KR100346912B1 - 박테리아에 고온내성을 부여하는 담배 유전자 ＮｔＬＨＳ1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고온내성 유전자 (heat-resistant gene)를 세포에 도입하여 고온내성을 가진 세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에서는 담배 (Nicotiana tabacum)로부터 분리된 고온내성 유전자NtLHS1과 순수분리된 재조합 NtLHS1 단백질을 제공한다. 상기 재조합 NtLHS1 단백질은 대장균과 같이 생장 온도 범위가 좁은 세포의 단백질이 고온에서 변성을 일으키는 것을 억제하고, 고온에 대한 내성을 부여하여 생존율을 높일 수 있으므로, 산업적으로 유용한 미생물의 형질전환이나 고온이 요구되는 효소반응 등에서 반응액 속의 단백질 변성 방지 등에 유용하게 쓰일 수 있다.

Description

박테리아에 고온내성을 부여하는 담배 유전자 ＮｔＬＨＳ1{Tobacco cDNA clone, NtLHS1, which endows high temperature stress resistance in bacteria}

본 발명은 고온내성 유전자 (heat-resistant gene)를 세포에 도입하여 고온내성을 가진 세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 담배 (Nicotiana tabacum)로부터 분리된 고온내성 유전자NtLHS1; 이를 고발현하는 대장균 균주; 상기 균주로부터 순수분리한 재조합 NtLHS1 단백질; 상기 단백질을 제조하는 방법; 상기 유전자를 진핵세포 또는 원핵세포에 도입하여 고온내성을 가진 세포를 제조하는 방법; 상기 재조합 단백질을 이용하여 고온조건에서 단백질의 변성을 방지하는 방법 등에 관한 것이다.

세균은 생태계의 물질 순환에서 중요한 기능을 할 뿐만 아니라, 생명공학 등의 산업 분야에서 유용물질의 생산에 이용된다. 세균류는 극심한 환경 조건에서도 생존하는 능력을 가진 것으로 잘 알려져 있으나, 개별 세균 종이 갖는 환경 내성 능력은 매우 제한적이다.

세균은 특히 고온에 민감하여, 적정 온도보다 약간 더 높은 수준의 온도에 노출되어도 생장 속도가 현저히 감소하고 생존력이 크게 저하된다 (Stanier 등, The Microbial World, 4th ed., Prantice-Hall, p.307, 1976). 반면, 식물체는 개별 종에 있어서 환경 스트레스에 내성을 나타내는 범위가 매우 넓다. 일례로, 식물체와 미생물체의 생장 곡선을 온도에 따라 비교해 볼 때, 식물체의 온도 내성 범위가 훨씬 넓음을 알 수 있다 (권영명 등, 식물생리학, 아카데미서적, p.372, 1997). 동물 세포와 미생물 세포는 정상 생장온도보다 5℃ 정도 체온이 상승하면 치명적인 피해를 입으나, 식물세포는 통상 15-20℃ 정도의 온도 상승에 의해서도 큰 피해를 입지 않는다.

모든 생물체는 고온에 노출되면 열충격단백질 (heat-shock protein)을 다량 생산하여 고온 내성을 강화시킨다. 그러나 열충격단백질에 의해 고온 내성을 강화하는 정도는 생물체에 따라 차이가 크며, 특히 식물체에서 훨씬 그 폭이 크다. 이러한 식물체의 탁월한 고온 내성은 열충격단백질의 다양성과 양적인 차이에 근거하는 것으로 추정되며, 실제로 식물체는 동물체 및 미생물체에 비해 특히 다양한 저분자량의 열충격단백질을 대량으로 생산하는 것으로 알려져 있다 (Waters 등, J. Exp. Bot., 47:325-338, 1996).

이러한 사실에 근거하여, 본 발명자들은 식물에 고온내성을 일으키는 단백질의 유전자를 활용하여 세균에 고온내성을 부여하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 담배 (Nicotiana tabacum)에서 분리된 저분자량 열충격단백질 유전자인NtLHS1을 대장균에서 고발현시키면 상기 균주가 1,000배 이상의 고온 내성 증가를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식물체의 고온내성 유전자를 세포에 도입시켜서 고온내성을 가진 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 식물체의 고온내성 단백질을 이용하여 고온에 의한 단백질의 변성을 방지하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 담배 유전자NtLHS1이 삽입되어 있는 대장균용 플라스미드 pGEM-T-Easy/NtLHS1의 제한지도이고,

Amp^r: 암피실린 저항성 유전자,

도 2는 본 발명의 담배 유전자NtLHS1를 포함하는 대장균용 발현벡터 pBADNH/NtLHS1의 제한 지도이고,

araC: 아라비노즈 오페론의 조절 유전자;

P_BAD: 아라비노즈 오페론의 프로모터;

rrnBT: 강력한 리보솜 rrnB 터미네이터;

Amp^r: 암피실린 저항성 유전자,

도 3은 상기 발현벡터를 포함하는 대장균 균주에서 다량의 NtLHS1 단백질이 생산됨을 보여주는 15% SDS-PAGE 분석 결과이고,

레인 1: 아라비노즈가 포함되지 않은 배양액에서의 대장균 용해액;

레인 2: 0.125% 아라비노즈가 포함된 배양액에서의 대장균 용해액;

레인 3: Ni²⁺친화 컬럼 및 세파크릴 S400 HR 컬럼으로 정제된 H₆NtLHS1 분획,

도 4는 정제된 NtLHS1 단백질을 SDS-PAGE 분석한 후, 은염색 (silver staining)한 것 (좌측)과 이를 니트로셀룰로즈 막에 옮겨 NtLHS1 단백질에 대한 폴리클로날 항체와 반응시킨 것 (우측)을 나타내고,

레인 1: 정제된 NtLHS1 단백질을 10 ng 로딩한 것;

레인 2: 정제된 NtLHS1 단백질을 50 ng 로딩한 것;

레인 3: 정제된 NtLHS1 단백질을 100 ng 로딩한 것;

레인 4: 정제된 NtLHS1 단백질을 200 ng 로딩한 것,

도 5는NtLHS1유전자가 고발현된 대장균 균주에서 수용성 단백질이 전반적으로 보호되었음을 보여주는 SDS-PAGE 분석 결과이고,

상단: 정제된 NtLHS1 단백질을 포함하는 대장균 용해액을 표시된 온도에서 열처리한 것;

하단: 정제된 NtLHS1 단백질을 포함하지 않는 대장균 용해액을 표시된 온도에서 열처리한 것,

도 6은NtLHS1유전자가 고발현된 대장균 균주의 고온내성을 분석한 결과이다.

