KR100393268B1 - 신규한 아세토박터 자일리넘 와이케이101 균주 및 그를이용한 셀룰로오스 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 아세토박터 자일리넘 와이케이101 (Acetobacter xylinumYK101) 균주 및 상기 균주를 이용한 셀룰로오스 제조방법에 관한 것으로, 종래의 아세토박터 자일리넘 BRC5 균주에 UV를 조사하여 글루콘산 생산능력이 결여된 돌연변이 균주 (KFCC-11152)를 분리한 후, 글루콘산의 역할을 조사한 결과 글루콘산은 산성조건을 유도하며 셀룰로오스 생산성을 향상시키는데 효과적이었다.

Description

신규한 아세토박터 자일리넘 와이케이101 균주 및 그를 이용한 셀룰로오스 제조방법{Novel Acetobacter xylinum YK101 and process for production of cellulose using the same}

본 발명은 신규한 아세토박터 자일리넘 와이케이101 (Acetobacter xylinumYK101) 및 상기 균주를 이용한 셀룰로오스 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 UV를 조사한 아세토박터 자일리넘 BRC5로부터 글루콘산 생산능력이결여된 돌연변이균주를 분리하고, 상기 돌연변이균주와 글루콘산를 이용하여 셀룰로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

미생물의 다당류와 그 유도체는 생분해성과 낮은 독성이라는 유용한 특성을 나타내므로 광범위하게 연구되어 왔다. 박테리아에 의해서 생산되어지는 다당류 중 셀룰로오스는 다양한 기질로부터 고순도의 형태로 생산되며, 다양한 유도체로의 변형이 용이하며, 뛰어난 수흡착능 (water absorption), 높은 결정성 및 기계적 강도로 인하여 주목을 받아 왔다.

셀룰로오스를 생산하는 박테리아인 아세토박터 자일리넘은 포도당을 성장기질로 하여 성장하는 동안에 셀룰로오스와 함께 글루콘산을 분비한다. Schramm 등은 배양배지 내에 축적되는 글루콘산이 배지의 pH를 낮춤으로써 아세토박터 자일리넘의 셀룰로오스 생산을 저해한다고 보고하였다. 그러나, Masaoka 등은 아세토박터 자일리넘 IFO 13693 균주에서 셀룰로오스 합성에 이용되지 않은 포도당으로부터 생산된 글루콘산이 셀룰로오스 생산에 어떠한 영향도 미치지 않으며, 따라서 글루콘산은 대사되어 다른 물질로 전화된다고 암시하였다. 아세토박터 자일리넘 BRC5 (KCCM 10100)의 경우 배지에 첨가된 대부분의 포도당이 글루콘산으로 대사되고 지수성장기에 소량의 셀룰로오스가 생산된다. 이후 축척된 글루콘산이 소멸되고 세포성장과 셀룰로오스 생산이 중지된다. 이상의 보고로부터 포도당에서 글루콘산으로의 전환되는 것이 아세토박터 자일리넘 BRC5에 의한 총괄 셀룰로오스 생산성에 유익하지 못하다는 결론을 도출할 수 있다. 반면에 상당량의 글루콘산이 배지내에 축척된 이후 아세토박터 자일리넘 BRC5에서 활발한 셀룰로오스 합성이 시작된다는 것은 탄소원 및 에너지원으로 포도당을 사용한 아세토박터 자일리넘 BRC5의 배양에서 글루콘산이 셀룰로오스 생산 이전에 생산되어야 함을 의미한다.

따라서, 본 발명의 목적은 글루콘산 생산능력이 결여된 신규한 아세토박터 자일리넘 돌연변이균주를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이균주 및 글루콘산을 이용하여 셀룰로오스를 제조하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 아세토박터 자일리넘 BRC5의 성장특성을 조사하고, 글루콘산 음성 돌연변이를 분리하여 그 특성을 조사한 후, 아세토박터 자일리넘 돌연변이균주의 셀룰로오스 생산에 미치는 글루콘산 및 pH의 영향을 조사함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 설명한다.

도 1은 UV에 노출된 HSC 배지에서 성장한 아세토박터 자일리넘 YK101 (a) 및 아세토박터 자일리넘 BRC5 (b)를 나타낸다.

