KR100343943B1

KR100343943B1 - 인간b형간염치료제로서의프테리딘유도체

Info

Publication number: KR100343943B1
Application number: KR1019970032177A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 김종우; 허용; 박상진; 임경묵
Original assignee: 동화약품공업주식회사
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1997-07-11
Publication date: 2002-11-16
Also published as: KR19990009690A

Abstract

본 발명은 인간의 B형 간염을 치료하기 위해서 HBV 중합효소 저해역가를 가진 미생물인 스트렙토마이세스 DWJJ 839(Streptomyces sp. DWJJ 839)를 분리하여 시험관내(in vitro) 실험을 통해 HBV 중합효소 저해 역가를 측정한후 이 균주를 발효조를 이용하여 대량 배양하여 배양액을 용매추출과 칼럼크로마토그래피 과정을 거쳐 HBV 저해역가를 가진 물질만을 분리 정제하여 제제화하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 공지물질이지만 간염치료제로서의 용도가 알려진 바가 없던 프테리딘 유도체가 인간 B형 간염 치료제로서의 용도를 제공하는 특징을 가진다.

Description

인간 B형 간염 치료제로서의 프테리딘 유도체{Pteridine derivatives as a materials for medical treatment of infectious hepatitis B.}

본 발명은 토양에서 순수한 형태로 분리한 스트렙토마이세스 DWJJ 839 균주 (Streptomyces sp. DWJJ 839)로부터 획득되는 프테리딘 유도체 및 이를 함유하는 인간 B형 간염 치료제로서의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 인간 B형 간염 바이러스(HBV)의 중합효소 억제제로서의 용도에 관한 것이다.프테리딘 유도체는 하기 일반식(I)으로 표시된다.

상기 식에서 R¹, R²는 각각 수소이거나 C_1-4의 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기이거나 또한 R¹과 R²는 서로 결합하여 벤젠환을 형성할 수 있다(이때 벤젠환은

이고, 여기서 R⁵, R⁶은 각각 수소이거나 C_1-4의 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기이며 이 경우 A-B와 C-D는 단일 결합이다). X¹과 X²는 서로 동일하고 질소원자 또는 탄소원자를 나타내며 A, C는 탄소원자 B, D는 질소원자이다. 그리고 A-B와 C-D는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며 이에 따라 R³, R⁴는 이중결합 또는 단일결합으로서 산소원자, 황원자 또는 질소원자 이거나 OH, SH, NH₂또는 C_1~3의 저급알킬기 또는 저급 알콕시기를 나타낸다.

한편, 종래에도 프테리딘 유도체에 해당되는 루미크롬이 비타민 B₂결핍증치료제로 알려져 왔으나 최근에는 일본공개특허 평 6-279445호에 암전이 억제제로서의 용도가 알려지고 또 국제특허공개 WO 95-11028호에는 항 HIV제로서의 용도가 공지되어 있다. 그러나 본 발명의 프테리딘 유도체는 아직 B형 간염치료제로서의 용도에 대하여는 알려진 바가 없다. 따라서, 본 발명의 인간 B형 간염치료제는 하기 일반식(Ⅰ-1)으로 표시되는 벤조프테리딘 유도체와 하기 일반식(Ⅰ-2), (Ⅰ-3) 또는 (Ⅰ-4)으로 표시되는 프테리딘 유도체나 퀴나졸린 유도체로 그룹화 할 수 있다.

상기 일반식 (Ⅰ-1)부터 (Ⅰ-4)까지에의 R⁵와 R⁶은 각각 수소이거나 탄소수 1~4의 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기이고, X¹, X²는 서로 동일하며 탄소원자 또는 질소원자를 나타내고, X³,X⁴는 각각 산소원자, 황원자 또는 질소원자를 나타내며 X³과 X⁴는 서로 같거나 다를 수 있다. X⁵, X⁶, X⁷은 각각 OH, SH, NH₂또는 탄소수 1~3의 저급 알킬기 혹은 저급 알콕시기이다.

상기 화합물중 본 발명에서 유용한 대표적인 화합물은 다음과 같다.

