KR100406503B1 - 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물, 가용화용액상제형, 및 가용화용 분말제형, 이들 각각의 제조방법및 백신 - Google Patents

폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물, 가용화용액상제형, 및 가용화용 분말제형, 이들 각각의 제조방법및 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항원 단백질인 폐렴구균성 표면 접착단백질을 포함하는 가용화용 조성물, 가용화용 액상제형, 및 가용화용 분말제형, 이들 각각의 제조방법 및 백신에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 물에 분산되면 작은 크기의 입자가 만들어지며 다양한 경로를 통하여 항원 단백질을 효과적으로 전달할 수 있다. 또한, 점막 면역 보조제로 사용되는 콜레라 독소와 함께 투여 시 혈청 및 점막 항체의 수준을 향상시킬 수 있어, 성인뿐 아니라 유아에게까지 방어면역능을 유발하는 효과적인 백신으로 이용될 수 있다.

Description

폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물, 가용화용 액상제형, 및 가용화용 분말제형, 이들 각각의 제조방법 및 백신{Composition, liquid formulation, and powder formulation for enhancing solubility of PsaA, manufacturing method thereof and vaccine}
본 발명은 항원성 단백질의 가용화용 조성물, 가용화용 액상제형, 및 가용화용 분말제형, 이들 각각의 제조방법 및 백신에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 효과적인 백신으로 사용하기 위하여 가용화와 생체적용 특성을 우수하게 개선시킨 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물, 가용화용 액상제형, 및 가용화용 분말제형, 이들 각각의 제조방법 및 백신에 관한 것이다.
물질의 가용화(solubilization)는 여러 가지 응용 분야를 가지고 있으며, 화학 공정에서는 촉매, 반응물, 중간체 등이 난용성 물질인 경우 이들의 가용화가 반응의 수율 및 진행 방향을 결정하기도 한다. 또한, 생리 효과가 우수한 많은 약물들이 난용성 물질이기 때문에 생체 내 효능은 높은 반면 낮은 용해도로 인해 생체 이용률이 낮은 단점을 가지고 있다. 따라서, 난용성 약물을 가용화시켜 약물의 투여 경로를 간편하게 하고 약효를 상승시킬 수 있는 기술이 필수적으로 요구되고 있다.
일반적으로, 약물을 생체에 적용하기 위한 제형으로는 지질을 매개체로 한 에멀젼(emulsion)이나 리포좀(liposome), 고분자를 매개체로 한 고분자 미립구(polymeric nanoparticle), 고분자 마이셀(polymeric micelle) 등이 알려져있다(Langeret al.,Nature, 392: 5-10, 1998).
이중, 에멀젼 제형은 유화제를 이용하여 지방 유제 기제를 물에 분산시킨 제형으로서, 특히, 수중유화형(oil/water형) 에멀젼은 난용성 약물을 지방 유제 기제에 용해시켜 가용화시킬 수 있다. 또한, 리포좀 제형은 지질 이중막으로 이루어진 구형의 지질 소낭(vesicle)들로 이루어져 있으며, 난용성 약물은 지질 이중막 소낭 안에 존재하고 이들 지질 이중막 소낭이 물에 용해되어 난용성 약물의 가용화가 이루어진다.
지질을 이용한 제형에는 상기 두 가지 대표적인 제형 이외에도 1990년대 초 스웨덴 과학자들에 의해 개발된 큐보좀TM(CubosomeTM)이란 제형이 있다. 큐보좀TM제형은 모노글리세라이드(monoglyceride)에 물을 가하면 자발적으로 형성되는 안정한 입방상(cubic phase) 구조체를 유화제를 이용하여 물에 분산시킨 것이다[미국 특허 제5,531,925호].
큐보좀 제형은 종래 제형에 비해 향상된 특성을 가지면서도 제조시 미세입자로 만들기가 어려우며, 또한 만들어진 미세입자는 안정성이 낮아 보관에 문제점이 있으므로 실제 약물을 가용화하는 제형으로는 제품화되지 못하고 있는 실정이다.
한편, 생리활성 물질인 펩타이드와 단백질은 작은 분자량의 화합물로 이루어진 약물에 비해 특이적인 약리활성 기능을 가진 치료약물(therapeutics)이다. 그러나, 단백질은 위장관 내에서 단백질 분해효소(protease)에 의해 분해되어 아미노산 형태로 흡수되기 때문에 단백질의 약리적 효과를 기대할 수 없다. 또한, 약리활성을 갖는 단백질을 주사제로 이용하는 경우에도 제거율(clearance rate)이 높아서 자주 주사를 해야하는 등 약물의 투여방법에 많은 문제가 있다.
