KR100343619B1 - Oligonucleotide for detection and identification of mycobacteria - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마이코박테리아 균종의 동정 및 감별 진단에 사용할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브(probe)에 관한 것으로, 비결핵 마이코박테리아의 일종인 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus), 마이코박테리움 베체(M. vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰 (M. asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(M. porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(M. acapulcensis), 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(M. diernhoferi)의 내부전사지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 염기서열을 밝히고, 이들 염기서열을 이용하여 마이코박테리아 속의 동정 및 각각의 마이코박테리움 균종의 동정이 가능한 PCR용 프라이머 또는 혼성화 반응용 프로브로서 서열 번호 10 내지 241의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.The present invention relates to oligonucleotide primers or probes that can be used for the identification and differential diagnosis of mycobacterial strains, Mycobacterium fortuitum ( M. fortuitum ), mycobacteria Leeum four cellos (M. chelonae), Mycobacterium epseo Seuss (M. abscessus), Mycobacterium beche (M. vaccae), Mycobacterium Plata bay sense (M. flavescens), Mycobacterium Asia The interior of M. asiaticum , Mycobacterium forcinum , Mycobacterium acapulcensis , and Mycobacterium Diernhoferi As a primer for PCR or hybridization reaction, the nucleotide sequence of the internal transcribed spacer region (ITS) can be identified, and the nucleotide sequence can be identified and identified for each mycobacteria species. An oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 to 241 provides an oligonucleotide.
Description
본 발명은 마이코박테리아 균종의 동정에 사용할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 비결핵 마이코박테리아의 일종인 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스 (Mycobacterium acapulcensis), 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(Mycobacterium diernhoferi)의 내부전사지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 염기서열을 밝히고, 이들 ITS 염기서열을 이용하여 마이코박테리아 속의 동정 및 각각의 마이코박테리움 균종의 동정이 가능한 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브를 제공하고자 한 것이다.The present invention relates to oligonucleotides that can be used for the identification of mycobacterial species, and more specifically, Mycobacterium fortuitum , which is a type of non-tuberculosis mycobacteria, Mycobacterium chelonae ), Mycobacterium abscessus , Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium asiaticum , Mycobacterium asiaticum the nucleotide sequence of the formate when num (Mycobacterium porcinum), Mycobacterium ah ride sensor system (Mycobacterium acapulcensis), and Mycobacterium diethoxy other inside the transfer area of the hopper Li (Mycobacterium diernhoferi) (ITS, internal Transcribed Spacer region) Using these ITS sequences, identification of the genus Mycobacteria and the identification of individual Mycobacterium species Possible oligonucleotides intended to provide an oligonucleotide primer or probe.
결핵은 과거에 비해서는 꾸준히 감소되고 있는 중이지만 아직도 전세계적으로 매년 약 800 만명 정도의 새로운 환자가 발생하고 300 만명 정도의 환자가 사망하는 것으로 보고되고 있다. 더우기, 개발도상국에서는 항결핵제의 부족으로 인한 부적절한 치료로 약제 내성균을 갖는 만성 보균자가 증가되고 있고, 선진국에서도 1980년대에 들어서면서 후천성면역결핍증(AIDS) 환자의 증가로 인하여 결핵 감소가 정체되고 다시 증가하는 양상을 보이고 있다. 따라서, 이러한 추세라면 2000 년 경에는 1200 만명의 새로운 환자가 발생할 것으로 예측되고 있다(J. P. Natain, M. C. Raviglione, 및 A. Kochi,Tubercle and Lung Disease, 73: 311-321, 1992; Murray CJL. 및 Lopez AD. The global burden of disease.Global burden of disease and injury series. Vol. 1.Cambridge, Mass: Harvard University Press, 1996, p349-350; Global Tuberculosis Programme: Anti-tuberculosis drug resistance, WHO Report 1997: World Health Organization. 1997).Tuberculosis is steadily decreasing compared to the past, but there are still around eight million new cases and three million deaths worldwide each year. Moreover, in developing countries, chronic carriers with drug-resistant bacteria are increasing due to inadequate treatment due to the lack of anti-tuberculosis drugs, and in developed countries, tuberculosis reduction is stagnating and increasing again in the 1980s due to the increase of AIDS patients. The aspect is showing. Thus, this trend is expected to generate 12 million new patients around 2000 (JP Natain, MC Raviglione, and A. Kochi, Tubercle and Lung Disease, 73 : 311-321, 1992; Murray CJL. And Lopez). AD.The global burden of disease.Global burden of disease and injury series.Vol. 1.Cambridge, Mass: Harvard University Press, 1996, p349-350; Global Tuberculosis Program: Anti-tuberculosis drug resistance, WHO Report 1997: World Health Organization, 1997).
1950년대에 비결핵 마이코박테리아(non-tuberculous mycobacteria, NTM)도 인간에게 질병을 일으킬 수 있다는 사실이 보고되었고, 1980년 이후 마이코박테리움 아비움 콤플렉스(M. aviumcomplex, MAC)가 AIDS 환자에게 전신 질환을 유발한다고 알려진 다음부터, 비결핵 마이코박테리아에 대한 관심이 높아지고 있다. 비결핵 마이코박테리아에 의한 질환은 임상적인 소견이나 일반적인 병리 소견이 결핵과 유사하다. 하지만 비결핵 마이코박테리아는 주변의 생활 환경에 널리 분포하고 있고, 임상 가검물로부터 분리되어도 병원성 여부를 판단하기 어려워 진단이 쉽지 않을 뿐만 아니라, 대부분의 각종 항결핵제에 약제 내성을 보이고 있어 치료가 어렵고 재발율도 높은 것으로 알려져 있다. 이처럼 여러 약제에 내성을 가진 비결핵 마이코박테리아 균주가 점차 증가하고 있는데, 이들에 의한 질병에 대해서는 결핵균에 의한 질환에서와 다른 방법을 사용하여야 하기 때문에 이들에 대한 신속하고도 정확한 동정 방법이 요구되고 있다. 또한, 결핵 발병율과 다제내성 결핵균주의 증가로 결핵의 효과적인 치료 및 관리를 위해서도 TB 복합체 뿐 아니라 NTM 균주의 보다 신속하고 정확한 동정이 요구되고 있다.In the 1950s, it was reported that non-tuberculous mycobacteria (NTM) could also cause disease in humans. Since 1980, the M. avium complex (MAC) has been reported in AIDS patients. Since being known to cause systemic diseases, interest in non-tuberculosis mycobacteria has increased. In non-tuberculosis mycobacterial diseases, clinical and general pathological findings are similar to those of tuberculosis. However, non-tuberculosis mycobacteria are widely distributed in the surrounding living environment and difficult to determine whether they are pathogenic even if they are separated from clinical specimens, and they are difficult to diagnose, and they are difficult to treat and have high recurrence rates. It is known. As non-tuberculosis mycobacterial strains that are resistant to various drugs are gradually increasing, a rapid and accurate identification method for these diseases is required because different methods must be used for diseases caused by Mycobacterium tuberculosis. . In addition, due to the increased incidence of tuberculosis and multidrug-resistant tuberculosis strains, more rapid and accurate identification of NTM strains as well as TB complexes is required for effective treatment and management of tuberculosis.
마이코박테리아 감염 여부의 조기 진단과 마이코박테리아 균종의 확인은 치료에 있어서 상당히 중요한 위치를 차지하기 때문에 여러 가지 진단 방법들이 연구 및 개발되어 왔다. 이들 중에서 현재 이용되고 있는 동정 및 감염 여부 진단 방법은 다음과 같다.Since early diagnosis of mycobacterial infection and the identification of mycobacterial strains play an important role in the treatment, various diagnostic methods have been researched and developed. Among them, currently used identification and diagnosis methods of infection are as follows.