좌측 막대: pBADNH/NtLHS1로 형질전환된 대장균의 생존률;

우측 막대: pBADNH로 형질전환된 대장균의 생존률.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 '고온내성 유전자'는, 이를 게놈에 포함하는 세포가 포함하지 않는 세포에 비해 고온에 대한 내성을 보다 높이 보유하고 이 유전자가 발현되어 생성된 단백질에 의해 이러한 고온 내성이 부여될 때 그 유전자를 칭한다. 상기 '고온내성'은 고온에서의 세포 또는 개체의 생존율, 생체내 (in vivo) 단백질 변성 정도, 세포 또는 개체의 물질 생산력, 생체내 단백질의 활성 유지 정도 등을 이용하여 측정 가능하다. 또한, 본 발명에서 '고온내성 단백질'이라 함은, 시험관내 (in vitro) 또는 생체내에 존재시 주변 환경 또는 그 생체에 고온내성을 부여하는 단백질을 의미하지만, 그 자체가 고온에서 변성되지 않는 단백질을 의미하는 것은 아니다.

먼저, 본 발명에서는서열번호 1로 기재되고 담배 (Nicotiana tabacum)로부터 분리된 고온내성 유전자NtLHS1를 제공한다.

본 발명의 고온내성 유전자NtLHS1을 분리하기 위해, 먼저 담배 식물체를 열충격 처리하고 이로부터 RNA를 추출한 다음, 분리된 RNA를 이용해서 cDNA 라이브러리를 제작하여, 고온내성 유전자의 분리를 위한 분별식 탐색 (differential screening)에 상기 라이브러리를 이용하였다. 라이브러리 탐색에 사용되는 cDNA 탐침 (probe)은 정상적인 생리 온도 (25 내지 28℃)에서 키운 담배로부터 추출한 mRNA로부터 최초로 합성된 cDNA를 이용하였다. 라이브러리 탐색을 한 번 실시한 후, 음성 반응을 보이는 클론을 포함하는 그룹으로부터 개별 클론을 다시 키우고 상기 탐색 방법을 반복하여 음성 반응을 보이는 개별 클론을 최종 분리하여NtLHS1으로 명명하였다.

염기서열 분석 결과, 상기NtLHS1으로 명명된 cDNA 클론은 전장의 (full length) ORF (open reading frame)를 포함하고 있었으며, 상기 ORF의 서열은서열번호 1에 기재된 바와 같고, 이로부터 번역된 159개의 아미노산 서열은서열번호 2에 기재된 바와 같다.

또한, 본 발명에서는 상기 고온내성 유전자NtLHS1을 포함하는 플라스미드 pGEM-T-Easy/NtLHS1을 제공한다 (도 1참조). 상기 재조합 플라스미드는 대장균에서 고온내성 유전자NtLHS1을 대량복제하고 양쪽 말단BglⅡ 제한자리를 이용하여 ORF를 다른 벡터로 이동시킬 목적으로 제조된 것이다.

또한, 본 발명에서는 pGEM-T-Easy/NtLHS1이 효율적으로 복제되고 유지될 수 있는 대장균 균주를 제공한다. 상기 대장균 균주는 pGEM-T-Easy/NtLHS1을 포함하고 있는 것을 특징으로 하므로, 본 발명의 실시예에서 사용된 형질전환용 대장균균주 대신 다른 공지의 대장균 컴피턴트 세포를 사용하여 본 발명의 균주와 동일한 기능을 가지는 대장균 균주를 용이하게 제조할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 재조합 플라스미드에 pGEM-T-Easy/NtLHS1을 대장균 균주 DH5α에 도입하여 대장균 균주 DH5α/NtLHS1을 제조한다. 상기 균주는 1999년 8월 6일 생명공학연구소 유전자은행 (KCTC)에 기탁되었다 (수탁번호: KCTC 0650BP).

또한, 본 발명에서는 상기 고온내성 유전자NtLHS1를 포함하는 발현벡터 pBADNH/NtLHS1를 제공한다 (도 2참조).

상기 발현벡터는 대장균에서 고온내성 유전자NtLHS1를 고발현시키기 위한 목적으로 제조되었으며, 유용한 대장균에게 고온내성을 부여하는 목적으로도 이용할 수 있다. 그러나, 공지의 유전자 재조합 기술과 본 발명의 유전자NtLHS1를 이용하면, 대장균 등의 원핵세포 뿐 아니라 효모나 고등생물 등의 진핵세포 등에 도입시킬 수 있는 발현벡터를 다양하게 제조할 수 있음이 명백하다. 이와 같이 제조된 대장균 등을 포함한 세균용 발현벡터, 효모용 발현벡터, 진핵세포용 발현벡터 등은 고온내성 단백질 NtLHS1를 대량제조하거나 세포에 고온내성을 부여하는 용도로 쓰일 수 있다.

상기 발현벡터 pBADNH/NtLHS1은 출발 벡터로서 pBADNH (Invitrogen사, 네덜란드)를 이용하였으며, 상기 고온내성 유전자NtLHS1는 pBADNH의SacI-SphI 위치에 삽입하였다. 상기 pBANDH의 구성 요소로는 araC (아라비노즈 오페론의 조절 유절자), P_BAD(아라비노즈 오페론의 프로모터), rrnBT (강력한 리보솜 rrnB 터미네이터), Amp^r(암피실린 저항성 유전자) 등이 있으며, 특히 상기와 같이 pBADNH의SacI-SphI 위치에 삽입하는 경우, 삽입된 외래유전자는 한쪽 말단에 6개의 히스티딘 코돈이 부가된다 (도 2참조). 상기 발현벡터 pBADNH/NtLHS1은서열번호 2에 의해 기재되는 단백질의 아미노 말단에 히스티딘 잔기 6개가 추가된 단백질을 코딩한다.

