KR100447945B1 - Method for coating fused silica capillary for biopolymer analysis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생고분자(biopolymer) 분석용 용융 실리카의 제조방법에 관한 것으로서, 용융 실리카를 증류수 및 알칼리금속염 수용액으로 세척하여 실리카 모세관 내벽이 실라놀(Si-OH) 그룹을 가지도록 전 처리한 후에, 전 처리한 용융 실리카를 알킬아미노실란 용액과 접촉시켜 실리카 모세관 내벽의 실라놀(Si-OH) 그룹을 효과적으로 실란화(silanization)하여 코팅하는 과정이 포함된 생고분자(biopolymer) 분석용 용융 실리카의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing fused silica for biopolymer analysis, and after pretreating the fused silica with distilled water and an aqueous alkali metal salt solution to pre-treat the inner wall of the silica capillary to have silanol (Si-OH) groups, Preparation of fused silica for analysis of biopolymers comprising contacting the pretreated fused silica with an alkylaminosilane solution to effectively silanize and coat the silanol (Si-OH) groups on the inner wall of the silica capillary. It is about a method.
본 발명에 따른 제조방법에서는 실리카 모세관 내벽을 코팅하는 물질로서 알킬아미노기를 매개그룹으로 하는 알킬아미노실란을 선택 사용하므로써 실리카 모세관 내벽의 실라놀과의 결합반응 효율을 극대화할 수 있어 추가적으로 수행하게 되는 친수성 고분자 코팅과정 등을 생략할 수 있어 종래 일반적인 실리카 모세관 코팅방법에 비교하여 그 공정이 간편하고 생고분자(biopolymer) 분석에 대한 재현성이 우수한 장점을 가지고 있다.In the preparation method according to the present invention, by using an alkylaminosilane having an alkylamino group as a medium to coat the inner wall of the silica capillary tube, the hydrophilicity of the silica capillary tube can be maximized by maximizing the efficiency of the coupling reaction with the silanol. Since the polymer coating process can be omitted, the process is simple and has excellent reproducibility for biopolymer analysis compared to the conventional general silica capillary coating method.
Description
본 발명은 생고분자(biopolymer) 분석용 용융 실리카의 제조방법에 관한 것으로서, 용융 실리카를 증류수 및 알칼리금속염 수용액으로 세척하여 실리카 모세관 내벽이 실라놀(Si-OH) 그룹을 가지도록 전 처리한 후에, 전 처리한 용융 실리카를 알킬아미노실란 용액과 접촉시켜 실리카 모세관 내벽의 실라놀(Si-OH) 그룹을 효과적으로 실란화(silanization)하여 코팅하는 과정이 포함된 생고분자(biopolymer) 분석용 용융 실리카의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제조방법에서는 실리카 모세관 내벽을 코팅하는 물질로서 알킬아미노기를 매개그룹으로 하는 알킬아미노실란을 선택 사용하므로써 실리카 모세관 내벽의 실라놀과의 결합반응 효율을 극대화할 수 있어 추가적으로 수행하게 되는 친수성 고분자 코팅과정 등을 생략할 수 있어 종래 일반적인 실리카 모세관 코팅방법에 비교하여 그 공정이 간편하고 생고분자(biopolymer) 분석에 대한 재현성이 우수한 장점을 가지고 있다.The present invention relates to a method for preparing fused silica for biopolymer analysis, and after pretreating the fused silica with distilled water and an aqueous alkali metal salt solution to pre-treat the inner wall of the silica capillary to have silanol (Si-OH) groups, Preparation of fused silica for analysis of biopolymers comprising contacting the pretreated fused silica with an alkylaminosilane solution to effectively silanize and coat the silanol (Si-OH) groups on the inner wall of the silica capillary. It is about a method. In the preparation method according to the present invention, by using an alkylaminosilane having an alkylamino group as a medium to coat the inner wall of the silica capillary tube, the hydrophilicity of the silica capillary tube can be maximized by maximizing the efficiency of the coupling reaction with the silanol. Since the polymer coating process can be omitted, the process is simple and has excellent reproducibility for biopolymer analysis compared to the conventional general silica capillary coating method.
