KR100368297B1

KR100368297B1 - 양성 전립선 비대증 치료용 메나퀴논 7

Info

Publication number: KR100368297B1
Application number: KR10-2000-0029454A
Authority: KR
Inventors: 이승기; 김용웅; 유춘희; 이상섭
Original assignee: 이승기
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2003-01-24
Also published as: KR20010108708A

Abstract

본 발명은 메나퀴논 7의 5-알파-리덕타제 저해제로서의 용도 및 메나퀴논 7의 제조방법에 관한 것으로서, 강력한 비스테로이드성 계열의 5-알파-리덕타제의 저해제이면서 5-알파-리덕타제의 이소효소들에 대한 저해의 선택성이 넓은 메나퀴논 7을 제공하며, 아르트로박테르 심플렉스(Arthrobacter simplex) 균주를 트립틱 소이 브로쓰 배지에서 배양하는 단계와; 상기의 배양액을 원심분리하여 여과한 후 여과액을 에틸아세테이트로 추출하는 단계와; 상기의 추출액을 농축한 후 박층크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계와; 상기의 정제액을 농축한 후 에틸아세테이트에 용해시켜 농축시킨 다음 석유에테르에 용해시켜 농축시킴으로써 노란색 판상의 화합물을 수득하는 단계로 구성되는 메나퀴논 7의 제조방법을 제공하며, 본 발명에 의한 메나퀴논 7은 사람이나 동물에게 다양한 형태로 투여되어 양성 전립선 비대증을 개선시키는데에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

양성 전립선 비대증 치료용 메나퀴논 7{menaquinone 7 for curing Benign Prostatic Hypertrophy}

본 발명은 테스토스테론 5-알파-리덕타제의 저해제에 관한 것으로서, 특히 메나퀴논 7(menaquinone 7), 필로퀴논(phylloquinone), 메나디온(menadione), 페나진 메토설페이트(phenazine methosulfate), 2,6-디클로로페놀인도페놀(2,6-dichlorophenolindophenol)의 테스토스테론 5-알파-리덕타제 저해제로서의 용도 및 메나퀴논 7의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 성인 남성에서 순환하는 주요 안드로겐인 테스토스테론은 전립선과 같은 표적 조직의 세포 내에서 테스토스테론 5-알파-리덕타제의 촉매 작용에 의해 더 강력한 안드로겐인 5-알파-디히드로테스토스테론으로 전환된다. 테스토스테론 5-알파-리덕타제는 사람과 랫트에서 적어도 두 이소효소 즉 타입 1 이소효소와 타입 2 이소효소로 존재한다는 것이 알려져 있다. 일반적으로 양성 전립선 비대증은 5-알파-디히드로테스토스테론의 과다 생산과 관련되어 있으므로, 테스토스테론 5-알파-리덕타제를 저해하는 것은 양성 전립선 비대증의 치료를 위해 중요하다.

테스토스테론 5-알파-리덕타제는 그 효소 반응의 반응물에 의해서는 저해되지만 생성물에 의해서는 저해되지 않는다. 그 이유로 초기에는 그 반응물 중 기질인 테스토스테론을 모방한 스테로이드들이 테스토스테론 5-알파-리덕타제의 저해제로 도입되었는데 이 저해제들은 많은 경우 그 자체가 기질로 작용하여 진정한 의미의 저해제라 할 수 없었다.

테스토스테론 5-알파-리덕타제의 저해제로서 스트렙토미세스(Streptomyces)로부터 WS-9659 A 및 B가 분리되었으며 WS-9659 A 및 B의 분류, 발효, 분리, 이화학적 특성, 구조규명, 생물학적 특성 및 약물학적 특성이 연구되었고(NAKAYAMA, O. et al., J. Antibiot., 42, 1221-1240 (1989)), 또한 리보플라빈(riboflavin)이 테스토스테론 5-알파-리덕타제의 저해제로서 연구되었으며(NAKAYAMA, O. et al., J. Antibiot., 43, 1615-1616 (1990)), 베르티실리움 에스피(Verticillium sp.)FO-2787에 의해 생산되는 8´,9´-데히드로아스코클로린(8´,9´-dehydroaschochlorin)이 신규한 테스토스테론 5-알파-리덕타제 저해제로서 개발되었다(TAKAMATSU, S. et al., Chem. Pharm. Bull., 42, 953-956 (1994)). WS-9659 A는 T. SATO, et al.에 의해 독립적으로 분리된 YP-02978L-C와 동일하다.(Jpn. Kokai 280,073 ('88), Nov. 17, 1988)