또한, 본 발명에서는 상기 고온내성 유전자NtLHS1를 효율적으로 발현하는 대장균 균주를 제공한다. 상기 대장균 균주는 고온내성 유전자NtLHS1를 포함한 대장균용 발현벡터를 공지의 대장균 균주에 도입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, 상기 발현벡터 pBADNH/NtLHS1를 대장균 균주 MC1061에 도입하여 대장균 균주 MC1061/NtLHS1를 제조하였다.

또한, 본 발명에서는 상기 고온내성 유전자NtLHS1에 의해 코딩되고서열번호 2에 의해 아미노산 서열이 기재되는 고온내성 단백질 NtLHS1 또는 그 변이형 단백질을 제공한다.

상기 고온내성 단백질 NtLHS1의 "변이형 단백질"이라는 용어는서열번호 2로 기재되는 NtLHS1의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 위치에서 삽입, 결실 또는 치환을 일으켜 제조한 단백질을 의미하며, 바람직하게는 NtLHS1과 비교할 때 아미노산 서열에 있어서 95% 이상의 상동성을 보이고 상기 NtLHS1과 동일한 활성을 나타내는 단백질을 뜻한다.

본 발명의 실시예에서는, NtLHS1의 순수분리를 효율적으로 수행하기 위해,서열번호 2로 기재되는 NtLHS1 아미노산 서열의 아미노 말단에 히스티딘 잔기가 6개 추가된 NtLHS1 단백질의 변이형 단백질을 제조한다. 상기 히스티딘 잔기 6개는 본 발명의 발현벡터 pBADNH/NtLHS1의 출발벡터인 pBADNH의 히스티딘 코돈에서 유래한 것이다. 공지의 단백질 분해 효소를 이용한 히스티딘 잔기 제거 기술을 이용하여 발현벡터를 구성하면 히스티딘 잔기 6개를 정제 단계 이후에 제거할 수 있으므로,서열번호 2로 기재되는 NtLHS1 단백질의 제조는 본 발명으로부터 용이하게 수행할 수 있다. 예를 들어,NtLHS1유전자를 포함하는 발현벡터를 구성할 때, 히스티딘 잔기를 암호화하는 코돈 6개 뒷 부분에 트롬빈 절단 부위 등을 암호화하는 코돈을 삽입함으로써 발현 및 정제 단계 이후 NtLHS1 단백질을 용이하게 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 고온내성 단백질 NtLHS1 또는 그 변이형 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:

1) 고온내성 유전자NtLHS1을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균 균주를 배양한 후 발현유도물질을 첨가하여NtLHS1유전자의 발현을 유도하는 단계;

2) 상기 배양액에서 세포를 수확하여 세포 용해액 (lysate)을 얻는 단계; 및

3) 크로마토그래피를 이용하여 상기 세포 용해액을 정제하는 단계.

상기 단계 1)에서 발현유도물질은 발현벡터에 사용된 프로모터의 종류에 따라 결정되며, IPTG, 아라비노즈 등을 예로 들 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, P_BAD(아라비노즈 오페론의 프로모터)를 포함하고 있는 pBADNH/NtLHS1를 발현벡터로 사용하였으므로 발현유도물질은 아라비노즈를 사용하였다. 이때 아라비노즈는 배양액의 600nm OD 값이 0.3 내지 0.4에 도달하였을 때 첨가하는 것이 바람직하고, 0.05 내지 0.3% (w/v)의 최종농도로 배양액에 첨가하는 것이 바람직하다.

상기 단계 2)에서 세포의 수확은 공지의 방법대로 수행하면 되는데, 이를테면 6,000g로 10분 동안 원심분리하여 세포 침전물을 분리하여 얻을 수 있다. 또한, 세포 용해액 (lysate) 또한 공지의 방법대로 얻을 수 있는데, 이를테면 재현탁 완충액 (20mM 트리스-염산, pH 8.0, 2.8mM 베타-머캅토에탄올)에 세포 침전물을 재현탁시키고 용해 완충액 (20mM 트리스-염산, pH 8.0, 2.8mM 베타-머캅토에탄올, 1.2㎎/㎖ 라이소자임)을 첨가하여 약 37℃에서 잠시 방치한 후, 동결-해동 과정을 거쳐 세포 용해액을 얻을 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 아라비노즈를 유도물질로 사용하는 경우 상기 단계 2)에서 수확은 아라비노즈를 배양액에 첨가한 지 4시간 후에 수행하는 것이 바람직하다.

상기 단계 3)에서는 분리된 세포 용해액에 공지의 크로마토그래피 방법, 용매 추출법, 여과법 등의 정제 방법을 이용하여 원하는 수준까지 정제할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, 황산암모늄 침전법과 크로마토그래피 방법을 이용하여 대장균 균주 MC1061/NtLHS1의 세포 용해액으로부터 히스티딘이 표지된 NtLHS1 단백질을 분리할 수 있었는데, 특히 크로마토그래피 방법으로 Ni²⁺친화 크로마토그래피및 젤 여과 크로마토그래피를 이용하였다.

상기와 같이 정제한 단백질로 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과, 히스티딘이 표지된 NtLHS1 단백질이 순수분리되었음을 확인할 수 있었다 (도 3및도 4참조).

또한 본 발명은 고온내성 유전자NtLHS1또는 NtLHS1 단백질의 변이형 단백질을 코딩하는 유전자를 진핵세포 또는 원핵세포에 도입하는 것으로 구성되는 고온내성을 가진 세포의 제조 방법을 제공한다.

상기 제조 방법에서 고온내성 유전자 또는 NtLHS1의 변이형 단백질을 코딩하는 유전자를 도입시키는 방법은 공지의 유전자 도입 방법에 따른다. 즉, 도입하고자 하는 유전자를 적당한 발현벡터에 삽입한 후 고온내성을 부여하고자 하는 세포에 이를 도입하거나, 발현벡터에 포함시키지 않고 직접 세포에 도입시킬 수 있다. 이때, 발현벡터, 발현벡터의 구성 요소, 발현벡터의 도입 방법 등은 유전자를 도입하고자 하는 세포의 종류에 따라 결정된다. 대장균 등의 원핵세포, 효모 등의 진핵 단세포 및 다양한 포유류 세포주와 식물 배양 세포 등의 진핵세포주에 발현벡터를 도입하는 방법은 Sambrook 등 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989), Spector 등 (Cells: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1998), Potrykus와 Spangenberg (Gene Transfer to Plants, Springer, 1995) 등의 참고 문헌에 구체적으로 기재되어 있다.