1. 7,8-디메틸벤조[g]프테리딘-2,4(1H, 3H)디온

2. 벤조[g]프테리딘-2,4(1H, 3H)디온

3. 2,4-프테리딘디올

4. 6,7-디메톡시-2,4(1H, 3H)퀴나졸린디올

5. 2-메르캅토-4(3H)-퀴나졸리논

6. 2-메틸-4(3H)-퀴나졸리논

7. 2-아미노-6,7-디메틸-4-히드록시프테리딘

인간 B형 간염 바이러스(HBV)는 전세계적으로 4억 정도의 인구가 감염되어 있는 간염의 주된 병원체로서, 사람에 침투하여 급성 또는 만성 간염을 일으킬 뿐만 아니라 간경화 또는 간암으로의 이행에도 관여하고 있다. 이처럼 B형 간염에 대한 치료의 필요성이 날로 높아감에도 불구하고 지금까지 인체에 안전한 주도적인 치료제가 거의 없었으며 이와 같은 중요성으로 HBV에 대해서는 간질환의 관련성 및 바이러스의 분자생물학적 특징에 관하여 많은 연구가 진행되어 왔다.

HBV의 복제 과정에는 HBV 중합효소가 중요한 역할을 하며 특히, 역전사효소 기능을 가지고 있으므로 HBV 중합효소의 억제를 통해 HBV의 복제를 억제하려는 연구가 진행되어 왔다. 지금까지 간염퇴치에 대한 연구는 대부분 백신의 개발에 주력하고 있는 상황이며 치료제로 개발되는 물질들은 크게 뉴클레오사이드유도체 (nucleoside analogue)와 비뉴클레오사이드계 물질로 나눌 수 있다. 기존의 간염치료제로 보고된 인터페론이나 뉴클레오사이드 유사체 등은 그 효과가 일시적이며, 장기간 치료시에는 중추신경과 말초신경계의 이상과 조혈세포 독성이 나타나는 등 심각한 부작용이 발생하는 것으로 알려지고 있어 비뉴클레오타이드계 물질에 대한 많은 연구가 요구되고 있었다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 인간 B형 간염치료제의 문제점을 해결하기 위해 안출한 것으로 재조합 중합효소 단백질을 이용한 시험관내(in vitro) HBV 중합효소 역전사(reverse transcriptase, RTase) 활성 측정법을 확립하고 HBV 중합효소에 대한 저해제를 선별함을 그 목적으로 한다.

본 발명의 또다른 목적은 국내의 토양에서 HBV 중합효소 저해 역가를 가진 미생물을 탐색하고 방선균 1종인 DWJJ 839를 분리, 동정하여 스트랩토마이세스 DWJJ 839 (Streptomyces sp. DWJJ 839)로 명명하고 시험관내 실험을 통해 HBV 중합효소 저해 역가를 측정 확인하는 것이다. 이 균주는 1997년 7월 7일자로 수탁번호 KFCC 10974로 사단법인 한국종균협회에 기탁되었다.

본 발명의 또다른 목적은 이 균주를 발효조를 이용하여 대량 배양한 후 그 배양액(culture broth)을 유기용매 추출과정과 여러 종류의 수지를 이용하여 칼럼크로마토그라피를 수행하고 HBV 중합효소 저해 역가를 가진 물질만을 분리 정제하여 인간 B형 간염치료제로서의 프테리딘 유도체를 제공하는데 있다.

이하 본 발명의 구체적 구성과 작용을 상세히 설명한다.

제1도는 본 발명 루미크롬의 HPLC 스펙트럼.

제2도는 본 발명 루미크롬의 IR 스펙트럼.

제3도는 본 발명 루미크롬의 EI-Mass 스펙트럼.

제4도는 본 발명 루미크롬의¹H NMR 스펙트럼.

제5도는 본 발명 루미크롬의¹³C NMR(DEPT) 스펙트럼.

본 발명은 토양으로부터 분리한 스트렙토마이세스 DWJJ 839(KFCC 10974) 균주의 포자현탁액을 배양하고 그 배양액을 용매 추출하여 프테리딘 유도체를 분리 정제한 다음 재조합 HBV 중합효소의 저해활성과 in vitro cell line assay를 이용한 상기 활성물질의 HBV 중합효소 저해활성을 검정하므로써 인간 B형 간염 치료제로서의 용도를 규명한 것이다.

본 발명의 구성과 작용을 첨부한 도면을 참고로 하여 설명하면 다음과 같다.

