KR101523877B1 - Methods for identification and detection of mycobacterium using real time polymerase chain reaction and melting curve analysis - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트, 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리아 동정용 키트 및 이를 이용하는 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 이용하는 마이코박테리아 동정 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의하면, 동정 가능한 마이코박테리아의 종의 종류가 많고, 검사가 간편하고 정확하며 빠르고, 적은 비용으로 효율적으로 마이코박테리아를 동정할 수 있는 임상진단 수단을 제공할 수 있다.The present invention relates to a kit for identification of mycobacteria including a primer set for identifying mycobacteria, a primer set for identifying mycobacteria, and a real-time PCR method using the same and a method for identification of mycobacteria using a melting curve analysis. According to the above method, a variety of species of mycobacteria that can be identified can be provided, and a clinical diagnostic tool capable of identifying mycobacteria efficiently, easily, accurately, quickly, and inexpensively can be provided.

Description

실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 이용하는 마이코박테리아의 동정 방법{METHODS FOR IDENTIFICATION AND DETECTION OF MYCOBACTERIUM USING REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION AND MELTING CURVE ANALYSIS}Identification method of mycobacteria using real-time polymerase chain reaction method and melting curve analysis {METHODS FOR IDENTIFICATION AND DETECTION OF MYCOBACTERIUM USING REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION AND MELTING CURVE ANALYSIS}

본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 이용하는 마이코박테리아의 동정 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트, 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리아 동정용 키트 및 이를 이용하는 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 이용하는 마이코박테리아 동정 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for identifying mycobacteria using a real-time polymerase chain reaction method and melting curve analysis. More specifically, it relates to a mycobacteria identification kit including a primer set for mycobacteria identification, a mycobacteria identification primer set, and a mycobacteria identification method using real-time polymerase chain reaction method and melting curve analysis using the same.

항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 나병균(Mycobacterium leprae)을 제외한 모든 마이코박테리아균을 지칭한다. 항산성비결핵균은 코흐가 결핵균을 발견한 후 얼마 지나지 않아 알려졌지만 최근에야 중요한 감염균으로 인식되기 시작하였다.Nontuberculous mycobacteria refers to all mycobacteria except Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae. The mycobacterium tuberculosis was known not long after Koch discovered tuberculosis, but only recently began to be recognized as an important infectious bacteria.

최근 보건당국의 노력으로 국내에서 결핵유병율이 저하하고 있으나 항산성비결핵균에 의한 감염은 증가하는 추세이다. 보고에 의하면 결핵도말 및 배양 양성 검체의 12%에서 항산성비결핵균이 분리된다. 또한 2009년 액체 결핵배양법이 보험급여 됨에 따라 액체결핵배양 검사를 실시하는 검사실이 늘고 있으며, 액체배지를 사용하여 결핵을 배양하는 경우 기존의 고체배지를 사용한 배양보다 항산성비결핵균의 검출이 증가한다. Recently, the prevalence of tuberculosis in Korea has been decreasing due to the efforts of the health authorities, but the number of infections caused by the acidic non-tuberculosis bacteria is on the rise. According to reports, acidic non-Tuberculosis bacteria were isolated from 12% of tuberculosis smears and culture-positive samples. In addition, as the liquid tuberculosis culture method was covered by insurance in 2009, the number of laboratories that conduct liquid tuberculosis culture tests is increasing, and when tuberculosis is cultured using liquid medium, the detection of acidic non-Tuberculosis bacteria is increased compared to culture using conventional solid culture media.

결핵균에 의한 유병률이 낮은 미국 및 유럽 여러나라에서도 항산성비결핵균에 의한 감염이 증가하고 있다. 미국의 보고에 의하면, 1979년에서 1980년에 분리된 마이코박테리아의 1/3에서 1992년에는 분리된 마이코박테리아의 3/4 으로 항산성비결핵균의 검출이 증가되었다. 또한 미국, 캐나다, 서유럽 등에서는 객담에서 분리된 항산성비결핵균의 40~50%가 폐질환을 일으킨다고 알려져 있다.In many countries in the United States and Europe, where the prevalence of Mycobacterium tuberculosis is low, the number of infections caused by Mycobacterium tuberculosis is increasing. According to a report from the United States, the detection of mycobacteria increased from one third of mycobacteria isolated in 1979 to 1980 to three quarters of mycobacteria isolated in 1992. In addition, in the United States, Canada, and Western Europe, it is known that 40-50% of the mycobacterium tuberculosis isolated from sputum causes lung disease.

마이코박테리아에 의한 감염증의 진단은 전통적으로 배양을 통해 균을 분리하고 생화학방법으로 동정하는 검사법을 사용한다. 그러나 이 방법은 마이코박테리아의 균 특성상 성장이 늦어 배양에 시간이 걸리고, 생화학적 방법만으로 다양한 마이코박테리아 균종을 정확하게 동정할 수 없다. 최근 분자생물학적 기법들을 이용한 마이코박테리아 동정법들이 검사실에 도입되고 있다. Accuprobe, INNO-LiPA 마이코박테리아, GenoType Mycobacterium CM, AS 등 상업용 검사 키트 등이다. 이들 검사키트 들은 검사시간이 상대적으로 짧고 민감하지만 동정 가능한 마이코박테리아의 종이 한정되어 있거나 PCR 반응 후 증폭산물을 교잡반응을 하는 과정에서 오염 가능성이 있는 단점이 있다. 따라서, 검사가 간편하고 정확하며 빠르고, 비용도 적게 들며, 동정 가능한 마이코박테리아의 종의 종류가 많은 마이코박테리아 동정 방법이 요구되고 있다.Diagnosis of infectious diseases caused by mycobacteria traditionally uses a test method that isolates bacteria through culture and identifies them by biochemical methods. However, this method takes time to cultivate due to the slow growth due to the characteristics of mycobacteria, and it is not possible to accurately identify various mycobacterial species only by biochemical methods. Recently, methods for the identification of mycobacteria using molecular biological techniques are being introduced into laboratories. Commercial test kits such as Accuprobe, INNO-LiPA mycobacteria, GenoType Mycobacterium CM, and AS. These test kits have a relatively short test time and are sensitive, but have a limited number of mycobacterial species that can be identified, or there is a possibility of contamination in the process of hybridizing the amplified product after PCR reaction. Therefore, there is a need for a method for identifying mycobacteria that is simple, accurate, fast, inexpensive, and has many types of mycobacteria that can be identified.

본 발명의 목적은 마이코박테리아를 특정 종으로 정확하게 검출하고 동정할 수 있는 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide a primer set for mycobacteria identification that can accurately detect and identify mycobacteria as a specific species.

본 발명의 다른 목적은 마이코박테리아를 특정 종으로 정확하게 검출하고 동정할 수 있는 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리아 동정용 키트를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a kit for identification of mycobacteria comprising a set of primers for identification of mycobacteria capable of accurately detecting and identifying mycobacteria as a specific species.

본 발명의 또 다른 목적은 마이코박테리아를 특정 종으로 정확하게 검출하고 동정할 수 있는 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리아 동정용 키트를 이용하는 이중 실시간 중합효소연쇄반응법(real-time polymerase chain reaction)과 융해곡선분석을 이용하는 마이코박테리아 동정 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is a double real-time polymerase chain reaction method using a kit for identification of mycobacteria including a set of primers for identification of mycobacteria that can accurately detect and identify mycobacteria as a specific species. ) And melting curve analysis.