본 발명의 실시예에 따르면,NtLHS1유전자를 고발현하는 세포는 고온내성형질을 획득하였다. 구체적으로, 본 발명의 대장균 균주 MC1061/NtLHS1의 고온 처리 후 생존률을 조사한 결과, 50℃에서 두 시간의 고온처리를 하였을 때, 출발벡터인 pBADNH로 형질전환된 대장균 균주의 경우 0.4% 미만의 생존률을 보였으나, NtLHS1을 생성하는 대장균 균주의 경우 30% 이상의 생존률을 나타내었다. 50℃ 고온처리 8시간 후에는 pNtLHS1를 가지고 있는 대장균의 생존률이 pBADNH를 가지고 있는 대장균의 경우에 비해 3,000배 이상 높았다 (도 6참조). 따라서, 본 발명의 고온내성 단백질 NtLHS1는 생체내 (in vivo) 고온내성 기능을 가지고 있음이 확인되었다.

상기 고온내성을 가진 세포의 제조 방법을 이용하면, 기존의 유용한 미생물에 고온내성을 부여할 수 있다. 즉, 상기 방법에 의해 고온내성의 형질을 획득한 대장균 등은 고온에서도 생존가능하므로, 보다 열악한 환경에서도 유용한 유전공학적 산물 등을 제조할 수 있다. 대장균, 효모 등 다양한 균주가 상기 방법에 따라 고온내성을 획득할 수 있다.

고온내성의 형질은 유전학적 분석에서 가장 흔히 사용되어 온 유전학적 마커 (genetic marker)이므로, 상기 고온내성을 가진 세포의 제조 방법은 산업적으로 유용한 미생물 뿐만 아니라 새로운 유전자의 발견, 돌연변이체의 탐색 등의 연구 목적으로도 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 고온내성 유전자NtLHS1에 대한 안티센스 RNA 또는 NtLHS1 단백질의 변이형 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 유전자를 진핵세포 또는 원핵세포에 도입하는 것으로 구성되는 세포의 고온내성 억제 방법을 제공한다.

'안티센스 RNA (antisense RNA)'는 해당 유전자에 대한 상보적인 염기서열로 구성된 RNA이다. 일반적으로, 안티센스 RNA를 발현하는 유전자를 세포내에 도입하여 고발현시키면, 안티센스에 대한 내생적 (endogenous) '센스 RNA'의 발현이 억제됨이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 고온내성을 가진 세포의 제조 방법과 동일한 방법을 이용하되, 센스 RNA를 발현하는 유전자 대신 안티센스 RNA를 발현하는 유전자를 도입시키면 된다. 이때 안티센스 RNA를 고발현시키고자 하는 세포는 담배세포 등 NtLHS1 단백질 또는 그 변이형 단백질을 내생적으로 생산하는 세포인 것이 바람직하며, NtLHS1 단백질 또는 그 변이형 단백질을 생산하도록 형질전환된 고온내성 대장균, 고온내성 효모 등도 바람직한 대상이 된다.

또한, 본 발명은 변성을 방지하고자 하는 단백질을 포함하는 계에 NtLHS1 단백질 또는 그 변이형 단백질을 첨가하는 것으로 구성되는 단백질의 고온변성 방지 방법을 제공한다.

상기 변성을 방지하고자 하는 단백질을 포함하는 계는 생체내 또는 시험관내에 위치할 수 있다. 예를 들어, 대장균 세포 내부의 총단백질을 열변성으로부터 보호하고자 NtLHS1 단백질을 첨가할 수도 있고, 대장균으로부터 분리한 세포 용해액의 단백질을 열변성으로부터 보호하고자 NtLHS1 단백질을 첨가할 수도 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 고온내성 단백질 NtLHS1은 대장균 단백질의 고온내성을 증가시킬 수 있었다. 구체적으로, 대장균의 배양액으로부터 무세포 추출액 (cell-free extract)을 획득하고 이에 정제된 NtLHS1을 첨가하거나 첨가하지 않고 고온 처리한 다음 처리된 무세포 추출액으로 SDS-PAGE를 수행하여 대장균의 수용성 단백질이 어느정도 변성되었는지 확인한 결과, NtLHS1이 첨가되지 않은 무세포 추출액의 경우 50℃의 고온 처리 시부터 단백질들의 용해도가 급격히 감소하는 반면, NtLHS1이 첨가된 경우 90℃의 고온에서도 단백질의 용해도에 별다른 차이가 관찰되지 않았다 (도 5참조). 즉, NtLHS1 단백질은 대장균의 다양한 종류의 단백질을 고온 조건에서 보호하는 시험관내 (in vitro) 기능을 보유하고 있음을 확인하였다.

시험관내 반응에서 고온변성 방지 효과를 보여주기 위한 NtLHS1의 유효량은, 1㎎의 총단백질 당 정제된 NtLHS1 단백질을 약 5㎍ 이상 첨가하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 고온내성 유전자 NtLHS1 의 분리

본 발명의 고온내성 유전자NtLHS1을 분리하기 위해, 먼저 담배 식물체를 열충격 처리하고 이로부터 RNA를 추출한 다음, 분리된 RNA를 이용해서 cDNA 라이브러리를 제작하여 고온내성 유전자의 분리를 위한 분별식 탐색 (differential screening)에 상기 라이브러리를 이용하였다.

구체적으로, 25 내지 28℃, 16시간의 명조건으로 유지된 온실에서 담배 식물체의 위스콘신 38 재배종 (Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsin 38)을 재배하여 이를 열충격 처리의 대상으로 하였다. 잎이 5-7개 난 어린 담배 식물체를 골라 각각 열충격을 가하되, 15분, 30분, 1시간, 2시간 또는 4시간 동안 32℃, 36℃, 40℃, 또는 44℃에서 상대습도 90% 이상, 암조건으로 유지된 배양기에서 열충격을 가하였다.

전체 (total) RNA를 분리하기 위해, 상기 열처리된 담배의 잎 부위를 액체 질소 존재 하에서 막자사발로 갈고, 구아니딘 티오시안산염 (guanidium thiocyanate)이 함유된 RNA 추출 완충액으로 RNA를 추출하고 CsCl 구배차 고속원심분리를 이용하여 정제하였다 (Hong과 Jeon, 한국식물학회지, 30:201, 1987).