현재까지 알려진 실리카 모세관 코팅 기술로서, 미국특허 제5,221,447호에는 용융 실리카 표면의 실라놀(HO-Si) 그룹이 Si-O-Si 결합을 형성하도록 하면서 비닐기 또는 아크릴기가 이탈기로 결합되어 있어 다음에 수행하게 되는 친수성 고분자와의 결합반응이 가능하도록 하는 적절한 결합제(Linking agent)를 선택 사용하여 실리카 표면을 활성화시킨 후에, 활성화된 실리카 표면에 친수성 고분자를 결합시켜 용융 실리카 모세관을 코팅하는 방법이 공지되어 있다. 상기 특허에서는 비닐기 또는 아크릴기가 매개 그룹으로 결합된 실란화합물을 결합제로 사용하여 모세관 내벽을 일차 코팅한 후에 친수성 고분자로 재차 코팅하고 있는 바, 실란화합물로 1차 코팅된 실리카 모세관은 pH 안정성이 열악하여 pH 8 조건으로 생고분자를 분석하게 되면 그 코팅이 불안정하여 전기적 삼투압 흐름(electroosmotic flow)이 발생하는 문제가 있는 것으로 지적되어 왔다.As known silica capillary coating technology, U.S. Pat.No. 5,221,447 discloses that a silanol (HO-Si) group on the surface of a fused silica combines a vinyl group or an acryl group with a leaving group while forming a Si-O-Si bond. It is known to coat a fused silica capillary by binding a hydrophilic polymer to the activated silica surface after activating the silica surface by selecting an appropriate linking agent to enable the coupling reaction with the hydrophilic polymer to be performed. have. In the above patent, a silane compound having a vinyl group or an acryl group bonded as a medium group is used as a binder to coat the inner wall of the capillary tube and then coated again with a hydrophilic polymer. The silica capillary tube coated with the silane compound has poor pH stability. As a result, the analysis of raw polymers at pH 8 has been pointed out that the coating is unstable, causing electroosmotic flow.
그밖에 또다른 실리카 모세관 코팅기술로서, 미국특허 제5,322,608호에서는 실록산디올(siloxanediol)을 모세관 내벽에 가교결합시켜 1차 층(Sub layer)을 형성시키고, 그리고 고분자의 모노머(monomer) 혼합물을 모세관 내에서 반응시켜 2차 층(top layer)을 형성시켜 용융 실리카 모세관을 코팅시키는 기술이 공지되어 있다. 미국특허 제5,447,617호에는 반응 기능기(functional group)를 지닌 배수성 고분자를 이용하여 그 중 한쪽의 기능기를 모세관 내벽에 공유결합시키고 다른 한쪽에는 친수성 고분자와 결합시키므로써 용융 실리카 모세관을 코팅하는 기술이 공지되어 있다. 미국특허 제5,605,613호에는 반응 기능기를 지닌 친수성 탄화수소 고분자를 사용하여 세관 내벽에 결합시켜 1차 층을 만들고, 다음으로 폴리비닐알콜과 결합하여 2차 층을 만들어 용융 실리카 모세관을 코팅시키는 기술이 공지되어 있다. 미국특허 제6,074,541호에는 반응 기능기를 지닌 실란(silane) 계열의 화학물질을 이용하여 용융 실리카 모세관 내벽에 1차 코팅을 한 후 실란의 기능기에 고분자를 결합시켜 실리카 모세관을 코팅시키는 기술이 공지되어 있다.As another silica capillary coating technique, U.S. Patent No. 5,322,608 crosslinks siloxanediol to the capillary inner wall to form a sub-layer, and a monomer mixture of polymer in the capillary. Techniques for coating a fused silica capillary by reacting to form a top layer are known. U.S. Patent No. 5,447,617 discloses a technique for coating a fused silica capillary by covalently bonding one functional group to a capillary inner wall using a drainage polymer having a reactive functional group and a hydrophilic polymer on the other. It is. U.S. Patent No. 5,605,613 discloses a technique in which a hydrophilic hydrocarbon polymer having a reactive functional group is used to bond to the inner wall of a tubule to form a primary layer, and then to bind a polyvinyl alcohol to form a secondary layer to coat a fused silica capillary. have. U.S. Patent No. 6,074,541 discloses a technique for coating a silica capillary by bonding a polymer to a functional group of a silane after first coating the inner wall of the fused silica capillary using a silane-based chemical having a reactive functional group. .