상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 M.gastri의 ITS(Internal transcribed spacer) 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 M.gastri의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 M.xenopi의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 M.fortuitum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M. fortuitum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균(M. tuberculosis complex)의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성 비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 14의 정방향 프라이머 및 서열번호 15의 역방향 프라이머를 포함하는 M.abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머를 포함하는 M. intracellulare의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 21의 역방향 프라이머를 포함하는 M.szulgai의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 22의 정방향 프라이머 및 서열번호 23의 역방향 프라이머를 포함하는 M.terrae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 24의 정방향 프라이머 및 서열번호 25의 역방향 프라이머를 포함하는 M. avium의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 26의 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 역방향 프라이머를 포함하는 M. chelonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 28의 정방향 프라이머 및 서열번호 29의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M. kansasii 또는 M. gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 30의 정방향 프라이머 및 서열번호 31의 역방향 프라이머를 포함하는 M. kansasii 또는 M. gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 32의 정방향 프라이머 및 서열번호 33의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gordonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 34의 정방향 프라이머 및 서열번호 35의 역방향 프라이머를 포함하는 M.gordonae의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 36의 정방향 프라이머 및 서열번호 37의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M.ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 38의 정방향 프라이머 및 서열번호 39의 역방향 프라이머를 포함하는 M. simiae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 40의 정방향 프라이머 및 서열번호 41의 역방향 프라이머를 포함하는 M. ulcerans의 HSP65(Heat shock protein 65)에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 42의 정방향 프라이머 및 서열번호 43의 역방향 프라이머를 포함하는 M. septicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 44의 정방향 프라이머 및 서열번호 45의 역방향 프라이머를 포함하는 M. smegmatis의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 46의 정방향 프라이머 및 서열번호 47의 역방향 프라이머를 포함하는 M. smegmatis의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 48의 정방향 프라이머 및 서열번호 49의 역방향 프라이머를 포함하는 M.scrofulaceum의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 50의 정방향 프라이머 및 서열번호 51의 역방향 프라이머를 포함하는 M. scrofulaceum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 52의 정방향 프라이머 및 서열번호 53의 역방향 프라이머를 포함하는 M. haemophilum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 54의 정방향 프라이머 및 서열번호 55의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 56의 정방향 프라이머 및 서열번호 57의 역방향 프라이머를 포함하는 M. celatum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 58의 정방향 프라이머 및 서열번호 59의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 60의 정방향 프라이머 및 서열번호 61의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus 또는 M. chelonae의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 62의 정방향 프라이머 및 서열번호 63의 역방향 프라이머를 포함하는 M.peregrinum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 64의 정방향 프라이머 및 서열번호 65의 역방향 프라이머를 포함하는 M. mucogenicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 서열번호 66의 정방향 프라이머 및 서열번호 67의 역방향 프라이머를 포함하는 M. shimoidei의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the above object, a set of primers specific to the ITS (Internal transcribed spacer) gene of M. gastri including the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2; A primer set specific to the ITS gene of M. gastri comprising the forward primer of SEQ ID NO: 3 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4; A primer set specific to the ITS gene of M.xenopi comprising the forward primer of SEQ ID NO: 5 and the reverse primer of SEQ ID NO: 6; A primer set specific to the ITS gene of M. fortuitum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 7 and a reverse primer of SEQ ID NO: 8; A primer set specific to the ITS gene of M. fortuitum comprising a set of forward primers of SEQ ID NO: 7 and reverse primers of SEQ ID NO: 9; A primer set specific to the IS6110 gene of M. tuberculosis complex, including the forward primer of SEQ ID NO: 10 and the reverse primer of SEQ ID NO: 11; A primer set specific to the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria comprising the forward primer of SEQ ID NO: 12 and the reverse primer of SEQ ID NO: 13; A primer set specific to the ITS gene of M.abscessus comprising the forward primer of SEQ ID NO: 14 and the reverse primer of SEQ ID NO: 15; A primer set specific to the ITS gene of M. abscessus comprising the forward primer of SEQ ID NO: 16 and the reverse primer of SEQ ID NO: 17; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. intracellulare comprising a forward primer of SEQ ID NO: 18 and a reverse primer of SEQ ID NO: 19; A primer set specific to the ITS gene of M.szulgai comprising the forward primer of SEQ ID NO: 20 and the reverse primer of SEQ ID NO: 21; A primer set specific to the ITS gene of M. terrae comprising the forward primer of SEQ ID NO: 22 and the reverse primer of SEQ ID NO: 23; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. avium comprising the forward primer of SEQ ID NO: 24 and the reverse primer of SEQ ID NO: 25; A primer set specific to the ITS gene of M. chelonae comprising the forward primer of SEQ ID NO: 26 and the reverse primer of SEQ ID NO: 27; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. kansasii or M. gastri comprising a set of forward primers of SEQ ID NO: 28 and reverse primers of SEQ ID NO: 29; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. kansasii or M. gastri comprising a forward primer of SEQ ID NO: 30 and a reverse primer of SEQ ID NO: 31; A primer set specific to the ITS gene of M. gordonae comprising the forward primer of SEQ ID NO: 32 and the reverse primer of SEQ ID NO: 33; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. gordonae comprising the forward primer of SEQ ID NO: 34 and the reverse primer of SEQ ID NO: 35; A primer set specific to the ITS gene of M. marinum or M. ulcerans comprising a forward primer of SEQ ID NO: 36 and a reverse primer of SEQ ID NO: 37; A primer set specific to the ITS gene of M. simiae comprising a forward primer of SEQ ID NO: 38 and a reverse primer of SEQ ID NO: 39; A primer set specific to HSP65 (Heat shock protein 65) of M. ulcerans comprising a forward primer of SEQ ID NO: 40 and a reverse primer of SEQ ID NO: 41; A primer set specific to the ITS gene of M. septicum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 42 and the reverse primer of SEQ ID NO: 43; A primer set specific to the ITS gene of M. smegmatis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 44 and a reverse primer of SEQ ID NO: 45; A primer set specific to the ITS gene of M. smegmatis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 46 and a reverse primer of SEQ ID NO: 47; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M.scrofulaceum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 48 and the reverse primer of SEQ ID NO: 49; A primer set specific to the ITS gene of M. scrofulaceum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 50 and the reverse primer of SEQ ID NO: 51; A primer set specific to the ITS gene of M. haemophilum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 52 and the reverse primer of SEQ ID NO: 53; A primer set specific to the ITS gene of M. marinum or M. ulcerans comprising the forward primer of SEQ ID NO: 54 and the reverse primer of SEQ ID NO: 55; A primer set specific to the ITS gene of M. celatum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 56 and the reverse primer of SEQ ID NO: 57; A primer set specific to the ITS gene of M. abscessus comprising a forward primer of SEQ ID NO: 58 and a reverse primer of SEQ ID NO: 59; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. abscessus or M. chelonae comprising a forward primer of SEQ ID NO: 60 and a reverse primer of SEQ ID NO: 61; A primer set specific to the ITS gene of M. peregrinum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 62 and a reverse primer of SEQ ID NO: 63; A primer set specific to the ITS gene of M. mucogenicum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 64 and a reverse primer of SEQ ID NO: 65; And it provides a primer set for the identification of mycobacteria comprising two or more primer sets selected from the group consisting of a primer set specific to the ITS gene of M. shimoidei comprising a forward primer of SEQ ID NO: 66 and a reverse primer of SEQ ID NO: 67.

상기 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트에서, 항산성비결핵균 중 M.gastri, M. xenopi, M. fortuitum, M. abscessus, M. avium, M. intracellulare, M.szulgai, M. terrae, M. chelonae, M. kansasii, M. gordonae, M. marinum, M. simiae, M.ulcerans, M. septicum, M. smegmatis, M. scrofulaceum, M. haemophilum, M.celatum, M. peregrinum, M. mucogenicum, M. shimoidei는 16S rRNA 유전자, hsp65(Heat Shock Protein 65) 유전자, ITS(internal transcribed spacer) 유전자를 타겟으로 하여, 각 균주에 특이적이면서도 각 균주의 실시간 증폭 산물의 융해 곡선의 융해온도(Tm)차이가 크도록 설계된 것이다. In the primer set for identification of mycobacteria, M.gastri, M. xenopi , M. fortuitum , M. abscessus , M. avium , M. intracellulare , M.szulgai , M. terrae , M. chelonae , M. . kansasii, M. gordonae, M. marinum , M. simiae, M.ulcerans, M. septicum, M. smegmatis, M. scrofulaceum, M. haemophilum, M.celatum, M. peregrinum, M. mucogenicum, M. shimoidei Targets the 16S rRNA gene, hsp65 (Heat Shock Protein 65) gene, and ITS (internal transcribed spacer) gene, which is specific to each strain and has a large difference in melting temperature (Tm) of the melting curve of the real-time amplification products of each strain. It is designed to be

서열번호 28의 정방향 프라이머 및 서열번호 29의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M. kansasii 또는 M. gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트는 M. kansasii 또는 M. gastri의 균주에 특이적으로, 실시간 중합효소연쇄반응 및 융해곡선 분석 시 상기 두 균주의 간에 염기서열이 동일하여 두 균주를 서로 구별할 수는 없으나, 다른 마이코박테리아 균주와는 구별할 수 있도록 설계된 것이다.A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. kansasii or M. gastri including a set of forward primers of SEQ ID NO: 28 and reverse primers of SEQ ID NO: 29 is specific to a strain of M. kansasii or M. gastri , in real time. When analyzing the polymerase chain reaction and melting curve, the two strains cannot be distinguished from each other because the base sequence is the same between the two strains, but it is designed to be distinguished from other mycobacterial strains.