첫째로, 미생물학적 방법인 도말 및 배양 검사가 있다. 그러나, 이 방법은 마이코박테리아처럼 세대 기간이 길어 배양 시간이 오래 걸리고 실험자에게 감염 위험이 수반되는 병원성 미생물에 적용하기에는 적합하지 않다.First is the microbiological method, smear and culture test. However, this method is not suitable for application to pathogenic microorganisms, such as mycobacteria, which require longer incubation periods and involve the risk of infection to the experimenter.
둘째로, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)법이 있는데, 이 방법은 민감도와 특이성이 높아 마이코박테리아처럼 분리 배양에 오랜 시간이 걸리는 병원균의 검출에 매우 유용하다. 특히 소량의 DNA를 증폭시켜 검출하므로 균주의 배양 과정을 거치지 않고 검체에 존재하는 소량의 병원균만으로도 동정이 가능하다는 장점이 있다. 이러한 PCR에 의한 검출은 증폭시키는 표적 DNA에 따라 여러 가지 방법이 소개되고 있는데 그 중에서도 여러 카피(copy)로 존재하는 IS6110과 16S rRNA가 주로 이용되고 있다(Bauer J, Andersen AB, Kremer K, 및 Miorner H,Usefulness of spoligotyping to discriminate IS6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark, 1999,J. Clin. Microbiol. 37: 2602-2606; Troesch, A., H. Nguyen, C. G. Miyada, S. Desvarenne, T. R. Gingeras, P. M. Kaplan, P. Cros 및 C. Mabilat. 1999, Microbacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays,J. Clin. Microbiol. 37: 49-55).Secondly, there is a polymerase chain reaction (PCR) method, which is very useful for the detection of pathogens that take a long time to isolate and culture such as mycobacteria due to their high sensitivity and specificity. In particular, since a small amount of DNA is amplified and detected, there is an advantage that only a small amount of pathogens present in the sample can be identified without going through the culture process of the strain. The detection by PCR is introduced in various ways depending on the target DNA to be amplified. Among them, IS6110 and 16S rRNA, which exist in several copies, are mainly used (Bauer J, Andersen AB, Kremer K, and Miorner). H, Usefulness of spoligotyping to discriminate IS6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark, 1999, J. Clin.Microbiol . 37 : 2602-2606; Troesch, A., H. Nguyen, CG Miyada, S. Desvarenne , TR Gingeras, PM Kaplan, P. Cros and C. Mabilat. 1999, Microbacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays, J. Clin. Microbiol. 37 : 49-55).
셋째는 마이코박테리아 균체 성분의 물리화학적 분석방법으로, 마이코박테리아의 균체 성분 중 지방 화합물을 HPLC 또는 GC 및 질량 분석기를 이용하여 검출하는 방법이다. 이 방법은 특이도가 높기는 하나 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있다.The third method is the physicochemical analysis of mycobacterial cell components, and a method for detecting fatty compounds in the mycobacterial cell components using HPLC or GC and mass spectrometry. This method has a high specificity but has the disadvantage of requiring expensive equipment.
넷째는 혈청학적 방법에 의한 균체 성분의 검출 방법으로, 균항원에 대한 항체를 흡착시킨 혈구나 라텍스(latex) 입자를 이용한 응집 반응과 효소를 항체에 결합시킨 효소 결합 면역 분석법 등이 이용되고 있다. 그러나 이 기법은 매우 정교하여 세심한 주의를 요하므로 한정된 검사실에서만 가능하고, 현재의 감염과 그 이전의 감염 간의 차이를 구별하는 것이 어렵다는 단점이 있다.Fourth, as a method for detecting cell components by serological methods, agglutination reaction using blood cells or latex particles which adsorb the antibody to the fungal antigen, and enzyme-linked immunoassay method in which the enzyme is bound to the antibody are used. However, this technique is very sophisticated and requires careful attention and is only possible in limited laboratories, and it is difficult to distinguish the difference between current and previous infections.
다섯째로는, 마이코박테리오파아지 L5에 루시페라제(luciferase) 유전자를 삽입하고 마이코박테리아에 감염시킨 후, 배지 내에 첨가된 루시페린(luciferin)으로 발광 여부를 조사하여 마이코박테리아를 검색할 수 있는 방법이 있다(W. R. Jacobs, R. G. Barletta, R. Udani, J. Chan, G. Kalkut, G. Sosne, T. Kieser, G. J. Sarkis, G. F. Hatful, 및 B. R. Bloom. 1993,Science 260:819-822).Fifth, there is a method to search for mycobacteria by inserting luciferase gene into mycobacterial phage L5 and infecting with mycobacteria, and then luminescence with luciferin added in the medium. (WR Jacobs, RG Barletta, R. Udani, J. Chan, G. Kalkut, G. Sosne, T. Kieser, GJ Sarkis, GF Hatful, and BR Bloom. 1993, Science 260: 819-822).
여섯째로는, 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화(hybridization)에 의한 동정 방법이 있다(A. Troesch, H. Nguyen, C. G. Miyada, S. Desvarenne, T. R. Gingeras, P. M. Kaplan, P. Cros 및 C. Mabilat. 1999.J. Clin. Microbiol. 37: 49-55).Sixth, there is a method of identification by hybridization of oligonucleotide probes (A. Troesch, H. Nguyen, CG Miyada, S. Desvarenne, TR Gingeras, PM Kaplan, P. Cros and C. Mabilat. 1999. J. Clin.Microbiol . 37 : 49-55).
한편, 인체에 질병을 유발하는 비결핵 마이코박테리아로는 상기 언급된 마이코박테리움 아비움 콤플렉스(MAC) 이외에도 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네 컴플렉스(M. chelonaecomplex), 마이코박테리움 테레(M. terrae) 및 마이코박테리움 베체(M. vaccae) 등이 알려져 있다. 이중에서 마이코박테리움 첼로네 컴플렉스는 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae)와 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus)로 분류되며, 임상에서 아직 이 두 균주를 구별할 수 있는 방법은 알려져 있지 않다.On the other hand, non-tuberculosis mycobacteria causing disease in the human body, in addition to the above-mentioned mycobacterium avium complex (MAC) mycobacteria, M. fortuitum ( M. fortuitum ), mycobacterium cellone complex ( M chelonae complex), Mycobacterium tere ( M. terrae ) and Mycobacterium becé ( M. vaccae ) are known. Among these, the Mycobacterium Cellone Complex is classified as Mycobacterium Cellone ( M. chelonae ) and Mycobacterium Epsomus ( M. abscessus ). Not known
도 1은 마이코박테리아 내부전사지역(ITS) 및 ITS의 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭에 이용되는 프라이머의 위치에 관한 개요도,1 is a schematic diagram of the location of the primers used for amplification of the Mycobacteria internal transcription region (ITS) and polymerase chain reaction (PCR) of the ITS,
도 2는 마이코박테리아의 16S rRNA 및 23S rRNA 일부를 포함하는 ITS 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진,Figure 2 is a photoelectrophoresis after PCR for a variety of mycobacteria strains using a primer pair for ITS amplification comprising a portion of 16S rRNA and 23S rRNA of mycobacteria,
도 3은 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진,Figure 3 is a photoelectrophoresis after PCR for the various mycobacterial strains using primer pairs (ITSF and MYC2) to determine whether the mycobacteria,
도 4는 마이코박테리아인지를 확인하고, 동시에 마이코박테리아 중에서 TB 복합체(complex)인지 비결핵 마이코박테리아(NTM)인지를 동정하는 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)을 설명하는 개요도,4 is a schematic diagram illustrating multiplex PCR (identification of mycobacteria) and simultaneously identifying TB complex or non-tuberculosis mycobacteria (NTM) among mycobacteria;
도 5는 마이코박테리아 확인용 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)과 마이코박테리아 중 TB 복합체(complex) 동정용 프라이머쌍(MTB2와 MYC2)으로 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)을 실시한 후 전기영동한 사진,FIG. 5 shows electrophoresis after performing multiplex PCR with primer pairs for identifying mycobacteria (ITSF and MYC2) and primer pairs for identifying complexes of mycobacteria (MTB2 and MYC2);
도 6은 비결핵 마이코박테리아(NTM) 각 균주의 다형성 지역의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 각각의 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진,Figure 6 shows the electrophoresis after PCR for each mycobacterial strain using a species-specific primer pair prepared from the nucleotide sequence of the polymorphic region of each non-tuberculosis mycobacteria (NTM) strain,
도 7은 비결핵 마이코박테리아(NTM) 각 균주의 다형성 지역의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진.Figure 7 is a picture of electrophoresis after PCR for a variety of mycobacteria strains using species-specific primer pairs prepared from the nucleotide sequence of the polymorphic region of each non-tuberculosis mycobacteria (NTM) strain.