도 1은 본 발명 프테리딘 유도체의 HPLC 스펙트럼을 보인 것으로 스트렙토마이세스 DWJJ 839 균주 배양물로부터 용매 추출하여 프테리딘 유도체를 얻은 후 HPLC를 수행한 결과를 보인 것이다.

도 2는 본 발명 프테리딘 유도체의 IR 스펙트럼을 보인 것이며 도 3은 본 발명 프테리딘 유도체의 EI-Mass 스펙트럼을 도 4는 본 발명 프테리딘 유도체의¹H NMR 스펙트럼을 측정한 결과를 보인 것이다. 한편, 도 5는 본 발명 프테리딘 유도체의¹³C NMR과 DEPT 스펙트럼을 측정한 결과를 보이고 있다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 당업자가 용이하게 실시할 수 있도록 하기 실시예에 의거 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 기술적 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 스트렙토마이세스 DWJJ 839 균주로부터 루미크롬의 분리정제

토양으로부터 분리한 스트렙토마이세스 DWJJ 839 균주의 포자 현탁액을 GS배지(Glycerol 1%, Soytone 1%, NaCl 0.1%, MgSO₄0.005%)에 접종한 다음 발효조에서 교반 속도 200rpm, 통기량 1vvm, 배양온도 30℃로 배양하였다. 접종한 후 10-12시간 정도의 정체기(lag phase)를 지난 다음, 성장이 시작된 후, 40시간정도까지 성장이 지속되다가 48-50시간 이후 성장이 급격히 감소하여 이때, pH가 급격히 증가하므로 이를 측정하여 배양을 멈추고 배양액을 얻어내었다. 배양이 끝난 후, 얻어진 배양액(culture broth)을 100℃에서 10분간 열처리하고, 원심분리(5000 rpm, 10min)하여 상등액만 얻었다. 상등액을 농축한 다음 동일 부피의 부탄올로 3회 추출하여 색소를 제거한 다음 에틸아세테이트로 평형된 Silica gel(Merck) column(5×50cm)에 loading 시키고 동일 용매로 용출하여 활성분획만 모았다. 위의 활성분획을 다시 메탄올로 평형된 LH-20 컬럼(3 ×30cm)에 loading 하고, 동일용매를 이용하여 30㎖/h의 유속으로 용출하였다. 여기서 모아진 활성분획은 HPLC를 이용하여 순수 분리하였다. 칼럼으로는 Lichrosorb RP-18(20 ×250cm) 컬럼을 사용하였으며, 이동상으로는 50% 메탄올을 5㎖/min의 유속으로 하여 용출하였다. UV 210nm의 흡광도에서 retention time 40분의 활성 피크가 확인되었다(도 1 참조).

실시예 2: 분리 정제된 루미크롬의 구조분석

분리 정제된 본 발명 프테리딘 유도체는 연노란색 분말의 외형을 나타내며, 217, 260, 353nm에서 UV최대 흡수 피크를 나타내었다. IR 스펙트럼을 측정하여 밴드(band)를 관찰하고(도 2 참조), EI-MS 측정하여 분자량을 결정하였다(도 3 참조). 또, DMSO -d6를 용매로 하여¹H NMR을 측정하여 signal을 관찰하고¹³C NMR과 DEPT 측정하여 본 발명 프테리딘 유도체의 구조를 결정하였다(도 4, 도 5 참조). 이들¹H 과¹³C NMR분석결과 본 발명 화합물은 다수의 sp²quaternary carbon 및 몇개의 hetero 원소로 구성된 방향족 화합물임을 알 수 있었다. 따라서 보다 더 정확한 화합물의 구조를 결정하기 위하여 HMQC 및 HMBC 실험을 포함한 2차원 NMR 실험을 실시하였다. HMQC 실험결과 직결합한 수소, 산소의 결합관계가 밝혀졌으며, HMBC 실험결과 2.47, 2.49ppm의 methyl proton으로부터 각각 128.1, 137.9 및 125.8, 144.5ppm의 탄소에 7.71, 144.5ppm의 탄소에 long range coupling 이 관찰되어 1,2 번에 질소와 4,5 번에 메틸기가 치환된 4치환 벤젠이 부분구조로서 존재함을 추정할 수 있었다. 그러나, 본 발명 화합물은 다수의 질소 및 산소를 함유하여 상기의 NMR 방법에 의하여 전체 화학구조를 결정할 수 없었다. 따라서 이상의 물리화학적 특성 및 NMR 데이터에 근거한 부분구조를 이용하여 data base 검색을 실시한 결과 리보플라빈의 irradiation 산물인 루미크롬과 비교할 때 UV, IR 및 mass fragment pattern이 동일하고 또¹H 및¹³C NMR의 chemical shift 값이 일치하여 본 발명의 화합물을 루미크롬으로 동정하였다.