그러나 WS-9659 A 및 B, 리보플라빈, 8´,9´-데히드로아스코클로린 및 그의 유도체는 테스토스테론 5-알파-리덕타제 저해제로서의 생리활성에 한계가 있으며 제조조건과 제조수율 면에서 문제점이 있어 대량생산이 곤란하다.

본 발명의 목적은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 제안된 것으로서, 본 발명의 목적은 강력한 비스테로이드성 계열의 5-알파-리덕타제의 저해제이면서 5-알파-리덕타제의 이소효소들에 대한 저해의 선택성이 넓은 메나퀴논 7을 제공하며 또한 상기의 5-알파-리덕타제 저해제인 메나퀴논 7의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 양성 전립성 비대증의 발생인자인 테스토테론 5-알파-리덕타제를 저해시키는 용도로 메나퀴논 7을 제공하는 것이다.

또 다른 발명의 목적은 아르트로박테르 심플렉스(Arthrobacter simplex) 균주를 트립틱 소이 브로쓰 배지에서 배양하는 단계와; 상기의 배양액을 원심분리하여 여과한 후 여과액을 에틸아세테이트로 추출하는 단계와; 상기의 추출액을 농축한 후 박층크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계와; 상기의 정제액을 농축한 후 에틸아세테이트에 용해시켜 농축시킨 다음 석유에테르에 용해시켜 농축시킴으로써 노란색 판상의 화합물을 수득하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 메나퀴논 7의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의하면 테스토스테론 5-알파-리덕타제를 저해할 수 있는 물질로서 아르트로박테르 심플렉스(Arthrobacter simplex) 균주의 배지 배양액으로부터 화학식 1의 메나퀴논 7(M.W.: 649, C₄₆H₆₄O₂)을 분리할 수 있었고 이로부터 페나진 메토설페이트를 비롯한 몇몇 전자운반 물질들이 강력한 저해 활성을 가진다는 것을 발견할 수 있었다.

메나퀴논 7과 유사한 구조를 갖는 화학식 2의 필로퀴논을 테스토스테론 5-알파-리덕타제의 저해제로서 평가한 결과 저해활성을 나타냄을 알 수 있었다. 슈도모나스(Pseudomonas), 노카르디아 레스트릭투스(Nocardia restrictus), 아르트로박테르 심플렉스(Arthrobacter simplex) 등으로부터 분리될 수 있는 메나퀴논 7은 이 균주들의 스테로이드 A환 탈수소효소에 대해 천연의 전자의 수용체의 역할을 하며 이들 효소들은 많은 종류의 미생물에 존재한다. 전자 운반 물질 중에서 화학식 3의 메나디온, 화학식 4의 페나진 메토설페이트, 화학식 5의 2,6-디클로로페놀인도페놀은 이 효소 반응에서 메나퀴논 7을 대신하여 작용할 수 있으며 랫트 전립선 5-알파-리덕타제에 대하여 저해 효과를 평가한 결과 저해 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

랫트 전립선 5-알파-리덕타제 저해 활성 평가

테스토스테론 5-알파-리덕타제의 저해제의 저해 활성을 평가하기 위하여 메나퀴논 7은 아르트로박테르 심플렉스(Arthrobacter simplex) 균주의 배지 배양액으로부터 분리하였으며, 필로퀴논은 E. 머크사로부터 구입한 제품을, 메나디온은 와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈, 리미티드사로부터 구입한 제품을, 페나진 메토설페이트, 2,6-디클로로페놀인도페놀은 시그마 케미칼 컴퍼니사로부터 구입한 제품을 각각 사용하였다.

