KR100359247B1

KR100359247B1 - 인체 상류 조절요소 결합단백질에 대한 단일클론 항체 및이를 생산하는 융합세포주

Info

Publication number: KR100359247B1
Application number: KR1020000015103A
Authority: KR
Inventors: 최인성; 김재화; 윤선영; 김주헌; 강호범; 최용경; 임종석; 정안식
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2002-11-04
Also published as: KR20010090283A

Abstract

본 발명은 암조직 및 암세포에서 특이적으로 발현되는 인체 상류 조절요소 결합단백질 1(upstream regulatory element binding protein 1; UREB1)에 특이적으로 결합하는 생쥐 유래의 단일클론 항체 및 이 항체를 생산하는 융합세포주에 관한 것이다. 본 발명의 인체 UREB1 단백질에 대한 단일클론 항체 및 이를 생산하는 융합세포주를 이용하면 인체 UREB1 단백질을 발현하는 암세포를 쉽게 검색할 수 있으므로, 이들을 인체 UREB1 단백질의 발암과정에 대한 관련성 연구 및 간암의 진단에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 판단된다.

Description

인체 상류 조절요소 결합단백질에 대한 단일클론 항체 및 이를 생산하는 융합세포주{MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC FOR HUMAN UPSTREAM REGULATORY ELEMENT BINDING PROTEIN 1 AND FUSION CELL STRAIN PRODUCING SAME}

본 발명은 인체에 발생하는 수 종의 암조직에서 특이적으로 발현되는 인체 상류 조절 요소 결합 단백질 1(upstream regulatory element binding protein 1; UREB1)에 대한 단일클론 항체 및 이를 생산하는 융합세포주에 관한 것이다. 특히 본 발명은 간암(hepatoma) 조직과 간의 콜란지오 암조직(cholangiocarcinoma)에서 그 발현이 현저하게 증가하는 인체 UREB1 단백질에 대한 단일클론 항체 및 이를 생산하는 융합세포주에 관한 것이다.

UREB1은 URE(upstream regulatory element)라는 핵산 염기서열에 결합하는 단백질로서 1994년에 쥐(rat)의 뇌에서 최초로 발견되었다. URE 핵산 염기서열은 1994년에 마약성 펩타이드인 다이노르핀(dynorphin)을 코딩하는 쥐의 유전자의 프로모터 부위에서 최초로 발견되었으며 피리미딘 성분이 많이 포함된 CACTCTCC 서열은, 유전자의 전사 개시부와 겹치거나 또는 매우 가까이에 위치하는 전사 개시 요소(transcription initiator(Inr) element)와 유사하지만 그보다 더 앞쪽으로 멀리 떨어진 위치에 존재하는 것이 밝혀져 URE(upstream regulatory element)라고 명명되었다. 이 핵산 염기서열은 사람의 대식세포 염증단백질(human macrophage inflamatory protein β: hMIPβ)을 코딩하는 유전자에서도 발견되었으며, 두 경우 모두 시스-작용 요소(cis-acting element)로서 전사 억제기능을 가진 것으로 보고되었다(Guet al.,Mol. Brain Res., 24, 77-88, 1994 ; Guet al.,Biochem. Biophys. Res. Com., 231, 172-177, 1997). 이 두 유전자의 발현산물들은 염증 반응이 일어날 때 유도되는 단백질이라는 공통성을 가지고 있어 URE는 염증신호에 의해 해소되는 전사 억제기능을 가지고 있을 것으로 생각되고 있다.

한편, 이 URE의 핵산 염기서열이 알려짐에 따라 이 염기서열과 결합하는 단백질을 탐색한 결과, 쥐에서 한 종류의 단백질이 밝혀져 UREB1(URE binding protein 1)이라고 명명되었으며 이 단백질에 대응하는 cDNA도 확인되어 클로닝되었다(Guet al.,Mol. Brain Res., 24, 77-88, 1994). UREB1은 URE 부위에 결합하여 아래 쪽에 위치하는 유전자의 전사활성을 증가시켜주는 단백질로서 핵내에 존재하며, 타이로신 키네이즈(tyrosine kinase)에 의하여 인산화된 경우 URE 부위에의 결합능력이 증가하는 것으로 밝혀져 있다(Guet al.,Oncogene, 11, 2175-2178, 1995). 또한 UREB1은, 사람 파필로마 바이러스의 발암성 단백질인 E6 단백질과 결합하여 p53 단백질의 분해를 유도하고 그 결과로 p53 단백질의 기능을 저해한다고 알려진 E6-관련 단백질(E6-associated protein; E6-AP)과 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 실제로 p53과 UREB1 단백질을 p53이 결손된 세포에서 과발현시켜 상호관계를 살펴본 결과 UREB1은 p53에 의한 전사활성능에 대한 억제인자로 작용함을 확인하였다. 이 과정에 있어서 타이로신 잔기의 인산화가 중요하다는 사실이 또한 알려져, 이 단백질은 세포의 신호전달기전과 전사조절의 연결고리로 작용하는 단백질일 것으로 추측된다(Guet al.,Oncogene, 11, 2175-2178, 1995). 쥐의 UREB1과 상동성을 보이는 효모의 RSP5, 사람의 hRPF1 등의 여러 가지 단백질들이 다양한 생물체에서 발견되고 있으며 이들 단백질은 그 기능이 전사과정에서의 공동 활성화제(co-activator)인 것으로 밝혀지고 있어 이 단백질들이 유사한 기능을 가지고 있는 단백질의 일족을 형성하고 있는 것으로 추정된다(Imhofet al.,Mol. Cell. Biol. 16, 2594-2605, 1996).