이상에서 열거된 공지의 실리카 모세관 코팅 기술은 실리카 모세관 내벽을 1차 코팅하여 활성화한 후에, 특정의 고분자로 재차 코팅하는 방법을 적용하고 있으므로 그 공정이 복잡할 뿐만 아니라, 코팅의 반응을 위해서 다양한 화학 물질들이 필요하여 생산공정 시 요구되는 시간과 비용을 높이는 결과를 초래한다.Known silica capillary coating techniques listed above are applied to a method of coating and re-coating silica capillary inner walls first with a specific polymer, so that the process is not only complicated, but also various chemicals for the reaction of the coating. Materials are needed, resulting in increased time and cost required for the production process.
본 발명의 발명자들은 기존의 용융 실리카 모세관 코팅 기술의 단점인 다단계 코팅과정 및 코팅에 필요한 다양한 화학 물질들을 요구로 인한 높은 생산비용 및 장시간 걸리는 공정시간 등의 단점들을 해결하며, 기존 기술들이 문제점으로 지적되어 왔던 분석 재현성과 pH 안정성 등이 우수한 새로운 코팅 기술을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 클로로실란 계열의 화학물질과 코팅 매개그룹으로서 알킬아민을 반응시켜 생성된 알킬아미노실란을 사용하는 실란화 반응을 통한 용융 실리카 모세관 코팅을 수행하게 되면 모세관 내벽의 실라놀과의 결합반응 효율이 극대화되어 특정 고분자로 재차 코팅할 필요가 없음을 알게됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors of the present invention solve the shortcomings of the multi-step coating process, which is a disadvantage of the conventional fused silica capillary coating technology, and the high production cost and long processing time due to the various chemicals required for coating, and point out the existing technologies as problems. Research efforts have been made to develop new coating technology with excellent analysis reproducibility and pH stability. As a result, when the fused silica capillary coating was carried out by silanization reaction using chlorosilane-based chemicals and alkylamines produced by reacting alkylamines as a coating mediation group, the coupling reaction efficiency with silanol in the capillary inner wall The present invention has been completed by knowing that it is maximized and does not need to be coated with a specific polymer again.
따라서, 본 발명은 생산비용 및 공정시간의 절감 효과가 우수한 생고분자(biopolymer) 분석용 용융 실리카의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing fused silica for analysis of biopolymer having excellent effect of reducing production cost and processing time.
도 1a, 1b, 1c 및 1d는 용융 실리카 모세관의 분리능을 알아보기 위한 것으로, 서로 다른 분자량 및 농도의 하이드록시에칠셀룰로우스를 분리 매개체로 이용하여 DNA를 분석한 결과이다.Figures 1a, 1b, 1c and 1d is to determine the resolution of the fused silica capillary, the results of DNA analysis using hydroxyethyl cellulose of different molecular weight and concentration as a separation medium.
도 2a, 2b, 2c, 2d, 2e 및 2f는 용융 실리카 모세관의 재현성을 알아보기 위한 것으로, 매 30회마다 분리 분석한 결과들이다.Figures 2a, 2b, 2c, 2d, 2e and 2f is to determine the reproducibility of the fused silica capillary, the results of the separation analysis every 30 times.
도 3은 용융 실리카 모세관의 재현성을 알아보기 위한 것으로, 매 30회마다 분리 분석한 DNA 조각들의 이동 시간을 비교한 결과이다.Figure 3 is to determine the reproducibility of the fused silica capillary, which is a result of comparing the transfer time of the DNA fragments separated and analyzed every 30 times.