효소 현탁액의 제조는 다음과 같다. 생후 7-8주의 것이 되도록 생육시킨 스프라그-도울리(Sprague-Dawley) 웅성 랫트를 디에틸에테르를 흡입시켜 희생시킨다.랫트의 복부의 전립선을 잘라낸 후 무게를 잰 다음 얼음으로 차게하여 둔 용액A(0.32M 자당, 0.1mM 디티오트레이톨, 20mM 인산나트륨, pH6.5)을 가하여 20% (w/v)가 되게 한 다음 파이렉스 유리 균질화기로 50회 정도 왕복하여 마쇄하였다. 그 마쇄물을 8겹이 되게 접은 외과용 거즈를 통과시켜 거른 후 3000×g에서 15분간 원심분리하였다. 위에 뜨는 현탁액을 버리고 남은 펠렛으로 침전이 된 부분에 소량의, 즉 처음에 잰 전립선의 무게정도에 해당하는, 용액A를 가한 다음 잘 현탁시킨 후 그 현탁액을 18-게이지 및 20-게이지의 주사바늘을 차례로 통과시켜 분쇄시킴으로써 단백질 농도를 20mg/ml로 하였다.

랫트 전립선 테스토스테론 5-알파-리덕타제 저해 활성을 시험할 시료 용액은 시험 시료의 용해성에 따라 10% 에탄올 용액으로 제조한다. 시료용액 10㎕와 반응용액(1mM 디티오트레이톨, 50μM NADPH, 2.2nM [1,2,6,7-³H]테스토스테론/테스토스테론(3.15-3.89TBq/mmol, 뉴 잉글랜드 누클리어사제), 40mM 인산나트륨 완충용액(pH6.5)) 525㎕와 효소현탁액 40㎕를 혼합한 후 즉시 37℃의 항온수조에 잠기게 하여 30분간 배양한다. 배양후 각 반응당 1ml씩의 에틸아세테이트로 추출하고 50㎕ 에틸아세테이트층을 실리카겔 박층크로마토그래피를 이용하여 분리시킨다. 이때 사용된 전개용매는 시클로헥산:에틸아세테이트(1:1)이다. 테스토스테론 및 5-알파-디히드로테스토스테론 영역을 가위로 잘라 낸 후 각 박층크로마토그래피판 조각들을 20ml 용량의 액체 섬광계수용 병에 넣고 아쿠아솔-2(뉴 잉글랜드 누클리어사제)를 5ml씩 가한 다음 각각의³H 방사능을 1211 랙베타 액체섬광계수기로 계측하여 cpm값을 얻는다. 또는 1409 액체섬광계수기를 사용한 경우에는 cpm값으로 계측한 것을 액체섬광계수기내에서 dpm값으로 바로 전환하여 얻는다.

랫트 전립선 테스토스테론 5-알파-리덕타제 저해 활성 측정 반응 결과의 계측값으로부터 그 효소 반응의 전환율(conversion(%))및 시험시료에 의한 그 효소 반응의 저해율(inhibition(%))을 다음의 (1), (2) 같은 식의 계산 과정을 통해 얻는다. 식 (1)에서 T와 D는 각각 테스토스테론 영역의 방사능 값과 5-알파-디히드로테스토스테론 영역의 방사능 값을 의미한다. 식 (2)에서 C_{test sample}및 C_{substrate blank}및 C_{enzyme control}은 각각 시험 시료의 효소 저해 활성을 알아보기 위해 시험 시료를 가하여 수행한 반응의 전환율, 기질 대조 반응의 전환율, 효소 대조 반응의 전환율값을 의미한다. 저해율을 계산한 후 효소 활성을 50% 저해하는 농도를 IC₅₀(M)로 하며 상기의 결과를 표 1에 나타내었다.