본 발명에서는 상기와 같은 종래의 마이코박테리아 동정 및 감염 여부 진단 방법의 문제점을 고려하여 기존의 균 배양 및 생화학적 방법에 의한 동정법을 대신할 수 있는 간단하면서도 정확도와 효율성 높은 방법을 제공하고자 한다.The present invention is to provide a simple, high accuracy and efficient method that can replace the conventional bacterial culture and biochemical method identification method in consideration of the problems of the conventional mycobacteria identification and infection diagnosis method as described above.
즉, 본 발명의 목적은 마이코박테리아 속에 공통적인 염기서열 부위와 각각의 균종에 특이적인 염기서열 부위를 PCR 용 프라이머 또는 동정용 프로브로 제공함으로써, 마이코박테리아 균주인지 여부의 판별 및 마이코박테리아 균주 중에서도 TB 복합체인지 NTM인지를 동정하는 방법, 즉 마이코박테리아 속(genus)과 종 (species)을 정확하게 동정하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.That is, an object of the present invention is to determine whether a mycobacteria strain and TB among mycobacteria strains by providing a PCR primer or a probe for PCR, by providing a nucleotide sequence common to mycobacteria and a nucleotide sequence specific to each strain. It is intended to provide a method for identifying complexes or NTMs, that is, for accurately identifying mycobacteria genus and species.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는 서열 번호 1 내지 서열 번호 9에 기재된 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스 (Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(Mycobacterium acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리 (Mycobacterium diernhoferi) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA를 제공한다.In order to achieve the above object, in the present invention, Mycobacterium fortuitum ( Mycobacterium fortuitum ), Mycobacterium chelonae ( Mycobacterium chelonae ), Mycobacterium abscessus ( Mycobacterium abscessus) ), Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium asiaticum , Mycobacterium porcinum , Mycobacterium vaccae Solarium Oh provides DNA of ride sensor system (Mycobacterium acapulcensis) and Mycobacterium diethoxy other hopper Li (Mycobacterium diernhoferi) inside the transfer region of the gene (ITS, internal Transcribed Spacer region) .
또한 본 발명에서는 PCR용 프라이머 또는 혼성화용 프로브로서,In the present invention, as a primer for PCR or a hybridization probe,
서열 번호 10∼14 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리아 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of mycobacteria having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 10-14;
서열 번호 15∼23 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리아중 TB 복합체 (TB complex)와 비결핵 마이코박테리아 구분에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used to distinguish between TB complex and non-tuberculosis mycobacteria among mycobacteria, having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 15-23;
서열 번호 24∼27 중 하나의 염기서열을 갖는, MAC (Mycobacterium avium및Mycobacterium intracellulare) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of MAC ( Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare ) having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 24-27;
서열 번호 28∼38 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 포튜이튬 (Mycobacterium fortuitum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium fortuitum having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 28 to 38;
서열 번호 39∼46 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 첼로네 (Mycobacterium chelonae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium chelonae having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 39-46;
서열 번호 47∼52 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 엡서수스 (Mycobacterium abscessus) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium abscessus having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 47 to 52;
서열 번호 53∼64 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 베체 (Mycobacterium vaccae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium vaccae having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 53 to 64 ;
서열 번호 65∼72 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 플라베센스 (Mycobacterium flavescens) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium flavescens having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 65-72;
서열 번호 73∼77 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 고도네 (Mycobacterium gordonae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium gordonae having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 73 to 77 ;
서열 번호 78∼100 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 테레 (Mycobacterium terrae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium terrae having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 78-100;
서열 번호 101∼108 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 스크로플래시움(Mycobacterium scroflaceum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium scroflaceum having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 101-108;
서열 번호 109∼112 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium kansasii having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 109-112 ;
서열 번호 113∼116 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 스줄가이 (Mycobacterium szulgai) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium szulgai having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 113-116;
서열 번호 117∼119 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 마리눔 (Mycobacterium marinum) 및 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium marinum and Mycobacterium ulcerans , having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 117-119;
서열 번호 120∼123 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 가스트리(Mycobacterium gastri) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium gastri having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 120 to 123 ;
서열 번호 124∼133 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 제노피 (Mycobacterium xenopi) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium xenopi having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 124-133;
서열 번호 134∼141 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 제나벤스 (Mycobacterium genavense) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium genavense having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 134-141;
서열 번호 142∼146 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 말모엔스 (Mycobacterium malmoense) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium malmoense having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 142 to 146 ;
서열 번호 147∼153 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 시미에 (Mycobacterium simiae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium simiae having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 147-153;
서열 번호 154∼165 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium smegmatis having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 154-165;
서열 번호 166∼172 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 쉬모이데이 (Mycobacterium shimoidei) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium shimoidei having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 166-172;
서열 번호 173∼180 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 하바나 (Mycobacterium habana) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium habana having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 173 to 180;
서열 번호 181∼189 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 파시노겐 (Mycobacterium farcinogen) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium farcinogen having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 181 to 189 ;
서열 번호 190∼193 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 아시아티쿰 (Mycobacterium asiaticum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium asiaticum having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 190 to 193;
서열 번호 194∼205 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium porcinum having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 194-205;
서열 번호 206∼215 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 아카풀센시스(Mycobacterium acapulcensis) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium acapulcensis having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 206 to 215 ;
서열 번호 216∼227 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 디에른호퍼리(Mycobacterium diernhoferi) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium diernhoferi having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 216 to 227 ;
서열 번호 228∼240 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 파라투베르쿨로시스(Mycobacterium paratuberculosis) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드; 및Oligonucleotides used for identification of Mycobacterium paratuberculosis , having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 228-240; And
서열 번호 241의 염기서열을 갖는, 마이코박테리아 속(Mycobacteria sp) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.Provided is an oligonucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 241 for use in identifying Mycobacteria sp .
종래의 PCR 방법에 의한 동정법에서는 목적으로 하는 한 종류 또는 두 종류의 균주 만을 동정할 수 있었으나, 본 발명에서는 거의 모든 인체 감염성 마이코박테리아 균주의 동정이 동시에 가능하도록 하기 위해 마이코박테리아의 ITS 염기서열로부터 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. ITS는 흔히 표적 DNA로 사용되는 16S rRNA 보다 다형성 지역이 많은 동시에 보존적인 지역이 존재하여 유전형 감별을 위한 표적 DNA로서 높은 유용성을 갖고 있는 영역이다(Gurtler, V., 및 V. A. Stanisich, 1996, New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region.Microbiol. 142:3-16).In the conventional PCR method, only one or two strains could be identified. However, in the present invention, almost all human infectious mycobacterial strains can be identified simultaneously from the ITS sequence of mycobacteria. Primers and probes were designed. ITS is a region that has more polymorphic regions and conservative regions than 16S rRNA, which is often used as target DNA, and thus has high utility as a target DNA for genotyping (Gurtler, V., and VA Stanisich, 1996, New approaches). to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region.Microbiol. 142: 3-16).