서열번호 30의 정방향 프라이머 및 서열번호 31의 역방향 프라이머를 포함하는 M. kansasii 또는 M. gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트M.kansasii 또는 M. gastri의 균주에 특이적으로, 실시간 중합효소연쇄반응 및 융해곡선 분석 시 상기 두 균주의 간에 염기서열이 동일하여 두 균주를 서로 구별할 수는 없으나, 다른 마이코박테리아 균주와는 구별할 수 있도록 설계된 것이다.A specific primer set specific to the 16S rRNA gene of M. kansasii or M. gastri comprising the forward primer of SEQ ID NO: 30 and the reverse primer of SEQ ID NO: 31 , specific to the strain of M.kansasii or M. gastri , real-time polymerase chain When analyzing the reaction and melting curve, the two strains cannot be distinguished from each other because the nucleotide sequence is the same between the two strains, but it is designed to be distinguished from other mycobacterial strains.

서열번호 36의 정방향 프라이머 및 서열번호 37의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트는 M.marinum 또는 M. ulcerans의 균주에 특이적으로, 실시간 중합효소연쇄반응 및 융해곡선 분석 시 상기 두 균주의 간에 염기서열이 동일하여 두 균주를 서로 구별할 수는 없으나, 다른 마이코박테리아 균주와는 구별할 수 있도록 설계된 것이다.Specific primer sets on the ITS gene of M. marinum or M. ulcerans comprising a forward primer and a reverse primer of SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 36 is specifically to the strain of the M.marinum or M. ulcerans, real-time polymerase chain When analyzing the reaction and melting curve, the two strains cannot be distinguished from each other because the nucleotide sequence is the same between the two strains, but it is designed to be distinguished from other mycobacterial strains.

서열번호 54의 정방향 프라이머 및 서열번호 55의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트는 M.marinum 또는 M. ulcerans의 균주에 특이적으로, 실시간 중합효소연쇄반응 및 융해곡선 분석 시 상기 두 균주의 간에 염기서열이 동일하여 두 균주를 서로 구별할 수는 없으나, 다른 마이코박테리아 균주와는 구별할 수 있도록 설계된 것이다.Specific primer sets on the ITS gene of M. marinum or M. ulcerans comprising a forward primer and SEQ ID NO: 55 reverse primer of SEQ ID NO: 54 is specifically to the strain of the M.marinum or M. ulcerans, real-time polymerase chain When analyzing the reaction and melting curve, the two strains cannot be distinguished from each other because the nucleotide sequence is the same between the two strains, but it is designed to be distinguished from other mycobacterial strains.

서열번호 60의 정방향 프라이머 및 서열번호 61의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus 또는 M. chelonae의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트는 M.abscessus 또는 M. chelonae의 균주에 특이적으로, 실시간 중합효소연쇄반응 및 융해곡선 분석 시 상기 두 균주의 간에 염기서열이 동일하여 두 균주를 서로 구별할 수는 없으나, 다른 마이코박테리아 균주와는 구별할 수 있도록 설계된 것이다.16S rRNA-specific primer set for a gene of M. abscessus or M. chelonae comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 60 and a reverse primer of SEQ ID NO: 61 is specifically to the strain of M.abscessus or M. chelonae, real-time polymerase In the case of chain reaction and melting curve analysis, the two strains cannot be distinguished from each other because the base sequence is the same between the two strains, but it is designed to be distinguished from other mycobacterial strains.

상기 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트에서 결핵균과 항산성비결핵균은 각각 결핵균의 IS6110 유전자 및 항산성비결핵균의 16S rRNA에 특이적이면서 상기 균주 간의 실시간 증폭 산물의 융해 곡선의 융해온도(Tm)차이가 크도록 설계된 것이다.In the primer set for mycobacteria identification, Mycobacterium tuberculosis and mycobacterium tuberculosis are designed to have a large difference in melting temperature (Tm) of the melting curve of real-time amplification products between the strains while being specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis and the 16S rRNA of mycobacterium tuberculosis. will be.

상기 프라이머 세트는 실시간 증폭 산물의 염기서열, 크기 및 GC 비율에 따라 특징적인 융해곡선을 보이므로 이를 고려하여 설계된 것이다.The primer set was designed in consideration of the characteristic melting curve according to the base sequence, size and GC ratio of the real-time amplification product.

상기 서열번호 12의 정방향 프라이머(5′-tktggtggaaagcttttgc-3′)는 5′-tgtggtggaaagcttttgc-3′(서열번호 68) 및 5′-tttggtggaaagcttttgc-3′ (서열번호 69)를 포함하는 프라이머 세트이다. 예를 들어, 5′-tgtggtggaaagcttttgc-3′(서열번호 68) 및 5′-tttggtggaaagcttttgc-3′(서열번호 69)가 1:1의 비율로 포함되는 프라이머 세트일 수 있다.The forward primer of SEQ ID NO: 12 (5'-tktggtggaaagcttttgc-3') is a primer set comprising 5'-tgtggtggaaagcttttgc-3' (SEQ ID NO: 68) and 5'-tttggtggaaagcttttgc-3' (SEQ ID NO: 69). For example, 5'-tgtggtggaaagcttttgc-3' (SEQ ID NO: 68) and 5'-tttggtggaaagcttttgc-3' (SEQ ID NO: 69) may be a primer set including a 1:1 ratio.

상기 서열번호 18의 정방향 프라이머(5′-ggtctaataccgrataggaccttta-3′)는 5′-ggtctaataccggataggaccttta-3′ (서열번호 70) 및 5′-ggtctaataccgaataggaccttta-3′ (서열번호 71)를 포함하는 프라이머 세트이다. 예를 들어, 5′-ggtctaataccggataggaccttta-3′(서열번호 70) 및 5′-ggtctaataccgaataggaccttta-3′(서열번호 71)가 1:1의 비율로 포함되는 프라이머 세트일 수 있다.The forward primer of SEQ ID NO: 18 (5'-ggtctaataccgrataggaccttta-3') is a primer set comprising 5'-ggtctaataccggataggaccttta-3' (SEQ ID NO: 70) and 5'-ggtctaataccgaataggaccttta-3' (SEQ ID NO: 71). For example, 5'-ggtctaataccggataggaccttta-3' (SEQ ID NO: 70) and 5'-ggtctaataccgaataggaccttta-3' (SEQ ID NO: 71) may be a primer set including a 1:1 ratio.