본 발명은 용융 실리카를 증류수 및 알칼리금속염 수용액으로 세척하여 전 처리하는 과정, 그리고 상기 전 처리된 용융 실리카에 알킬아미노실란 용액을 접촉시키는 과정이 포함되는 생고분자(biopolymer) 분석용 용융 실리카의 제조방법을 그 특징으로 한다.The present invention is a method for producing fused silica for analysis of biopolymers, which comprises a step of pretreatment by washing the fused silica with distilled water and an aqueous alkali metal salt solution, and contacting the alkylaminosilane solution with the pretreated fused silica. It is characterized by.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the present invention in more detail as follows.
본 발명은 생고분자(biopolymer) 분석에 사용되는 용융 실리카의 DNA 분석에 대한 재현성을 높힐 목적으로 클로로실란 화합물과 알킬아민을 반응시켜 얻어진 알킬아미노실란으로 실리카 표면을 처리하여 실리카 모세관 벽이 Si-O-Si의 공유 결합을 형성하도록 코팅하는 방법에 관한 것이다. 즉, 용융 실리카를 이용한 생고분자(biopolymer) 분석에 있어 재현성이 떨어지는 주요인이 전기적 삼투압 흐름(Electroosmotic flow)을 발생시키는 모세관 내벽의 특성에 있는 바, 이에 모세관 벽의 실라놀(Si-OH)에 실란 화합물을 이용하여 코팅하므로써 전기적 삼투압 흐름 발생을 최대한 억제하도록 하는 것이다. 이와 관련하여서는 종래 용융 실리카 코팅기술에서도 언급되어 있지만, 본원발명은 실란코팅을 위한 매개그룹으로서 지금까지 알려진 비닐기 또는 아크릴기와는 전혀 다른 알킬아미노기를 이용한다는 점에 차별성이 있다. 즉, 알킬아미노기를 이용하여 코팅하게 되면 알킬아미노기 그 자체가 촉매역할을 하게 되므로, 비닐기 또는 아크릴기와는 달리 실리카 모세관 내벽 코팅에 있어 단층으로 균일하게 코팅되어 전기적 삼투압 흐름을 억제하고 높은 pH에 강한 저항력을 가지는 특징이 있다.The present invention provides a method for increasing the reproducibility of DNA analysis of fused silica used for biopolymer analysis. The silica capillary wall is treated with an alkylaminosilane obtained by reacting a chlorosilane compound with an alkylamine. To a method of coating to form a covalent bond of -Si. In other words, the main cause of poor reproducibility in the analysis of biopolymers using fused silica is the characteristics of the capillary inner wall generating the electroosmotic flow, and thus the silanes in the silanol (Si-OH) in the capillary wall. Coating with the compound is to minimize the occurrence of electrical osmotic flow. In this regard, while also mentioned in the conventional fused silica coating technology, the present invention is different in that it uses an alkylamino group that is completely different from the vinyl or acrylic groups known to date as a mediating group for silane coating. In other words, when coating with alkylamino group, the alkylamino group itself acts as a catalyst. Unlike vinyl or acrylic groups, it is uniformly coated with a single layer in the silica capillary inner wall coating to suppress electric osmotic flow and resist high pH. It is characterized by resistance.
다음에서는 본 발명에 따른 용융 실리카의 코팅방법을 그 공정별로 세분화하여 설명하고자 한다.In the following, the coating method of the fused silica according to the present invention will be described by subdividing the process.
먼저, 클로로실란과 알킬아민을 반응시켜 다음 화학식 1로 표시되는 알킬아미노실란을 합성한다.First, chlorosilanes and alkylamines are reacted to synthesize alkylaminosilanes represented by the following Chemical Formula 1.