이에 따라, 본 발명에서는 비결핵 마이코박테리아 중에서 아직 염기서열이 밝혀지지 않은 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(Mycobacterium acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리 (Mycobacterium diernhoferi) 유전자의 ITS 염기서열을 밝히고, 이들을 이용하여 균종의 구별이 가능한 프로브 및 프라이머를 디자인하였다. 그 밖의 균주는 현재까지 공중(GenBank)에 공개되어 있는 염기서열 정보를 멀티얼라인먼트(multi-alignment)와 블라스트(blast)로 분석하여 이론적으로 동일한 부위의 다형성 (polymorphism)으로 감별이 가능한 부위를 선택하여 프로브 또는 프라이머를 디자인하여 균주 특이적인 혼성화 반응(hybridization)으로 동정을 하였다. 그 확인 실험으로서 PCR 반응의 속특이적 및 종특이적 프라이머로 증폭시켜본 결과 효과적으로 동정이 가능함을 확인할 수 있었다.Accordingly, in the present invention, Mycobacterium fortuitum ( Mycobacterium fortuitum ), Mycobacterium chelonae ( Mycobacterium chelonae ), Mycobacterium abscessus ), Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium asiaticum , Mycobacterium porcinum , Mycobacterium vaccae Solarium ah ride sensor system (Mycobacterium acapulcensis) and Mycobacterium diethoxy other hopper Li (Mycobacterium diernhoferi) reveal the ITS sequences of a gene, a probe and primers were designed to distinguish the species as possible by using them. In other strains, multi-alignment and blast analysis of nucleotide sequence information that has been published in the public (GenBank) is selected to select a site that can be discriminated theoretically by polymorphism of the same site. Probes or primers were designed and identified by strain specific hybridization. As a confirmation experiment, amplification by genus-specific and species-specific primers of the PCR reaction showed that identification was possible.
즉, 마이코박테리아의 ITS에 존재하는 특이 핵산 서열에만 혼성화하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)를 고형 지지체에 부착시켜 마이코박테리아의 균종을 특이적이고 민감하게 탐지 또는 동정할 수 있다. 또한, 각 균종을 특이적으로 탐지하는 이들 올리고뉴클레오티드 프로브와 같은 서열로 프라이머를 제작하여 PCR을 실시한 후 일정한 크기로 증폭되는지 여부에 의해서도 동정이 가능하다. 이들 마이코박테리아 ITS 염기서열로부터 제작된 본 발명의 프로브 또는 프라이머를 이용하면, 먼저 마이코박테리아인지 여부를 구별하고, 계속해서 마이코박테리아 중에서도 TB 복합체인지 NTM인지를 구별하고, 나아가 NTM 중에서도 균종을 정확히 구별할 수 있다.That is, the oligonucleotide probe of the present invention which hybridizes only to specific nucleic acid sequences present in the ITS of mycobacteria can be attached to a solid support to detect or identify mycobacteria species. In addition, it is possible to identify by amplification to a certain size after the PCR by primers prepared by the same sequence as these oligonucleotide probes that specifically detect each species. Using the probes or primers of the present invention prepared from these mycobacterial ITS sequences, it is possible to first distinguish whether they are mycobacteria, then to discriminate whether they are TB complexes or NTMs among mycobacteria, and to accurately distinguish species among NTMs Can be.
본 발명을 다음 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.The present invention is explained in more detail by the following examples. However, these Examples are only illustrative to aid the understanding of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these.
실시예 1. 마이코박테리아의 배양 및 게놈 DNA(genomic DNA) 분리Example 1 Culture of Mycobacteria and Isolation of Genomic DNA
마이코박테리아 표준균주는 KCTC(Korean Collection for Type Culture, 유전자은행)와 ATCC(American Type Culture Collection)로부터, 임상균주는 대한결핵협회, 결핵병원 및 부산대학병원을 통해서 입수하였으며, 균주의 보관과 배양은 부산대학병원 임상병리과 임상미생물 전공교수의 관리하에 수행하였다. 본 발명에서 사용된 마이코박테리아와 일반 병원성 세균의 종류는 아래 표 8과 같다.Mycobacteria standard strains were obtained from Korean Collection for Type Culture (KCTC) and American Type Culture Collection (ATCC), and clinical strains were obtained from the Korean Tuberculosis Association, Tuberculosis Hospital, and Pusan National University Hospital. It was performed under the supervision of the professor of clinical pathology at the university hospital. The types of mycobacteria and general pathogenic bacteria used in the present invention are shown in Table 8 below.
마이코박테리아에서 DNA의 추출은 다음과 같은 방법으로 실시하였다: 마이코박테리아를 오가와(Ogawa) 배지에서 배양한 후 1 백금이를 따서 원심분리관에 넣고 인스타진 매트릭스(InstaGene matrix, Bio-Rad Co.) 200 ㎕를 가하여 부유시킨 후, 56 ℃에서 30 분 동안 유지하고 10 초 동안 교반(vortex)한 다음 100 ℃에서 8 분 동안 열처리하였다. 다시 10 초 동안 교반(vortex)한 후 12,000 rpm에서 3 분 동안 원심분리하여 상층액을 새 튜브로 옮겨 -20 ℃에 보관하였다. 분리된 각 균종의 DNA 2 ㎕를 아래의 PCR 반응에 사용하였다.Extraction of DNA from mycobacteria was carried out in the following manner: Mycobacteria were cultured in Ogawa medium, followed by 1 platinum centrifuge and placed into an InstaGene matrix (Bio-Rad Co.). After 200 μl of the suspension was suspended, the solution was held at 56 ° C. for 30 minutes, vortexed for 10 seconds, and then heat-treated at 100 ° C. for 8 minutes. After stirring for another 10 seconds (vortex) and centrifuged for 3 minutes at 12,000 rpm the supernatant was transferred to a new tube and stored at -20 ℃. 2 μl of each isolated DNA was used for the following PCR reaction.
실시예 2. 마이코박테리아의 ITS 증폭용 프라이머의 제작Example 2 Preparation of Primer for ITS Amplification of Mycobacteria
마이코박테리아의 ITS 및 ITS의 PCR 증폭에 이용되는 프라이머의 위치는 도1에 나타낸 바와 같다. 마이코박테리아의 ITS를 증폭시키기 위한 프라이머는 마이코박테리아의 16S rRNA와 23S rRNA의 보존적인 지역 중 일부 염기서열을 선정하여 제작하였다. 즉, 이미 공개되어 있는 마이코박테리아의 16S와 23S rRNA의 염기서열을 멀티얼라인먼트 (multialignment)와 블라스트 검색(blast search)으로 컴퓨터 분석하여 프라이머를 디자인하였는데, 선정된 프라이머는 16S rRNA 및 23S rRNA 일부와 함께 ITS 부위가 약 500 bp 크기로 선택적으로 증폭되도록 고안된 것으로, 서열 번호 242(ITSF) 및 243(ITSR)의 염기서열을 갖는다. ITS 증폭 프라이머를 포함하여 실험에 사용한 모든 프라이머는 바이오베이직(BioBasic, 캐나다)에 의뢰하여 퍼킨-엘머 DNA 합성기 (Perkin-Elmer DNA synthesizer)에서 50 nmol 농도로 제작하여 사용하였다.The positions of the primers used for ITS of mycobacteria and PCR amplification of ITS are shown in FIG. 1. Primers for the amplification of mycobacteria were prepared by selecting some of the conserved regions of 16S rRNA and 23S rRNA of mycobacteria. In other words, the primers were designed by computer analysis of previously disclosed mycobacterial 16S and 23S rRNAs by multialignment and blast search, and the selected primers were combined with a portion of 16S rRNA and 23S rRNA. The ITS site is designed to be selectively amplified to about 500 bp in size and has the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 242 (ITSF) and 243 (ITSR). All primers used in the experiments, including the ITS amplification primers, were prepared at a concentration of 50 nmol in a Perkin-Elmer DNA synthesizer by BioBasic (Canada).