상기 추출된 RNA 중 39℃에서 1시간 동안 열충격을 가한 담배잎으로부터 분리한 전체 RNA를 선택하여, 올리고(dT)-셀룰로즈 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 상기 전체 RNA로부터 mRNA만을 분리하였다. 분리된 mRNA를 주형으로 하고 역전사 효소 및 RNaseH를 이용하여 cDNA를 합성한 다음 (cDNA 합성 키트, Amersham 사, 미국), 합성된 cDNA를 pBR322 벡터 (Promega 사, 미국)의EcoRV 제한 자리에 둔단 삽입시켰다. 상기 제조된 재조합 벡터를 대장균 균주 HB101에 형질전환시켜 cDNA 뱅크를 제작한 후, 이를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 분주하여 -70℃에 보관하였다.

라이브러리 탐색을 위해서, cDNA 라이브러리의 클론을 10개 단위로 암피실린을 함유한 LB 액체배지 (박토트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, 염화나트륨 10g/L)에서 함께 배양하였다. 이 배양액으로부터 대장균을 원심분리를 통해 수확하고 알칼리 용해법 (Sambrook 등, Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory Press, 미국, 1989)을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리한 후, 이를EcoRI 및HindⅢ로 절단한 다음 아가로즈 젤 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 젤 상의 DNA를 나일론 막으로 옮기고³²P로 표지한 cDNA 탐침으로 라이브러리 탐색을 수행하였다. 이 때, 라이브러리 탐색에 사용되는 cDNA는 정상적인 생리 온도 (25 내지 28℃)에서 키운 담배로부터 추출한 mRNA로부터 최초로 합성된 cDNA이며,³²P 표지는 cDNA 합성 시 첨가하였다 (Sambrook 등, 1989).

그 결과 음성 반응을 보이는 클론을 포함하는 그룹으로부터 개별 클론을 다시 키우고 상기 탐색 방법을 반복하여 음성 반응을 보이는 개별 클론을 분리하였다.

<실시예 2> 선발된 클론의 염기서열 결정

상기 실시예에서 분리된 cDNA 클론을 pBluescript Ⅱ SK(+)의BamHI 위치에 삽입하였다. 염기서열 결정을 위해, 엑소뉴클레이즈 Ⅲ (exonuclease Ⅲ)를 사용하는 염기서열 결정용 결실 키트 (deletion kit for kilo-sequencing, Takara, 일본)을 이용하여 한쪽 방향 결실 계열을 제작하였다. 한쪽 방향으로 절삭된 클론들의 염기서열 결정은 시쿼네이즈 (Sequenase version 2.0, United States Biochemical Cooperation, 미국)를 사용하여 생거 (Sanger)의 다이디옥시 사슬 종결법 (Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463, 1977)으로 수행하였다.

이와 같이 결정된 염기서열 중NtLHS1으로 명명된 cDNA 클론은 전장 (full length)의 ORF (open reading frame)를 포함하고 있었으며, 상기 ORF의 서열은서열번호 1에 기재된 바와 같고, 이로부터 번역된 159개의 아미노산 서열은서열번호 2에 기재된 바와 같다.

상기NtLHS1cDNA 클론을 포함한 pBR322/NtLHS1벡터를 주형으로 PCR을 수행하여 ORF의 양쪽 끝에BglⅡ 제한자리를 갖는NtLHS1DNA 절편을 증폭하였다. PCR에 사용된 프라이머는 P1 (서열번호 3) 및 P2 (서열번호 4)로서, P1 프라이머는NtLHS1코딩 서열의 5' 말단 부위와, P2 프라이머는NtLHS1코딩 서열의 3' 말단 부위와 각각 결합하며 염기서열의 중앙에BglⅡ 제한자리를 포함한다. PCR의 어닐링 (annealing) 온도는 50℃였으며, DNA 증폭은 30회 수행하였다.

상기 증폭된 PCR 산물을BglⅡ 제한효소로 처리하고 T4 DNA 라이게이즈 (ligase)를 이용하여 pGEM-T Easy 벡터 (Promega사, 미국)의BglⅡ 위치에 삽입하였다 (도 1참조). 반응이 끝난 라이게이션 혼합액 1㎕를 대장균 균주 DH5α에 도입하여 대장균 형질전환체 DH5α/NtLHS1을 제조하였으며, 이를 1999년 8월 6일 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 0650BP).

<실시예 3> 발현벡터 pBADNH/NtLHS1 및 이를 포함하는 대장균 균주의 제조

본 발명의 발현벡터 pBADNH/NtLHS1를 제조하기 위해, 먼저NtLHS1유전자의 단백질 코딩 서열을 포함하는 DNA 절편을 PCR을 이용하여 제조하였다. 상기 PCR에서 주형은 실시예 1에서 pBR322 벡터에 삽입된NtLHS1cDNA였으며, 사용된 프라이머는 P3 (서열번호 5) 및 P4 (서열번호 6)였다. 상기 P3 프라이머는NtLHS1코딩 서열의 5' 부분과 결합하며SacI 제한 자리를 포함하고 있고, P4 프라이머는NtLHS1코딩 서열의 3' 부분과 결합하며SphI 제한 자리를 포함하고 있다. PCR의 어닐링 (annealing) 온도는 50℃였고 DNA 증폭을 30회 수행하였다.

상기 증폭된 PCR 산물은SacI 및SphI 제한효소로 12시간 동안 처리한 다음, T4 DNA 라이게이즈 (ligase)를 이용하여 pBADNH (Invitrogen사, 네덜란드)의SacI-SphI 위치에 삽입하였다. 반응이 끝난 라이게이션 혼합액 1㎕를 대장균 균주 MC1061 형질전환용 컴피턴트 세포와 혼합하고 얼음 위에서 40분 간 방치한 후, 42℃ 수조에서 2분간 열충격을 주고 0.9㎖의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 형질전환체의 선발을 위해서, 암피실린 (50㎎/ℓ)가 함유된 LB 배지에 상기 배양액 100㎕를 도말하고 37℃에서 12시간 동안 배양하였다 (Sambrook 등, 1989).

그 결과 본 발명의 재조합 발현벡터 pBADNH/NtLHS1를 포함한 대장균 균주 MC1061/NtLHS1을 얻을 수 있었다 (도 2참조).

