KR100343781B1 - Extraction and purification of chondroitin sulfates from rays - Google Patents
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Abstract
본 발명은 의약품, 화장품, 건강음료, 다이어트 식품, 노인용 건강식품 등 콘드로이틴황산을 이용하고자 하는 각종 분야에 가오리류로부터 콘드로이틴황산을 추출·정제하여 공급할 수 있게 하여 해양생물자원의 고도이용으로 국민건강의 증진 및 외국으로부터 전량 수입에 의존하고 있는 콘드로이틴황산의 수입대체 효과를 도모하고자 한 것으로,The present invention enables the extraction and purification of chondroitin sulfate from stingrays in various fields such as pharmaceuticals, cosmetics, health drinks, diet foods, health foods for the elderly, and the like, to provide and use of marine biological resources. It is intended to promote the import substitution effect of chondroitin sulfate, which relies on the promotion and total import from foreign countries,
본 발명은 가오리(동결 및 건조)를 마쇄한 분말에 증류수 또는 황산활성수(SO4 2-)를 약 2-10배 첨가하여 100-121℃(압력:1-1.5 kg/cm2)에서 2-4시간 가열하는 조작을 3-4회 반복하고 이로부터 생성된 액을 원심분리하고, 원심분리에 의하여 얻어진 상등액을 브릭스(brix) 3.0-10.0이 되도록 농축하거나, 가오리 마쇄분말을 가수분해하기 위하여 각종 단백질 분해효소 0.1-4.0％를 첨가하여 각 효소의 적정 pH를 조정하고, 최적온도에서 최적시간 가수분해한 재료를 원심분리하여 얻은 상등액을 브릭스(brix) 3.0-10.0이 되도록 농축한다. 이들 농축액에 에탄올을 3-4배량 가하여 24시간 방치하여 조다당류를 침전시키고 상기 침전된 조다당류를 동결건조하여 분쇄하고, 이것을 디이에이이-셀룰로오스(DEAE-Cellulose) 또는 도웨스(Dowex) 50(H+) 수지를 충진한 유리칼럼에 조다당류를 넣고, 염화나트륨(NaCl)용액으로 당이 검출되지 않을 때까지 용출시키고, 용출액은 분획하여 에탄올처리하는 가오리류로부터 정제된 콜드로이틴황산을 얻을 수 있도록 한 것에 그 특징이있다.The present invention adds about 2-10 times distilled water or sulfuric acid activated water (SO 4 2- ) to the ground powder of stingrays (freezing and drying), and then, at 100-121 ° C. (pressure: 1-1.5 kg / cm 2 ). Repeat the heating operation for 4 hours 3-4 times and centrifuge the resulting liquid, and concentrate the supernatant obtained by centrifugation to brix 3.0-10.0, or hydrolyze the stingray grinding powder. 0.1-4.0% of various proteolytic enzymes are added to adjust the appropriate pH of each enzyme, and the supernatant obtained by centrifuging the material hydrolyzed at the optimum temperature at the optimum temperature is concentrated to brix 3.0-10.0. 3-4 times the amount of ethanol was added to these concentrates, and the crude polysaccharides were precipitated for 24 hours. The precipitated crude polysaccharides were lyophilized and pulverized, followed by DEAE-Cellulose or Doex 50 ( H + ) Put the crude polysaccharides in a glass column filled with resin, eluting with sodium chloride (NaCl) solution until no sugar is detected, and the eluate is fractionated to obtain purified colloidin sulfate from stingrays treated with ethanol. There is one characteristic to that.
Description
본 발명은 의약품, 화장품, 건강음료, 다이어트식품, 노인용 건간식품 등 콘드로이틴황산을 이용하고자 하는 각종 분야에 가오리류로부터 콘드로이틴황산을 추출·정제하여 공급할 수 있도록 한 것이다.The present invention is to enable the extraction and purification of chondroitin sulfate from stingrays in various fields that want to use chondroitin sulfate, such as pharmaceuticals, cosmetics, health drinks, diet foods, dried foods for the elderly.