Conversion(%)={D/(T+D)}×100 (1)

Inhibition(%)={1-(C_{test sample}-C_{substrate blank})/(C_{enzyme control}-C_{substrate blank})}×100 (2)

<비교예 1>

실시예 1의 메나퀴논 7, 필로퀴논, 메나디온, 페나진 메토설페이트, 2,6-디클로로페놀인도페놀과 비교평가하기 위한 테스토스테론 5-알파-리덕타제의 저해제로서 피오시아닌(pyocyanine)은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)KCTC1636의 배지 배양들로부터 분리하였다. 상기의 슈도모나스 아에루기노사는 한국과학기술연구원 유전공학센타 유전자 은행으로부터 구입 하였다. 1-히드록시페나진(1-hydroxyphenazine)은 피오시아닌을 1.3% NaOH로 처리하여 제조하였으며, 리보플라빈은 준세이 케미칼 컴퍼니, 리미티드사로부터 구입한 제품을, NADP⁺는 알드리치 케미칼 컴퍼니사로부터 구입한 제품을, 카르보닐시아나이드-m-클로로페닐히드라존(carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone(CCCP))은 시그마 케미칼 컴퍼니사로부터 구입한 제품을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며 그 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1의 결과는 4회의 다른 실험으로부터의 결과의 평균 ±S.D.이다.

구 분	화합물	IC₅₀(M)
실시예 1	메나퀴논 7	4.0 ±2.1 ×10^-5
	필로퀴논	6.6 ±3.5 ×10^-4
	메나디온	3.1 ±2.2 ×10^-6
	페나진 메토설페이트	4.9 ±0.6 ×10^-8
	2,6-디클로로페놀인도페놀	8.9 ±1.5 ×10^-5
비교예 1	NADP⁺	9.2 ±4.9 ×10^-5
	카르보닐시아나이드-m-클로로페닐히드라존	＞ 1.0 ×10^-3
	피오시아닌	3.1 ±2.8 ×10^-6
	1-히드록시페나진	1.9 ±0.3 ×10^-4
	리보플라빈	1.5 ±1.3 ×10^-5

표 1의 결과로부터 특히 메나디온과 페나진 메토설페이트는 메나퀴논 7보다 더 강력한 저해 활성을 나타내었고, 페나진 메토설페이트의 저해 활성은 피오시아닌의 저해 활성보다도 10배 이상 더 강력한 것으로 나타났다. 이와 같이 상기의 전자 운반 물질들이 테스토스테론 5-알파-리덕타제에 대한 저해 활성을 페나진 메토설페이트, 메나디온, 2,6-디클로로페놀인도페놀의 순으로 갖는다는 것은 상기의 전자 운반 물질에 대해 알려져 있는 스테로이드 A환 탈수소효소들에 대한 촉진 활성의 순서와도 일치한다. 5-알파-리덕타제 효소 반응의 생성물 중의 하나로서 전자 및 양성자의 운반 물질이라 할 수 있는 NADP⁺는 랫트 전립선의 테스토스테론 5-알파-리덕타제에 의한 5-알파-환원반응을 9.2 ×10^-5M의 IC₅₀값으로 저해하며 이는 이미 알려져 있는 연구 결과와 부합된다.

그러나 산화적 인산화에 대한 언커플러 물질로 알려져 있고 양성자의 운반 물질이라 할 수 있는 카르보닐시아나이드-m-클로로페닐히드라존이 랫트 전립선의 테스토스테론 5-알파-리덕타제 저해 활성을 전혀 가지고 있지 않는 것으로 부터 저해 효과는 양성자 전달 과정보다 전자 전달 과정에 연관되어 있음을 알 수 있다.

<실시예 2>

테스토스테론 5-알파-리덕타제 저해제 메나퀴논 7의 제조방법

도쿄대학교 응용미생물 연구소로부터 구입한 아르트로박테르 심플렉스(Arthrobacter simplex)IAM1660 균주를 화염 멸균한 백금이를 사용하여 250ml 엘렌메이여 플라스크에 들어 있는 멸균한 50ml의 트립틱 소이 브로쓰(소이빈-카제인 디제스트 미디엄, 딥코사제) 배지에 접종한다. 그 플라스크를 28℃에서 200rpm으로 회전하는 회전진탕배양기 위에서 96시간 동안 배양한다. 상기의 50ml의 배양액 2개를 2000ml 엘렌메이여 플라스크에 들어 있는 멸균한 400ml의 같은 조성의 배지 10개에 각 400ml 배지당 종균 배양액을 10ml씩 2.5% 접종한다. 그 배양액들을 종균 배양에서와 마찬가지로 28℃에서 200rpm으로 회전하는 회전진탕배양기 위에서 96시간 동안 배양한다.