따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 단백질 및 펩타이드를 투여하기 위한 다양한 약물 전달 체계(drug delivery system)에 대한 연구가 진행되고 있다. 이중 시클로스포린(cyclosporin)은 펩타이드 약물 중 유일하게 경구용 제제의 개발에 성공한 경우이다. 시클로스포린이 시판되는 제형은 크레모포어(Cremophor) 에멀젼(emulsion)의 예비 농축제(pre-concentrate) 형태로서 물에 분산시켜 자발적으로 형성된 마이크로에멀젼(microemulsion)이다[미국 특허 제5,438,072호]. 그러나, 시클로스포린을 제외하고는 현재 경구용으로 판매되고 있는 펩타이드 또는 단백질 제재는 없는 실정이다.
이는 펩타이드 또는 단백질의 봉입이 어렵고, 봉입이 된다고 하여도 봉입과정 또는 저장 중에 변성(denaturation)이 쉽게 일어나 제재로서의 약리학적 효과가 감소되기 때문이다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 모노글리세라이드 (monoglyceride), 유화제(emulsifier) 및 유기용매로 구성된 약물의 가용화용 조성물을 개발한 바 있다[대한민국 특허출원 제2000-12465호].
상기 약물의 가용화용 조성물은 여러 가지 물질, 특히 난용성 물질 및 양쪽성 물질 모두를 효과적으로 가용화시키는 것을 특징으로 하는데, 상기 조성물은 물에 혼합한 후 흔들어 주거나 볼텍스(vortex)를 하면 평균 입자의 크기가 500nm 이하인 입자의 분산액을 쉽게 형성한다. 상기 가용화용 조성물은 약물의 분자량 및극성에 따라 정도의 차이가 있지만 대부분의 약물을 높은 효율로 봉입할 수 있다.
한편, 백신(vaccine)이란 어떤 감염증에 대하여 인공적으로 면역을 얻기 위하여 그 병원 미생물 또는 그 독소액에 적당한 조작을 가하여 만든항원성을 갖는 단백질로서, 이러한 항원성 단백질이 갖는 면역성은 새로운 백신 전략의 목표로 대두되고 있다.
최근 강력한 백신 후보로서 인식되고 있는 폐렴구균성 단백질에는 뉴몰리신(pneumolysin), 뉴라미니다제(neuraminidase), 오토리신(autolysin), 폐렴구균성 표면 접착단백질 A(Pneumococcal surface adhesin A ; 이하 "PsaA"라 함) 및 폐렴구균성 표면 단백질 A(Pneumococcal surface protein ; PspA)등이 있다(McDanielet al.,The Journal of Infectious Diseases173(2): 380-386, 1996).
이러한 단백질들은 많은 혈청형에 대하여 보다 광범위한 보호작용(protection)을 제공할 수 있으며, T 세포 의존적 면역 반응을 일으킬 수 있고 기억 반응(memory response)을 제공하기 때문에, 폐렴을 보다 효과적으로 예방할 수 있는 백신이 될 수 있다.
특히, 뉴몰리신과 폐렴구균성 표면 접착단백질 A(PsaA)는 생쥐들을 대상으로 하여 실험한 결과, 부분적인 보호작용을 일으키는 것으로 알려져 있어 폐렴에 대한 유력한 백신 후보로 제시되고 있으나(Alonso Develascoet al.,Microbiological Reviews, 59(4): 591-603, 1995) 아직까지 효과적으로 사용될 수 있는 백신 제형은 제시된 바 없다. 따라서, 항원성 단백질인 PsaA를 효과적인 백신으로 사용하기 위한 제형의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 요구를 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 항원성 단백질인 PsaA를 가용화시켜 안정하게 체내에 전달시킴으로써 효과적인 백신으로 사용될 수 있는 가용화용 조성물, 가용화용 액상제형, 및 가용화용 분말제형, 이들 각각의 제조방법 및 백신을 제공하는 데 있다.
도 1은 폐렴구균성 표면 접착단백질이 포함된 본 발명의 액상제형으로 3차 면역시킨 후, 혈청에서의 IgG 생성량을 엘리자(ELISA)로 측정하여 나타낸 그래프이다.
1 : 아무것도 처리하지 않은 대조군.
2 : PsaA가 포함되지 않은 가용화용 조성물만 투여한 군.
3 : PsaA가 포함된 액상제형을 투여한 군.
도 2a는 폐렴구균성 표면 접착단백질과 콜레라 독소가 포함된 액상제형으로 3차 면역시킨 후, 혈청에서의 IgG 생성량을, 도 2b는 혈청에서의 IgA 생성량을, 도 2c는 장에서의 IgA 생성량을, 그리고, 도 2d는 폐에서의 IgA 생성량을 본 그래프이다.