실시예 3. In vitro HBV 중합효소 RT assay를 이용한 일반식(Ⅰ-1)화합물의 HBV 중합효소 저해활성

Non-radioactive Reverse transcriptase assay Kit(Boehringer Mannheim)를 사용하여 시험관내 분석을 하였다. 여기에는 대장균으로부터 발현된 재조합 HBV 중합효소를 친화컬럼(affinity column)으로 분리 정제하여 사용하였다. 먼저 HBV 중합효소 20㎕을 streptavidine 으로 코팅된 well에 넣고 template/primer hybrid poly(A) ·oligo(dT)15와 DIG-(digoxigenin)-dUTP, biotin-dUTP, TTP가 포함된 반응혼합액 20㎕를 가한 다음 활성을 측정하고자 하는 본 발명 루미크롬(화합물 A)을 20㎕ 가하여 18-20시간 동안 20℃에서 반응시켰다. 본 발명 시료를 넣지 않은 것을 대조군으로 하여 활성을 비교하였다. 이때 HBV 중합효소의 작용에 의하여 DNA가 만들어지며 디그옥시게닌 (digoxigenin)과 바이오틴(biotin)이 입혀진(label) 뉴클레오티드가 함께 포함되므로 well의 바닥에 코팅되어 있는 streptavidine 과 결합하게 된다. 반응이 끝나면 남아있는 불순물 등을 제거하기 위하여 각 well당 250㎕의 세척 완충액(pH 7.0)을 가하여 30초간 5차례 씻어주고, anti-DIG-POD 항체를 200㎕씩 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 다시 불순물 제거를 위해 세척 완충액으로 씻어준 후, POD(peroxidase)의 기질(substrate)인 A B T S^ⓡ을 각각 200㎕씩 가하여 30분간 상온에서 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 HBV 중합효소의 활성과 저해정도를 정량화하였다. 그 결과는 다음 표 1과 같다.

실시예 4. 일반식(Ⅰ-2), (Ⅰ-3) 및 (Ⅰ-4)화합물의 In vitro에서의 HBV 중합효소 저해 활성

루미크롬과 구조적으로 유사성이 있는 물질들인 일반식 (Ⅰ-2), (Ⅰ-3) 및 (Ⅰ-4)화합물 등의 HBV 중합효소에 대한 저해활성을 조사하기 위하여 상기 실시예 3과 동일한 시험관내 분석 실험을 실시하였다. 그 결과 구조적인 유사성과 함께 HBV중합효소에 대한 저해 분석에서도 유사한 활성을 보였다. 그 결과는 다음 표 2와 같다.

실시예 5. In vitro cell line assay를 이용한 루미크롬의 HBV 중합효소 저해 활성

인간 B형 간염 바이러스를 생산하는 세포주인 HepG2. 2.15세포를 T25플라스크에서 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1%ABAM(GIBCO BRL. #15240-013), 최종농도 200mg/㎖이 되는 G418을 포함하는 DMEM배지에서 6일간 배양한 후 24well 마이크로 플레이트에 1.0-1.2×105cells/㎖/well 되게 희석, 분주하여 5% CO2 배양기에서 3시간 정도 배양하였다. 세포가 플레이트 바닥에 잘 붙은 것을 확인한 다음 각 시료를 최종농도 10μM에서 1nM로 1/10씩 희석하여 처리하였다. 이때 대조군으로는 3TC를 동일한 농도로 처리하였다.