그 4l의 트립틱 소이 브로쓰 배지 배양액(pH8.5)을 10000×g에서 15분간 원심분리한 다음 그 상층액을 감압하에서 여과지를 통과시켜 여과시킨다. 상기의 여과액을 분액 깔때기를 사용하여 2l의 에틸아세테이트로 추출한 다음 그 에틸아세테이트 추출액을 농축하여 유상 잔사를 얻는다. 그 유상 잔사를 에틸아세테이트:메탄올(9:1)을 전개 용매계로 사용하여 실리카겔 플레이트 상에서 분리한다. 실리카겔 플레이트 상에서 Rf값이 0.62-0.72에 해당하는 영역을 긁어내어 64ml의 메탄올에 녹여 내어 활성 성분 용출액을 만든다. 그 활성 성분 용출액을 감압하에서 농축하여 잔사를 얻고 상기의 잔사를 시클로헥산:에틸아세테이트(1:1)를 전개용매계로 하여 위에서와 같은 종류의 실리카겔 플레이트 상에서 한번 더 분리시킨다. 실리카겔 플레이트 상에서 Rf값이 대략 0.78에 해당하는 영역을 긁어내어 64ml의 메탄올에 녹여 내어 활성성분 용출액을 만든다.

상기의 활성성분 용출액을 감압하에서 농축하여 활성분획을 얻고 그 활성 분획을 에틸아세테이트에 용해시킨 다음 감압하에서 농축시켜 노란색을 띠는 고체 형태의 활성분획을 얻는다. 이 노란색을 띠는 고체 형태의 활성분획을 소량의 석유에테르에 녹인 후 4℃에 보관하여 석유에테르를 서서히 날려 보낸다음 노란색을 띠는 결정상의 고체 화합물 13.3mg을 얻었다.

상기의 화합물을¹H-NMR 분광기, IR 분광기, UV 분광기, 질량분석기를 이용하여 분석하였으며 각 측정치는 다음과 같다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ: 1.52-1.98 (48H, 3´-Me, 4´, 5´, 7´-Me, 8´, 9´, 11´-Me, 12´, 13´, 15´-Me, 16´, 17´, 19´-Me, 20´, 21´, 23´-Me, 24´, 25´, 27´-Me, 28´), 2.19 (s, 3H, 3-Me), 3.37 (d,J=7.3 Hz, 2H, 1´), 5.11 (br s, 7H, 2´, 6´, 10´, 14´, 18´, 22´, 26´), 7.53 (m, 2H, 6, 7), 7.70 (m, 2H, 5, 8).

IR (KBr) cm^-1: 1660 (C=O), 1290, 670 (C-H).

UV λ_max(석유에테르) nm (ε): 218 (12090), 241 (15490), 267 (15100), 322 (4940).

MS m/z (rel. int. %): 648 (M⁺, 34), 646 (4), 633 (3), 551 (1), 550 (1), 476 (1), 474 (1), 443 (1), 376 (1), 375 (1), 368 (1), 307 (2), 239 (4), 225 (100), 187 (8), 149 (32), 121 (12), 81 (27), 69 (41), 68 (6).

상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 메나퀴논 7은 항전립선 비대증 활성을 갖는 약물이나 테스토스테론 5-알파-리덕타제 저해제로서 사용할 수 있으며 사람이나 동물에게 다양한 형태로 투여하여 양성 전립선 비대증을 개선시키는데에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

양성 전립성 비대증의 발생인자인 테스토테론 5-알파-리덕타제를 저해시키는 용도로 사용되는 양성 전립성 비대증 치료용 메나퀴논 7.
아르트로박테르 심플렉스(Arthrobacter simplex) 균주를 트립틱 소이 브로쓰 배지에서 배양하는 단계와; 상기의 배양액을 원심분리하여 여과한 후 여과액을 에틸아세테이트로 추출하는 단계와; 상기의 추출액을 농축한 후 박층크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계와; 상기의 정제액을 농축한 후 에틸아세테이트에 용해시켜 농축시킨 다음 석유에테르에 용해시켜 농축시킴으로써 노란색 판상의 화합물을 수득하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 메나퀴논 7의 제조방법.