콘드로이틴황산을 이용한 산업분야에의 응용에 관한 기술은 미국, 유럽, 일본을 비롯한 세계 각국에서 다양한 기술을 개발해 놓고 있으며, 현재도 새로운 기술을 개발하기 위하여 많은 투자를 계속하고 있다. 특히, 콘드로이틴황산을 함유한 자원의 탐색은 1950년대부터 시작되어 지금까지 계속되어 오고 있으며, 최근에 일본을 중심으로 수산가공폐기물로부터 콘드로이틴황산을 얻으려는 시도가 이뤄지고 있다. 콘드로이틴황산의 가장 중요한 생리적 기능은 무코다당체를 구성하는 콜라겐과 함께 고분자 세포지지체를 구성하는 세포의 형태를 유지해 줌으로서 각 기관의 특징적인 구조를 형성하는 것이다. 최근 콘드로이틴황산의 생리적 기능성에 관한 많은 연구결과가 밝혀지고 있으며, 동물 및 임상실험을 거쳐 확인된 대표적인 기능을 살펴보면, 체내수분량의 조절기능, 뼈의 형성을 조장하는 기능, 관절의 원활한 운동을 도와주는 기능, 혈중지질을 개선시키는 기능, 혈관신생을 개선시키는 기능, 세포 출입 물질의 조절기능, 상처를 치료하는 기능, 세균의 감염을 방지하는 기능, 혈액응고를 억제하는 기능, 안구의 투명도를 유지하는 기능, 노화억제기능 등을 가지는 것으로 알려져 있다.The technology related to the application to the industrial field using chondroitin sulfate has developed a variety of technologies in the United States, Europe, Japan and other countries, and continues to invest a lot to develop new technologies. In particular, the search for resources containing chondroitin sulfate has been started since the 1950s and has continued until now, and recently, attempts have been made to obtain chondroitin sulfate from fish processing wastes, particularly in Japan. The most important physiological function of chondroitin sulfate is to form the characteristic structure of each organ by maintaining the morphology of cells constituting the polymer cell support together with collagen constituting mucopolysaccharide. Recently, many researches on the physiological function of chondroitin sulfate have been revealed, and the representative functions confirmed through animal and clinical experiments show that the function of controlling the amount of water in the body, promoting the formation of bones, and helping the smooth movement of the joints. Function, improve blood lipid, improve angiogenesis, regulate cell entry material, heal wound, prevent bacterial infection, inhibit blood coagulation, maintain eye transparency It is known to have a function, an anti-aging function, and the like.
콘드로이틴황산과 관련된 기술은 발명특허 공고번호 제97-57053호, 제97-009608호, 제97-010792호, 제96-000238호, 제96-040174호, 제95-024690호, 제95-700918호, 제90-018129호 등이 있으며, 이와 같은 콘드로이틴황산은 식품, 화장품, 의약품, 건강음료 등에 널리 이용되고 있고, 앞으로 노령화사회의 도래와 건강에 대한 관심의 고조로 그 용도는 더욱 넓어질 전망이다. 그러나 현재 의약품 및 건강식품용으로 이용되는 콘드로이틴황산은 상어지느러미와 해삼과 고급의 해양천연자원으로부터 추출되어 이용되고 있어 자원의 지속적인 공급과 생산가격의 상승이 예상된다. 그리고 해양생물자원으로부터 추출된 콘드로이틴황산만이 소비자로부터 높은 가격을 받을 수 있어 해양자원의 탐색에 심혈을 기울이고 있다. 그리고 척추동물의 늑골, 연골, 피부의 장점막, 소 점막 등으로부터 추출된 콘드로이틴황산은 화장품 원료를 비롯한 저순도를 요구하는 상품의 원료로 이용되고 있다.Techniques related to chondroitin sulfate are disclosed in Invention Patent Publication Nos. 97-57053, 97-009608, 97-010792, 96-000238, 96-040174, 95-024690, and 95-700918 No. 90-018129, etc., such chondroitin sulfate is widely used in foods, cosmetics, medicines, health drinks, etc., and its use is expected to expand further in the future due to the advent of an aging society and health concern. to be. However, chondroitin sulfate, which is currently used for pharmaceuticals and health foods, is extracted from shark fins, sea cucumbers, and high-quality marine natural resources, which is expected to continue to supply resources and raise production prices. And only Chondroitin Sulfate extracted from marine biological resources can receive high prices from consumers, so they are focusing on exploring marine resources. And chondroitin sulfate extracted from ribs, cartilage, skin mucosa, and bovine mucosa of vertebrates is used as a raw material for products requiring low purity, including cosmetic raw materials.
이에 본 발명에서는 상어지느러미, 해삼과 같은 고급의 천연자원을 이용하지 않고, 많은 양이 생, 냉동 및 건조품으로만 이용되고 있는 가오리류를 이용하여 적은 추출비용으로 고순도의 콘드로이틴황산을 추출·정제하여 이용할 수 있도록 한 것으로서,Therefore, the present invention extracts and purifies high-purity chondroitin sulfate with little extraction cost by using stingrays that are used only in raw, frozen and dried products, without using high-quality natural resources such as shark fin and sea cucumber. As it was available,
현재, 가오리의 수입가격은 톤당 ＄1,000이하가 될 것으로 여겨져 자원의 확보 및 산업적 효과 측면에서 저가의 콘드로이틴황산의 공급이 가능하여 전량 외국의 수입에 의존하고 있는 국내 콘드로이틴황산의 공급시장에 고품질을 공급함과 아울러 수출이 가능할 것으로 여겨진다.At present, stingray's import price is expected to be less than ＄ 1,000 per ton, so it is possible to supply low-cost Chondroitin Sulfate in terms of resources and industrial effects, thus supplying high quality to the domestic market of Chondroitin Sulfate, which is entirely dependent on foreign imports. In addition, exports are expected.