1 : 아무것도 처리하지 않은 대조군.
2 : PsaA가 포함되지 않은 가용화용 조성물만 투여한 군.
3 : PsaA가 포함된 액상제형을 투여한 군.
4 : PsaA와 CTB가 1:0.04의 비율로 포함된 액상제형을 투여한 군.
5 : PsaA와 CTB가 1:0.5의 비율로 포함된 액상제형을 투여한 군.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 표면 접착단백질의 가용화용 조성물은, 유효성분으로 PsaA 0.01 ∼ 2 중량%, 1종 이상의 모노글리세라이드(monoglyceride)계 화합물 9 ∼ 90 중량%, 1종 이상의 유화제 0.01 ∼ 90 중량%, 물 또는 수용액 0.01 ∼ 10 중량% 및 유기용매 0.001 ∼ 5 중량%로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물의 제조방법은 폐렴구균성 표면 접착단백질, 1 종 이상의 모노글리세라이드, 1 종 이상의 유화제 및 물 또는 수용액을 1 종 이상의 유기용매에 용해시켜 점성의 액체를 제조하는 단계(a); 및 상기 단계(a)의 액체로부터 유기용매를 제거하는 단계(b)로 구성되는 것을 특징으로 하는 한다.
또한, 본 발명은 상기 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물을 제조하는 단계(a); 및 상기 단계(a)에서 제조된 가용화용 조성물을 유기용매와 혼합하여 균일한 액상을 제조하는 단계(b)로 구성되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형 제조방법 및 가용화용 액상제형을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형을 물에 분산시켜 분산액을 제조하는 단계(a); 및 상기 단계(a)의 분산액을 동결건조시키는 단계(b)로 구성되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 분말제형 제조방법 및 가용화용 분말제형을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 PsaA의 가용화용 조성물은 유효성분으로 PsaA 0.01 ∼ 2 중량%, 1종 이상의 모노글리세라이드(monoglyceride)계 화합물 9 ∼ 90 중량%, 1종 이상의 유화제 0.01 ∼ 90 중량%, 물 또는 수용액 0.01 ∼ 10 중량% 및 유기용매 0.001 ∼ 5 중량%로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기에서 모노글리세라이드계 화합물은 탄소수 10 ∼ 22인, 포화 또는 불포화된 모노글리세라이드계 화합물 중에서 1종 이상 선택되며, 9 ∼ 90 중량%의 함량으로 첨가되는 것이 바람직하다. 상기 모노글리세라이드계 화합물로는 모노올레인(monoolein), 모노팔미톨레인(monopalmitolein), 모노미리스톨레인(monomyristolein), 모노일레이딘(monoelaidin) 및 모노이루이신(monoerucin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 특히, 모노올레인이 가장 바람직하다.
상기에서 유화제로는 인지질(phospholipid), 스핑고지질(sphingolipid), 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 및 담즙산(bile acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 구체적으로 0.01 ∼ 90 중량%의 함량으로 첨가되는 것이 가장 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 인지질로는 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline) 유도체, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine) 유도체, 포스파티딜세린(phosphatidyl serine) 유도체, 친수성 고분자가 결합된 지질(polymeric lipid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 스핑고지질로는 세라마이드계(ceramides), 세레브로사이드계(cerebroside), 스핑고마이엘린계(sphingomyelins)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 비이온성 계면 활성제로는 폴록사머(Poloxamer; Pluronic; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 솔비탄 에스테르(sorbitan esters; Span), 폴리옥시에틸렌 솔비탄(polyoxyethylene sorbitans; Tween), 폴리옥시에틸렌 에테르(polyoxy ehtylene ethers; Brij)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 음이온성 계면 활성제로는 포스파티딜세린 유도체, 포스파티딘산(phosphatidic acid) 유도체, 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 양이온성 계면 활성제로는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판(1,2-dioleyl-3-trimethylammonium propane), 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드(dimethyldioctadecylammonium chloride), N-[1-(1,2-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-[1-(1,2-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-디올레일-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleyl-3-ethylphosphocholine), 3β-[N-[(N',N'-디메틸아미노)에탄]카바모일]콜레스테롤(3β-[N-[(N',N'-dimethylamino)ethan)carbamoyl]chloresterol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 유화제로 사용되는 담즙산으로는 콜린산(cholic acid)과 그의 염 및 유도체, 데옥시콜린산(deoxycholic acid)과 그의 염 및 유도체, 리토콜린산(lithocholic acid)과 그의 염 및 유도체, 체노콜린산(chenocholic acid)과 그의 염 및 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 조성물에 사용되는 수용액은 염산 용액, 인산 용액, 초산 용액 등의 산성 용액; 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate) 등의 염기성 용액 또는 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)인 것이 바람직하며, 구체적으로 0.01 ∼ 10 중량%의 함량으로 첨가되는 것이 바람직하다.