상기에서 R1, R2, R3, R4및 R5는 서로 같거나 다른 것으로서 수소원자 또는 탄소수1 내지 6의 알킬기를 나타낸다.In the above, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 are the same as or different from each other and represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
상기한 알킬아미노실란의 합성 반응온도는 0 ℃를 유지하도록 하고, 반응용매로는 에테르, 톨루엔 등 중에서 선택 사용하는 것이 바람직하다.The synthesis reaction temperature of the alkylaminosilane described above is maintained at 0 ° C, and the reaction solvent is preferably selected from ether, toluene and the like.
다음은, 용융 실리카 모세관의 전 처리 과정으로서 이온제거 증류수와 알칼리 수용액으로 차례로 세척하여줌으로써 용융 실리카 모세관 내벽의 상태를 실라놀(Si-OH)의 상태로 만들어준다. 그리고, 다시 이온제거 증류수로 세척하여 잉여 알칼리를 제거한 후에 가열 건조하여 모세관 내에 존재하는 이온제거 증류수를 건조시킨다.Next, as a pretreatment process of the fused silica capillary, the ion rinsed with distilled water and an aqueous alkali solution in order to make the state of the inner wall of the fused silica capillary tube silanol (Si-OH). Then, the resultant is washed with deionized distilled water again to remove excess alkali and dried by heating to dry deionized distilled water present in the capillary.
마지막 과정으로는 용융 실리카 모세관 내벽을 실란화하는 과정으로서, 질소분위기에서 상기 전 처리하여 건조시킨 모세관 내벽을 에테르 등의 용매로 세척한 후 상기 화학식 1로 표시되는 알킬아미노실란 함유 용액을 흘려보냄으로써 모세관 내벽을 코팅한다.The final process is to silanize the inner wall of the fused silica capillary tube, by washing the pretreated and dried capillary inner wall in a nitrogen atmosphere with a solvent such as ether, and then flowing an alkylaminosilane-containing solution represented by Formula 1 above. Coating the capillary inner wall.
상기에서 R1, R2, R3, R4및 R5는 서로 같거나 다른 것으로서 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 나타낸다.In the above, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 are the same as or different from each other and represent an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
상기 실란 코팅과정에 이용되는 용매는 에테르, 톨루엔 등이고, 반응온도는 상온을 유지하도록 하여 코팅한다.The solvent used in the silane coating process is ether, toluene and the like, and the reaction temperature is coated to maintain room temperature.
이상의 방법으로 코팅된 용융 실리카 모세관은 통상의 방법과 비교하여 단층코팅 반응율이 현저하게 상승되었고, pH 안정성이 우수한 결과를 나타내었다. 따라서, 추가적인 고분자 코팅과정을 수행하지 않아도 충분히 생고분자 분석(pH 8.2 에서 수행)에 적용될 수 있다.The fused silica capillary coated with the above method had a significantly higher monolayer coating reaction rate compared with the conventional method, and showed excellent pH stability. Therefore, it can be sufficiently applied to biopolymer analysis (performed in pH 8.2) without performing additional polymer coating process.
상기한 바와 같은 본 발명의 방법으로 코팅된 용융 실리카 모세관은 DNA, RNA 및 단백질 등의 생고분자 분석 시 사용되어 정확한 분석능과 높은 재현성을 나타낸다.The fused silica capillary coated with the method of the present invention as described above is used in the analysis of biomolecules such as DNA, RNA and protein, showing accurate analytical performance and high reproducibility.
이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.The present invention as described above will be described in more detail based on the following Examples and Experimental Examples, but the present invention is not limited thereto.