본 발명이 구성하는 가오리류로부터 콘드로이틴황산을 추출 및 정제하는 과정은 다음과 같다.The process of extracting and purifying chondroitin sulfate from the stingrays of the present invention is as follows.
실시예 1 : 가열온도에 따른 콘드로이틴황산의 함량Example 1 Content of Chondroitin Sulfate According to Heating Temperature
인간은 약 60조개의 세포로 이루어져 있으며, 이들 각각의 세포는 결합조직에 의하여 그 구조를 유지하고 있다. 결합조직은 세포, 섬유, 기질로 구성되어 있으며, 이 결합구조의 주성분의 하나는 기질에 함유되어 있는 무코다당이다. 무코다당은 인체에 존재하는 단백질과 결합된 형태로 있으며, 동물성 점짐물로 널리 알려져 있다. 이 무코다당의 대표적인 물질이 콘드로이틴황산이다. 무코다당은 산성 및 중성의 2종류가 존재하며, 콘드로이틴황산은 산성 무코다당에 속하며, 산성 무코다당은 강한 음전하로 하전되어 있다. 콘드로이틴황산은 정상적인 생체내에서는 유리상태로 존재하지 않고 단백질과 결합된 무코단백질 프로티오클리칸(proteoglycan)으로 존재하며, 단백질과 결합되어 있을 때 본래의 기능을 나타낸다. 이와같은 콘드로이틴황산을 추출하기 위해서는 강력하게 하전되어 있는 결합력을 끊어야 추출이 가능하므로 물리적 및 화학적 방법으로 콘드로이틴황산의 결합을 절단하여 추출하고자 하였다.Humans consist of about 60 trillion cells, each of which maintains its structure by connective tissue. The connective tissue is composed of cells, fibers, and matrix. One of the main components of the connective structure is mucopolysaccharide contained in the matrix. Mucopolysaccharide is in a form combined with proteins present in the human body, and is widely known as an animal deposit. The typical substance of this mucopolysaccharide is chondroitin sulfate. Mucopolysaccharide has two kinds of acid and neutral, chondroitin sulfate belongs to acidic mucopolysaccharide, and acidic mucopolysaccharide is charged with strong negative charge. Chondroitin sulfate does not exist in a free state in a normal body, but exists as a protein-free proteoglycan bound to a protein and exhibits its original function when bound to a protein. In order to extract such chondroitin sulfate, it is necessary to break the binding force, which is strongly charged, so that the extraction of the chondroitin sulfate was cut by physical and chemical methods.
조콘드로이틴황산의 추출 : 조콘드로이틴황산을 추출하기 위하여 냉동 및 건조 가오리를 사용하였다. 먼저, 가열온도에 따른 추출효율을 검토하기 위하여 재료를 잘게 마쇄한 후 함유된 지질을 제거하기 위하여 아세톤(acetone) 약 3배량을 가하여 하룻밤 실온에서 방치한 후 여과하는 방법을 3회 반복하여서 가오리에 함유된 지질을 완전히 제거하였다. 지질을 제거한 잔사에 황산이온을 다량 함유하고 있는 활성수(SO4 2-)를 시료량의 약 10배 첨가하여 105℃(압력:1.0 kg/cm2) 및 121℃(압력:1.5 kg/cm2)에서 2시간 가열하는 조작을 3-4회 반복하였다. 이로부터 생성된 액을 원심분리(3,000rpm, 20 min)하여 모으고, 이를 다시 24시간 동결건조시켜 분쇄하였다.Extraction of crude chondroitin sulfate: Frozen and dried stingrays were used to extract crude chondroitin sulfate. First, in order to examine the extraction efficiency according to the heating temperature, finely crush the material, and then add about three times the amount of acetone to remove the lipids, and leave it at room temperature overnight, and then filter it three times. The contained lipids were completely removed. Active water (SO 4 2- ) containing a large amount of sulfate ions was added to the residue from which lipids were removed, and about 10 times of the sample amount was added to 105 ° C (pressure: 1.0 kg / cm 2 ) and 121 ° C (pressure: 1.5 kg / cm 2). Heating for 2 hours was repeated 3-4 times. The resulting solution was collected by centrifugation (3,000 rpm, 20 min), which was again lyophilized and ground for 24 hours.