상기 조성물에 사용되는 유기용매는 알코올(alcohol), 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO), 아세톤(acetone), 아세토니트릴(acetonitrile), 클로로포름(chloroform), 벤젠(benzene), 톨루엔(toluene) 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 구체적으로 0.001 ∼ 5 중량%의 함량으로 첨가되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 조성물에는 첨가제가 추가로 포함될 수 있다. 상기 첨가제는 지방산, 지방산의 에스테르류 또는 지방산의 알코올류가 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로 5 중량% 이하의 함량으로 첨가되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물에는 폐렴구균성 표면 접착단백질 100 중량부에 대하여 콜레라 독소 4 내지 50 중량부가 추가로 포함될 수 있다.
한편, 본 발명의 PsaA의 가용화용 조성물은 액상제형의 형태로 제조될 수 있다.
상기 액상제형은 PsaA, 1종 이상의 모노글리세라이드, 1종 이상의 유화제 및 물 또는 수용액을 1종 이상의 유기용매에 완전히 녹인 후, 유기용매를 제거하여 가용화용 조성물을 제조하고, 상기 가용화용 조성물을 유기용매와 혼합하여 제조되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
가용화용 액상제형 제조시 사용되는 유기용매는 알코올, 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 또는 이들의 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명에 의한 제형의 용도가 약물 전달 체계에 사용하는 것이 아닐 경우에는 유기용매인 아세톤 (acetone), 아세토니트릴(acetonitrile), 클로로포름(chloroform), 벤젠 (benzene),톨루엔(toluene) 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형에는 폐렴구균성 표면 접착단백질 100 중량부에 대하여 콜레라 독소 4 내지 50 중량부가 추가로 포함될 수 있다.
한편, 본 발명의 PsaA의 가용화용 조성물의 상기 액상제형을 물에 분산시켜 분산액을 제조한 후, 동결건조시켜 분말제형의 형태로 제조될 수 있다. 상기 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 분말제형에도 폐렴구균성 표면 접착단백질 100 중량부에 대하여 콜레라 독소 4 내지 50 중량부가 추가로 포함될 수 있다.
상기에서 동결건조시 제형 내 단백질 성분의 변성을 방지하기 위하여 30 중량% 이하의 동결건조 보호제가 추가로 첨가될 수 있으며, 동결건조 보호제로는 만니톨(mannitol), 트리할로오즈 (trehalose)와 같은 당류; 아르기닌(arginine)과 같은 아미노산류; 또는 알부민(albumin)과 같은 단백질류가 사용되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 액상 및 분말제형은 손으로 흔들어 주는 등의 최소한의 기계적 도움에 의해 쉽게 물에 분산시킬 수 있고, 분산계를 형성하는 입자의 크기는 일반적으로 200㎚ 정도이며, 유화제나 약물의 성질에 따라 500㎚ 이하로 형성되어 종래에 비해 매우 작은 크기를 형성할 수 있다. 특히, 입자의 형성시 가혹한 기계적 힘을 가할 필요가 없으므로 입자의 구성 성분이나 약물이 변성되는 것을 방지할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 분말제형이 경구용으로 사용될 경우, 경구용 약물의 일반적인 섭취방법 중의 하나인 물과 함께 섭취할 때 복용 전에 상기 분말제형을 물과 혼합하면 물에 쉽게 분산될 수 있다. 주사형으로 투여할 경우에도 주사직전 물과 섞어 분산액을 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 제형은 상온 이하에서 밀봉하여 장기간 안정하게 보관할 수 있으며, 사용하기 전에 물을 첨가하여 분산액을 제조할 수 있으므로 제형의 특성이 변하지 않고 상분리 현상 또한 일어나지 않는다는 이점이 있다. 특히, 장기 보관의 경우, 분말제형은 유기용매 및 수분과 접촉하지 않으므로 더욱 바람직하다.