상기 서열번호 19의 역방향 프라이머(5′-cgcaaaagctttccaccwa-3′)는 5′-cgcaaaagctttccaccaa-3′ (서열번호 72) 및 5′-cgcaaaagctttccaccta-3′ (서열번호 73)를 포함하는 프라이머 세트이다. 예를들어, 5′-cgcaaaagctttccaccaa-3′(서열번호 72) 및 5′-cgcaaaagctttccaccta-3′(서열번호 73)가 1:1의 비율로 포함되는 프라이머 세트일 수 있다.The reverse primer of SEQ ID NO: 19 (5'-cgcaaaagctttccaccwa-3') is a primer set comprising 5'-cgcaaaagctttccaccaa-3' (SEQ ID NO: 72) and 5'-cgcaaaagctttccaccta-3' (SEQ ID NO: 73). For example, 5'-cgcaaaagctttccaccaa-3' (SEQ ID NO: 72) and 5'-cgcaaaagctttccaccta-3' (SEQ ID NO: 73) may be a primer set including a 1:1 ratio.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gastri의 ITS(Internal transcribed spacer) 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gastri의 ITS(Internal transcribed spacer) 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 M. xenopi의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 M.fortuitum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M. fortuitum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균(M. tuberculosis complex)의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성 비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 14의 정방향 프라이머 및 서열번호 15의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머를 포함하는 M.abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머를 포함하는 M. intracellulare의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 21의 역방향 프라이머를 포함하는 M. szulgai의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 22의 정방향 프라이머 및 서열번호 23의 역방향 프라이머를 포함하는 M.terrae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 24의 정방향 프라이머 및 서열번호 25의 역방향 프라이머를 포함하는 M. avium의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 26의 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 역방향 프라이머를 포함하는 M. chelonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 28의 정방향 프라이머 및 서열번호 29의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M.kansasii 또는 M. gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 30의 정방향 프라이머 및 서열번호 31의 역방향 프라이머를 포함하는 M. kansasii 또는 M. gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 32의 정방향 프라이머 및 서열번호 33의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gordonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 34의 정방향 프라이머 및 서열번호 35의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gordonae의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 36의 정방향 프라이머 및 서열번호 37의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 38의 정방향 프라이머 및 서열번호 39의 역방향 프라이머를 포함하는 M. simiae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 40의 정방향 프라이머 및 서열번호 41의 역방향 프라이머를 포함하는 M. ulcerans의 HSP65(Heat shock protein 65)에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 42의 정방향 프라이머 및 서열번호 43의 역방향 프라이머를 포함하는 M. septicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 44의 정방향 프라이머 및 서열번호 45의 역방향 프라이머를 포함하는 M.smegmatis의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 46의 정방향 프라이머 및 서열번호 47의 역방향 프라이머를 포함하는 M. smegmatis의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 48의 정방향 프라이머 및 서열번호 49의 역방향 프라이머를 포함하는 M. scrofulaceum의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 50의 정방향 프라이머 및 서열번호 51의 역방향 프라이머를 포함하는 M.scrofulaceum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 52의 정방향 프라이머 및 서열번호 53의 역방향 프라이머를 포함하는 M. haemophilum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 54의 정방향 프라이머 및 서열번호 55의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 56의 정방향 프라이머 및 서열번호 57의 역방향 프라이머를 포함하는 M. celatum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 58의 정방향 프라이머 및 서열번호 59의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 60의 정방향 프라이머 및 서열번호 61의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus 또는 M. chelonae의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 62의 정방향 프라이머 및 서열번호 63의 역방향 프라이머를 포함하는 M. peregrinum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 64의 정방향 프라이머 및 서열번호 65의 역방향 프라이머를 포함하는 M.mucogenicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 서열번호 66의 정방향 프라이머 및 서열번호 67의 역방향 프라이머를 포함하는 M. shimoidei의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리아 동정용 키트를 제공한다.In order to achieve the above other object, a primer set specific to the ITS (Internal transcribed spacer) gene of M. gastri including the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2; A primer set specific to the ITS (Internal transcribed spacer) gene of M. gastri including the forward primer of SEQ ID NO: 3 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4; A primer set specific to the ITS gene of M. xenopi comprising the forward primer of SEQ ID NO: 5 and the reverse primer of SEQ ID NO: 6; A primer set specific to the ITS gene of M. fortuitum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 7 and a reverse primer of SEQ ID NO: 8; A primer set specific to the ITS gene of M. fortuitum comprising a set of forward primers of SEQ ID NO: 7 and reverse primers of SEQ ID NO: 9; A primer set specific to the IS6110 gene of M. tuberculosis complex, including the forward primer of SEQ ID NO: 10 and the reverse primer of SEQ ID NO: 11; A primer set specific to the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria comprising the forward primer of SEQ ID NO: 12 and the reverse primer of SEQ ID NO: 13; A primer set specific to the ITS gene of M. abscessus comprising a forward primer of SEQ ID NO: 14 and a reverse primer of SEQ ID NO: 15; A primer set specific to the ITS gene of M.abscessus comprising the forward primer of SEQ ID NO: 16 and the reverse primer of SEQ ID NO: 17; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. intracellulare comprising a forward primer of SEQ ID NO: 18 and a reverse primer of SEQ ID NO: 19; A primer set specific to the ITS gene of M. szulgai comprising the forward primer of SEQ ID NO: 20 and the reverse primer of SEQ ID NO: 21; A primer set specific to the ITS gene of M. terrae comprising the forward primer of SEQ ID NO: 22 and the reverse primer of SEQ ID NO: 23; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. avium comprising the forward primer of SEQ ID NO: 24 and the reverse primer of SEQ ID NO: 25; A primer set specific to the ITS gene of M. chelonae comprising the forward primer of SEQ ID NO: 26 and the reverse primer of SEQ ID NO: 27; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M.kansasii or M. gastri comprising a set of forward primers of SEQ ID NO: 28 and reverse primers of SEQ ID NO: 29; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. kansasii or M. gastri comprising a forward primer of SEQ ID NO: 30 and a reverse primer of SEQ ID NO: 31; A primer set specific to the ITS gene of M. gordonae comprising the forward primer of SEQ ID NO: 32 and the reverse primer of SEQ ID NO: 33; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. gordonae comprising the forward primer of SEQ ID NO: 34 and the reverse primer of SEQ ID NO: 35; A primer set specific to the ITS gene of M. marinum or M. ulcerans comprising a forward primer of SEQ ID NO: 36 and a reverse primer of SEQ ID NO: 37; A primer set specific to the ITS gene of M. simiae comprising a forward primer of SEQ ID NO: 38 and a reverse primer of SEQ ID NO: 39; A primer set specific to HSP65 (Heat shock protein 65) of M. ulcerans comprising a forward primer of SEQ ID NO: 40 and a reverse primer of SEQ ID NO: 41; A primer set specific to the ITS gene of M. septicum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 42 and the reverse primer of SEQ ID NO: 43; A primer set specific to the ITS gene of M.smegmatis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 44 and a reverse primer of SEQ ID NO: 45; A primer set specific to the ITS gene of M. smegmatis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 46 and a reverse primer of SEQ ID NO: 47; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. scrofulaceum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 48 and the reverse primer of SEQ ID NO: 49; A primer set specific to the ITS gene of M.scrofulaceum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 50 and the reverse primer of SEQ ID NO: 51; A primer set specific to the ITS gene of M. haemophilum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 52 and the reverse primer of SEQ ID NO: 53; A primer set specific to the ITS gene of M. marinum or M. ulcerans comprising the forward primer of SEQ ID NO: 54 and the reverse primer of SEQ ID NO: 55; A primer set specific to the ITS gene of M. celatum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 56 and the reverse primer of SEQ ID NO: 57; A primer set specific to the ITS gene of M. abscessus comprising a forward primer of SEQ ID NO: 58 and a reverse primer of SEQ ID NO: 59; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. abscessus or M. chelonae comprising a forward primer of SEQ ID NO: 60 and a reverse primer of SEQ ID NO: 61; A primer set specific to the ITS gene of M. peregrinum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 62 and the reverse primer of SEQ ID NO: 63; A primer set specific to the ITS gene of M.mucogenicum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 64 and the reverse primer of SEQ ID NO: 65; And a primer set for identification of mycobacteria comprising two or more primer sets selected from the group consisting of a primer set specific to the ITS gene of M. shimoidei comprising a forward primer of SEQ ID NO: 66 and a reverse primer of SEQ ID NO: 67. Provides a kit for identification of bacteria.

상기 마이코박테리아 동정용 키트는 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 상기 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하기 위한 시약으로는 DNA 중합효소, dNTPs, PCR 버퍼 등을 포함할 수 있다. 상기 마이코박테리아 동정용 키트는 마이코박테리아를 신뢰성 있게 구별할 수 있도록, 각 균주를 특정 균으로 동정하기 위하여 특정 균주에 특이적인 유전자를 타겟으로 하면서도, 융해온도 차이가 크도록 설계된 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 실시간 증폭 산물의 염기서열, 크기 및 GC 비율에 따라 특징적인 융해곡선을 보이므로 이를 고려하여 설계된 것이다.The kit for identification of mycobacteria may include a reagent for amplifying DNA through a real-time polymerase chain reaction. Reagents for amplifying the DNA by real-time polymerase chain reaction may include DNA polymerase, dNTPs, PCR buffer, and the like. The kit for identification of mycobacteria may include a primer designed to have a large difference in melting temperature while targeting a gene specific to a specific strain in order to identify each strain as a specific bacteria so as to reliably distinguish the mycobacteria. . The primer set was designed in consideration of the characteristic melting curve according to the base sequence, size and GC ratio of the real-time amplification product.