표 1 에 나타낸 바와 같이 105℃에서 2시간 가열한 시료로부터 추출한 조콘드로이틴황산의 수율 및 함량은 냉동시료에서 각각 10.8％ 및 16.9％, 건조시료에서 각각 10.7％ 및 16.3％였고, 121℃에서 가열한 시료로부터 추출한 조콘드로이틴황산의 수율 및 함량은 냉동시료에서 각각 12.0％ 및 17.3％, 건조시료에서 각각 11.9％ 및 17.6％였으나, 121℃에서 가열한 시료의 조콘드로이틴황산의 함량은 약간 높게 나타났으나 색깔이 옅은 갈색을 띠고 있어 최종제품으로 사용하는 데 어려움이 있을 것으로 여겨져 이후 105℃를 기준으로 하여 시료를 제조하였다.As shown in Table 1, the yield and content of the crude chondroitin sulfate extracted from the sample heated at 105 ° C. for 2 hours were 10.8% and 16.9% in the frozen sample and 10.7% and 16.3% in the dry sample, respectively, and were heated at 121 ° C. The yield and content of the crude chondroitin sulfate extracted from the sample were 12.0% and 17.3% in the frozen sample and 11.9% and 17.6% in the dry sample, respectively, but the content of the crude chondroitin sulfate in the sample heated at 121 ° C was slightly higher. It is light brown in color and is considered to be difficult to use as a final product. Thus, a sample was prepared based on 105 ° C.
실시예 2 : 추출용매의 종류에 따른 콘드로이틴황산의 함량Example 2 Content of Chondroitin Sulfate According to the Type of Extraction Solvent
가열에 의한 콘드로이틴황산의 추출은 열을 에너지원으로하여 결합을 절단하는 과정이므로 첨가하는 용매의 이온성에 따라 추출되는 콘드로이틴황산의 함량이 달라질 것으로 여겨져 두가지 종류의 용매를 사용하여 가오리로부터 콘드로이팅황산을 추출·농축하였다. 표 2 에 나타난 바와 같이 증류수를 사용하였을 때 콘드로이틴황산의 수율 및 함량은 냉동시료에서 각각 9.4％ 및 15.1％, 건조시료에서 각각 9.0％ 및 14.2％였고, SO4 2-함량이 높은 활성수를 사용하였을 때 콘드로이틴황산의 수율 및 함량은 냉동시료에서 각각 10.8％ 및 16.9％, 건조시료에서 각각 10.7％ 및 16.3％였으므로 수율과 함량이 높은 활성수를 사용하여 실험을 계속하였다.Extraction of chondroitin sulfate by heating is a process of cleaving bonds using heat as an energy source. Therefore, the content of chondroitin sulfate extracted is different according to the ionicity of the added solvent. Therefore, chondroitin sulfate from stingray using two solvents Was extracted and concentrated. When using distilled water as shown in Table 2 was the yield and content of chondroitin sulfate were 9.4% and 15.1% in the frozen sample, respectively, and 9.0% in the dry sample and 14.2%, SO 4 2- content using a high number of active When the yield and content of chondroitin sulfate were 10.8% and 16.9% in the frozen sample and 10.7% and 16.3% in the dry sample, respectively, the experiment was continued using the active water with high yield and content.
실시예 3 : 가열시간에 따른 콘드로이틴황산의 함량Example 3 Content of Chondroitin Sulfate According to Heating Time
재료로부터 콘드로이틴황산을 전부 추출하기 위해서는 장시간의 가열시간이 필요하지만 추출되는 효율과 추출경비를 고려해 볼 때 적절한 가열시간의 설정은 제조단가에 큰 영향을 미칠것으로 여겨져 가오리에 함유된 콘드로이틴황산을 충분히 추출하는데 소요되는 시간을 설정하기 위하여 실험한 결과를 표 3 에 나타내었다. 가열시간은 60분에서 240분으로 설정하고 60분간격으로 가열로 냉동시료에서 각각 5.6％ 및 14.8％, 건조시료에서 각각 5.4％ 및 14.2％의 콘드로이틴황산이 추출되어 효과적이지 못하였으나, 120분 가열에 의해서는 냉동시료에서 각각 10.7％ 및 16.3％가 추출되어 수율과 함량을 고려할 때 가장 적절한 것으로 나타났다. 그리고 가열시간의 증가에 따라 수율은 약간 증가하였지만 콘드로이틴황산의 함량에는 거의 변화가 없어 경제적인 면을 고려할 때 2시간 가열이 적절한 것으로 나타났다.It takes a long heating time to extract all Chondroitin Sulfate from the material, but considering the extraction efficiency and extraction cost, it is considered that setting proper heating time will greatly affect the manufacturing cost. Table 3 shows the results of the experiment to set the time required to complete the process. The heating time was set from 60 minutes to 240 minutes, and 5.6% and 14.8% of chondroitin sulfate, respectively, was extracted from the frozen sample by heating at 60 minute intervals and 5.4% and 14.2%, respectively. By 10.7% and 16.3% were extracted from the frozen samples, respectively, and appeared to be most appropriate when considering the yield and content. Yield slightly increased with increasing heating time, but the content of chondroitin sulfate was little changed.