이외에도, 본 발명에 따른 제형은 상기의 간단한 제조공정 만으로도 60 ∼ 100% 정도의 약물봉입율을 나타내므로 특히 약물 전달 체계에 유리하며, 본 발명에 따른 제형을 약물 전달 체계에 사용할 경우에는 경구투여, 구강내투여, 점막투여, 비강내투여, 복강내투여, 피하주사, 근육주사, 경피투여 또는 정맥주사가 가능하고, 구체적으로, 경구투여가 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 폐렴구균성 표면 접착단백질을 포함하는 가용화용 조성물은 폐렴에 대한 백신으로 사용된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
폐렴구균 표면 접착단백질(Pneumococcal surface adhesin A, PsaA)을 포함하는 액상제형의 제조
1-1) 액상제형의 제조
대한민국 공개특허공보 제 2001-3853호에 기재된 방법에 따라 준비된 폐렴구균 표면 접착단백질(Pneumococcal surface adhesin A; PsaA) 수용액을 Sep-Pak Cartridges(Waters)를 이용하여 메탄올로 농축하여 0.5㎎/㎖농도의 PsaA 용액을 제조하였다. 2㎎의 플루로닉 F-68 또는 플루로닉 F-127을 10㎎의 모노올레인 및 메탄올 1㎖과 혼합하여 균질한 액상을 제조하였다. 실내온도가 낮을 경우에는 50℃ 이하의 온도로 가온하여 완전히 용해시켰다. 여기에 상기 0.5㎎/㎖의 PsaA 용액을 각각 0㎕, 50㎕ 및 500㎕를 넣어 교반하여 액상을 제조하였고, 이를 산소를 포함하지 않은 질소기체를 이용하여 퍼징하여 메탄올을 완전히 증발시켜 PsaA가 포함된 가용화용 조성물을 제조하였다. 상기 가용화용 조성물을 프로필렌 글리콜(propylene glycol)과 혼합하여 PsaA가 포함된 액상제형을 제조하였다.
1-2) 액상제형의 특성 분석
3차 증류수 3㎖에 상기 실시예 1-1)에서 제조한 액상제형 10㎕를 가한 후 잘 흔들어 혼합하여 분산액을 제조하였고, 입자 크기 및 분산도 (polydispersity)를 측정하였다. 본 발명에서 입자의 크기 측정은 말버른 제타사이저(Malvern Zetasizer, Malvern사)를 이용한 광자 분광법(Photon Correlation spectroscopy; QELS법)으로 측정하였으며 동일한 시료를 3회 측정하여 평균값을 구하였고,분산도(polydispersity)는 입자 크기의 일반적인 분포도로 알려진 정상 로그 분포도의 로그-스케일에서의 분산 정도로 나타내었다(Orret al.,Encyclopedia of emulsion technology,1: 369-404, 1985). 그 결과, 상기 제형들은 물에 잘 분산되었고 평균 입자도와 분산도는 하기 표 1에 나타낸 바와 같았다.
<실시예 2>
PsaA를 포함하는 동결건조 분말제형의 제조 및 특성 분석
상기 실시예 1-1)과 같은 방법으로 제조된 PsaA를 포함하는 액상제형 0.1㎖을 5% 트레할로오즈 수용액 1㎖에 첨가하고 손으로 흔들어 분산시킨 후 동결건조하여 분말제형을 제조하였다. 상기 분말제형 약 3㎎을 각각 3 ㎖의 증류수 또는 0.01M NaDC 수용액에 재분산시켜 분산액을 만든 후, 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 입자크기 및 분산도를 측정하였다.
그 결과, 상기 제형은 물에 잘 분산되었으며, 평균 입자도 및 분산도 측정 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같았다. PsaA의 입자 내 봉입률은 100%이었다.
평균 입자도 및 분산도 측정
구분 제형 유화제 PsaA 량(㎕) 크기(nm) 분산도
실시예3 액상제형 플루로닉 F68 0 231.6 0.055
50 228.2 0.175
500 220.1 0.063
플루로닉 F127 0 233.2 0.201
50 214.5 0.097
500 237.8 0.244
실시예4 동결건조분말제형 플루로닉 F68 0 244.6 0.145
50 227.0 0.098
500 217.5 0.123
플루로닉 F127 0 243.0 0.152
50 228.3 0.092
500 229.7 0.138
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 액상제형의 경우, 유화제로 플루로닉 F68을 사용한 경우, PsaA의 양이 50㎕일 때, 분산도가 가장 컸으며, 유화제로 플루로닉 F127을 사용한 경우, PsaA의 양이 500㎕일 때, 분산도가 가장 높음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
PsaA 단백질을 포함하는 액상제형에 대한 전신적 및 국소적 항체반응
3-1) PsaA에 의한 면역반응 유도 후, 혈청, 장 및 폐로부터의 샘플 준비
6 내지 8주령의 Balb/c 마우스 암컷을 대한 실험동물 연구센터(DAEHAN Laboratory Animal Research Center Co.)로부터 얻었으며, 실험과정을 통해 임의로 조합된 사료와 특정항원이 존재하지 않는 표준 환경에서 사육하였다. 전신면역 유발을 위하여, PBS(200㎕)와 완전 프로인트 보조제(Freund's complete adjuvant)(boosting은 불완전 프로인트 보조제로 수행하였다)에 용해한 PsaA 액상제형을 40㎍씩 피하에 주사하였다. 아무것도 처리하지 않은 것과 PsaA를 포함하지않은 가용화용 조성물만을 처리한 것, PsaA를 포함하는 액상제형을 처리한 것을 샘플로 준비하였으며, 첫 번째 면역화한 후 2주 간격으로 제 2, 3회 면역화를 실시하였다.