실시예 3. PCR 반응 및 산물의 확인Example 3. PCR Reaction and Identification of Products
실시예 1에서 얻은 각 균종의 DNA 2 ㎕씩을 PCR 반응에 사용하였다. 반응물의 조성은 다음과 같다: 500 mM KCl, 100 mM Tris HCl(pH 9.0), 1% Triton X-100, 0.2 mM dNTP(dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP), 1.5 mM MgCl2, 1 pmol 프라이머, 1U Taq DNA 폴리머라제(Bio Basic Inc.). 이 혼합액을 94 ℃에서 5 분 동안 반응시켜 충분히 변성시킨 후 94 ℃에서 1 분, 60 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분씩 30 회 반응시켰으며, 마지막으로 72 ℃에서 10 분간 연장하였다. 반응이 끝난 후 1.5 % 아가로즈 겔(agarose gel)에 전기영동하여 PCR 산물을 확인하였다. GenBank의 자료를 통해서 미리 예견하였던 바와 같이 16S rRNA와 23S rRNA의 보존적인 프라이머로 증폭시킨 ITS의 크기는 약 500 bp로 나타났다.2 μl of DNA of each strain obtained in Example 1 was used for the PCR reaction. The composition of the reaction was as follows: 500 mM KCl, 100 mM Tris HCl (pH 9.0), 1% Triton X-100, 0.2 mM dNTP (dATP, dGTP, dTTP and dCTP), 1.5 mM MgCl 2 , 1 pmol primer, 1U Taq DNA Polymerase from Bio Basic Inc. The mixture was reacted for 5 minutes at 94 ° C. to sufficiently denature, and then reacted 30 times for 1 minute at 94 ° C., 1 minute at 60 ° C. and 1 minute at 72 ° C., and finally extended at 72 ° C. for 10 minutes. After the reaction, the PCR product was confirmed by electrophoresis on 1.5% agarose gel. As predicted from GenBank's data, the size of ITS amplified by conservative primers of 16S and 23S rRNA was about 500 bp.
도 2는 마이코박테리아의 16S rRNA 및 23S rRNA 일부를 포함하는 ITS 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서 M은 분자량 표지로 100 bp 간격을 갖고 있으며, C는 대조군, 레인(lane) 1은 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 레인 2는 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 레인 3은 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularae), 레인 4는 마이코박테리움 아비움(M. avium), 레인 5는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. Tb), 레인 6은 마이코박테리움 아그리(M. agri), 레인 7은 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii), 레인 8은 마이코박테리움 고도네(M. gordonae), 그리고 레인 9는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. TbH37Rv)를 나타내는 것으로, 대조군인 C를 제외하고 레인 1∼9의 마이코박테리아에서는 ITS 증폭이 일어난 것을 볼 수 있다.Figure 2 is a photoelectrophoresis after PCR for a variety of mycobacteria strains using a primer pair for ITS amplification comprising a portion of 16S rRNA and 23S rRNA of mycobacteria. Here, M is a molecular weight label with a 100 bp interval, C is a control, lane 1 is mycobacterium fortuitum , lane 2 mycobacterium cellone ( M. chelonae) ), Lane 3 is mycobacterium intracellularae , lane 4 is mycobacterium avium , lane 5 is mycobacterium tuberculosis ( M. Tb ), Lane 6 is M. agri , lane 7 is M. kansasii , lane 8 is M. gordonae , and lane 9 is M. agri Cobacterium tuberculosis ( M. Tb H37Rv), which represents the ITS amplification occurred in the mycobacteria of lanes 1-9 except for the control group C.
실시예 4. 마이코박테리아 ITS의 DNA 서열 분석Example 4 DNA Sequence Analysis of Mycobacteria ITS
PCR 반응의 확인이 끝난 후, ITS 염기서열이 공개되어 있지 않은 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus), 마이코박테리움 베체(M. vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(M. porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(M. acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(M. diernhoferi)의 ITS 반응물을 PCR로 증폭시킨 후 PCR 반응물 그대로 DNA 서열 분석에 사용하였다.After confirmation of the PCR reaction, mycobacterium fortuitum ( M. fortuitum ), mycobacterium cellone ( M. chelonae ), mycobacterium epsus ( M. abscessus ), mycobacterium becé ( M. vaccae ), mycobacterium flavescens ( M. flavescens ), mycobacterium asiaticum , mycobacterium forcinum ( M. porcinum ), The ITS reactions of Mycobacterium acapulcensis and Mycobacterium Dietenhoferi were amplified by PCR and used for DNA sequencing.
DNA는 200 μmol 농도로 정량하여 반응에 사용하였다. DNA 자동서열분석기 (auto sequencer, Perkin-Elmer, ABI prim 377 sequencer)로 만능 프라이머 (universal primer) M13을 사용하여 다이 터미네이터(dye terminator) 법으로 염기서열을 결정하였다.DNA was quantified at a concentration of 200 μmol and used for the reaction. DNA sequences were determined by a die terminator method using a universal primer M13 using an auto sequencer (Perkin-Elmer, ABI prim 377 sequencer).
서열 번호 1 내지 9는 각각 마이코박테리움 포튜이튬 (Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(Mycobacterium acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(Mycobacterium diernhoferi)의 ITS 염기서열을 나타낸다.SEQ ID NOs: 1 to 9 are Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium chelonae , Mycobacterium abscessus and Mycobacterium vaccae , respectively . , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium asiaticum , Mycobacterium porcinum , Mycobacterium acapulcensis and Mycobacterium acapulcensis It shows the ITS sequence of Cobacterium diernhoferi ( Mycobacterium diernhoferi ).
실시예 5. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 선정과 합성Example 5. Selection and Synthesis of Oligonucleotide Primers
실시예 4에서 얻어진 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus), 마이코박테리움 베체(M. vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(M. porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(M. acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(M. diernhoferi)의 ITS 염기서열 중에서 각각 20 bp 크기의 프라이머를 디자인한 후, GenBank로부터 확보된 다른 마이코박테리아의 ITS 염기서열을 멀티얼라인먼트 (multi-alignment)와 블라스트(blast)로 분석하여 비교하였다.M. embodiment obtained in Example 4 Te Solarium Four tyuyi lithium (M. fortuitum), Mycobacterium cello four (M. chelonae), Mycobacterium epseo Versus (M. abscessus), Mycobacterium beche (M. vaccae ), Mycobacterium flavescens ( M. flavescens ), Mycobacterium Asiaticum ( M. asiaticum ), Mycobacterium forcinum ( M. porcinum ), Mycobacterium acapulsensis ( M. acapulcensis) and Mycobacterium diethoxy other hopper Li (after design primers of 20 bp in size, respectively from the ITS sequences of M. diernhoferi), the ITS sequences of a multi-alignment of the other mycobacteria obtained from GenBank (multi -alignment) and blast (blast) analysis.