본 발명에서 단일클론 항체를 생산하는데 사용된 UREB1 단백질은 동물세포에서 p53의 트랜스활성화(transactivation)를 억제하는 기능을 가진 쥐의 UREB1 단백질의 인체 유사물(human homologue to rat UREB1 또는 UREBP: URE binding protein)이며, UREB1 유전자에 대해서는 미국의 NIDR, NIH에 있는 Dr. Gu의 그룹이 쥐의 뇌에서 클로닝하여 연구를 진행하고 있을 뿐 현재까지 보고된 바가 전혀 없다.

본 발명의 목적은 인체 UREB1 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론 항체의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

도 1a는 본 발명의 단일클론 항체에 대한 항원으로 사용되는 UREB1 재조합 단백질을 그를 생산하는 대장균 형질전환체로부터 분리, 정제하여 확인한 SDS-PAGE 결과이고, 도 1b는 이를 재조합 단백질의 특이적 항체(T7·tag 단일클론 항체)로 웨스턴 블랏팅하여 확인한 결과이다.

도 2는 본 발명의 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체의 항원 특이성을 웨스턴 블랏팅 방법으로 검증한 결과이다.

도 3a는 본 발명의 단일클론 항체가 인지하는 특정 에피토프를 확인하기 위한 항원 단백질의 절단 변이(deletion mutant) 재조합단 백질의 구성 모식도이고, 도 3b는 그 재조합 단백질들의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과이고, 도 3c 및 3d는 본 발명의 단일클론 항체가 인지하는 항원의 특정 에피토프를 본 발명의 단일클론 항체 URE#6-3 및 URE#8을 각각 사용한 웨스턴 블랏팅 방법으로 확인한 결과이며, 도 3e는 본 발명의 단일클론항체들이 인지하는 에피토프의 위치를 나타낸 모식도이다.

도 4 는 본 발명의 단일클론 항체가 인간 암조직 유래의 여러 세포주의 파쇄액에서 인체 UREB1 단백질에 대해 나타내는 항원 특이성을 웨스턴 블랏팅 방법으로 검증한 결과이다.

도 5a 및 5b는 본 발명의 단일클론 항체의 항원 특이성을 암 환자의 콜란지오 암조직(도 5a) 및 간암 조직(도 5b)에서 면역조직학적 염색법을 이용하여 검증한 결과이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 암의 진전 표식자로 추정되는 단백질 중의 하나인 인체 UREB1 재조합 단백질에 대해 특이성을 갖는 단일클론 항체와 이를 생산하는 융합세포주를 제공한다.

인체 UREB1 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제조하기 위해서는, 우선 UREB1 단백질을 입수하여야 한다. UREB1 단백질은 공지된 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전공학적 방법에 의해 재조합 단백질로서 생산할 수도 있다. 예를 들면, 서열번호: 1의 인체 UREB1 유전자(Gene bank 등록번호; AF057569)를 포함한 발현 벡터를 제조하여 재조합 단백질을 생산하는 대장균에 형질전환시킨 후 이들 형질전환체들을 배양하여 그로부터 인체 UREB1 재조합 단백질을 분리, 정제함으로써 UREB1 재조합 단백질을 제조할 수 있다.

융합세포주의 개발에 필요한 면역화된 생쥐를 얻기 위해서는, 인체 UREB1 단백질과 동량의 프로인트 완전 보조항원 (complete Freund adjuvant)을 유상화될 때까지 잘 혼합하여 생쥐의 복강 내에 주사한다. 첫 번째 면역주사 후 생쥐의 면역성을 높이기 위해 추가로 부스터 주사(booster injection)하는데, 이 때 보조항원을사용하지 않고 인체 UREB1 재조합 단백질만을 생쥐의 복강 내에 추가로 3회에 걸쳐 부스터 주사하는 것이 바람직하다.