<실시예 4> SDS-PAGE 분석에 의한 재조합 단백질 H ₆ NtLHS1의 과량 발현 확인

상기 실시예의 대장균 균주 MC1061/NtLHS1으로부터 히스티딘 잔기 6개가 아미노말단에 추가된 형태의 NtLHS1 단백질 (H₆NtLHS1)이 과량 발현되는지 확인하기 위해, 발현 유도체인 아라비노즈 (arabinose)를 포함한 배지에서 상기 균주를 배양한 후 SDS-PAGE를 수행하였다.

구체적으로, 대장균 균주 MC1061/NtLHS1을 LB 배지에서 배양한 다음 다양한 농도의 아라비노즈 (arabinose)를 유도체로 첨가하여 과량발현을 유도한 후 다양한 시간 후에 수확하여 SDS-PAGE를 수행하였다.

단백질의 전기영동은 램리의 방법 (Laemmli, Nature 227: 680, 1970)에 근거하여 수행하였고 SE600 키트 (Hoefer Scientific Instruments, 미국)를 사용하였다. 15개의 웰이 있는 두께 1.5mm, 18×16 cm 규격의 젤을 만들고 각각의 시료를 시료완충액 [50mM 트리스-염산, pH 6.8, 1% SDS, 1% 베타-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 0.005% 브로모페놀 블루 (bromophenol blue)]과 섞어 3분 동안 끓인 후 얼음에 1분 동안 방치하였다. 각 웰 당 50㎍에 해당하는 시료를 로딩하고 스태킹 젤(stacking gel)에서는 7.5mA로, 세퍼레이팅 젤 (separating gel)에서는 15mA로 전기영동하였다.

전기영동 후 젤의 염색은 0.125% (w/v) 쿠마시 블루 (Coomassie brillant blue R-250), 50% (v/v) 메탄올 및 10% (v/v) 빙초산이 포함된 염색액에서 30분 동안 수행하였으며, 염색된 젤은 10% 메탄올과 10% 빙초산을 포함하는 탈색액으로 탈색시켰다. 한편, 단백질의 정량분석은 쿠마시 블루 (Coomassie brillant blue G-250)를 이용한 브래드포드의 방법에 근거하였다. 염색시약 (Bio-Rad, 미국)을 반응부피의 1/4을 섞어 상온에서 5 분간 반응시킨 후, 595nm에서 OD를 측정하여 표준시료의 흡광도를 기준으로 시료의 단백질을 정량하였다. 표준시료로는 우혈청알부민(Sigma사, 미국)을 사용하였다.

이와 같이 발현 유도물질의 최적 농도 및 최적 배양 시간을 결정한 결과, 0.125% 내지 0.2%의 아라비노즈를 배지에 첨가한 지 4시간 후에 수확할 때, 21kD 크기의 H₆NtLHS1 단백질이 대량으로 생산된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 3의 레인 2 참조).

<실시예 5> 재조합 단백질 H ₆ NtLHS1의 정제

재조합 단백질 H₆NtLHS1을 대량 제조하기 위해, 상기 실시예에서 제조한 대장균 균주 MC1061/NtLHS1의 배양액에 아라비노즈를 첨가하여NtLHS1유전자의 발현을 유도하고, 상기 배양액에서 세포를 수확하여 세포 용해액 (lysate)을 얻은 후, 황산암모늄 분별침강법, Ni²⁺친화 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피 등을 이용하여 정제하였다. 활성 분획을 선별하기 위해, 각 정제단계에서 얻은 분획으로 SDS-PAGE를 수행하였다.

구체적으로 본 발명의 대장균 균주 MC1061/NtLHS1을 20ℓ의 LB 배지에서 배양한 후, 배양액의 600nm OD 값이 0.3 내지 0.4에 도달하였을 때 아라비노즈를 0.125% 농도로 첨가하였다. 아라비노즈 첨가 후 4시간 째에 배양액을 6,000g로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 대장균을 수확하고, 수확한 세포를 200㎖의 재현탁 완충액 (20mM 트리스-염산, pH 8.0, 2.8mM 베타-머캅토에탄올)에 재현탁시켰다. 재현탁한 상기 완충액에 용해 완충액 (20mM 트리스-염산, pH 8.0, 2.8mM 베타-머캅토에탄올, 1.2㎎/㎖ 라이소자임)을 첨가하여 37℃에서 3 분간 방치하였다. 이를 다시 얼음 위로 옮겨 30 분간 방치하고 액체질소로 얼린 후 얼음 위에서 천천히 녹이면서 세포를 파쇄시켰다. 세포가 완전히 녹은 후 4℃에서 35,000g로 30분간 원심분리하여 상층액을 취하여 수용성 분획을 얻었다. 상기 분획에 황산암모늄을 0.38g/㎖의 최종농도로 30분간 천천히 첨가한 후 4℃에서 35,000g로 30분간 원심분리하여 단백질을 분획하였다. 분획된 단백질은 100mM KCl가 첨가된 완충액 A (25mM 트리스-염산, pH 8.0, 10% 글리세롤, 2.8mM 베타-머캅토에탄올)에 녹인 후 염기를 제거하기 위해 100mM KCl가 첨가된 완충액 A에서 4 내지 5시간 동안 투석을 하였고 액체질소에 얼려 -70℃에 보관하였다.

상기 단백질 분획을 정제하기 위해, Ni²⁺친화 크로마토그래피를 수행하였다. Ni²⁺친화 컬럼은 킬레이팅 세파로즈 레진 (chelating sepharose fast flow resin, Pharmacia, 스웨덴)을 충진하여 만들었으며, 컬럼의 2배 부피의 0.1 M NiCl₂를 통과시킴으로써 컬럼에 Ni²⁺이온을 붙이고 100mM KCl을 포함하는 완충액 A로 평형을 이룬 후 단백질 시료를 가하였다. 그리고 20mM 이미다졸 (imidazole)이 첨가된 100mM KCl 완충액 A를 컬럼의 5배 부피만큼 가하여 H₆NtLHS1이 포함된 분획을 용출시켰다. Ni²⁺친화 크로마토그래피 이후 SDS-PAGE를 통해 결정된 단백질의 순도는 약 60 내지 70%에 달하였다.