상기 결과에 기초하여, 마이코박테리아 ITS의 보존적인 염기서열에 해당하는 것은 마이코박테리아 동정용 프라이머 또는 프로브로, 다형성이 높은 염기서열 부분에 해당하는 것은 균주 특이적 프라이머 또는 프로브로 선정하였다. 디자인한 프라이머 또는 프로브의 ITS 내에서의 위치 및 그 서열 번호는 표 1 내지 7와 같다.Based on the above results, a conservative base sequence of mycobacteria ITS was selected as a primer or probe for identifying mycobacteria, and a strain specific primer or probe corresponds to a base sequence having a high polymorphism. The positions and the sequence numbers of the designed primers or probes in the ITS are shown in Tables 1-7.
실시예 6. 마이코박테리아 동정용 프라이머에 의한 RCR 결과Example 6 RCR Results by Primer for Identification of Mycobacteria
마이코박테리아에 존재하는 보존적인 염기서열을 선택하여, 마이크로박테리아 만을 증폭시키는 속 특이적인 프라이머(genus-specific primer)로 제작하였다. 즉, 약 270-350 bp 크기의 ITS 염기서열 중에서 보존적인 염기서열을 선택하여 프라이머로 제작하였으며, 이중에서 ITSF(서열 번호 242)와 MYC2(서열 번호 11)의 프라이머쌍으로 PCR 반응을 실시하였다. 그 결과, 마이코박테리아 균주에 대해서는 약 350 bp의 크기로 증폭되었으나, 다른 병원성 세균인 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 패키움(Enterococcus faecium), 그리고 세라티아 마르케센스(Serratia marcescens) 등에서는 증폭되지 않았다. 따라서, 이들 프라이머가 마이코박테리아 동정용으로 사용 가능함을 알 수 있다.The conservative sequences present in mycobacteria were selected and constructed as genus-specific primers that amplify microbacteria only. That is, a conservative base sequence was selected from the ITS sequences of about 270-350 bp in size and prepared as a primer. Among them, PCR reaction was performed using primer pairs of ITSF (SEQ ID NO: 242) and MYC2 (SEQ ID NO: 11). As a result, it was amplified to about 350 bp for the mycobacterial strain, but other pathogenic bacteria Staphylococcus aureus , Enterococcus faecium , and Serratia marquessen marcescens ) and the like. Therefore, it can be seen that these primers can be used for identifying mycobacteria.
도 3은 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서, M은 분자량 표지로 100 bp 간격을 갖고 있으며, C는 대조군, 레인 1은 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessusATCC 19977), 레인 2는 마이코박테리움 아그리(M. agriATCC 27406), 레인 3은 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticumATCC 25276), 레인 4는 마이코박테리움 아우스트로아프리카눔(M. austroafricanumATCC 33464), 레인 5는 마이코박테리움 아비움(M. aviumATCC 25291), 레인 6은 마이코박테리움 보비스(M. bovisATCC 19210), 레인 7은 마이코박테리움 첼로네(M. chelonaeATCC 35752), 레인 8은 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescensATCC 14474), 레인 9는 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitumATCC 6841), 레인 10는 마이코박테리움 고도네(M. gordonae ATCC 14470), 레인 11은 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularaeATCC 13950), 레인 12는 마이코박테리움 칸사시(M. kansasiiATCC 12478), 레인 13은 마이코박테리움 플레이(M. phleiATCC 354), 레인 14는 마이코박테리움 스크로플래시움(M. scroflaceumATCC 19981), 레인 15는 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatisATCC 21701), 레인 16은 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgaiATCC 35799), 레인 17은 마이코박테리움 테레(M. terraeATCC 15755), 레인 18은 마이코박테리움 트리비알레(M. trivialeATCC 23292), 레인 19는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosisH37Rv), 그리고 레인 20은 마이코박테리움 베체(M. vaccaeATCC 15483)를 나타내는 것으로, 대조군인 C를 제외하고 레인 1∼20의 마이코박테리아 전부에서 ITS 증폭을 확인할 수 있다.Figure 3 is a photograph of electrophoresis after PCR for a variety of mycobacteria strains using primer pairs (ITSF and MYC2) to determine whether the mycobacteria. Here, M has a molecular weight label 100 bp intervals, C is a control, lane 1 is Mycobacterium Epsus ( M. abscessus ATCC 19977), lane 2 is Mycobacterium agri ( M. agri ATCC) 27406), lane 3 is mycobacterium asiaticum ( M. asiaticum ATCC 25276), lane 4 is mycobacterium austrian africanum ( M. austroafricanum ATCC 33464), lane 5 is mycobacterium avium ( M avium ATCC 25291), lane 6 is Mycobacterium bovis ( M. bovis ATCC 19210), lane 7 is Mycobacterium cellone ( M. chelonae ATCC 35752), lane 8 is Mycobacterium flavesense ( M. flavescens ATCC 14474), lane 9 is Mycobacterium fortuitium ( M. fortuitum ATCC 6841), lane 10 is Mycobacterium Godne ( M. gordonae ATCC 14470 ), lane 11 is Mycobacterium intra Cellulare ( M. intracellularae ATCC 13950), lane 12 is mycobacterium Kansashi ( M. kansasii ATCC 12478), lane 13 is mycobacterium play ( M. phlei ATCC 354), lane 14 is mycobacterium scrablasium ( M. scroflaceum ATCC 19981), lane 15 is mycobacterium smegmatis ( M. smegmatis ATCC 21701) Lane 16 is M. szulgai ATCC 35799, lane 17 is M. terrae ATCC 15755, lane 18 is Mycobacterium triviale ( M. triviale ATCC) 23292), lane 19 represents mycobacterium tuberculosis H37Rv, and lane 20 represents mycobacterium becche ( M. vaccae ATCC 15483), except for the control group lanes 1 to ITS amplification can be found in all 20 mycobacteria.
표 8은 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)으로 PCR을 실시한 후 증폭 여부를 나타낸 것으로, 마이코박테리아 이외의 균주에서는 증폭이 일어나지 않은 것을 볼 수 있다.Table 8 shows the amplification after PCR with primer pairs (ITSF and MYC2) to confirm whether the mycobacteria, it can be seen that the amplification did not occur in strains other than mycobacteria.
실시예 7. TB 복합체 동정 프라이머에 의한 PCR 결과Example 7. PCR Results by TB Complex Identification Primer
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 PCR 용 프라이머로 제작하여 각 균주 특이적인 동정이 가능한지에 대한 실험을 PCR에서의 증폭 여부로 확인하였다. 먼저 TB 복합체(TB complex) 동정을 위하여, 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)과 TB 복합체를 동정하는 프라이머쌍(MTB2와 MYC2; 서열 번호 16과 11)으로 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 실시하였다. 도 4는 이와 같이 마이코박테리아인지를 확인하고, 동시에 마이코박테리아 중에서 TB 복합체(complex)인지 비결핵 마이코박테리아(NTM)인지를 동정하는 멀티플렉스 PCR을 설명하는 개요도이다.An oligonucleotide according to the present invention was prepared as a primer for PCR, and the experiments for the identification of each strain specificity were confirmed by amplification in PCR. First, in order to identify TB complex, multiplex PCR (primer pair) (ITSF and MYC2) to identify mycobacteria and primer pair (MTB2 and MYC2; SEQ ID NO: 16 and 11) to identify TB complex ) Was performed. FIG. 4 is a schematic diagram illustrating multiplex PCR confirming whether or not the mycobacteria, and at the same time identify whether the TB complex or non-tuberculosis mycobacteria (NTM) among the mycobacteria.