실시예 4 : 추출용매의 첨가량에 따른 콘드로이틴황산의 함량Example 4 Content of Chondroitin Sulfate According to the Amount of Extraction Solvent
가오리로부터 콘드로이틴황산을 완전하게 추출하기 위해서는 추출용매의 종류와 함께 그 양이 매우 중요하다. 추출용매를 비중이 높은 물을 사용하기 때문에 추출 후 증발하는데 제조비용의 대부분이 소요된다고 하여도 과언이 아니다. 따라서 가장 효율적인 농축기술 및 방법은 이 기술의 핵심이되는 부분이다. 따라서 가장 효율이 높은 범위의 첨가량을 결정하기 위하여 2배-10배량의 활성수를 첨가하여 각각 콘드로이틴황산의 수율과 함량을 측정하여 표 4 에 나타내었다. 표 4 에서 나타난 바와같이 2배량의 활성수를 첨가하였을 때 콘드로이틴황산의 수율 및 함량은 냉동시료에서 각각 6.7％ 및 14.3％, 건조시료에서 각각 6.6％ 및 14.7％였고, 4배량의 활성수를 첨가하였을 때도 수율 및 함량은 증가하지 않았다. 그러나 6배량의 활성수를 첨가하여 추출한 결과 냉동시료에서 각각 10.5％ 및 16.6％, 건조시료에서 10.4％ 및 16.5％로 나타났다. 그리고 10배량의 활성수를 첨가하여 가열하였을때의 수율과 함량을 비교하였을 때 6배량을 첨가한 경우와 크게 차이가 없어 농축시간과 경비를 고려할 때 6배량 이상의 활성수를 첨가하여 가열하면 콘드로이틴황산을 충분히 추출할 수 있는 것으로 여겨진다.In order to completely extract chondroitin sulfate from the stingray, the amount is very important along with the type of extraction solvent. It is no exaggeration to say that since the extraction solvent uses water having a high specific gravity, most of the manufacturing cost is required to evaporate after extraction. The most efficient enrichment techniques and methods are therefore at the heart of this technique. Therefore, in order to determine the amount of addition of the most efficient range 2 to 10 times the amount of active water was added to measure the yield and content of chondroitin sulfate, respectively, are shown in Table 4. As shown in Table 4, the yield and content of chondroitin sulfate when the double amount of active water was added were 6.7% and 14.3% in the frozen sample and 6.6% and 14.7% in the dry sample, respectively, and four times the amount of active water was added. Even when the yield and content did not increase. However, extraction with the addition of 6 times the amount of active water showed 10.5% and 16.6% in frozen samples and 10.4% and 16.5% in dry samples, respectively. And when comparing the yield and content when heated with the addition of 10 times the amount of active water, there is no significant difference from the case of adding 6 times the amount of chondroitin sulfate It is believed that can be extracted sufficiently.