세포융합을 실시하기 위하여 항원을 주사한 생쥐로부터 적취한 비장세포와 세포융합 모세포, 예를 들어, Sp2/0·Ag 14 골수종 세포 (myeloma cell)를 세포수를 기준으로 10:1의 비율로 혼합하고 폴리에틸렌글리콜을 넣어 세포융합 반응을 시킨 다음 배양용 배지, 예를 들어, RPMI 1640 배지를 가하여 희석시킨다. 다음에 융합된 세포들을 선별용 배지 (HAT 배지)에 옮겨 배양한 후 융합세포군들의 성장이 명확히 확인되는 시점에 배양용 배지를 HT 배지로 바꾸어 세포의 증식이 촉진되도록 한다.

HT 배지에서 성장하는 융합세포군 중 인체 UREB1 단백질 항원에만 특이적으로 반응하는 융합세포군을 간접 효소결합 면역흡착검사 (indirect enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA) 분석방법을 사용해 선별한다. 효소결합 면역흡착검사 판독기 (ELISA reader)로 흡광도를 측정하여 정제된 인체 UREB1 단백질과 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 융합세포주를 선별하고, 선별된 세포가 단일클론이 되도록 제한 희석법 (limiting dilution)을 사용해 융합세포를 희석한 후 하나의 세포로부터 증식한 세포들로 이루어진 세포주를 확립한다. 본 발명의 세포주들은 각각 'KY0603'과 'KY0800'으로 명명하여 한국 과학기술연구원 부설 생명공학연구소의 유전자은행(KCTC)에 1999년 11월 8일자로 수탁번호 제KCTC 0689BP호 및 제KCTC 0690BP호로 기탁하였다.

상기와 같이 확립된 세포주들을 생쥐 등의 복강내로 주사한 후 복수액을 채취하고, 그로부터 항체 단백질을 정제함으로써 본 발명의 단일클론 항체를 대량으로 생산할 수 있다.

본 발명에서 확립된 세포주가 분비하는 인체 UREB1에 대한 단일클론 항체는 항체의 아형이 면역글로블린 G₁타입 (IgG₁)과 G_2a타입(IgG_2a)이며, 웨스턴 블랏팅 방법으로 확인되는 바와 같이 인체 UREB1 재조합 단백질에 대해 높은 특이성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는 UREB1 재조합 단백질 항원의 240번 내지 308번 아미노산 부위의 에피토프를 특이적으로 인지한다.

본 발명의 단일클론 항체는 암 환자로부터 얻은 간암 조직과 콜란지오 암 조직에 존재하는 UREB1 단백질 항원에 면역 조직염색법을 이용하여 반응시킬 경우 암세포에 강하게 염색되어 암세포와 정상세포를 명확하게 구분시킨다. 따라서 본 발명의 단일클론 항체는 환자의 세포내 UREB1 단백질 항원의 농도 결정뿐 아니라 발암 관련성에 대한 연구 및 암의 진단에도 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 각각의 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인체 UREB1 재조합 단백질을 생산하는 발현벡터의 제조

인체 UREB1 유전자 중 UREB1 단백질을 코드하는 염기서열을 얻기 위해, UREB1 유전자(Gene bank 등록번호; AF057569)를 주형으로 하고 서열번호: 3 및 4의 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR reaction)으로 전체 오픈리딩프레임을증폭시킨 후, 이를 제한효소인 BamHI과 EcoRI으로 절단한 다음 930 bp 크기의 DNA 절편을 분리, 정제하였다. 이를 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 분리한 pET28a 발현벡터(Novagen사)와 접합시켜 플라스미드 pET28a-UREB1을 제조하였다. pET28a 발현벡터는 발현시키고자 하는 단백질에 6개의 히스티딘(histidine) 잔기를 붙여 발현시킬 수 있는 것으로서, pET28a-UREB1 발현벡터를 대장균에 형질전환시킨 후 재조합 단백질을 유도하면 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 UREB1 단백질(His·tag-UREB1)이 생산된다.

<실시예 2＞ 인체 UREB1 재조합 단백질의 분리 및 정제

인체 UREB1 유전자를 포함하고 있는 발현벡터 pET28a-UREB1로 대장균 BL21(λDE3)를 형질전환시키고, 이를 25ug/ml의 가나마이신(kanamycin)을 포함한 LB배지에서 37℃로 진탕 배양한 후 세포의 대수적 증식기에 1 mM IPTG를 가하여 UREB1 단백질의 생산을 유도함으로써 인체 UREB1 단백질을 재조합 단백질의 형태로 생산하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 후 초음파로 파쇄하여 얻은 침전물을 전기영동(10 % SDS-PAGE)시킴으로써 불용성 단백질로 발현된 UREB1 재조합 단백질을 침전물에 포함된 다른 단백질로부터 분리하였다. UREB1 재조합 단백질을 분리시킨 SDS-PAGE 젤을 25 mM CuCl₂용액으로 염색한 후 Cu²⁺이온과 결합하지 않은 UREB1 재조합 단백질을 절단하여 전기영동으로 젤 상에서 추출하였다. 추출된 이 재조합 단백질을 인산완충용액으로 투석하여 농축하였다. 최종 시료를 대상으로 브레드포드법(Bradford method)에 의해 측정한 단백질의 농도는 1 ㎎/㎖이었다.