3번째 면역화하고 2주 후에 안와정맥동에서 채혈을 하였고, 채혈된 혈액은 4℃에서 18시간 동안 원심분리함으로써 혈청을 분리하였다.
장 세척 샘플(gut wash samples)은 엘슨 등(Elsonet al.,Journal of Immunology133(6): 2892-2897, 1984)의 방법에 의해 수집되었다. 즉, 1㎖의 세척액[25mM NaCl, 40mM Na2SO4, 10mM KCl, 20mM NaHCO3, 50mM EDTA, 0.1mg/㎖ 소이빈 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor) 및 162mg/㎖ 폴리-에틸렌 글리콜(평균 분자량 3,350)]을 분리된 장에 주사하고, 10분 후 장관을 짜서 나온 액을 원심분리 튜브에 모았다. 이를 와동혼합(votex) 및 원심분리(1,000 ×g, 10min)하여 상등액을 100mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF, Sigma Co.)가 전체부피의 0.01 부피로 포함된 원심분리 튜브에 옮겼다. 상기 샘플을 13,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하고, 상등액을 회수하여 100mM PMSF를 전체부피의 0.01 부피가 되도록 첨가하였다. 장에서 얻어진 투명한 액을 얼음 위에 놓고, 여기에 글로블린을 함유하지 않은(globulin-free) 3.5% BSA 용액을 전체부피의 0.05 부피만큼 첨가한 후, 사용할 때까지 -70℃로 동결한 상태로 보관하였다.
한편, 기관지에 캐뉼러(Amarsham Pharmacia Biotech)를 삽입하여 샘플을 채취하고, 차가운 PBS 0.7㎖로 기관지포상을 세척하였다. 약 0.5㎖의 폐세척액(bronchoalveolar lavage)을 각 마우스로부터 회수하고 잔유물(debris)을 제거하기 위하여 3,000 ×g로 4℃에서 5분 동안 원심분리한 후, -20℃에서 저장하였다. 기관지포상 세척액의 혈액 오염은 OD575에서 헤모글로빈(hemoglobin)을 검출함으로써 평가되었다. PBS에서 연속적으로 희석된 마우스의 혈액을 표준물질로서 사용하였으며, 평균 오염도는 4±0.7%이었다.
3-2) 엘리자(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)분석
상기 실시예 3-1)에서 얻은 샘플로부터 ELISA 방법으로 항체량을 측정하였다.
폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Corning, Cambrige, MA, USA)를 중탄산염 코팅 완충액(40mM Na2CO3, 60mM NaHCO3, pH 9.6) 존재하에 3.2㎍/㎖ 농도의 PsaA로 코팅하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 흡착되게 한 후, 플레이트 내 성분을 0.05% 트윈20??(PBST)을 포함하는 PBS로 2회 세척하였다. 웰은 5% 탈지우유 용액으로 채워지고, 블로킹을 위해서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 내용물을 제거한 뒤 웰을 PBST로 2회 세척하였다. 혈청 표본을 50배 희석하고, 2배로 희석된 장 세척 및 폐 세척 샘플을 1차 항체로 사용하였으며, 2,000배 희석된 고추냉이(HRP)-결합 항-마우스 염소 면역글로불린(Organon Teknika Corp., Durham, NC, USA)을 2차 항체로 사용하였다. 사용된 모든 면역 글로불린(immunoglobulines)은 1% 탈지우유를 포함하는 PBS에 희석되고 37℃에서 30분 동안 배양되었으며, 각각의 단계 후에 웰은PBST로 6회 세척하였다. 모든 시약은 100㎕ 표준 부피로 사용하였다. OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride)(1mg/㎖)를 포함하는 안정한 퍼옥시다제(peroxidase) 기질 완충액(PIERCE Chemical Co., Rockford, IL, USA)은 발색반응을 위해 사용되었다. 2.0N 황산 100㎕를 첨가하여 반응을 중단시키고, 492nm에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 OD값을 측정하였다.
항체의 양은 검체내의 항체의 농도의 비례평균(geometric mean)으로서 표현하였다. 항체의 농도 결정을 위하여 샌드위치 엘리자(sandwich ELISA)를 사용하여 표준곡선을 구하였다. 마이크로타이터 플레이트는 4㎍의 항-마우스 염소 면역글로불린 동위체(IgG, IgA;Organon Teknika Corp., Durham, NC, USA)를 포함하는 50㎕의 중탄산 완충액으로 4℃에서 하루동안 코팅하였다. 5% 탈지우유로 블로킹한 후, 표준물질인 동위체(isotopes)의 알려진 농도로 마우스 면역 글로불린(Organon Teknika Corp.)을 정제하였다.