실시예 5 : 분자량 분별에 따른 콘드로이틴황산의 함량Example 5 Content of Chondroitin Sulfate According to Molecular Weight Classification
일반적으로 알려져 있는 콘드로이틴황산의 분자량은 약 50,000-200,000으로 밝혀져 있고, 이 획분을 물질이 생리적 기능을 갖는 것은 여러 실험을 통하여 알려져 있다. 이들의 분자구조를 밝히기 위하여 질량분석, NMR, 전기영동 등의 기기분석결과를 통하여 이들 화합물이 당의 3 또는 4번 위치에 황산이온을 가지고 있다는 것이 밝혀져 있다. 위의 실험예에서 본 것처럼 가오리로부터 콘드로이틴황산을 충분히 추출하기 위해서는 최소 6배량의 활성수를 가하여 2시간 이상 가열하여 추출해야 한다. 이렇게 추출된 조콘드로이틴황산의 함량을 증가시키고 농축효율을 증대시키기 위하여 분자량에 따른 분획을 통하여 농축경비를 줄여보고자 하였다. 이에분자량 크기가 각각 다른 여과막을 사용하여 분자량 30,000미만, 분자량 30,000-200,000, 분자량 200,000이상의 3가지 획분으로 분획하여 각각의 콘드로이틴황산의 수율과 함량을 측정하여 표 5 에 나타내었다. 표 5 에 나타난 바와 같이 분자량 30,000 이하의 시료로부터 추출한 조콘드로이틴황산의 수율 및 함량은 냉동 시료에서 각각 2.6％ 및 0.8％, 건조시료에서 각각 2.3％ 및 0.9％였고, 분자량30,000-200,000의 시료로부터추출한 조콘드로이틴황산의 수율 및 함량은 냉동시료에서 각각 8.9％ 및 14.2％, 건조시료에서 각각 8.7％ 및 13.9％였으며, 분자량 200,000 이상의 시료로부터 추출한 조콘드로이틴황산의 수율 및 함량은 냉동시료에서 각각 4.5％ 및 6.9％, 건조시료에서 각각 4.1％ 및 6.9％, 건조시료에서 각각 4.1％ 및 6.6％였다. 따라서 여과막을 사용하면 생리적 활성을 갖는 콘드로이틴황산의 효과적인 농축 및 정제가 가능한 것으로 나타났다.The molecular weight of commonly known chondroitin sulfate is found to be about 50,000-200,000, and it is known through various experiments that this fraction has a physiological function. In order to elucidate their molecular structure, mass spectrometry, NMR, electrophoresis, etc., revealed that these compounds have sulfate ions at positions 3 or 4 of the sugar. In order to sufficiently extract chondroitin sulfate from stingrays as seen in the above experimental example, at least 6 times the amount of active water should be added and heated for 2 hours or more. In order to increase the content of the extracted crude chondroitin sulfate and increase the concentration efficiency, we tried to reduce the concentration cost through the fraction according to the molecular weight. Thus, by using three different filtration membranes with different molecular weights, the fractions were divided into three fractions having a molecular weight of less than 30,000, a molecular weight of 30,000-200,000, and a molecular weight of 200,000 or more. As shown in Table 5, the yield and content of crude chondroitin sulfate extracted from a sample having a molecular weight of 30,000 or less were 2.6% and 0.8% in a frozen sample and 2.3% and 0.9% in a dry sample, respectively, and were extracted from a sample having a molecular weight of 30,000-200,000. The yield and content of crude chondroitin sulfate were 8.9% and 14.2% in frozen samples and 8.7% and 13.9% in dry samples, respectively. The yield and content of crude chondroitin sulfate extracted from samples with a molecular weight of 200,000 or higher were 4.5% and 6.9%, 4.1% and 6.9% in dry samples and 4.1% and 6.6% in dry samples, respectively. Therefore, the use of a filtration membrane has been shown to enable effective concentration and purification of physiologically active chondroitin sulfate.
실시예 6 : 침전용매의 종류에 따른 콘트로이틴황산의 함량Example 6 Content of Controtin Sulfate According to Precipitation Solvent
현재 콘드로이틴황산의 용도는 의약품, 화장품, 건강음료 등으로 이용되기 때문에 유기용매의 사용에 제한을 받게 된다. 그래서 콘드로이틴황산 품질규격에는 중금속 및 무기질의 허용치를 규정하여 품질검사를 철저히 실시하고 있다. 여러 가지 추출방법을 사용하여 가오리로부터 콘드로이틴황산을 추출하면 이를 침전시켜야 한다. 침전시 침전효율을 평가하나 가능한 효율이 좋으면서 규격에 맞는 용매를 사용하여 침전시키는 것이 좋다. 표 6 과 같은 용매를 사용하여 침전효율을 측정하였다. 가격이 싸면서 효율이 좋은 2종류의 알코올을 선정하여 침전수율 및 함량을 측정한 결과, 에탄올 80％를 사용한 경우 냉동시료에서 각각 10.8％ 및 16.9％, 건조시료에서 각각 10.7％ 및 16.3％, 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 80％를 사용한 경우 냉동시료에서 각각 11.3％ 및 16.6％, 건조시료에서 10.9％ 및 16.1％로 나타나 가격이 싸고 침전함량이 높은 알코올을 사용하는 것이 효과적인 것으로 나타났다.Currently, the use of chondroitin sulfate is limited to the use of organic solvents because it is used in medicine, cosmetics, health drinks, and the like. Therefore, the Chondroitin Sulfate Quality Standard specifies the allowable values for heavy metals and minerals, and conducts quality inspections thoroughly. Extraction of chondroitin sulfate from stingrays using various extraction methods should precipitate. The precipitation efficiency is evaluated during the precipitation, but it is better to precipitate with a solvent that meets the standard while the efficiency is as good as possible. Precipitation efficiency was measured using the solvent shown in Table 6. Precipitating yield and content were measured by selecting two types of low-cost and highly efficient alcohols. When 80% of ethanol was used, 10.8% and 16.9% in frozen samples and 10.7% and 16.3% in dry samples, respectively, When 80% propyl alcohol (isopropyl alcohol) was used, 11.3% and 16.6% in frozen samples and 10.9% and 16.1% in dry samples, respectively, were found to be effective to use low-cost and high-precipitation alcohols.