실험예 1. 분비된(extracellular) HBV의 DNA 중합효소 저해 테스트

인간 B형 간염 바이러스를 생산, 분비하는 세포주에 저해 후보물질을 최종농도 10μM에서 1nM로 처리하고 1주일 동안 배양한 후, 배양액을 따로 취하여 바이러스 입자를 농축한 다음 5㎕를 취하였다. 여기에 각각 10μM의 dGTP, dCTP와 dATP를 포함한 중합효소 완충용액(50mM Tris-Cl(pH 7.4), 30mM NH4Cl, 20mM MgCl2, 0.55 Nonidet P-40, 0.3% 2-mercaptoethanol)과 1μCi의α-³²P-dTTP(3000Ci/mmol)를 혼합하여 37℃에서 120분간 반응시키고, 반응이 끝난 후 1% SDS와 0.2mg/㎖의 프로테이나아제(proteinase) K로 처리한 다음 포화된 페놀로 2회 추출하여 단백질을 제거하였다. 방사능은 DEAE-cellulose(DE-81) paper를 이용하거나, 반응용액을 Sephadex G-50 column에 통과시킨 후 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 측정한다. 측정된 방사능 양으로 HBV DNA 중합효소의 활성 저해 정도를 계산하였다.

실험예 2. HBV genomic DNA(intracellular)의 정량분석에 의한 저해활성 검정

인간 B형 간염 바이러스를 생산, 분비하는 세포주에 저해 후보물질을 최종 농도10μM에서 1nM로 처리하고 1주일 동안 배양한 후 이들 세포로부터 HBV DNA를 포함한 전체 DNA를 분리, 정제하였다. 분리 정제하는 과정은 먼저 배양세포에 트립신을 처리하여 바닥에서 분리시킨 다음 분리된 세포를 1.5㎖ 튜브에 옮겨서 3000rpm으로 원심 분리하였다. 상층액은 버리고 침전물을 Lysis buffer(10mM Tris-Ci, 1mM EDTA, 100mM NaCl, 1% SDS, 200㎍/㎖ Proteinase K)에 재분산한다음 56℃에서 2시간 배양하였다. 배양후 분해된 세포를 페놀/클로로포름에 혼합한 후 다시 원심 분리하여 상등액을 취한 후 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시킨 다음 침전된 DNA를 건조하여 TE buffer에 잘 녹였다. HBV 게놈의 특정부위를 증폭하여 처리된 저해제 후보물질의 B형 간염 바이러스 저해활성을 검정하였다. 분리 정제된 세포내 HBV DNA는 PCR방법으로 증폭하였다. 이와 같은 방법을 통해 얻어진 루미크롬의 In vitro cell line assay에서의 HBV 저해활성 결과는 표 3과 같다.

상기 실시예 4, 5에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 벤조프테리딘 유도체와 프테리딘, 퀴나졸린 유도체들은 HBV 중합효소에 대해 우수한 저해활성을 나타내므로 본 발명에 의한 약제는 간염의 치료제로서 사용될 수 있다.

실시예 6. 세포독성 실험

본 발명의 물질들이 나타내는 HBV 중합효소 저해효과가 세포성장 자체에 미치는 영향과 독성을 알아보기 위해 세포독성 시험을 하였다. 시험관내 방법을 사용하였으며 Hep G2 세포에 대한 독성을 조사한 결과는 표 4와 같다.

이와 같은 본 발명의 프테리딘 유도체들은 약제학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합하여 통상적인 제제 예컨대, 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제, 연고제, 크림제, 액체 등의 국소적용형 제제 등의 다양한 제제로서 B형 간염 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 상기 담체는 약제학적 분야에서 통상적인 것으로 예컨대, 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 있으며, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제, 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 있다. 이렇게 제조된 약제학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내 또는 국소적용할 수 있다. 또한 경구투여시에 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나, 정제 등의 경구투여용 고형제제를 장용피로 피복된 제제로 제형화하여 투여할 수도 있다. 본 발명 프테리딘 유도체의 인체에 대한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나 일반적으로 성인에게 1일에 10내지 1000mg, 바람직하게는 50내지 500mg의 양이 투여되도록 한다. 따라서 본 발명을 단위투여형으로 제조시에 각각의 단위투여형은 상기 언급된 유효용량 범위를 고려하여 본 발명 프테리딘 유도체를 10 내지 1000mg, 바람직하게는 50 내지 500mg을 함유하도록 제형화시킬수 있다. 이렇게 제형화된 단위투여형은 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정시간 간격으로 수회, 바람직하게는 1회 내지 6회 투여할 수 있다.