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, PsaA를 포함한 액상제형은 혈청에서 IgG 반응을 유도하였으며(p < 0.05), 이로부터, PsaA를 포함한 본 발명에 따른 액상제형이 항원의 생체내에서의 분해를 방지하여 전신성(systemic) 항체 반응을 증가시킴을 확인할 수 있었다. 또한, PsaA를 포함한 본 발명에 따른 액상제형이 장 및 폐 세척액에서의 IgA 반응도 유도함을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
콜레라 독소에 의한 면역반응 증가 여부 조사
PsaA에 대한 전신성 및 점막성 면역 반응을 증가시키기 위하여, 콜레라 독소(cholera toxin) B 단위체(CTB)와 PsaA를 함께 투여하였다. CTB를 같이 투여하는 경우에는 독소를 각각 5㎍/마우스 또는 10㎍/마우스로 접종하였으며, 첫 번째 면역화 후 2주 간격으로 2회와 3회 면역화를 시행하였다. 면역화 후, 혈청, 장 및 폐로부터 상기 실시예 3-1)에서와 같은 방법으로 샘플 1 내지 3을 준비하였고, PsaA와 CTB가 1:0.04의 비율로 포함된 액상제형을 투여한 것을 샘플 4로, PsaA와 CTB가 1:0.5의 비율로 포함된 액상제형을 투여한 것을 샘플 5로 준비하였으며, 실시예 3-2)와 같은 방법으로 항체의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이, PsaA와 CTB를 함께 분산된 제형에 포함시켜 복용시킨 경우, PsaA만을 포함한 액상제형을 복용시킨 그룹보다 혈청내 IgG와 IgA의 농도가 증가되었다. 즉, 마이크로캡슐화된 항원 PsaA와 함께 점막 면역보조제인 CTB를 동시에 경구복용할 경우, 혈청내 전신성 및 점막성 면역 반응을 높게 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(p < 0.05). 또한, PsaA와 CTB의 비율이 1:0.04일 때 가장 높게 증가된 항체수준을 보였다.
또한, 도 2c 및 2d에 도시된 바와 같이, PsaA와 CTB를 섞어 분산된 제형에 싸서 복용시키고, 장내의 IgA와 폐의 IgA 농도를 살펴보면 1:0.5의 비율로 PsaA와 CTB를 분산된 제형에 포함시켜 복용시킨 그룹이 PsaA만이 포함된 액상제형을 복용시킨 그룹에서 보다 훨씬 높은 항체 수준을 나타냈다.
따라서, PsaA를 단독으로 포함하는 제형을 복용하는 것보다 점막 면역보조제를 함께 분산된 제형에 포함시킨 제형을 복용하는 것이 면역반응을 증가시킬 수 있는 방법임을 확인할 수 있었다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물은 물에 분산되면 작은 크기의 입자가 만들어지며 다양한 경로를 통하여 항원 단백질을 효과적으로 전달할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 높은 면역원성을 나타낼 뿐만 아니라 점막 면역보조제로 사용되는 콜레라 독소와 함께 투여 시 혈청 및 점막 항체의 수준을 향상시킬 수 있어, 성인뿐 아니라 유아에게까지 방어 면역능력을 유발하는 효과적인 백신으로 이용될 수 있다.