도 2는 UV에 노출된 HSC 배지에서 성장한 아세토박터 자일리넘 BRC5 (a) 및 아세토박터 자일리넘 YK101 (b)의 콜로니를 나타낸다. 막대는 5 mm를 나타낸다.

도 3은 아세토박터 자일리넘 YK101의 셀룰로오스 합성에 대한 글루콘산 농도의 영향을 나타낸다.

본 발명은 셀룰로오스 생산균주인 아세토박터 자일리넘 BRC5의 성장특성을 조사하는 단계; 글루콘산 생산력이 결여된 돌연변이균주를 분리하여 그 특성을 조사하는 단계; 아세토박터 자일리넘 YK101의 셀룰로오스 생산에 미치는 글루콘산의 영향을 조사하는 단계 및; 아세토박터 자일리넘 YK101의 셀룰로오스 생산에 미치는 pH의 영향을 조사하는 단계로 구성되어 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세하게 설명하고자 하지만 본 발명의 권리는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 아세토박터 자일리넘 BRC5의 성장특성 조사

아세토박터 자일리넘 BRC5(KCCM 10100)은 국내 식초공장의 초막에서 분리한 셀룰로오스를 생산하는 세균이다. 야생균주와 글루콘산 음성 돌이변이균주는 2%(w/v) 포도당을 함유하는 HS(Hestrin-Schramm) 배지(pH 6.0)를 사용하여 30℃에서 배양하였다. 액체배양의 경우 HS배지 200 mL를 포함하는 1000 mL 플라스크에서 10 mL를 접종하여 배양하였고, 7L 발효기를 사용한 경우 운전부피는 5L로 하고 250 mL를 접종하여 0.6 vvm의 공기주입하에 배양하였다. 온전한 셀룰로오스 섬유의 생산를 저해하는 세포응집 현상을 방지하기 위하여 0.3%(w/v) 셀룰라제(Celluclast, Novo Nordisk Co., Dittingen, Denmark)가 배지에 첨가되었다. 고체배양을 통하여 선별된 콜로니는 종균배양을 위하여 플라스크에서 36시간동안 액체배양하였다.

세포성장은 흡광도계(U-2000, Kitachi, Japan)를 이용하여 540 nm에서 측정하였다. 글루코스 옥시다제의 활성은 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase; Sigma)와 o-디아니시딘(o-dianisidine; Sigma)의 존재하에 포도당 상당 흡광도의 증가를 500 nm에서 측정함으로써 35℃에서 분석하였다. 세포추출액은 지수성장기의 세포를 수집하여 0.1 M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.1)에 재현탁시키고, 초음파기(25 s/m, VCX 6000, US)로 처리하여 파괴한 후, 27,000×g로 30분간 원심분리하여 형성된 상등액을 사용하였다. 효소활성 1 unit는 분당 1 μmol의 포도당을 글루콘산과 과산화수소로 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.단백질은 표준물질로 BSA(bovine serum albumin)을 사용하여 Bradford법으로 정량하였다.

일반적으로 아세토박터 자일리넘 BRC5의 셀룰로오스 생산능력은 전단력에 매우 민감한 것으로 알려졌다. 그러나, 아세토박터 자일리넘 BRC5는 200 rpm으로 배양하여도 셀룰로오스 생산능력을 상실하지 않아 이 세균의 셀룰로오스 생산능력은 전단력에 저항성을 나타내기도 하였다. 아세토박터 자일리넘 BRC5가 발효기에서 성장하였을 경우 초기 지수성장기(비성장속도 = 0.25 h^-1) 동안 상당량의 글루콘산을 분비하였다. 글루콘산 농도는 배양후 3시간만에 최대치(19 g/L)에 도달한 후 감소하였으며, 배양 24시간 후에는 글루콘산이 검출되지 않았다. 그러나, 글루코스 옥시다제(0.22 unit/mg)의 활성은 66시간 동안 크게 변동이 없었고, 3시간 배양한 후의 pH는 5.0이었다.