본 발명의 일실시예에 따른 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트에는 SYBR Green과 같은 형광 색소는 고농도에서 중합효소연쇄반응을 저하시키고 융해과정에서 형광색소의 재분포가 일어나 유전자형결정까지 가능한 고해상 융해곡선(high-resolution melting curve)분석에는 불리할 수 있으므로, SYTO 9, EvaGreen, LCGreen 등의 형광색소를 포함할 수 있다. 다시 말해, 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 위한 반응액에는 상기 SYTO 9, EvaGreen, LCGreen 등의 형광색소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 위한 반응액에는 EvaGreen 형광색소가 포함될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 Type-it HRM PCR 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 실시간-중합효소연쇄반응을 실시하였다. 상기 Type-it HRM PCR 키트에는 형광 색소로서 EvaGreen이 들어 있다.In the kit for detecting Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis according to an embodiment of the present invention, a fluorescent dye such as SYBR Green lowers the polymerase chain reaction at a high concentration, and redistribution of the fluorescent dye occurs during the melting process, resulting in a high resolution melting curve ( High-resolution melting curve) analysis may be unfavorable, so fluorescent dyes such as SYTO 9, EvaGreen, and LCGreen may be included. In other words, the reaction solution for real-time polymerase chain reaction method and melting curve analysis may contain fluorescent dyes such as SYTO 9, EvaGreen, and LCGreen. For example, the reaction solution for polymerase chain reaction method and melting curve analysis may contain EvaGreen fluorescent dye. In one embodiment of the present invention, a real-time-polymerase chain reaction was performed using a Type-it HRM PCR kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA). The Type-it HRM PCR kit contains EvaGreen as a fluorescent dye.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 마이코박테리아 동정용 키트는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gastri의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 M. xenopi의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 M.fortuitum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성 비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제1 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 14의 정방향 프라이머 및 서열번호 15의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머를 포함하는 M. intracellulare의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 21의 역방향 프라이머를 포함하는 M. szulgai의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 및 서열번호 22의 정방향 프라이머 및 서열번호 23의 역방향 프라이머를 포함하는 M. terrae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제2 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 24의 정방향 프라이머 및 서열번호 25의 역방향 프라이머를 포함하는 M.avium의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 26의 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 역방향 프라이머를 포함하는 M. chelonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 28의 정방향 프라이머 및 서열번호 29의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M. kansasii 또는 M. gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 32의 정방향 프라이머 및 서열번호 33의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gordonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제3 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 36의 정방향 프라이머 및 서열번호 37의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 38의 정방향 프라이머 및 서열번호 39의 역방향 프라이머를 포함하는 M. simiae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 40의 정방향 프라이머 및 서열번호 41의 역방향 프라이머를 포함하는 M.ulcerans의 HSP65에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 42의 정방향 프라이머 및 서열번호 43의 역방향 프라이머를 포함하는 M. septicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 44의 정방향 프라이머 및 서열번호 45의 역방향 프라이머를 포함하는 M. smegmatis의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제4 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 48의 정방향 프라이머 및 서열번호 49의 역방향 프라이머를 포함하는 M. scrofulaceum의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 50의 정방향 프라이머 및 서열번호 51의 역방향 프라이머를 포함하는 M. scrofulaceum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 52의 정방향 프라이머 및 서열번호 53의 역방향 프라이머를 포함하는 M.haemophilum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 56의 정방향 프라이머 및 서열번호 57의 역방향 프라이머를 포함하는 M. celatum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제5 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 및 서열번호 58의 정방향 프라이머 및 서열번호 59의 역방향 프라이머를 포함하는 M.abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 62의 정방향 프라이머 및 서열번호 63의 역방향 프라이머를 포함하는 M. peregrinum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 64의 정방향 프라이머 및 서열번호 65의 역방향 프라이머를 포함하는 M. mucogenicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 66의 정방향 프라이머 및 서열번호 67의 역방향 프라이머를 포함하는 M.shimoidei의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제6 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트로 이루질 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the kit for identification of mycobacteria is a primer set specific to the ITS gene of M. gastri comprising a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, specific primers sets the ITS gene of M. xenopi, which contains the reverse primer of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: forward primer specific for a primer set for a gene of the ITS M.fortuitum comprising a reverse primer of 8, 16S rRNA gene of acidic non-Tuberculosis bacteria comprising a primer set specific to the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis including a forward primer of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer of SEQ ID NO: 11, and a forward primer of SEQ ID NO: 12 and a reverse primer of SEQ ID NO: 13 A first primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the group; A primer set specific for the ITS gene of M. abscessus comprising a forward primer of SEQ ID NO: 14 and a reverse primer of SEQ ID NO: 15, a forward primer of SEQ ID NO: 18, and a 16S rRNA of M. intracellulare comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 19. A primer set specific for the gene, a primer set specific for the ITS gene of M. szulgai comprising a forward primer of SEQ ID NO: 20 and a reverse primer of SEQ ID NO: 21, and a forward primer of SEQ ID NO: 22 and a reverse primer of SEQ ID NO: 23. A second primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. terrae containing; ITS of M. chelonae comprising a primer set specific to the 16S rRNA gene of M.avium comprising a forward primer of SEQ ID NO: 24 and a reverse primer of SEQ ID NO: 25, a forward primer of SEQ ID NO: 26, and a reverse primer of SEQ ID NO: 27. A primer set specific for the gene-specific primer set, a primer set specific for the 16S rRNA gene of M. kansasii or M. gastri comprising a set of a forward primer of SEQ ID NO: 28 and a reverse primer of SEQ ID NO: 29, and a forward primer and sequence of SEQ ID NO: 32 A third primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. gordonae comprising the reverse primer of No. 33; M. containing the reverse primer of the primer set specific for SEQ ID NO: 38 of the forward primer and SEQ ID NO: 39 to the ITS gene of M. marinum or M. ulcerans containing SEQ ID NO: 36 of the forward primer and a reverse primer of SEQ ID NO: 37 simiae ITS gene-specific primer set, a primer set specific to HSP65 of M.ulcerans comprising a forward primer of SEQ ID NO: 40 and a reverse primer of SEQ ID NO: 41, a forward primer of SEQ ID NO: 42, and a reverse primer of SEQ ID NO: 43 Identification of a fourth mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. septicum and a primer set specific to the ITS gene of M. smegmatis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 44 and a reverse primer of SEQ ID NO: 45. Primer set for; ITS of M. scrofulaceum comprising a primer set specific to the 16S rRNA gene of M. scrofulaceum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 48 and a reverse primer of SEQ ID NO: 49, a forward primer of SEQ ID NO: 50, and a reverse primer of SEQ ID NO: 51. A primer set specific to the ITS gene of M.haemophilum comprising a gene-specific primer set, a forward primer of SEQ ID NO: 52 and a reverse primer of SEQ ID NO: 53, and a forward primer of SEQ ID NO: 56 and a reverse primer of SEQ ID NO: 57 A fifth mycobacteria identification primer set comprising a primer set specific to the ITS gene of M. celatum; And of SEQ ID NO: M. peregrinum containing specific primer sets, the forward primer of SEQ ID NO: 62 and a reverse primer of SEQ ID NO: 63 to the ITS gene of M.abscessus containing 58 forward primer and a reverse primer of SEQ ID NO: 59 ITS A primer set specific to the gene, a primer set specific to the ITS gene of M. mucogenicum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 64 and a reverse primer of SEQ ID NO: 65, and a forward primer of SEQ ID NO: 66 and a reverse primer of SEQ ID NO: 67 The sixth mycobacteria identification primer set including a primer set specific to the ITS gene of M. shimoidei may be used.