Claims (30)

  1. 유효성분으로 폐렴구균성 표면 접착단백질 0.01 ∼ 2 중량%, 1종 이상의 모노글리세라이드계 화합물 9 ∼ 90 중량%, 1종 이상의 유화제 0.01 ∼ 90 중량%, 물 또는 수용액 0.01 ∼ 10 중량% 및 유기용매 0.001 ∼ 5 중량%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 모노글리세라이드계 화합물은 탄소수 10 ∼ 22인 포화 또는 불포화된 모노글리세라이드계 화합물인 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 모노글리세라이드계 화합물은 모노올레인(monoolein), 모노팔미톨레인(monopalmitolein), 모노미리스톨레인(monomyristolein), 모노일레이딘(monoelaidin) 및 모노이루이신(monoerucin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유화제는 인지질(phospholipid),스핑고지질(sphingolipid), 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 및 담즙산(bile acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline) 유도체, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine) 유도체, 포스파티딜세린(phosphatidyl serine) 유도체 및 친수성 고분자가 결합된 지질(polymeric lipid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 스핑고지질은 세라마이드계(ceramides), 세레브로사이드계(cerebroside), 스핑고마이엘린계(sphingomyelins)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 비이온성 계면 활성제는 폴록사머(Poloxamer; Pluronic; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 솔비탄 에스테르 (sorbitan esters; span), 폴리옥시에틸렌 솔비탄(polyoxyethylene sorbitans;Tween) 및 폴리옥시에틸렌 에테르(polyoxyehtylene ethers; Brij)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 음이온성 계면 활성제는 포스파티딜세린 유도체, 포스파티딘산(Phosphatidic acid) 유도체 및 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  9. 제4항에 있어서, 상기 양이온성 계면 활성제는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판(1,2-dioleyl-3-trimethylammonium propane), 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드(dimethyldioctadecylammonium chloride), N-[1-
    (1,2-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-[1-(1,2-
    dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-디올레일-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleyl-3-ethylphosphocholine) 및 3β-[N-[(N',N'-디메틸아미노)에탄]카바모일]콜레스테롤(3β-[N-[(N',N'-dimethylamino)
    ethan)carbamoyl]chloresterol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  10. 제4항에 있어서, 상기 담즙산은 콜린산(cholic acid)과 그의 염 및 유도체, 데옥시콜린산(deoxycholic acid)과 그의 염 및 유도체, 리토콜린산 (lithocholic acid)과 그의 염 및 유도체 및 체노콜린산(chenocholic acid)과 그의 염 및 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 수용액은 완충용액, 산성 용액 또는 염기성 용액인 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 유기용매는 알코올, 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), 아세톤 (acetone), 아세토니트릴(acetonitrile), 클로로포름(chloroform), 벤젠 (benzene), 톨루엔(toluene) 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 첨가제가 5 중량% 이하로 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 첨가제는 지방산, 지방산의 에스테르류 및 지방산의 알코올류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  15. 제1항의 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물을 유기용매와 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 유기용매는 알코올, 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형.
  17. 제15항에 있어서, 상기 액상제형은 경구투여, 구강내투여, 점막투여, 비강내투여, 복강내투여, 피하주사, 근육주사, 경피투여 또는 정맥주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형.
  18. 제15항에 따른 액상제형을 물에 분산시켜 분산액을 제조한 후, 동결건조시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 분말제형.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 동결건조 보호제(crypprotectant) 30 중량% 이하가 추가로 첨가되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 분말제형 .
  20. 제19항에 있어서, 상기 동결건조 보호제는 만니톨(mannitol), 트리할로오즈(trehalose), 아르기닌(arginine) 및 알부민(albumin)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 분말제형.
  21. 제18항에 있어서, 상기 분말제형은 경구투여, 구강내투여, 점막투여, 비강내투여, 복강내투여, 피하주사, 근육주사, 경피투여 또는 정맥주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 분말제형.
  22. 제1항에 있어서, 폐렴구균성 표면 접착단백질 100 중량부에 대하여 콜레라 독소 4 내지 50 중량부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물.
  23. 제15항에 있어서, 폐렴구균성 표면 접착단백질 100 중량부에 대하여 콜레라 독소 4 내지 50 중량부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형.
  24. 제18항에 있어서, 폐렴구균성 표면 접착단백질 100 중량부에 대하여 콜레라 독소 4 내지 50 중량부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 분말제형.
  25. 폐렴구균성 표면 접착단백질, 1 종 이상의 모노글리세라이드, 1 종 이상의 유화제 및 물 또는 수용액을 1 종 이상의 유기용매에 용해시켜 점성의 액체를 제조하는 단계(a); 및
    상기 단계(a)의 액체로부터 유기용매를 제거하는 단계(b)로 구성되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물의 제조방법.
  26. 제25항에 따른 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물을 제조하는 단계(a); 및
    상기 단계(a)에서 제조된 가용화용 조성물을 유기용매와 혼합하여 균일한 액상을 제조하는 단계(b)로 구성되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형 제조방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 유기용매는 알코올, 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형 제조방법.
  28. 제26항에 따른 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 액상제형을 물에 분산시켜 분산액을 제조하는 단계(a); 및
    상기 단계(a)의 분산액을 동결건조시키는 단계(b)로 구성되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 분말제형 제조방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 단계(b)에서 동결건조 보호제(crypprotectant) 30 중량% 이하가 추가로 첨가되어 동결건조되는 것을 특징으로 하는 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 분말제형 제조방법.
  30. 제1항의 폐렴구균성 표면 접착단백질의 가용화용 조성물로 제조된 백신.
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KR20020005563A (ko) * 1999-06-25 2002-01-17 박호군 경구용 백신으로 사용할 수 있는 알긴산염 마이크로스피어및 그 제조방법

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