실시예 2 : 글루콘산 음성 돌연변이의 분리 및 특성 조사

글루콘산 음성 돌연변이균주를 분리하기 위하여 1000 mL 플라스크에서 지수성장하는(A₅₄₀= 0.4∼0.5) 세포배양액 20 mL를 취하여 0.1 M MgSO₄200 mL에 현탁시키고, 이 현탁액 10 mL를 직경 85 mm의 평판배지에 옮긴 후, 22 cm의 간격에서 2분동안 단파장 UV를 조사하였다. UV를 조사한 세포는 0.2%(w/v) 브로모티몰 블루 (bromothymol blue)를 포함한 HS 고체배지에 도말하여 30℃에서 36시간 동안 배양하였다. 배지의 pH는 인산나트륨 (disodium)을 사용하여 7.2로 조절하였다. 아세토박터 자일리넘 BRC5의 글루콘산 음성 돌연변이균주는 배지의 색을 어두운 녹청색에서 녹황색으로 변화시키는 돌연변이의 성질을 토대로 분리하였다.

UV에 조사된 아세토박터 자일리넘 BRC5의 생존율은 0.1%이었으며, 3×10⁵의 UV에 조사된 세포로부터 4개의 글루콘산 음성 돌연변이균주 (#10, #22, #23, #24)를 분리하였다. 예상대로 돌연변이균주는 글루코스 옥시다제 활성을 나타내지 않았다. HSB 배지에서 성장한 돌연변이균주를 HSC 고체배지로 옮겨서 36시간 동안 배양하였을 때 도 1에 나타낸 바와 같이, 돌연변이균주는 UV lamp 하에서 형광을 나타내지 않았다. 돌연변이균주는 정치배양에서 셀룰로오스 초막을 형성하지 않았고, 이러한 결과들은 글루콘산 생산능력이 결여된 아세토박터 자일리넘 BRC5의 돌연변이균주는 셀룰로오스 합성능력 또한 결여되어 있음을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 야생균주의 콜로니는 작고(30℃에서 36시간 배양후 1.5∼2.0 mm) 볼록하고 조밀한 반면에 돌연변이균주의 콜로니는 야생균주 보다 크고(30℃에서 36시간 배양후 2.5∼3.0 mm) 단순히 돌출하고 상대적으로 느슨하였다. 돌연변이균주는 야생균주보다 빠르게 성장하였고(비성장속도 = 0.47 h^-1), 이러한 이유는 돌연변이균주가 글루콘산 및 셀룰로오스 합성을 위하여 포도당을 소모하지 않았기 때문이었다.

상기 돌연변이균주 중 그 특성이 가장 우수한 균주 #23(YK101)을 2000년 3월 4일 사단법인 한국종균협회에 수탁번호 KFCC-11152로 기탁하였다.

실시예 3 : 아세토박터 자일리넘 YK101의 셀룰로오스 생산에 미치는 글루콘산의 영향 조사

아세토박터 자일리넘의 셀룰로오스 생산능은 0.01%(w/v) Calcofluor WT (Sigma)를 함유한 HS 고체배지 (pH 6.0)에서 형성된 콜로니를 단파장(254 nm) UV 핸드램프(UVGL-55, Ultra Violet Products Limitied, Upland, CA, U.S.A.)에 노출시키고 형광을 측정함으로써 평가하였다. 글루콘산은 Aminex HPX-87H 컬럼(7.8 by 300 mm, Bio-Rad Co., USA)과 UV 모니터(model 486, Waters Co.)를 장착한 HPLC(Delta Prep 400, Waters Co., USA)를 사용하여 210 nm에서 정량하였고, 0.002 N 황산을 이동상으로 0.6 mL/min의 유속에서 실시하였다.

글루콘산 생산능력이 결여된 아세토박터 자일리넘 BRC5의 돌연변이균주는 셀룰로오스를 합성하지 않았기 때문에 임의로 선택된 돌연변이균주 YK101을 이용하여 셀룰로오스 합성에 미치는 글루콘산의 영향을 조사하였다. YK101 균주는 셀룰라제가 존재하지 않고 다양한 농도의 글루콘산나트륨(Sigma)이 첨가된 플라스크에서 36시간 동안 배양한 후, 2%(w/v) 글루콘산나트륨을 포함한 HSC 고체배지로 옮겨 36시간 동안 배양하여 UV 의존성 형광을 나타내는 능력을 조사하였다.