도 5는 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머 쌍(ITSF와 MYC2)과 마이코박테리아 중 TB 복합체(complex) 동정용 프라이머 쌍(MTB2와 MYC2)으로 멀티플렉스 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서, M은 분자량 표지로 100 bp 간격을 갖고 있으며, C는 대조군, 레인 1과 2는 TB 복합체인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. TbH37Rv)와 마이코박테리움 보비스(M. bovis)를 나타내고, 레인 3∼10은 각각 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularae), 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 고도네(M. gordonae), 마이코박테리움 스줄가이 (M. szulgai), 마이코박테리움 테레(M. terrae) 및 마이코박테리움 스크로플래시움 (M. scroflaceumATCC 19981)을 나타내는 것으로, TB 복합체인 레인 1과 2에서는 마이코박테리아 확인용 프라이머와 TB 복합체용 프라이머에 의해 두 개의 밴드가 형성되어 이중 증폭이 일어난 것을 알 수 있고, 나머지 NTM 균종들에서는 하나의 밴드만 형성되어 단일 증폭이 일어난 것을 확인할 수 있다.Figure 5 is an electrophoresis after performing a multiplex PCR with a primer pair (ITSF and MYC2) to identify the mycobacteria and primer pairs for identifying the TB complex (MTB2 and MYC2) of mycobacteria. Here, M has a 100 bp interval with a molecular weight label, C is a control group, lanes 1 and 2 are TB complexes Mycobacterium tuberculosis ( M. Tb H37Rv) and Mycobacterium bovis ( M. bovis ), lanes 3 to 10 represent Mycobacterium avium , Mycobacterium intracellularae , Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium M. Te Leeum four cellos (M. chelonae), Mycobacterium altitude four (M. gordonae), Mycobacterium seujul Guy (M. szulgai), Mycobacterium terephthalate (M. terrae) and Mycobacterium Scroflashium ( M. scroflaceum ATCC 19981), which shows that in the lanes 1 and 2 of the TB complexes, two bands were formed by the primers for identifying the mycobacteria and the primers for the TB complex. Only one band is formed in the remaining NTM strains. We can see that a single amplification occurs.
실시예 8. NTM 균종 동정용 프라이머에 의한 PCR 결과Example 8. PCR results by primers for NTM species identification
비결핵 마이코박테리아(NTM)의 각 균종(species)을 동정하기 위해 각 균주의 다형성지역(polymorphic site)의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머 (species-specific primer)를 가지고 PCR 반응을 실시하였다.In order to identify each species of non-tuberculosis mycobacteria (NTM), PCR was carried out with a species-specific primer prepared from the nucleotide sequence of the polymorphic site of each strain.
즉, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosisH37Rv)와 마이코박테리움 보비스(M. bovis)에 특이적인 서열 번호 16과 21, 마이코박테리움 아비움(M. avium) 및 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularae)에 특이적인 서열24와 27, 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum)에 특이적인 서열 29와 37, 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae)에 특이적인 서열 41과 44, 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus)에 특이적인 서열 48과 49, 마이코박테리움 베체(M. vaccae)에 특이적인 서열 55와 63, 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens)에 특이적인 서열 66과 72, 마이코박테리움 고도네(M. gordonae)에 특이적인 서열 73과 75, 마이코박테리움 테레(M. terrae)에 특이적인 서열 88과 96, 마이코박테리움 스크로플래시움 (M. scroflaceum)에 특이적인 서열 102와 103, 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii)에 특이적인 서열 109와 110, 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai)에 특이적인 서열 113와 114, 마이코박테리움 마리눔(M. marinum)에 특이적인 서열 117과 119, 마이코박테리움 울세란스(M. ulcerans)에 특이적인 서열 117과 119, 마이코박테리움 가스트리(M. gastri)에 특이적인 서열 120과 123, 마이코박테리움 제노피(M. xenopi)에 특이적인 서열 128과 132, 마이코박테리움 제나벤스(M. genavense)에 특이적인 서열 135와 141, 마이코박테리움 말모엔스(M. malmoense)에 특이적인 서열 143과 145, 마이코박테리움 시미에(M. simiae)에 특이적인 서열 147과 149, 그리고 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)에 특이적인 서열 154와 159의 염기서열을 각각 선택하여, 첫번째 염기서열의 센스 스트랜드(sense strand)를 가진 프라이머와 두번째 염기서열의 안티센스 스트랜드 (antisense strand)를 가진 프라이머의 쌍으로 각 마이코박테리아의 균종들과 PCR 반응시킨 후 전기영동하여 결과를 확인하였다.That is, SEQ ID NOs: 16 and 21 specific to Mycobacterium tuberculosis H37Rv and Mycobacterium bovis , and Mycobacterium avium and Mycobac. SEQ ID NOs: 24 and 27 specific for M. intracellularae , SEQ ID NOs: 29 and 37 specific for M. fortuitum , and M. chelonae Specific sequences 41 and 44, sequences 48 and 49 specific for M. abscessus , sequences 55 and 63 specific to M. vaccae , mycobacterium flave SEQ ID NOs: 66 and 72 specific for M. flavescens ; SEQ ID NOs: 73 and 75 specific for M. gordonae ; SEQ ID NOs: 88 and 96 specific for M. terrae , Mycobacterium disk by flash Titanium-specific sequence 102 and 103 for (M. scroflaceum), Mycobacterium kansa (M. kansasii) specific sequences 109 and 110, Mycobacterium seujul this specific sequence and 117 to 119 (M. szulgai) specific sequences 113 and 114, Mycobacterium grains num (M. marinum) in the , Mycobacterium ulse lance (M. ulcerans) specific sequences 117 and 119, Mycobacterium gas tree (M. gastri) specific sequences 120 and 123, Mycobacterium gen blood (M. xenopi) in the SEQ ID NOs: 128 and 132, which are specific for M. genavense , SEQ ID NOs: 135 and 141, which are specific for M. malmoense , SEQ ID NOs: 143 and 145, which are specific for Mycobacterium malmoense . By selecting the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 147 and 149 specific to M. simiae and the sequences 154 and 159 specific to Mycobacterium smegmatis , respectively, the sense strand of the first nucleotide sequence ( primer with sense strand and antisense strand of second sequence PCR was performed with a pair of primers having an isense strand), and the results were confirmed by electrophoresis after PCR reaction with the mycobacterial strains.