실시예 7 :효소처리에 따른 콘드로이틴황산의 함량Example 7 Content of Chondroitin Sulfate by Enzyme Treatment
수산동물의 콘드로이틴황산은 단백질과 결합된 상태로 존재한다. 그러므로, 콘드로이틴황산 소재를 제조하기 위해서는 단백질의 효율적인 가수분재가 필요하다. 따라서 각종 소화효소 및 단백질 분해효소를 이용하여 원료를 가수분해하고 가수분해물의 수율과 콘드로이틴황산을 측정함으로써 효소 가수분해에 적합한 최적 효소농도, pH, 반응시간 등을 선정하고자 하였다. 가오리류로부터 추출 효율을 높이기 위하여 단백질 분해효소인 플레이버자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex) 1.5MG, 뉴트라스(Neutrase), 믹쳐스(Mixture)-2000, 알칼라스(Alcalase) 0.6L 등의 효소를 사용하여 가수분해시켰다. 가오리 마쇄분말을 가수분해하기 위하여 아세톤(acetone)액 3배량을 가하여 하룻밤 실온에서 방치한 후 여과하는 방법을 3회 반복하여 가오리에 함유된 지질을 완전히 제거하였다. 위의 단백질 분해효소를 약 2.0％ 첨가하고 각 효소이 pH를 플레이버자임(Flavourzyme), pH 6.5, 45℃; 프로타멕스(Protamex) 1.5MG, pH 5.5, 40℃ ; 뉴트라스(Neutrase), pH 6.5, 40℃; 믹쳐스(Mixture)-2000, pH 7.0, 50℃; 알칼라스(Alcalase) 0.6L, pH 7.0, 60℃로 조정하여 각각 24시간 가수분해한 후 각 분해 물의 콘드로이틴황산 수율 및 함량을 측정한 결과를 표 7에 나타내었다. 표 7에서 나타난 바와같이 최적온도에서 최적시간 가수분해한 재료를 원심분리하여 얻은 상동액을 브릭스(brix) 3.0-10.0이 되도록 농축한 다음 이들 농축액에 에탄올을 3-4배량 가하여 24시간 실온에서 방치한 후 조콘드로이틴황산을 침전·세정시켰다. 상기 침전된 조콘드로이틴황산을 원심분리(3,000rpm, 20min)하여 모으고, 이를 다시 24시간 동결건조 시켜 분쇄하였다. 그 결과 콘드로이틴황산의 수율 및 함량은 냉동시료에서 플레이버자임(Flavourzyme) 처리구가 각 11.2％ 및 8.8％, 뉴트라스(Neutrase) 처리구가 각각 13.1％ 및 6.9％, 프로타멕스(Protamex) 1.5MG 처리구가 각각 15.3％ 및 9.1％, 믹쳐스(Mixture)-2000 처리구가 각각 15.6％ 및 5.8％ , 알칼라스(Alcalase) 0.6L 처리구가 각각 21.3％ 및 17.1％였고, 건조시료에서 플레이버자임(Flavourzyme) 처리구가 각각 12.7％ 및 8.9％, 뉴트라스(Neutrase) 처리구가 각각 14.3％ 및 6.5％, 프로타멕스(Protamex) 1.5MG 처리구가 각각 16.0％ 및 9.2％, 믹쳐스(Mixture)-2000 처리구가 각각 15.9％ 및 6.1％ , 알칼라스(Alcalase) 0.6L 처리구가 각각 22.6％ 및 17.8％였다. 이로 미루어 효소중 가격이 싸고 수율 및 함량이 높은 알칼라스(Alcalase) 0.6L이 가장 적절한 효소인 것으로 나타났다.Chondroitin sulfate in aquatic animals exists in a state bound to protein. Therefore, in order to prepare chondroitin sulfate material, efficient hydrolysis of proteins is required. Therefore, we tried to select the optimum enzyme concentration, pH, reaction time, etc., suitable for enzymatic hydrolysis by hydrolyzing the raw materials using various digestive enzymes and proteolytic enzymes, and measuring the yield of hydrolyzate and chondroitin sulfate. In order to improve the extraction efficiency from stingrays, Flavorzyme, Protamex 1.5MG, Neutrase, Mixture-2000, Alcalase 0.6L, etc. Hydrolysis was done using enzymes. To hydrolyze the stingray ground powder, three times the amount of acetone solution was added, and the mixture was left at room temperature overnight, followed by filtration three times to completely remove the lipid contained in the stingray. About 2.0% of the above protease was added, and each enzyme had a pH of Flavorzyme, pH 6.5, 45 ° C .; Protamex 1.5MG, pH 5.5, 40 ° C; Neutrase, pH 6.5, 40 ° C .; Mixers-2000, pH 7.0, 50 ° C .; Alcalase 0.6L, pH 7.0, and adjusted to pH 7.0, 60 ℃ after 24 hours of hydrolysis respectively, the results of the chondroitin sulfate yield and the content of each decomposition was measured in Table 7 are shown. As shown in Table 7, the homogenate obtained by centrifuging the material hydrolyzed at the optimum temperature at the optimum temperature was concentrated to brix 3.0-10.0, and 3-4 times the amount of ethanol was added to these concentrates, and