실시예 :Example
(1) 디에칠아미노트리메틸실란의 합성 과정(1) Synthesis of Diethylaminotrimethylsilane
얼음중탕(ice bath)에서 무수 에테르(ether) 100 ㎖에 클로로트리메틸실란 5 ㎖와 디에칠아민 3 ㎖를 차례로 첨가하여 2 시간동안 교반하였다. 이때 얼음중탕은 반응 초기의 급격한 반응열을 제거하기 위해 사용되는 것으로 디에칠아민 첨가 후 5분 동안 반응시킨 후 제거하였다. 반응을 끝나면 생성물은 셀라이트(celite)로 채워진 컬럼을 통해 염을 제거하므로써 디에칠아미노트리메틸실란이 용해된 에테르 용액을 얻었다.In an ice bath, 5 ml of chlorotrimethylsilane and 3 ml of dimethylamine were sequentially added to 100 ml of anhydrous ether, followed by stirring for 2 hours. At this time, the ice bath is used to remove the rapid heat of reaction at the beginning of the reaction, and then reacted for 5 minutes after the addition of dimethylamine. After the reaction, the product was removed through a column filled with celite to obtain a solution of ether in which ethylaminotrimethylsilane was dissolved.
(2) 용융실리카 모세관의 전 처리 과정(2) pretreatment of molten silica capillary
용융 실리카 모세관은 이온제거 증류수로 1 시간동안, 그리고 1N NaOH 용액으로 1 시간동안 세척하여 용융 실리카 모세관 내벽의 상태를 실라놀(Si-OH)의 상태로 만들었다. 그리고 다시 이온제거 증류수로 2 시간동안 모세관 내벽을 세척 시킨 후 100 ℃ 온도의 오븐에서 모세관 내에 존재하는 이온제거 증류수를 건조시켰다.The fused silica capillary was washed with deionized distilled water for 1 hour and with 1N NaOH solution for 1 hour to bring the inner wall of the fused silica capillary into silanol (Si-OH). Then, the inner wall of the capillary was washed with deionized distilled water for 2 hours, and the deionized distilled water present in the capillary was dried in an oven at 100 ° C.
(3) 실란화(silanization) 코팅 과정(3) silanization coating process
상기 전 처리된 용융 실리카 모세관을 질소분위기(1 atm)에서 건조한 후에, 무수화 에테르로 30 분동안 모세관 내벽을 세척하였다. 그리고, 상기에서 합성한 디에칠아미노트리메틸실란의 에테르 용액을 흘려보냄으로써 모세관 내벽을 코팅하였다.The pretreated fused silica capillary was dried in a nitrogen atmosphere (1 atm) and then the inner wall of the capillary was washed for 30 minutes with anhydrous ether. The inner wall of the capillary was coated by flowing an ether solution of diethylaminotrimethylsilane synthesized above.
실험예 1: 분리 매개체(sieving media)로서 하이드록시에칠셀룰로우스 (hydroxyethyl-cellulose)를 이용한 ΦΧ174-Hae Ⅲ digest DNA 분석Experimental Example 1 Analysis of ΦΧ174-Hae III digest DNA using hydroxyethyl cellulose as sieving media
본 발명에 따른 방법으로 코팅한 용융 실리카 모세관의 DNA 분석능을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.In order to confirm the DNA analysis ability of the fused silica capillary coated by the method according to the invention was carried out the following experiment.
본 실험에서 사용되는 ΦΧ174-Hae Ⅲ digest DNA 샘플(시그마 알드리치사 구입)은 각각 72, 118, 194, 234, 271, 281, 310, 603, 872, 1078 그리고 1353 염기쌍(base pair)의 크기를 지닌 DNA 조각들로 이루어져 있다. 상기한 DNA 샘플을 이온제거 증류수를 이용하여 100 ㎍/㎖로 희석시켰다. DNA 분석에는 완충(buffer)용액으로서 89 mmol 트리스하이드록시메칠아미노메탄, 89 mmol 보릭 액시드 그리고 5 mmol 에칠렌다이아민테트라아세틱 액시드로 구성된 pH 8.2의 용액을 사용하였다. 분리 매개체로는 하이드록시에칠셀룰로우스를 사용하였고, 하이드록시에칠셀룰로우스로는 분자량이 각각 90,000 g/mol(90K), 250,000 g/mol(250K), 720,000 g/mol(720K), 1,300,000 g/mol(1.3M)인 것을 사용하였고, 상기한 완충용액에 넣어 24 시간동안 교반시켜 준비하였다.ΦΧ174-Hae III digest DNA samples used in this experiment (Sigma Aldrich) purchased 72, 118, 194, 234, 271, 281, 310, 603, 872, 1078 and 1353 base pairs, respectively. It consists of DNA fragments. The DNA sample was diluted to 100 μg / ml using deionized distilled water. As a buffer solution, a pH 8.2 solution consisting of 89 mmol trishydroxymethylaminomethane, 89 mmol boric acid and 5 mmol ethylenediaminetetraacetic acid was used as a buffer solution. Hydroxyethylcellulose was used as the separation medium, and molecular weights of hydroxyethylcellulose were 90,000 g / mol (90K), 250,000 g / mol (250K), and 720,000 g / mol (720K), respectively. , 1,300,000 g / mol (1.3M) was used, and the mixture was prepared by stirring in the buffer solution for 24 hours.