상기 분리, 정제 과정의 각 단계에서 얻은 시료 10 ㎕씩을 전기영동(SDS-PAGE)한 결과는 도 1a와 같다. 도 1a에서, 레인 1은 발현 벡타 pET28a만을 형질전환시킨 대장균의 세포조액이고, 레인 2는 UREB1 재조합 단백질의 발현벡타인 pET28a-UREB1을 형질전환 시킨 후 단백질 발현을 유도하지 않은 형질전환 대장균의 세포조액이고, 레인 3은 재조합 단백질의 발현을 1mM IPTG(Isoprophylthio-β-D-galactoside)로 유도한 형질전환 대장균의 세포조액이고, 레인 4는 재조합 단백질의 발현을 유도한 대장균을 초음파를 이용하여 파쇄한 후 원심분리하여 얻은 침전물이며, 레인 5는 SDS-PAGE를 이용한 전기영동 추출법으로 분리, 농축한 재조합 단백질이다.

상기 도 1a에서와 같이 전기영동한 재조합 단백질을, 이를 특이적으로 인식하는 항체(T7·tag IgG-HRP conjugate 항체[Novagen사])를 사용하여 다음과 같이 웨스턴 블랏팅 방법으로 확인하였다. 우선 10 %의 SDS-PAGE로 분리된 단백질들을 전기적인 방법으로 막 필터에 옮겼다. 막 필터에 옮긴 다른 단백질들이 보이는 비특이적인 반응을 줄이기 위해 3 %의 소 혈청 알부민 용액으로 1-2시간 동안 막을 차단시켰다. pET28a-UREB1 발현벡터를 이용하여 생산한 재조합 단백질을 인지하는 단일클론 항체(T7·tag IgG-HRP 항체)를 가하고 상온에서 2시간 반응시켰다. 이 막 필터를 0.5 % 트윈 20(Tween 20)이 포함된 인산 완충액으로 세척한 후, ECL 용액(한국 Amersham사)을 이용하여 형광발색시키고 이를 X-ray 필름(Kodax사)에 감광시켜 확인한 결과는 도 1b와 같다.

상기 도 1a 및 1b의 결과로부터, 대장균으로부터 생산된 UREB1 재조합 단백질이 순수하게 분리, 정제되었음을 확인할 수 있었다.

본 실시예에서 분리·정제된 UREB1 재조합 단백질은 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 선별하고 분석하기 위해 시행한 효소결합 면역흡착검사법을 위한 항원으로 사용되었다.

＜실시예 3＞ 생쥐의 면역화

융합세포주의 제작에 필요한 면역화된 생쥐를 얻기 위하여, 실시예 2에서 제조한 인산완충용액에 용해된 인체 UREB1 재조합 단백질(10 ㎍/100 ㎕)과 같은 부피의 프로인트 완전 보조항원(Freund's complete adjuvant; FCA)을 유상화될 때까지 잘 혼합한 후 생후 6-8주가 된 Balb/c 생쥐의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 처음 면역주사한 것과 같은 양의 인체 UREB1 재조합 단백질을 동량의 불완전 보조 항원(Freund's incomplete adjuvant, FIA)과 혼합한 후 생쥐의 동일 부위에 주사하였다. 그 후 4∼5일 지난 뒤에 생쥐의 눈 부위 혈관에서 소량의 피를 뽑아내어(eye bleeding) 항체의 역가를 확인하고, 세포융합 실험을 실시하기 3∼4일 전에 0.85 % 생리식염수에 녹인 10 ㎍의 인체 UREB1 재조합 단백질을 정맥 및 복강 내에 주사하였다.

＜실시예 4＞ 세포 융합

실시예 3과 같은 방법으로 면역화된 생쥐를 이터(ether)로 마취시킨 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 꺼내서 조직 파쇄기(tissue homogenizer)로 곱게 갈아서 한스완충액(Hans' buffered saline solution, HBSS)을 이용하여 현탁액을 만들고, 이 때 얻어진 비장세포를 15 ml의 원심분리관에 넣어서 원심분리하였다.이 과정을 2회 반복하여 비장 세포를 한스완충액으로 충분히 세척하였다.

한편, 세포융합의 모세포(parent cell)로서 SP2/0ㆍAg14 세포주를 최대 밀도를 5×10⁵/㎖ 정도로 유지시키면서 10 % 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 배지에서 배양하였다. 모세포인 SP2/0ㆍAg14도 한스완충액을 이용하여 2회 원심분리하여 세척하였다.