이상 실시예와 실험예에서 알 수 있듯이 본 발명은 스트렙토마이세스 DWJJ 839(기탁번호 KFCC 10974호)로부터 인간 B형 간염 virus 저해활성 물질로서 프테리딘 유도체를 제공하는 효과가 있다. 또한 프테리딘 유도체는 여러 분광학적 분석에 의해 구조 분석한 결과 공지물질인 루미크롬과 동일한 구조를 갖는 것으로 결정되었다. 한편, 본 발명은 루미크롬과 구조적 유사성을 갖는 벤조 프테리딘 유도체와 프테리딘, 퀴나졸린 유도체 등을 재조합 중합효소 단백질을 이용하고 시험관내(in vitro) HBV 중합효소 역전사 활성 측정방법을 통하여 HBV 중합효소 저해 역가를 가진 물질만을 분리 정제하고 활성을 측정하여 HBV 중합효소에 대한 고도의 저해활성을 갖는 공통적인 화합물로써 제공하는 효과가 있다.

본 발명 미생물유래의 벤조프테리딘 유도체와 프테리딘, 퀴나졸린 유도체들은 HBV 중합효소에 대해 우수한 저해활성을 나타내므로 약제학적 분야에서 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제등의 경구 투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조 분말 등의 형태인 주사용 제제, 연고제, 크림제, 액체 등의 국소적용형 제제 등 다양한 제제로서 인간 B형 간염치료제로 사용할 수 있는 효과가 있어 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

토양으로부터 분리한 스트렙토마이세스 DWJJ 839(기탁번호 KFCC 10974호)를 배양하는 단계; 상기 배양액을 열처리하고, 원심분리하여 상등액만을 분리하는 단계; 상기 상등액을 농축한 다음 동일 부피의 부탄올로 추출하는 단계; 상기 추출액을 컬럼크로마토그래피로 정제하는 단계; 그리고 HPLC로 순수 분리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 인간 B형 간염치료 활성이 있는 하기 화학식의 프테리딘 유도체 생산방법.

상기 식에서, R⁵, R⁶,는 CH₃, X¹, X²는 질소원자이고, X³, X⁴는 산소원자를 나타낸다.
약제학적으로 허용되는 담체와 함께 활성성분으로 하기 일반식(I)으로 표시되는 프테리딘 유도체 또는 그의 염을 함유하는 인간 B형 간염 치료제.

상기 식에서 R¹, R²는 각각 수소이거나 C_1~4의 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기이거나 또한 R¹과 R²를 포함한 벤젠환을 형성할 수 있다(이때 벤젠환은
이고, 여기서 R⁵, R⁶은 각각 수소이거나 C_1~4의 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기이며 이 경우 A-B와 C-D는 단일 결합이다). X¹과 X²는 서로 동일하며 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고 A, C는 탄소원자 B, D는 질소원자이다. A-B와 C-D는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며 이에 따라 R³, R⁴는 이중결합 또는 단일결합으로서 산소원자, 황원자 또는 질소원자 이거나 OH, SH, NH₂또는 C_1~3의 저급알킬기 또는 저급 알콕시기를 나타낸다.
제 2항에 있어서, 프테리딘 유도체가 하기 일반식(I-1)으로 표시되는 벤조프테리딘 유도체인 인간 B형 간염치료제.

상기 식에서, R⁵, R⁶, X¹, X²는 제 2항에서 정의된 바와 같고, X³, X⁴는 각각 산소원자, 황원자 또는 질소원자를 나타내며 서로 같거나 다를 수 있다.
제 2항에 있어서, 프테리딘 유도체가 하기 일반식(Ⅰ-2)으로 표시되는 인간B형 간염치료제.

상기 식에서, R⁵, R⁶, X¹, X², X³, X⁴는 제 2항 및 제 3항에서 정의된 바와 같다.
제 2항에 있어서, 프테리딘 유도체가 하기 일반식(Ⅰ-3)으로 표시되는 인간 B형 간염치료제.

상기 식에서 R⁵, R⁶, X¹, X³은 2항 언급한 내용과 같고 X⁵는 OH, SH, NH₂또는 탄소수 1~3의 저급 알킬기이거나 알콕시기이다.
제 2항에 있어서, 프테리딘 유도체가 하기 일반식(Ⅰ-4)으로 표시되는 인간 B형 간염치료제.

상기 식에서 R⁵, R⁶, X¹, X²는 제 2항에서 정의한 바와 같고 X⁶, X⁷은 OH, SH,NH₂또는 탄소수 1~3의 저급알킬기 이거나 저급알콕시기이다.