상기 친화 크로마토그래피의 분획을 더 정제하기 위해 젤 여과 크로마토그래피 (gel filtration chromatography)를 수행하였다. 100mM KCl 완충액 A로 평형을 이룬 세파크릴 S400 컬럼 (Sephacryl S400 column, 1.6×70 cm, Pharmacia, 스웨덴)에 Ni²⁺친화 크로마토그래피의 분획을 가하였다. 전개속도는 분당 0.26㎖로 하여 150㎖의 같은 완충액으로 용출하였으며 각 분획의 크기는 2㎖이 되도록 하였다. 이와 같이 젤 여과 크로마토그래피를 수행한 이후 단백질의 순도는 약 95% 이상 순수 분리됨을 확인할 수 있었다 (도 3참조).

또한 최종 정제된 NtLHS1 단백질의 수율을 측정한 결과, 대장균 배양액 L당 1.5㎎의 NtLHS1을 얻을 수 있음이 확인되었다.

한편, NtLHS1의 용해도를 알아보기 위해 상기 세포 용해액을 35,000g로 30분간 원심분리하여 수용성 분획과 비수용성 분획으로 나누어서 SDS-PAGE 상으로 확인한 결과, NtLHS1은 각각의 분획에서 유사한 비율로 나타났다.

<실시예 6> NtLHS1 단백질에 대한 폴리클로날 항체 제조

NtLHS1을 인지할 수 있는 폴리클로날 항체를 제조하기 위하여, Ni²⁺친화 크로마토그래피를 통해 용출하여 얻은 분획으로 SDS-PAGE를 수행한 후, H₆NtLHS1에 해당하는 젤의 부위를 자른 다음 전기용출법 (electroelution)을 통하여 얻은 단백질을 항원으로 이용하여 토끼를 면역화시켰다.

구체적으로, 상기 전기용출법은 젤을 마쇄한 후 전기영동 완충액 (25mM 트리스, 192mM 글라이신, 0.1% SDS)이 채워진 전기영동 농축기 (electrophoretic concentrator, ISCO, 미국)에 모았다. 그리고 100V로 1시간 동안 전기영동하고 N₆NtLHS1 단백질을 분리하여 농축시켰다.

처음에는 항원 100㎍을 같은 부피의 프로인트 완전 보조제 (Freund's complete adjuvant)와 섞은 후 흰색 토끼 (원산사, 한국)에 주사하였으며, 이후로는 3주 간격으로 항원 100㎍을 같은 부피의 불완전 보조제 (incomplete adjuvant)와 섞어서 3회 더 주사하였고, 마지막으로 주사한 지 5일 후 대정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 상온에서 30 분간 방치한 후 4℃에서 10시간 다시 방치하고, 4℃에서 5,500g로 15 분간 원심분리하여 상층액인 혈청을 취하여 폴리클로날 항체로 이용하였다 (Harlow와 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 미국, 1988).

<실시예 7> NtLHS1의 웨스턴 블럿 분석

NtLHS1의 단백질 블럿 분석은 화학발광법 (chemiluminescence)을 이용한 ECL 웨스턴 블럿 키트 (Amersham, 미국)를 사용하였으며, 상세한 방법은 상기 키트의 제조업체 지시에 따랐다.

구체적으로, 전기영동 후 단백질 블럿을 수행할 젤은 염색하지 않고 세퍼레이팅 젤 부분만을 떼내어 니트로셀룰로즈 막으로 단백질을 전이시켰다. 단백질 전이는 미니트랜스 블럿 전기영동 전이기 (Minitrans-blot electrophoretic transfer cell: Bio-Rad, 미국)를 이용하였으며, 4℃가 유지되는 저온실에서 전이 완충액(0.05% SDS, 25mM 트리스-염산, 192mM 글라이신)을 자석교반기로 섞어주면서 90 V로 1시간 동안 수행하였다. 단백질 전이가 끝난 니트로셀룰로즈 막은 5% 탈지유가 포함된 TBS 용액 (10mM 트리스-염산, 150mM 염화나트륨, pH 7.5)에 담궈 로터 (Hoefer사, 미국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 흔들어 주었다. TBS에 0.1% Tween 20이 첨가된 TBS-T 용액으로 30 분간 세척한 뒤, NtLHS1에 대한 폴리클로날 항체를 TBS-T 용액에 1000배로 희석시켜 제조한 용액을 니트로셀룰로즈 막의 단위면적 (㎠) 당 0.1㎖의 비율로 넣어서 막과 함께 상온에서 로터로 1시간 동안 흔들어주면서 반응시켰다. 폴리클로날 항체와 반응 후 막을 상온에서 15분 간격으로 2회, 다시 10분 간격으로 2회에 걸쳐 TBS-T 용액으로 세척하였다. 2차항체를 TBS-T 용액에 3000배로 희석하여 세척된 막과 함께 상온에서 로터로 1시간 동안 흔들어주면서 반응시킨 후, TBS-T 용액으로 15분 간격으로 2회, 다시 10분 간격으로 4회에 걸쳐 세척하고, ECL 검출시약 1과 2를 동일한 비율로 섞은 것을 니트로셀룰로즈 막 cm²당 0.125㎖ 씩 사용하여 막과 1분 동안 반응시킨 후 상온에서 엑스선 필름에 15초 동안 감광시켰다.

상기와 같이 정제한 단백질로 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과,히스티딘이 표지된 NtLHS1 단백질이 순수분리되었음을 확인할 수 있었다 (도 4참조).

<실시예 8> NtLHS1에 의한 대장균 단백질의 내열안정성 분석

본 발명의 고온내성 단백질 NtLHS1이 대장균 단백질의 고온내성을 증가시킬 수 있는지 확인하기 위해, 대장균의 배양액으로부터 무세포 추출액 (cell-free extract)을 획득하고 이에 정제된 NtLHS1을 첨가하거나 첨가하지 않고 고온 처리한 다음, 처리된 무세포 추출액으로 SDS-PAGE를 수행하여 대장균의 수용성 단백질이 어느정도 변성되었는지 확인하였다.

구체적으로, 대장균의 무세포 추출액을 상기 실시예 5의 방법대로 제조한 다음, 단백질의 농도가 3㎎/㎖이 되도록 희석하였다. 희석된 대장균의 무세포 추출액에 정제된 NtLHS1 단백질을 대장균 총 단백질 1㎎ 당 20㎍ 첨가하고 30℃ 내지 100℃의 온도에서 20분간 배양하였다. 배양이 끝난 무세포 추출액을 15,000g로 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 15% SDS-PAGE를 수행하였다.