비장세포와 모세포를 각각 10 ㎖가 되도록 한스완충액에 다시 현탁시킨 후 각 현탁액 내의 세포 수를 세어서 생쥐의 비장세포 10⁸개와 모세포 10⁷개가 되도록 두 현탁액을 50 ㎖의 원심분리관에서 섞은 다음 다시 원심분리하여 침전시켰다. 원심분리관 내의 침전물을 손가락으로 가볍게 두드려서 분산시키고, 37℃에서 1분간 정치한 후 한스완충액에 들어있는 45 % 폴리에틸렌글라이콜(polyethylene glycol), PEG)-5 % 디엠에스오(DMSO)의 푸소겐(fusogen) 1 ㎖를 1분간에 걸쳐서 천천히 가하고 또 다시 1분간 약간 흔들어 주었다. 그 후 배양용 배지(RPMI) 9 ㎖을 3분간에 걸쳐 천천히 첨가하고, 다시 가볍게 흔들어 주면서 서서히 배양용 배지(RPMI)를 첨가하여 최종적으로 현탁액의 용적이 50 ㎖이 되도록 하였다. 이 현탁액을 다시 원심분리한 후 세포 침전물을 분리용 배지(HAT 배지)에 1∼2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96웰(well) 마이크로 타이터 플레이트에 0.2 ㎖씩 분주한 후 37℃로 유지된 가습 이산화탄소 세포배양기에서 배양하였다.

＜실시예 5＞ 단일클론 항체를 생산하는 융합세포의 선별

실시예 4 에서 제조한 융합세포군 중에서 인체 UREB1 재조합 단백질 항원에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하기 위해 정제된 인체 UREB1 재조합 단백질을 항원으로 이용해 효소결합 면역흡착검사법으로 스크리닝을 수행하였다.

마이크로타이터 플레이트(micro-titer plate)에 실시예 2에서 얻은 인체 UREB1 재조합 단백질을 인산완충용액에 용해시킨 용액을 각 웰당 50 ul(2 ug/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시킨 후, 반응하지 않은 항원은 인산완충용액-트윈 20 (PBST) 용액으로 세척하여 제거하였다. 이 플레이트에 융합세포의 배양액을 각 웰당 50 ul씩 가하고 1시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase(HRP); Sigma 사)를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 인산완충용액-트윈 20 용액으로 충분히 세척하였다. 세척이 끝난 각각의 웰에 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 넣어 반응시키고, 그 반응 정도를 효소결합 면역흡착검사 판독기를 사용해 파장 492 nm에서 흡광도를 측정해 결정하였다.

실험의 결과로부터 인체 UREB1 재조합 단백질 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 융합세포들을 우선 선별한 후, 선별된 세포들을 대상으로 상기 과정을 여러 번 반복 실시하여 인간 UREB1 재조합 단백질 항원에만 높은 결합력을 갖고 특이적으로 반응하는 융합세포 집단을 재선별한 다음, 이 세포들의 집합을 단일클론이 되게 제한 희석법으로 희석하여 우수한 단일클론 항체를 생산하는 하나의 세포로부터 유래한 융합세포주를 확립하였다. 이때 최종적으로 KY0603 및 KY0800으로 명명된 2개의 클론을 얻었으며 이 2개의 클론들을 순수하게 클로닝한 다음 동결보존하였다. 또한, 융합세포주 KY0603 및 KY0800은 한국 과학기술연구원 부설 생명공학연구소의 유전자은행(KCTC)에 1999년 11월 8일자로 수탁번호 제KCTC 0689BP호 및 제KCTC 0690BP호로 기탁하였다.

상기 융합세포주들을 배양한 후 상등액을 이용하여 효소면역법으로 항체의 역가를 측정하고 2중 면역 확산법으로 면역글로블린의 아형을 결정하였다. 분리된 클론의 아형은 2개 각각 IgG₁과 IgG_2a로 판명되었으며, KY0603 융합세포주로부터 분리한 단일클론항체(아형이 IgG_2a)를 URE#6-3으로, KY0800 융합세포주로부터 분리한 단일클론항체(아형이 IgG₁)를 URE#8으로 각각 명명하였다.

본 실시예에서 얻은 융합세포주와 이들이 생산하는 면역글로불린을 표 1에 나타내었다.