그런 다음, 상기 실시예 방법으로 코팅한 용융 실리카 모세관은 이온제거 증류수로 5 분동안 그리고 완충(buffer)용액으로 5 분동안 세척한 후 분리 매개체로 준비한 하이드록시에칠셀룰로우스/완충용액으로 모세관을 채웠다. 그리고, 모세관에 전기역학적(Electrokinetic) 방법으로 2초 동안 3 kV의 전압을 걸어주어 DNA 샘플을 주입하였다. 주입이 끝나면 바로 2 kV의 전압을 걸어주어 분리분석을 실시하였다. 모든 전압은 입구가 음극, 출구가 양극이 되도록 걸어주었다.Then, the fused silica capillary coated with the above-described method was washed for 5 minutes with deionized distilled water and for 5 minutes with a buffer solution and then capillary with hydroxyethylcellulose / buffer prepared as a separation medium. Filled up. In addition, a DNA sample was injected to the capillary by applying a voltage of 3 kV for 2 seconds by an electrokinetic method. Immediately after the injection, a separation of 2 kV was applied. All voltages were applied so that the inlet was the cathode and the outlet was the anode.
첨부도면 도 1a, 1b, 1c 및 1d는 분리 매개체인 하이드록시에칠셀룰로우스의 분자량 및 농도별로 구분하여 DNA를 분리 분석한 결과이다. 즉, 분자량이 각각 90K, 250K, 720K, 1.3M인 하이드록시에칠셀룰로우스(HEC)를 완충용액에 첨가한 농도(%w/v)를 변화시키면서 DNA 분리능을 확인한 실험이다.Figures 1a, 1b, 1c and 1d are the results of DNA analysis by separating the molecular weight and concentration of hydroxyethyl cellulose as a separation medium. In other words, the DNA separation ability was confirmed by varying the concentration (% w / v) of hydroxyethyl cellulose (HEC) having a molecular weight of 90K, 250K, 720K, 1.3M, respectively, in the buffer solution.
도 1a, 1b, 1c 및 1d의 결과에 의하면, 본 발명의 용융 실리카 모세관을 사용하게 되면 DNA 샘플에 포함된 11종의 생고분자를 확연하게 분리하였음을 쉽게 확인할 수 있다.According to the results of FIGS. 1A, 1B, 1C, and 1D, it can be easily confirmed that 11 kinds of biopolymers contained in the DNA sample were clearly separated by using the fused silica capillary tube of the present invention.
실험예 2 : 재현성 검사Experimental Example 2 Reproducibility Test
본 발명에 따른 방법으로 코팅한 용융 실리카 모세관의 DNA 분석능에 대한 재현성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.In order to confirm the reproducibility of the DNA analysis ability of the fused silica capillary coated by the method according to the invention was carried out the following experiment.
720,000 g/mol(720K)의 분자량을 지닌 하이드록시에칠셀룰로우스의 농도가 0.25%(w/v)되도록 버퍼 용액에 첨가하였고, 상기 실험예 1에서 사용된 DNA 샘플을 반복해서 분리 분석하였다.The concentration of hydroxyethylcellulose having a molecular weight of 720,000 g / mol (720 K) was added to the buffer solution at 0.25% (w / v), and the DNA sample used in Experimental Example 1 was repeatedly separated and analyzed. .
