬例示性，故而無意用作本 發明範疇之限制0其中之改變以及其他使用均將由業界熟 練人士思及，故涵蓋於如各申請專利項所定義之本發明精 神內0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297一今葶） 533072 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（27 ) 序列表 (1 ) 一般資訊： (i )申請人：（略） (ii)發明名稱：糖皮質激素對基因表現作用之提升 (i i i )序列數：3 (iv)通信地址：（略） (v )電腦可讀形式： (A) 媒體類型：DS, HD 1·44 Mb/1.44 Mo (B) 電腦：IBM相容個人電腦 (c)操作系統：PC-D0S/MS-D0S (D)軟體：WordPerfect 6,0 (v 1 )目前申請資料：（略） (v i i i )代理人資訊：（略） (i X )電信資訊：（略） (2 )序列辨識編號1之資訊： (i )序列特徵： (A) 長度： 50 (B) 類型： 核酸 (C) 股別： 單股 (D) 外形： 直線形 (i i )分子類型： (A )說明：他種核酸 (iii)假設：無 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X29_7|^ ) ----------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
Jm 533072 A7 B7 五、發明説明（28 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (iv)反義：無 (v i ) 原始 來 源 (略） (X i ) 序列 說 明 序列辨識編號1 : GAACATCGAT GACAAGCTTA GGTATCGATA CACCTCGCGG AAACCGACAT 50 3 )序歹ϋ 辨識 編 號2之資訊： (i ) 序列 特 徵 (A) 長 度 22 (B) 類 型 核酸 (c) 股 別 單股 (D) 外形 直線形 (i i ) 分子 類 型 (A) 說 明 他種核酸 (i i i ) 假設 擊 • (i v) 反義 φ • to /\w (vi ) 原始 來 源： ;(略） (xi ) 序列 說 明： :序列辨識編號2 : GAGAATCCGA CGGGTTGTTA CT 22 4 )序歹L 1辨識 編 號3之資訊： (i ) 序列 特 徵： • • (A) 長 度： :31 (B) 類 型 :核酸 (C )股別：單股 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ29ϋ笔） 533072 A7 B7 五、發明説明（29 ) (D)外形：直線形 (i i )分子類型： (A )說明：他種核酸 (iii)假設：無 (i v)反義：無 (v i )原始來源：（略） (X i )序列說明：序列辨識編號3 : GAACATCGAT GAACAAGCTT AGGTATCGAT A 31 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（⑽）Μ規格（训)