융합 세포주	흡광도(492 nm)	면역글로불린의 아형(명칭)
KY0603	1.120	IgG_2a(URE#6-3)
KY0800	1.337	IgG₁(URE#8)

＜실시예 6＞ 단일클론 항체의 대량 생산

실시예 5 에서 확립한 융합세포주로부터 인체 UREB1 단백질에 대한 단일클론 항체를 대량으로 생산하기 위하여, 우선 생쥐(Balb/c) 한 마리당 0.5 ㎖의 프리스텐(pristane)을 복강 내로 주사하였다. 1주일이 지난 다음 융합세포들을 생쥐 1마리당 5×10⁶개씩 주사하고, 복강이 부풀어 오른 생쥐에서 복수액을 채취하였다. 이복수액은 높은 농도로 자란 융합세포를 포함하고 있으므로, 채취된 복수액을 10,000 rpm에서 원심분리하여 융합세포를 침전시킨 후, 상층액만을 취하였다. 이 채취된 상층액은 항체 단백질을 정제할 때까지 섭씨 영하 70도에서 보관하였다.

인체 UREB1 재조합 단백질에 대한 단일클론 항체를 복수액으로부터 정제하기 위하여 채취된 복수액의 상층액에 포화된 황산암모늄(ammonium sulfate) 용액을 동량으로 첨가하여 단백질만을 침전시켰다. 침전물을 인산완충용액에 용해시킨 후 24-42 시간 동안 인산완충용액에서 투석하고 프로틴 G 아가로즈 친화성 컬럼(Protein G agarose affinity column; Biorad사)을 이용하여 분리한 후 항체 단백질의 양을 브레드포드(Biorad) 측정법으로 정량하여 섭씨 영하 70도에서 보관하였다.

＜실시예 7＞ 본 발명의 단일클론 항체와 UREB1 단백질의 항원-항체 반응 확인

실시예 6에서와 같이 준비된 단일클론 항체의 인체 UREB1 재조합 단백질에 대한 특이적 반응성을 다음과 같이 웨스턴 블랏팅 방법을 사용하여 확인하였다.

우선 UREB1 재조합 단백질 발현 벡타 pET28a-UREB1만을 형질전환시킨 대장균의 세포조액 및 발현 벡타 pET28a-UREB1으로 형질전환시킨 후 UREB1 재조합 단백질의 발현을 유도한 대장균의 세포조액을 10 %의 SDS-PAGE로 전기영동한 다음 막 필터에 전기적인 방법으로 옮겼다. 막 필터에 옮긴 다른 단백질들이 보이는 비특이적인 반응을 줄이기 위해 3%의 소 혈청 알부민 용액으로 1-2시간 동안 막을 차단시켰다. 인체 UREB1 재조합 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 확인하기 위하여, 1차 항체로 실시예 5에서 생산한 UREB1 재조합 단백질에 대한 단일클론 항체(URE#6-3 또는 URE#8)을 가하고 상온에서 2시간 반응시켰다. 이 막 필터를 0.5 %의 소 혈청 알부민이 포함된 인산 완충액으로 3회 세척한 다음 2차 항체로 호스래디쉬 퍼옥시다제가 결합된 염소의 항-마우스 면역글로블린 G(Goat-anti-mouse- IgG-HRP; ICN, 미국)을 사용하여 상온에서 반응시켰다. 막 필터를 다시 0.5 % 트윈 20이 포함된 인산 완충용액으로 세척한 후 ECL(Enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블랏팅 용액(한국 아머샴파마샤바이오텍)을 이용하여 발색반응을 시켰다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있는 것과 같이, 본 발명의 인체 UREB1 재조합 단백질에 대한 단일클론 항체들이 인체 UREB1 재조합 단백질에만 특이적으로 반응하는 항체임을 확인하였다. 도 2에서, 레인 M은 표준 분자량 크기 표지이고, 레인 1, 3 및 4는 UREB1 재조합 단백질 발현 벡타 pET28a-UREB1만을 형질전환시킨 대장균의 세포조액이고, 레인 2, 4 및 6은 발현 벡타 pET28a-UREB1으로 형질전환시킨 후 UREB1 재조합 단백질의 발현을 유도한 대장균의 세포조액이다. 레인 1과 2는 분리한 세포조액을 코마시(coomassie blue)염색한 것이고, 레인 3과 4는 융합 세포주 KY0603으로부터 얻은 단일클론 항체(URE#6-3)로 웨스턴 블랏팅한 결과이며, 레인 5와 6은 융합 세포주 KY0800으로부터 얻은 단일클론 항체(URE#8)로 웨스턴 블랏팅한 결과이다.

＜실시예 8＞ UREB1 재조합 단백질에 특이적인 단일클론 항체의 에피토프 결정

UREB1 재조합 단백질에 특이적인 단일클론항체 URE#6-3과 URE#8이 인지하는 특정 에피토프를 결정하기 위하여 우선 308개의 아미노산으로 이루어진 UREB1 단백질의 전체 아미노산 서열 정보 (Genebank 등록번호; AF057569)를 이용하여 UREB1단백질의 카르복실 말단으로부터 특정 수의 아미노산 잔기를 절단한 4 가지의 절단 변이체들, 즉, UREB1 단백질의 1번-60번 아미노산으로 이루어진 UD ①, UREB1 단백질의 1번-120번 아미노산으로 이루어진 UD ②, UREB1 단백질의 1번-180번 아미노산으로 이루어진 UD ③, 및 UREB1 단백질의 1번-240번 아미노산으로 이루어진 UD ④를 고안하였다.