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 마이코박테리아 동정용 키트는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gastri의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 M. xenopi의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 M.fortuitum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성 비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제1 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머를 포함하는 M. intracellulare의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 21의 역방향 프라이머를 포함하는 M. szulgai의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 및 서열번호 22의 정방향 프라이머 및 서열번호 23의 역방향 프라이머를 포함하는 M. terrae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제2 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 24의 정방향 프라이머 및 서열번호 25의 역방향 프라이머를 포함하는 M.avium의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 26의 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 역방향 프라이머를 포함하는 M. chelonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 28의 정방향 프라이머 및 서열번호 29의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M. kansasii 또는 M. gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 32의 정방향 프라이머 및 서열번호 33의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gordonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제3 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 38의 정방향 프라이머 및 서열번호 39의 역방향 프라이머를 포함하는 M. simiae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 40의 정방향 프라이머 및 서열번호 41의 역방향 프라이머를 포함하는 M. ulcerans의 HSP65에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 42의 정방향 프라이머 및 서열번호 43의 역방향 프라이머를 포함하는 M. septicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 44의 정방향 프라이머 및 서열번호 45의 역방향 프라이머를 포함하는 M. smegmatis의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제4 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 48의 정방향 프라이머 및 서열번호 49의 역방향 프라이머를 포함하는 M. scrofulaceum의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 52의 정방향 프라이머 및 서열번호 53의 역방향 프라이머를 포함하는 M. haemophilum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 54의 정방향 프라이머 및 서열번호 55의 역방향 프라이머를 포함하는 M.marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 56의 정방향 프라이머 및 서열번호 57의 역방향 프라이머를 포함하는 M. celatum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제5 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 및 서열번호 60의 정방향 프라이머 및 서열번호 61의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus 또는 M. chelonae의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 62의 정방향 프라이머 및 서열번호 63의 역방향 프라이머를 포함하는 M. peregrinum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 64의 정방향 프라이머 및 서열번호 65의 역방향 프라이머를 포함하는 M. mucogenicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 66의 정방향 프라이머 및 서열번호 67의 역방향 프라이머를 포함하는 M. shimoidei의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제6 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the kit for identification of mycobacteria is a set of primers specific to the ITS gene of M. gastri including a forward primer of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and a forward primer of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, specific primers sets the ITS gene of M. xenopi, which contains the reverse primer of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: forward primer specific for a primer set for a gene of the ITS M.fortuitum comprising a reverse primer of 8, 16S rRNA gene of acidic non-Tuberculosis bacteria comprising a primer set specific to the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis including a forward primer of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer of SEQ ID NO: 11, and a forward primer of SEQ ID NO: 12 and a reverse primer of SEQ ID NO: 13 A first primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the group; A primer set specific for the ITS gene of M. abscessus comprising a forward primer of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, and a 16S rRNA of M. intracellulare comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 19. A primer set specific for the gene, a primer set specific for the ITS gene of M. szulgai comprising a forward primer of SEQ ID NO: 20 and a reverse primer of SEQ ID NO: 21, and a forward primer of SEQ ID NO: 22 and a reverse primer of SEQ ID NO: 23. A second primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. terrae containing; ITS of M. chelonae comprising a primer set specific to the 16S rRNA gene of M.avium comprising a forward primer of SEQ ID NO: 24 and a reverse primer of SEQ ID NO: 25, a forward primer of SEQ ID NO: 26, and a reverse primer of SEQ ID NO: 27. A primer set specific for the gene-specific primer set, a primer set specific for the 16S rRNA gene of M. kansasii or M. gastri comprising a set of a forward primer of SEQ ID NO: 28 and a reverse primer of SEQ ID NO: 29, and a forward primer and sequence of SEQ ID NO: 32 A third primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. gordonae comprising the reverse primer of No. 33; A primer set specific for the ITS gene of M. simiae comprising a forward primer of SEQ ID NO: 38 and a reverse primer of SEQ ID NO: 39, a forward primer of SEQ ID NO: 40 and a reverse primer of SEQ ID NO: 41 to HSP65 of M. ulcerans comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 41 A specific primer set, a primer set specific to the ITS gene of M. septicum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 42 and a reverse primer of SEQ ID NO: 43, and M comprising a forward primer of SEQ ID NO: 44 and a reverse primer of SEQ ID NO: 45 the fourth mycobacteria identifying primer set comprising a set of primers specific to the gene of the ITS smegmatis; ITS of M. haemophilum comprising a primer set specific for the 16S rRNA gene of M. scrofulaceum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 48 and a reverse primer of SEQ ID NO: 49, a forward primer of SEQ ID NO: 52, and a reverse primer of SEQ ID NO: 53. A primer set specific to the ITS gene of M.marinum or M. ulcerans comprising a primer set specific to the gene, a forward primer of SEQ ID NO: 54 and a reverse primer of SEQ ID NO: 55; A fifth mycobacterial identification primer set comprising a primer set specific to the ITS gene of M. celatum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 56 and the reverse primer of SEQ ID NO: 57; And a primer set specific for the 16S rRNA gene of M. abscessus or M. chelonae comprising a forward primer of SEQ ID NO: 60 and a reverse primer of SEQ ID NO: 61, a forward primer of SEQ ID NO: 62, and a reverse primer of SEQ ID NO: 63. A primer set specific to the ITS gene of M. peregrinum , a primer set specific to the ITS gene of M. mucogenicum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 64 and a reverse primer of SEQ ID NO: 65, and a forward primer of SEQ ID NO: 66 and a forward primer of SEQ ID NO: 67 It may consist of a primer set for identification of the sixth mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. shimoidei containing the reverse primer of.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 마이코박테리아 동정용 키트는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 M. xenopi의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 62의 정방향 프라이머 및 서열번호 63의 역방향 프라이머를 포함하는 M. peregrinum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성 비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제1 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머를 포함하는 M. intracellulare의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 21의 역방향 프라이머를 포함하는 M. szulgai의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 및 서열번호 22의 정방향 프라이머 및 서열번호 23의 역방향 프라이머를 포함하는 M. terrae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제2 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 24의 정방향 프라이머 및 서열번호 25의 역방향 프라이머를 포함하는 M. avium의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 26의 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 역방향 프라이머를 포함하는 M. chelonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 30의 정방향 프라이머 및 서열번호 31의 역방향 프라이머를 포함하는 M. kansasii 또는 M.gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M. fortuitum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제3 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 38의 정방향 프라이머 및 서열번호 39의 역방향 프라이머를 포함하는 M. simiae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 40의 정방향 프라이머 및 서열번호 41의 역방향 프라이머를 포함하는 M. ulcerans의 HSP65에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 42의 정방향 프라이머 및 서열번호 43의 역방향 프라이머를 포함하는 M. septicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 34의 정방향 프라이머 및 서열번호 35의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gordonae의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제4 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 48의 정방향 프라이머 및 서열번호 49의 역방향 프라이머를 포함하는 M. scrofulaceum의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 54의 정방향 프라이머 및 서열번호 55의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 46의 정방향 프라이머 및 서열번호 47의 역방향 프라이머를 포함하는 M. smegmatis의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제5 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 M.gastri의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 64의 정방향 프라이머 및 서열번호 65의 역방향 프라이머를 포함하는 M. mucogenicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 56의 정방향 프라이머 및 서열번호 57의 역방향 프라이머를 포함하는 M. celatum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제6 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the kit for identification of mycobacteria is a set of primers specific to the ITS gene of M. xenopi including a forward primer of SEQ ID NO: 5 and a reverse primer of SEQ ID NO: 6, and a forward primer of SEQ ID NO: 62. And a primer set specific to the ITS gene of M. peregrinum comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 63, a forward primer of SEQ ID NO: 10, and a reverse primer of SEQ ID NO: 11; A first set of primers for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the 16S rRNA gene of an acidic non-Tuberculosis bacteria including the forward primer of 12 and the reverse primer of SEQ ID NO: 13; A primer set specific for the ITS gene of M. abscessus comprising a forward primer of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, and a 16S rRNA of M. intracellulare comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 19. A primer set specific for the gene, a primer set specific for the ITS gene of M. szulgai comprising a forward primer of SEQ ID NO: 20 and a reverse primer of SEQ ID NO: 21, and a forward primer of SEQ ID NO: 22 and a reverse primer of SEQ ID NO: 23. A second primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. terrae containing; ITS of M. chelonae comprising a primer set specific to the 16S rRNA gene of M. avium comprising a forward primer of SEQ ID NO: 24 and a reverse primer of SEQ ID NO: 25, a forward primer of SEQ ID NO: 26, and a reverse primer of SEQ ID NO: 27. A primer set specific to the gene, a primer set specific to the 16S rRNA gene of M. kansasii or M.gastri comprising a forward primer of SEQ ID NO: 30 and a reverse primer of SEQ ID NO: 31, and a forward primer of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 A third primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. fortuitum comprising a set of reverse primers of; A primer set specific for the ITS gene of M. simiae comprising a forward primer of SEQ ID NO: 38 and a reverse primer of SEQ ID NO: 39, a forward primer of SEQ ID NO: 40 and a reverse primer of SEQ ID NO: 41 to HSP65 of M. ulcerans comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 41 A specific primer set, a primer set specific to the ITS gene of M. septicum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 42 and a reverse primer of SEQ ID NO: 43, and M comprising a forward primer of SEQ ID NO: 34 and a reverse primer of SEQ ID NO: 35 the fourth mycobacteria identifying primer set comprising a primer set specific for the 16S rRNA gene of gordonae; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. scrofulaceum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 48 and the reverse primer of SEQ ID NO: 49 , M. marinum or M comprising the forward primer of SEQ ID NO: 54 and the reverse primer of SEQ ID NO: 55 fifth mycobacteria identifying primer set comprising a primer set specific for the ITS gene of M. smegmatis containing the specific primer set and the forward primer of SEQ ID NO: 46 and a reverse primer of SEQ ID NO: 47 to the ITS gene of ulcerans; And of SEQ ID NO: M. mucogenicum containing three of the forward primer, and specific primers, a forward primer of SEQ ID NO: 64 and a reverse primer of SEQ ID NO: 65 to the ITS gene of M.gastri comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 4 ITS It may consist of a primer set specific for a gene and a primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. celatum including a forward primer of SEQ ID NO: 56 and a reverse primer of SEQ ID NO: 57.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 마이코박테리아 동정용 키트는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 M. xenopi의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 62의 정방향 프라이머 및 서열번호 63의 역방향 프라이머를 포함하는 M. peregrinum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성 비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제1 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머를 포함하는 M. intracellulare의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 21의 역방향 프라이머를 포함하는 M. szulgai의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 및 서열번호 22의 정방향 프라이머 및 서열번호 23의 역방향 프라이머를 포함하는 M. terrae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제2 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 24의 정방향 프라이머 및 서열번호 25의 역방향 프라이머를 포함하는 M. avium의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 26의 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 역방향 프라이머를 포함하는 M. chelonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 30의 정방향 프라이머 및 서열번호 31의 역방향 프라이머를 포함하는 M. kansasii 또는 M.gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M. fortuitum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제3 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 38의 정방향 프라이머 및 서열번호 39의 역방향 프라이머를 포함하는 M. simiae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 40의 정방향 프라이머 및 서열번호 41의 역방향 프라이머를 포함하는 M. ulcerans의 HSP65에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 42의 정방향 프라이머 및 서열번호 43의 역방향 프라이머를 포함하는 M. septicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 34의 정방향 프라이머 및 서열번호 35의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gordonae의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제4 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 서열번호 48의 정방향 프라이머 및 서열번호 49의 역방향 프라이머를 포함하는 M. scrofulaceum의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 54의 정방향 프라이머 및 서열번호 55의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 46의 정방향 프라이머 및 서열번호 47의 역방향 프라이머를 포함하는 M. smegmatis의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제5 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 M.gastri의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 64의 정방향 프라이머 및 서열번호 65의 역방향 프라이머를 포함하는 M. mucogenicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 56의 정방향 프라이머 및 서열번호 57의 역방향 프라이머를 포함하는 M. celatum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제6 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the kit for identification of mycobacteria is a set of primers specific to the ITS gene of M. xenopi including a forward primer of SEQ ID NO: 5 and a reverse primer of SEQ ID NO: 6, and a forward primer of SEQ ID NO: 62. And a primer set specific to the ITS gene of M. peregrinum comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 63, a forward primer of SEQ ID NO: 10, and a reverse primer of SEQ ID NO: 11; A first set of primers for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the 16S rRNA gene of an acidic non-Tuberculosis bacteria including the forward primer of 12 and the reverse primer of SEQ ID NO: 13; A primer set specific for the ITS gene of M. abscessus comprising a forward primer of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, and a 16S rRNA of M. intracellulare comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 19. A primer set specific for the gene, a primer set specific for the ITS gene of M. szulgai comprising a forward primer of SEQ ID NO: 20 and a reverse primer of SEQ ID NO: 21, and a forward primer of SEQ ID NO: 22 and a reverse primer of SEQ ID NO: 23. A second primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. terrae containing; ITS of M. chelonae comprising a primer set specific to the 16S rRNA gene of M. avium comprising a forward primer of SEQ ID NO: 24 and a reverse primer of SEQ ID NO: 25, a forward primer of SEQ ID NO: 26, and a reverse primer of SEQ ID NO: 27. A primer set specific to the gene, a primer set specific to the 16S rRNA gene of M. kansasii or M.gastri comprising a forward primer of SEQ ID NO: 30 and a reverse primer of SEQ ID NO: 31, and a forward primer of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 A third primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. fortuitum comprising a set of reverse primers of; A primer set specific for the ITS gene of M. simiae comprising a forward primer of SEQ ID NO: 38 and a reverse primer of SEQ ID NO: 39, a forward primer of SEQ ID NO: 40 and a reverse primer of SEQ ID NO: 41 to HSP65 of M. ulcerans comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 41 A specific primer set, a primer set specific to the ITS gene of M. septicum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 42 and a reverse primer of SEQ ID NO: 43, and M comprising a forward primer of SEQ ID NO: 34 and a reverse primer of SEQ ID NO: 35 the fourth mycobacteria identifying primer set comprising a primer set specific for the 16S rRNA gene of gordonae; A primer set specific to the 16S rRNA gene of M. scrofulaceum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 48 and the reverse primer of SEQ ID NO: 49 , M. marinum or M comprising the forward primer of SEQ ID NO: 54 and the reverse primer of SEQ ID NO: 55 fifth mycobacteria identifying primer set comprising a primer set specific for the ITS gene of M. smegmatis containing the specific primer set and the forward primer of SEQ ID NO: 46 and a reverse primer of SEQ ID NO: 47 to the ITS gene of ulcerans; And of SEQ ID NO: M. mucogenicum containing three of the forward primer, and specific primers, a forward primer of SEQ ID NO: 64 and a reverse primer of SEQ ID NO: 65 to the ITS gene of M.gastri comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 4 ITS It may consist of a primer set specific for a gene and a primer set for identification of mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. celatum including a forward primer of SEQ ID NO: 56 and a reverse primer of SEQ ID NO: 57.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트 내지 제6 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트는 별도의 보관수단에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트 내지 제6 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트는 별도의 튜브에 의해 분리될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the first primer set for mycobacterial identification to the sixth primer set for mycobacterial identification may be separated by a separate storage means. For example, the first primer set for mycobacteria identification to the sixth primer set for mycobacteria identification may be separated by a separate tube.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 상기 마이코박테리아 동정용 키트를 이용하여 상기 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계; 온도를 변화시키면서 상기 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 마이코박테리아 동정 방법을 제공한다.In order to achieve the above other object, the step of separating DNA from the specimen; Subjecting the DNA to a real-time polymerase chain reaction using the kit for identification of mycobacteria; Obtaining a melting curve by melting the amplified product amplified by the real-time polymerase chain reaction while changing the temperature; And it provides a mycobacteria identification method comprising the step of checking the melting temperature of the melting curve.