the mixture was left at room temperature for 24 hours. The crude chondroitin sulfate was then precipitated and washed. The precipitated crude chondroitin sulfate was collected by centrifugation (3,000 rpm, 20 min), which was lyophilized for 24 hours and then ground. As a result, the yield and content of chondroitin sulfate were 11.2% and 8.8%, respectively, in Flavorzyme treatment, 13.1% and 6.9% in Neutrase treatment, and Protamex 1.5MG treatment in frozen samples. 15.3% and 9.1%, 15.6% and 5.8% Mixture-2000 and 21.3% Alcalase 0.6L treatment, respectively, and 21.3% and 17.1% respectively, and the Flavorzyme treatment in the dry sample 12.7% and 8.9% respectively, Neutrase treated 14.3% and 6.5% respectively, Protamex 1.5MG treated 16.0% and 9.2% respectively, and Mix-2000 treated 15.9% respectively And 6.1% of the Alcalase 0.6L treatment groups were 22.6% and 17.8%, respectively. In conclusion, Alcalase 0.6L, which is low in cost, high in yield, and high in content, was the most suitable enzyme.
실시예 8 : 조콘드로이틴황산의 정제Example 8 Purification of Zochondroitin Sulfate
콘드로이틴황산의 정제는 20mM 인산완충액(pH 70.)으로 평형화시킨 DEAE-셀룰로오스(Cellulose)나 도웩스(Dowex) 50(H)를 충진한 컬럼 (Φ3.5 x 25cm)에 조콘드로이틴황산을 넣고 NaCI이 함유된 완충용액을 1.5M까지 직선적으로 증가시키면서 당이 검출되지 않을 때까지 용출시켰다. 용출액을 분획기로 6ml씩 모은 후 전당 및 황산기의 함량을 측정하면서 순도를 측정하여 표 8 에 수율과 함량을 나타내었다. 냉동시료에서 DEAE-셀룰로오스(Cellulose) 수지를 사용하면 각각 1.9％ 및 88.7％, 도웩스(Dowex) 50 수지를 사용하면 각각 2.0％ 및 90.1％였고, 건조시료에서 DEAE-셀룰로오스(Cellulose) 수지를 사용하면 각각 1.8％ 및 89.1％, 도웩스(Dowex) 50 수지를 사용하면 각각 2.1％ 및 89.6％로 나타났다. 따라서 정제과정을 거치면 고순도의 콘드로이틴황산을 얻을 수 있다.Purification of Chondroitin Sulfate was performed by adding Chochondroit Sulfate to a column (Φ3.5 x 25 cm) filled with DEAE-Cellulose or Dowex 50 (H) equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 70.). The containing buffer solution was eluted until no sugar was detected while increasing linearly to 1.5 M. 6 ml each of the eluate was collected with a fractionator, and the purity and the content of the starch and sulfate groups were measured. In frozen samples, DEAE-Cellulose resins were 1.9% and 88.7%, respectively, and Doexx 50 resins were 2.0% and 90.1%, respectively, and DEAE-Cellulose resins were used in dry samples. The lower surface was 1.8% and 89.1%, and Doexx 50 resin was 2.1% and 89.6%, respectively. Therefore, high purity chondroitin sulfate can be obtained through the purification process.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 가오리류로부터 콘드로이틴황산을 추출하는 방법을 제시함으로서 냉동 및 건조되어 식용으로만 사용되던 자원을 산업적으로 부가가치가 높은 의약품, 화장품, 건강음료, 다이어트 식품의 원료로 이용할 수 있게 하는 것으로서 각종 콘드로이틴황산의 이용분야에 경제적 이익과 기술의 발전을 가져올 수 있는 우수한 발명이다.As described above, the present invention provides a method of extracting chondroitin sulfate from a stingray, thereby making it possible to use resources that were used only for food as a raw material for high value-added medicines, cosmetics, health drinks, and diet foods. It is an excellent invention that can bring economic benefits and development of technology to the field of use of various chondroitin sulfate.
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