그 결과 NtLHS1이 첨가되지 않은 무세포 추출액의 경우 50℃의 고온 처리 시부터 단백질들의 용해도가 급격히 감소하는 반면, NtLHS1이 첨가된 경우 90℃의 고온에서도 단백질의 용해도에 별다른 차이가 관찰되지 않았다 (도 5참조). 즉, NtLHS1 단백질은 대장균의 총단백질을 고온 조건에서 보호하는 시험관내 (in vitro) 기능을 보유하고 있음을 확인하였다.

<실시예 9> 고온 처리된 대장균의 생존률 분석

실시예 3에서 제조한 대장균 균주 MC1061/NtLHS1처럼 NtLHS1을 고발현하는 세포가 고온내성 형질을 획득하였는지 확인하기 위해, 상기 균주의 고온 처리 후 생존률을 조사하였다.

구체적으로, 본 발명의 발현벡터 pBADNH/NtLHS1으로 형질전환된 대장균 균주 MC1061/NtLHS1 및 출발벡터 pBADNH로 형질전환된 대장균 균주 (대조구)를 각각 로그기 (log phase)까지 배양한 다음, 배양액에 0.125% (w/v) 아라비노즈를 첨가하고 2시간 더 배양하였다. 그리고 각각의 대장균 배양을 50℃ 조건에서 8시간까지 액체배양하여 고온처리하였다. 고온처리된 대장균 배양액의 소량을 취하여 암피실린이 함유된 LB 고체배지에 도말하고 37℃에서 배양하였으며 (Sambrook 등, Molecular Cloning, 1989), 고체배지 상에 형성된 콜로니 수를 세어 대장균의 생존률을 비교 분석하였다.

그 결과, 50℃에서 두 시간의 고온처리를 하였을 때, 출발벡터인 pBADNH로 형질전환된 대장균 균주의 경우 0.4% 미만의 생존률을 보였으나, NtLHS1을 생성하는 대장균 균주의 경우 30% 이상의 생존률을 나타내었다. 50℃ 고온처리 8시간 후에는 NtLHS1를 가지고 있는 대장균의 생존률이 pBADNH를 가지고 있는 대장균의 경우에 비해 3,000배 이상 높았다 (도 6참조). 따라서, 본 발명의 고온내성 단백질 NtLHS1는 생체내 (in vivo) 고온내성 기능을 가지고 있음이 확인되었다.

본 발명의 고온내성 유전자NtLHS1를 고발현하는 대장균 균주는 고온에서도 생존률이 높고, 상기 유전자에 의해서 코딩되는 단백질 NtLHS1은 고온에서 시험관내 단백질 변성을 억제하므로,NtLHS1유전자는 대장균, 효모 등 산업적으로 유용한 미생물의 형질전환 등에 사용될 수 있으며, NtLHS1 단백질은 고온이 필요한 효소 반응 등에서 반응액 속의 단백질 변성 방지 등에 유용하다.

Claims (14)

1. 서열번호 1로 기재되는 담배 (Nicotiana tabacum)의 고온내성 유전자NtLHS1.
2. 제 1항의 유전자NtLHS1를 포함하고도 1에 기재된 제한지도를 갖는 벡터 pGEM-T-Easy/NtLHS1.
3. 제 2항의 벡터 pBADNH/NtLHS1를 포함하는 대장균 균주 DH5α/NtLHS1 (수탁번호: KCTC 0650BP).
4. 제 1항의 유전자NtLHS1를 포함하고도 2에 기재된 제한지도를 갖는 발현벡터 pBADNH/NtLHS1.
5. 제 1항의 유전자NtLHS1를 포함한 발현벡터를 포함하는 대장균 균주.
6. 제 5항에 있어서, 발현벡터가 pBADNH/NtLHS1인 것을 특징으로 하는 대장균 균주 MC1061/NtLHS1.
7. 제 1항의 유전자NtLHS1에 의해 코딩되고서열번호 2에 의해 기재되는 아미노산 서열을 갖는 고온내성 단백질 NtLHS1 또는 95% 이상의 아미노산 서열 상동성을 보이고 상기 NtLHS1과 동일한 활성을 갖는 변이형 단백질.
8. 1) 제 5항의 대장균 균주를 배양한 후 발현유도물질을 첨가하여NtLHS1유전자의 발현을 유도하는 단계;

   2) 상기 배양액에서 세포를 수확하여 세포 용해액 (lysate)을 얻는 단계; 및

   3) 크로마토그래피를 이용하여 상기 세포 용해액을 정제하는 단계

   를 포함하는 제 7항의 단백질 NtLHS1 또는 그 변이형 단백질의 제조 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 대장균 균주는 제 4항의 균주 MC1061/NtLHS1이고, 상기 발현유도물질은 0.05 내지 0.3% (w/v)의 최종농도로 배양액에 첨가되는 아라비노즈이고, 상기 수확은 아라비노즈를 배양액에 첨가한 지 4시간 후에 수행하고, 상기 크로마토그래피는 Ni²⁺친화 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 제 5항의 단백질 NtLHS1 또는 그 변이형 단백질의 제조 방법.
10. 제 1항의 유전자NtLHS1또는 제 7항의 단백질 NtLHS1의 변이형 단백질을 코딩하는 유전자를 진핵세포 또는 원핵세포에 도입하는 것으로 구성되는 고온내성을 가진 세포의 제조 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 진핵세포는 효모인 것을 특징으로 하는 고온내성을 가진 세포의 제조 방법.
12. 제 10항에 있어서, 상기 원핵세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 고온내성을 가진 세포의 제조 방법.
13. 변성을 방지하고자 하는 단백질을 포함하는 계에 제 7항의 단백질 NtLHS1 또는 그 변이형 단백질을 첨가하는 것으로 구성되는 단백질의 고온변성 방지 방법.
14. 제 1항의 유전자NtLHS1에 대한 안티센스 RNA 또는 제 7항의 단백질 NtLHS1의 변이형 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 유전자를 진핵세포 또는 원핵세포에 도입하는 것으로 구성되는 세포의 고온내성 억제 방법.