도 6은 비결핵 마이코박테리아(NTM) 각 균주의 다형성 지역의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 각각의 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서, M은 분자량 표지로 100 bp 간격을 갖고 있으며, C는 대조군, 레인 1과 2는 TB 복합체인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosisH37Rv)와 마이코박테리움 보비스(M. bovisATCC 19210), 레인 3과 4는 마이코박테리움 아비움(M. aviumATCC 25291)과 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularaeATCC 13950), 레인 5는 마이코박테리움 포튜이튬 (M. fortuitumATCC 6841), 레인 6은 마이코박테리움 첼로네(M. chelonaeATCC 35752), 레인 7은 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessusATCC 19977), 레인 8은 마이코박테리움 베체(M. vaccaeATCC 15483), 레인 9는 마이코박테리움 플라베센스 (M. flavescensATCC 14474), 레인 10은 마이코박테리움 고도네(M. gordonaeATCC 14470), 레인 11은 마이코박테리움 테레(M. terraeATCC 15755), 레인 12는 마이코박테리움 스크로플래시움(M. scroflaceumATCC 19981), 레인 13은 마이코박테리움 칸사시(M. kansasiiATCC 12478), 레인 14는 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgaiATCC 35799), 레인 15는 마이코박테리움 마리눔(M. marinumATCC 927), 레인 16은 마이코박테리움 울세란스(M. ulceransATCC 19423), 레인 17은 마이코박테리움 가스트리(M. gastriATCC 15754), 레인 18은 마이코박테리움 제노피(M. xenopiATCC 19250), 레인 19는 마이코박테리움 제나벤스(M. genavenseATCC 1233), 레인 20은 마이코박테리움 말모엔스(M. malmoenseATCC 29571), 레인 21은 마이코박테리움 시미에(M. simiaeATCC 25275), 그리고 레인 22는 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatisATCC 21701)로, 레인 1∼22의 각 마이코박테리아 균주가 종 특이적으로증폭된 것을 볼 수 있다.Figure 6 is a photograph of the electrophoresis after PCR for each mycobacteria strain using a species-specific primer pair prepared from the nucleotide sequence of the polymorphic region of each non-tuberculosis mycobacteria (NTM) strain. Here, M has a 100 bp interval with a molecular weight label, C is a control, lanes 1 and 2 are mycobacterium tuberculosis (TB complex)M. tuberculosisH37Rv) and Mycobacterium Vorbis (M. bovisATCC 19210), lanes 3 and 4 Mycobacterium Abium (M. aviumATCC 25291) and Mycobacterium IntracellularM. intracellularaeATCC 13950), Lane 5 shows Mycobacterium Potitiumium (M. fortuitumATCC 6841), Lane 6 is the Mycobacterium Cellone (M. chelonaeATCC 35752), Lane 7 is Mycobacterium Epsus (M. abscessusATCC 19977), Lane 8 shows Mycobacterium Becce (M. vaccaeATCC 15483), lane 9 is Mycobacterium flavesense (M. flavescensATCC 14474), Lane 10 is Mycobacterium Godone (M. gordonaeATCC 14470), Lane 11 is Mycobacterium Tere (M. terraeATCC 15755), Lane 12 is Mycobacterium Scroflashum (M. scroflaceumATCC 19981), lane 13 shows the mycobacterium Kansashi (M. kansasiiATCC 12478), Lane 14 is Mycobacterium Schluggai (M. szulgaiATCC 35799), lane 15 shows Mycobacterium marinum (M. marinumATCC 927, lane 16 is Mycobacterium Ulcerans (M. ulceransATCC 19423), Lane 17 is Mycobacterium Gastri (M. gastriATCC 15754), Lane 18 is Mycobacterium Genophy (M. xenopiATCC 19250, lane 19 is Mycobacterium Jennavens (M. genavenseATCC 1233), Lane 20 is Mycobacterium Malmoens (M. malmoenseATCC 29571), Lane 21 is Mycobacterium Shimie (M. simiaeATCC 25275), and lane 22 is Mycobacterium smegmatis (M. smegmatisATCC 21701), the species-specific amplification of each mycobacterial strain in lanes 1 to 22 can be seen.
또한, 도 7은 비결핵 마이코박테리아(NTM) 각 균주의 다형성 지역의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서 보면, TB 복합체(complex)에 특이적인 제 1 단의 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)에서는 레인 1과 2의 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosisH37Rv)와 마이코박테리움 보비스(M. bovis)가 증폭되고, 마이코박테리움 아비움(M. avium)과 마이코박테리움 인트라셀룰라레 (M. intracellularae)에 특이적인 제 2 단의 프라이머쌍(MAC1와 MAC4)에서는 레인 3과 4의 마이코박테리움 아비움(M. avium)과 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularae)가 증폭되고, 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum)에 특이적인 제 3 단의 프라이머쌍(FOR2와 FOR10)에서는 레인 5의 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum)이 증폭되고, 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae)에 특이적인 제 4 단의 프라이머쌍(CHE3와 CHE6)에서는 레인 6의 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae)가 증폭되고, 마이코박테리움 고도네(M. gordonae)에 특이적인 제 5 단의 프라이머쌍(GOR1과 GOR3)에서는 레인 7의 마이코박테리움 고도네(M. gordonae)가 증폭되고, 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai)에 특이적인 제 6 단의 프라이머쌍(SZU1과 SZU2)에서는 레인 8의 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai)가 증폭되고, 그리고 마이코박테리움 스크로플래시움(M. scroflaceum)에 특이적인 제 7 단의 프라이머쌍 (SCO2와 SCO3)에서는 레인 10의 마이코박테리움 스크로플래시움(M. scroflaceum) 만이 증폭되고 다른 균종에서는 증폭이 일어나지 않은 것을 볼 수 있다. 레인 9는 마이코박테리움 테레(M. terrae)로, 이들 종 특이적인 프라이머쌍 어디에서도 증폭이 일어나지 않았다.In addition, Figure 7 is a picture of the electrophoresis after PCR for a variety of mycobacteria strains using species-specific primer pairs prepared from the nucleotide sequence of the polymorphic region of each non-tuberculosis mycobacteria (NTM) strain. Here, in the primer pairs of the first stage specific to the TB complex (ITSF and MYC2), Mycobacterium tuberculosis of lanes 1 and 2 (M. tuberculosisH37Rv) and Mycobacterium Vorbis (M. bovis) Is amplified, Mycobacterium Abium (M. avium) And Mycobacterium IntracellularM. intracellularaeIn the second pair of primer pairs (MAC1 and MAC4) specific to the mycobacterium avium (lanes 3 and 4)M. avium) And Mycobacterium IntracellularM. intracellularae) Is amplified and mycobacterium fortuitium (M. fortuitumIn the third primer pair (FOR2 and FOR10) specific to), the mycobacterium fortuitium of lane 5 (M. fortuitum) Is amplified, and Mycobacterium Cellone (M. chelonae), The fourth pair of primers (CHE3 and CHE6) are specific to the mycobacterium cellone (lane 6).M. chelonae) Is amplified, and Mycobacterium Godone (M. gordonaeIn the fifth primer pair (GOR1 and GOR3) specific toM. gordonae) Is amplified, and mycobacterium schullai (M. szulgaiIn the 6-stage primer pairs (SZU1 and SZU2) specific to Mycobacterium strugai (lane 8)M. szulgai) Is amplified, and Mycobacterium scroflashium (M. scroflaceumIn the seventh-stage primer pairs (SCO2 and SCO3), the Mycobacterium scroplasmium (lane 10)M. scroflaceum) Only amplified and no amplification in other species. Lane 9 is Mycobacterium Tere (M. terrae), No amplification occurred in any of these species specific primer pairs.
따라서, 각각의 종 특이적인 프라이머쌍에 의한 PCR 반응으로 마이코박테리아의 각 균종을 특이적으로 동정할 수 있음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that each species of mycobacteria can be specifically identified by PCR reaction with each species-specific primer pair.
이상에서 살펴본 바와 같이, 비결핵 마이코박테리아의 일종인 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스 (Mycobacterium acapulcensis), 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(Mycobacterium diernhoferi)의 내부전사지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 염기서열을 분석하고, 이를 이용하여 마이코박테리아 속의 동정 및 각각의 마이코박테리움 균종의 동정이 가능한 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머를 디자인할 수 있다. 이와 같이 얻어진 PCR용 프라이머 또는 혼성화 반응용 프로브에 의하면 이들 균종의 동정 결과를 신속하고도 효과적으로 얻을 수 있으며, TB 복합체와 NTM 균종의 구별이 가능하여 그 결과에 따라 올바른 치료 방법을 선택할 수 있고 동시 감염도 효과적으로 진단할 수 있다.As described above, Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium chelonae , Mycobacterium abscessus , Mycobacterium, which are a type of non-tuberculosis mycobacteria Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium asiaticum , Mycobacterium porcinum , Mycobacterium acapulsensis ( Mycobacterium acapulcensis ), and the nucleotide sequence of the Internal Transcribed Spacer region (ITS) of the Mycobacterium diernhoferi , and using this to identify the genus Mycobacterium and each Oligonucleotide probes or primers can be designed that allow for identification of the Leeum species. The PCR primers or hybridization reaction probes thus obtained can quickly and effectively obtain the identification results of these species, and can distinguish between TB complex and NTM species, so that the correct treatment method can be selected according to the result and simultaneous infection. It can also diagnose effectively.
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