첨부도면 도 2a, 2b, 2c, 2d, 2e 및 2f에는 매 30회마다 분리 분석한 결과들을 보여주는 것으로, 150회 분석하는 동안 상대오차가 0.7% 이내의 아주 미세한 오차로 본 코팅기술이 뛰어난 재현성을 지닌다는 결과를 나타내고 있다.Figures 2a, 2b, 2c, 2d, 2e and 2f show the results of the separation analysis every 30 times. The reproducibility of this coating technique is excellent with a very small error of less than 0.7% during 150 analysis. It has the result.
또한, 첨부도면 도 3에는 매 30회마다 분리 분석한 DNA 조각들의 이동시간을 나타낸 것으로, 150회의 분석하는 동안 DNA 조각들의 이동시간이 거의 일정함을 알 수 있는 바, 이로써 본 발명의 용융 실리카 모세관이 생고분자 분석능은 물론이고 재현성도 우수함을 확인할 수 있었다.In addition, Figure 3 shows the movement time of the DNA fragments separated and analyzed every 30 times, it can be seen that the movement time of the DNA fragments is almost constant during 150 analysis, thereby fused silica capillary tube of the present invention The biopolymer analysis ability as well as the reproducibility was confirmed.
실험예 3 : pH 안정성 검사Experimental Example 3: pH stability test
본 발명에 따라 알킬아미노기를 매개그룹으로 사용하여 코팅한 용융 실리카 모세관의 pH 안정성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.According to the present invention, the following experiment was performed to confirm the pH stability of the fused silica capillary tube coated with an alkylamino group as a mediation group.
본 발명에서는 0.25 %(w/v) 720K HEC를 pH 8.2 TBE 버퍼를 사용하여 150회실험한 결과 상대표준오차 (relative standard deviation : RSD)가 0.7% 미만인 것을 확인하였다. 상기 실험 방법으로 측정한 pH 안정성 실험결과는 도 2a∼2f 와 도 3에 각각 나타내었다.In the present invention, the 150% experiment of 0.25% (w / v) 720K HEC using a pH 8.2 TBE buffer was confirmed that the relative standard deviation (RSD) is less than 0.7%. The pH stability test results measured by the test method are shown in FIGS. 2A to 2F and 3, respectively.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 알킬아미노기가 매개그룹으로 도입되어 있는 알킬아미노실란을 코팅물로 이용하여 용융 실리카 모세관에 실란화 코팅하는 방법에 그 특징이 있고, 이러한 코팅방법에 의하면 통상적으로 수행하게 되는 실란 코팅후의 특정 고분자로의 재차 코팅공정을 수행하지 않아도 되므로 생산공정에 소요되는 시간과 비용을 경감시키는 효과가 매우 크다. 또한, 알킬아미노실란로 코팅처리된 본 발명의 용융 실리카 모세관은 생고분자의 분석능이 우수할 뿐만 아니라 재현성 검사 결과에서도 150회 분석하는 동안 각각의 DNA 조각들에 대한 이동시간의 상대편차가 0.7% 이내로 매우 높은 재현성을 나타내고 있어 분석의 정밀도 유지에도 큰 기여를 하고 있다.As described above, the method according to the present invention is characterized by a method of silanizing coating on a fused silica capillary tube using an alkylaminosilane having an alkylamino group introduced as a mediating group as a coating material. Since it is not necessary to perform the coating process again with a specific polymer after the silane coating, which is conventionally performed, it is very effective in reducing the time and cost required for the production process. In addition, the fused silica capillary tube of the present invention coated with alkylaminosilane not only has excellent analytical ability of biopolymers, but also has a relative deviation of the movement time for each DNA fragment within 0.7% during 150 analysis in reproducibility test results. It has high reproducibility and contributes to maintaining the accuracy of analysis.
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| KR20030073106A (en) | 2003-09-19 |
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