글루콘산 존재하에서 성장한 YK101 균주는 셀룰로오스 생산능력을 회복하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 글루콘산 부재하에서 성장한 돌연변이균주는 형광을 나타내지 않은 반면에, 0.1 및 2%(w/v) 글루콘산나트륨 존재하에서 성장한 돌연변이균주는 각각 약하고 강한 형광을 나타내었다. 이러한 결과는 글루콘산이 아세토박터 자일리넘 YK101의 셀룰로오스 생산에 긍정적인 효과로 작용함을 나타내며, 글루콘산이 다른 아세토박터 자일리넘 균주의 셀룰로오스 생산을 저해한다는 보고와 상반되는 결과였다. 또한, 상기의 결과는 글루콘산 생산이 포도당 상에서 성장하는 아세토박터 자일리넘 YK101의 셀룰로오스 합성을 위하여 필요한 요소라는 것을 나타낸다. 5%(w/v) 글루콘산나트륨 존재하에서 성장한 돌연변이균주는 2%(w/v) 글루콘산나트륨 존재하에서 성장한 돌연변이균주와 유사한 강도의 형광을 나타내어, 2%(w/v) 글루콘산나트륨이 HS 배지에서 YK101 균주의 셀룰로오스 최적생산을 획득하기 위한 충분한 농도임을 확인하였다. 2%(w/v) 글루콘산나트륨 용액은 1 L 당 18 g의 글루콘산을 함유하여 아세토박터 자일리넘 BRC5 야생균주의 배양액에서 측정한 최대 글루콘산 농도(18∼19 g/L)와 일치하였다.

실시예 4 : 아세토박터 자일리넘 YK101의 셀룰로오스 생산에 미치는 pH의 영향 조사

글루콘산 농도는 배양 3시간에서 최대치에 도달하였고, 배지의 pH는 초기 3시간 동안 급격하게 감소하였다. 상기의 결과와 글루콘산이 글루콘산 음성 돌연변이균주의 셀룰로오스 합성을 유도한다는 결과로부터 글루콘산이 배지의 pH를 감소시킴으로써 아세토박터 자일리넘 YK101의 셀룰로오스 합성을 유도한다고 제시할 수 있으며, 이러한 결과는 배지내에 상당량의 글루콘산 축적이 급격한 pH 감소를 초래하여 활발한 셀롤로오스 합성을 유발한다는 기존의 보고와 일치하였다. 이러한 글루콘산의 역할을 조사하기 위하여 YK101 균주를 pH 5.0으로 조절된 셀룰라제 결핍 HS 배지에서 36시간 동안 배양한 후, pH 5.0으로 조절된 HSC 고체배지에 도말하여36시간 동안 배양하였다.

글루콘산 부재하에 pH 5.0에서 성장한 YK101 균주는 HSC 배지에서 약한 형광을 나타내어 산성환경이 글루콘산 음성 돌연변이균주의 셀룰로오스 섬유 형성을 유도함을 나타내었다. 동일 pH에서 성장한 야생균주는 pH 6.0에서 성장한 경우보다 셀룰로오스를 더 빠르게 합성하여 산성조건이 아세토박터 자일리넘의 셀룰로오스 합성속도를 가속시킴을 암시하였다. 글루콘산은 산성조건을 초래하여 결과적으로 셀룰로오스 합성에 수반되는 주요효소의 안정화와 활성화가 촉진될 수 있다. 아세토박터 자일리넘에 의한 셀룰로오스 합성과정에서 글루콘산이 축적되는 현상은 클로스트리디엄 아세토부틸리컴(Clostridium acetobutylicum)의 용매화 (solventogenesis)를 유발하는 아세트화(acetogenesis) 과정 중 배지내에 아세트산 및 부틸산 (butyric acid)이 축적되는 현상과 유사한 양상이었다.

이상, 실시예를 들어 설명한 바와 같이, 본 발명 아세토박터 자일리넘 BRC5의 UV 돌연변이균주는 글루콘산으로부터 셀룰로오스를 생산하므로 셀룰로오스 이용산업상 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

1. 글루콘산(gluconic acid) 생산능력이 결여된 돌연변이균주 아세토박터 자일리넘 와이케이101(Acetobacter xylinumYK101; 수탁번호 : KFCC-11152).
2. 제 1항 아세토박터 자일리넘 와이케이101 균주(수탁번호 : KFCC-11152)를 글루콘산 함유 배지에서 배양하는 것을 포함하는 셀룰로오스 제조방법.