UREB1 전체 단백질 및 각각의 절단변이체들을 코딩하는 DNA 절편을 제조하기 위하여, UREB1 유전자(Genebank 등록번호; AF057569)를 주형으로 하고 서열번호 3 내지 8의 프라이머들을 각각 사용한 중합효소 연쇄반응(PCR reaction)으로 UREB1 및 절단 변이체(deletion mutant) 유전자들의 전체 염기서열을 각각 증폭시킨 후 이를 제한효소인 BamHI과 EcoRI으로 절단하고 각각의 DNA 절편을 분리, 정제하였다.

상기에서 제조된 DNA 절편들을 BamHI과 EcoRI으로 절단하여 분리한 pGEX2T 발현벡터(한국 아머샴파마샤 바이오텍)와 각각 접합시켜 UREB1 절단변이체 발현 플라스미드 pGEX2T-UD ①, pGEX2T-UD ②, pGEX2T-UD ③ 및 pGEX2T-UD ④와 UREB1 발현 플라스미드 pGEX4T-1-UREB1을 제조하였다. pGEX2T 발현벡터는 발현시키고자 하는 단백질에 글루타티온 에스 전이효소(glutathione S-transferase[GST])를 붙여 발현시킬 수 있는 것으로서 상기 UREB1 발현벡터 또는 이의 절단변이체 발현벡터들을 대장균에 형질전환 후 재조합 단백질들을 유도하면 각각 GST 단백질이 포함된 UREB1 및 UREB1 절단 변이체 재조합 단백질들이 생산된다. 이들 각각을 GST-UD ①(UREB1 1번-60번 아미노산), GST-UD ②(UREB1 1번-120번 아미노산), GST-UD③(UREB1 1번-180번 아미노산), GST-UD ④(UREB1 1번-240번 아미노산), 및 GST-UREB1(UREB1 1번-308번 아미노산)이라고 명명하였다. 도 3a는 각각의 절단 변이체 재조합 단백질의 제작 모식도를 나타내고 있다.

상기에서 제조된 UREB1 또는 UREB1 절단변이체 발현벡터들을 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후 배양하고 1 mM IPTG로 재조합 단백질을 유도한 후 배양한 균체를 회수하여 SDS-PAGE 상에서 분리하여 유도한 재조합 단백질들을 확인하였다. 도 3b는 유도된 GST-UREB1 단백질 및 절단변이체들을 확인한 결과로서, 레인 M은 표준 분자량 크기 표지이고, 레인 1 내지 6은 발현벡터인 pGEX2T, pGEX2T-UD ①, pGEX2T-UD ②, pGEX2T-UD ③, pGEX2T-UD ④ 및 pGEX4T-1-UREB1을 각각 대장균에 형질전환시킨 세포조액이다.

이어서, 도 3b와 같이 SDS-PAGE로 분리된 각 세포조액의 단백질들을 막 필터에 전기적인 방법으로 옮긴 후, 실시예 7에서와 같은 방법으로 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 그 결과 도 3c 및 도 3d에서 확인할 수 있는 것과 같이, 인체 UREB1 재조합 단백질에 특이적인 단일클론항체인 URE#6-3 과 URE#8이 모두 GST-UREB1 단백질 발현이 유도된 세포조액에서만 특이적인 발색반응을 나타내었다. 이 결과로부터 본 발명에서 얻은 UREB1 재조합 단백질에 대한 단일클론항체들은 도 3e의 모식도에서 볼 수 있는 바와 같이 인체 UREB1 재조합 단백질의 아미노 말단으로부터 240번째 아미노산으로부터 카르복실 말단의 308번째 아미노산 사이의 서열을 인지함을 확인할 수 있었다.

<실시예 9> 인체 UREB1 재조합 단백질에 특이적인 단일클론 항체의 인간 간 종양 관련 세포주들에서의 특이적 반응 확인

본 발명에서 얻은 단일클론항체들이 인간 간 종양 세포주에서 UREB1 단백질과 항원-항체 특이적 반응을 나타내는지 확인하기 위하여 우선 인간 간 관련 세포주인 Chang liver(ATCC CCL-13)와 간 종양관련 세포주인 HepG2(ATCC HB-8065), Hep3B(ATCC HB-8064), 및 PLC/PRF5 세포(ATCC CRL-8024)를 10 % 소 태아 혈청(Fetal bovine serum)을 포함한 DMEM(Gibco/BRL) 세포 배양액에서 증식, 유지하였다. 회수된 세포주들의 세포조액을 얻기 위하여 파쇄 완충액(lysis buffer; 50 mM TrisㆍHCl[pH 7.6], 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 1 mM aprotinin, 1 mM PMSF)에 세포들을 현탁시킨 후 4℃에서 1시간 동안 방치하고 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 세포내 단백질들을 상등액으로 회수하였다. 각각의 회수된 상등액을 브래드포드 시약으로 정량하여 동일한 양의 세포조액을 SDS-PAGE에서 분리한 후 실시예 7의 웨스턴 블랏팅 방법으로 막 필터에 단백질들을 옮긴 후 1차 항체로 URE#6-3(1 ㎍/㎖)을 반응시켜 확인하였다. 그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 간암 관련 세포주인 HepG2와 PLC/PRF5 세포에서 약 36 KDa 크기의 인체 UREB1 단백질과 단일클론항체가 특이적인 반응을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예10> 인체 UREB1 재조합 단백질에 대한 단일클론항체의 인체 간암 조직 및 콜란지오 암 조직에서의 면역염색반응 확인

본 발명의 인체 UREB1에 대한 단일클론 항체의 특이성을 검증하는 또 다른 방법으로 간암 및 콜란지오 암 환자의 조직을 단일클론 항체를 이용하여 면역염색법으로 확인하였다.

우선 암 환자의 조직을 4 % 포름알데하이드(Formaldehyde)를 포함한 인산 완충액으로 고정한 후 녹아 있는 파라핀에 포매하였다. 파라핀으로 포매시킨 조직을 마이크로톰(microtome)으로 얇게 썬 다음 이 절편을 슬라이드 위에 고정하여 자일렌(xylene)과 히스토클리어(histoclear) 용매로 파라핀을 제거하였다. 절편을 1 M 트리스 완충액으로 세척한 후 1차 항체로 URE#6-3을 1 M 트리스 완충액으로 200배 희석하여 40℃에서 20 분간 처리하였다. 다시 남은 항체를 1 M 트리스 완충액으로 완전히 세척하고 2차 항체로 바이오틴(biotin)이 결합한 아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다아제(avidin-horseradish peroxidase) 용액(Immunotech 사)을 40℃에서 10 분간 처리한 후 반응하지 않은 2차 항체를 완전히 세척하였다. 이 절편들을 퍼옥시다아제 기질용액인 0.05 % H₂O₂를 포함한 3-아민-9-에틸카바졸(3-amin-9-ethylcarbazole) 용액에 반응시켜 헤마톡실린(hematoxylin)으로 상호 염색시키고 슬라이드를 봉합한 후 현미경으로 확인하였다. 그 결과 도 5a의 콜란지오 암 조직과 도 5b의 간암 조직에서 정상조직에 비해 훨씬 많은 양의 UREB1 단백질 항원이 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.

인체 UREB1 단백질에 대해 특이적으로 반응하는 본 발명의 단일클론 항체는 서로 다른 수 종의 암환자로부터 절제된 암조직에 존재하는 암세포에만 특이적으로결합하는 우수한 특성을 가지므로 암세포를 특이적으로, 또 정상세포와 명확히 구분하여 선명하게 면역조직염색을 할 수 있도록 한다. 그러므로 이 항체를 사용하면 UREB1 단백질이 인체의 각종 조직에서 어느 정도로 발현되며 또 어떻게 분포되어 있는가를 명확히 측정할 수 있어 임상적으로 보다 정확한 병변의 확인에 따른 체계적인 연구를 할 수 있을 뿐 아니라 실용적인 면에서도 암을 진단하기 위한 정확하고 유용한 표식자로 활용할 수 있다.

Claims

생쥐 유래의 융합세포주 KYO603(수탁번호: KCTC 0689BP) 또는 KY0800(수탁번호: KCTC 0690BP)에 의해 생산되고, 인체 상류 조절요소 결합단백질 1(upstream regulatory element binding protein 1; UREB1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
제 1 항에 있어서,

IgG_2a의 소 단위형(subclass type)을 갖는 단일클론 항체.
제 1 항에 있어서,

IgG₁의 소 단위형을 갖는 단일클론 항체.
인체 UREB1에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주 KYO603(기탁번호: KCTC 0689BP).
인체 UREB1에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주 KY0800(기탁번호: KCTC 0690BP).
제 4 항 또는 제 5 항의 융합세포주를 생쥐의 복강내로 주사한 후 복수액을 채취하고, 그로부터 인체 UREB1에 대한 단일클론 항체를 분리하는 것을 포함하는, 인체 UREB1에 대한 단일클론 항체를 생산하는 방법.