본 발명의 일 실시예에 따른 융해곡선분석은 510nm 형광파장을 측정하여 수행할 수 있다.The melting curve analysis according to an embodiment of the present invention may be performed by measuring a fluorescence wavelength of 510 nm.

본 발명은 마이코박테리아를 특정 종으로 정확하게 검출하고 동정할 수 있는 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트, 이를 포함하는 마이코박테리아 동정용 키트 및 이를 이용하는 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선 분석을 이용하는 마이코박테리아 동정 방법을 제공한다. 상기 방법에 의하면, 동정 가능한 마이코박테리아의 종의 종류가 많고, 검사가 간편하고 정확하며 빠르고, 적은 비용으로 효율적으로 마이코박테리아를 동정할 수 있는 임상진단 수단을 제공할 수 있다.The present invention is a mycobacteria identification primer set capable of accurately detecting and identifying mycobacteria as a specific species, a mycobacteria identification kit including the same, and a real-time polymerase chain reaction method using the same and a mycobacteria identification method using the melting curve analysis Provides. According to the above method, there are many types of mycobacteria that can be identified, and it is possible to provide a clinical diagnosis means capable of efficiently identifying mycobacteria at a simple, accurate, fast, and low cost test.

도 1 내지 도 5는 각각 튜브 Ⅰ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M.fortuitum, M.gastri, Nontuberculous mycobacteria, M.tuberculosis complex 및 M.xenopi의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 6 내지 도 9는 각각 튜브 Ⅱ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M.abscessus, M.intracellulare, M. szulgaiM.terrae의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 10 내지 도 13은 각각 튜브 Ⅲ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. avium, M.chelonae, M. gordonaeM. kansasii의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 14 내지 도 18은 각각 튜브 Ⅳ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. marinum, M.septicum, M. simiae, M. smegmatisM. ulcerans의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 19 내지 도 21은 각각 튜브 Ⅴ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. celatum, M.haemophilumM. scrofulaceum의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 22 내지 도 25는 각각 튜브 Ⅵ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M.abscessus, M. mucogenicum, M. peregrinumM. shimoidei의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 26 내지 도 30은 각각 튜브 Ⅰ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.fortuitum, M. gastri, Nontuberculous mycobacteria, M. tuberculosis complex 및 M.xenopi의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 31 내지 도 34는 각각 튜브 Ⅱ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.abscessus, M. intracellulare, M. szulgaiM. terrae의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 35 내지 도 38은 각각 튜브 Ⅲ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. avium, M.chelonae, M. gordonaeM. kansasii의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 39 내지 도 42는 각각 튜브 Ⅳ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.septicum, M. simiae, M. smegmatisM. ulcerans의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 43 내지 도 47은 각각 튜브 Ⅴ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M. celatum, M.haemophilum, M. scrofulaceum, M. marinumM. ulcerans의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 48 내지 도 52는 각각 튜브 Ⅵ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M. abscessus, M. chelonae, M. mucogenicum, M. peregrinumM. shimoidei의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 53 내지 도 56은 각각 튜브 Ⅰ-C의 프라이머 믹스를 이용하여 M. xenopi, M.peregrinum, Nontuberculous mycobacteria 및 M. tuberculosis complex의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 57 내지 도 60은 각각 튜브 Ⅱ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.abscessus, M. intracellulare, M. szulgaiM. terrae의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 61 내지 도 64는 각각 튜브 Ⅲ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M. avium, M.chelonae, M. fortuitumM. kansasii의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 65 내지 도 68은 각각 튜브 Ⅳ-C의 프라이머 믹스를 이용하여 M.septicum, M. simiae, M. gordonaeM. ulcerans의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 69 내지 도 71은 각각 튜브 Ⅴ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.scrofulaceum, M. marinumM. smegmatis의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
도 72 내지 도 74는 각각 튜브 Ⅵ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M. gastri, M. mucogenicumM. celatum의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
1 to 5 are amplification products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.fortuitum , M.gastri , Nontuberculous mycobacteria, M.tuberculosis complex, and M.xenopi using the primer mix of Tube I-A, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
6 to 9 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.abscessus , M.intracellulare , M. szulgai, and M.terrae using the primer mix of Tube II-A, respectively. The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
10 to 13 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. avium , M.chelonae , M. gordonae and M. kansasii using the primer mix of Tube III-A, respectively. The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
14 to 18 are amplification products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. marinum , M.septicum , M. simiae , M. smegmatis and M. ulcerans using the primer mix of Tube IV-A, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
19 to 21 show the results of melting curve analysis of the amplified products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. celatum , M. haemophilum and M. scrofulaceum using the primer mix of Tube V-A, respectively. . In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
22 to 25 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reactions of M.abscessus , M. mucogenicum , M. peregrinum and M. shimoidei using the primer mix of Tube VI-A, respectively. The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
26 to 30 show an amplification product obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.fortuitum , M. gastri , Nontuberculous mycobacteria, M. tuberculosis complex and M.xenopi using the primer mix of Tube I-B, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
31 to 34 show the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reactions of M.abscessus , M. intracellulare , M. szulgai and M. terrae using the primer mix of Tube II-B, respectively. The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
35 to 38 show melting curves of an amplicon obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. avium , M.chelonae , M. gordonae and M. kansasii using the primer mix of Tube III-A, respectively. The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
39 to 42 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.septicum , M. simiae , M. smegmatis and M. ulcerans using the primer mix of Tube IV-B, respectively. The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
43 to 47 show amplification products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. celatum , M.haemophilum , M. scrofulaceum , M. marinum, and M. ulcerans using the primer mix of Tube V-B, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
48 to 52 show amplification products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. abscessus , M. chelonae , M. mucogenicum , M. peregrinum and M. shimoidei using the primer mix of tube VI-B, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
53 to 56 are melting curves of the amplification products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. xenopi , M. peregrinum, Nontuberculous mycobacteria and M. tuberculosis complex using the primer mix of Tube I-C, respectively The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
57 to 60 show the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.abscessus , M. intracellulare , M. szulgai and M. terrae using the primer mix of Tube II-B, respectively. The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
61 to 64 show the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. avium , M.chelonae , M. fortuitum and M. kansasii using the primer mix of Tube III-B, respectively. The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
Figures 65 to 68 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.septicum , M. simiae , M. gordonae and M. ulcerans using the primer mix of Tube IV-C, respectively. The analysis result is shown. In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
69 to 71 show the results of melting curve analysis of an amplicon obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.scrofulaceum , M. marinum, and M. smegmatis using the primer mix of Tube V-B, respectively. . In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).
72 to 74 show the results of melting curve analysis of an amplicon obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. gastri , M. mucogenicum and M. celatum using the primer mix of Tube VI-B, respectively. . In the melting curve, the x-axis is the temperature (°C) and the y-axis is the change in fluorescence per unit time (dF/dT).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples, but the following examples are only illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited thereto.

실시예: 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석을 이용하는 마이코박테리아 동정 방법Example: Double real-time polymerase chain reaction method and mycobacteria identification method using melting curve analysis

1. 검출대상 부위 및 프라이머 설계1. Design of detection target site and primer

가. 검출대상 유전자end. Gene to be detected

마이코박테리아의 16S rRNA 유전자, hsp65(Heat Shock Protein 65) 유전자, ITS(internal transcribed spacer) 유전자 염기서열 자료를 Sequencher 4.10로 분석하여 M.gastri, M.xenopi, M.fortuitum, M.abscessus, M.avium, M.intracellulare, M.szulgai, M.terrae, M.chelonae, M.kansasii, M.gordonae, M.marinum, M.simiae, M.ulcerans, M.septicum, M.smegmatis, M.scrofulaceum, M.haemophilum, M.celatum, M.peregrinum, M.mucogenicum, M.shimoidei에 특이한 프라이머를 primer3프로그램과 수기법을 사용하여 설계하였다. 16S rRNA gene, hsp65 (Heat Shock Protein 65) gene, ITS (internal transcribed spacer) gene sequence data of mycobacteria were analyzed by Sequencher 4.10 and analyzed with M.gastri, M.xenopi , M.fortuitum , M.abscessus , M. avium , M.intracellulare , M.szulgai , M.terrae , M.chelonae , M.kansasii , M.gordonae , M.marinum , M.simiae , M.ulcerans , M.septicum , M.smegmatis , M.scrofulaceum , Primers specific to M.haemophilum, M.celatum, M.peregrinum , M.mucogenicum , and M.shimoidei were designed using the primer3 program and manual techniques.

염기서열 자료는 NCBI(National center for Biotechnology Information)의 데이터베이스에서 얻었으며, 해당 마이코박테리아에 특이한 프라이머 설계에 사용된 염기서열 자료는 다음과 같았다. The nucleotide sequence data were obtained from the database of NCBI (National Center for Biotechnology Information), and the nucleotide sequence data used for designing primers specific to the mycobacteria were as follows.

M. gastri(GU142918.1, AF547836.1, AY299182.1, Y14182.1), M.xenopi(AJ536033.1, AY082373.1, AF547891.1, AJ243481.1, L15624.1, Y14192.1), M.fortuitum(AY458072.1, AY299168.1, AY299167.1, AY457066.1, AF480580.1, GU142933.1, AF144326.1, AM709726.1), M.abscessus(AJ419970.1, AJ416940.1, AJ536038,AM709728.1, AF163815.1, FM955485.1, FM955486.1, AY458075.1, EF486338.1), M.avium(NR_025584.1, AJ536037.1, EF521892.1, GU362530.1, HM056131.1, AB0266901.1, AF410479.1, L15620.1, X74054.1, Z46421.1), M.intracellulare(AY652958.1, AJ536036.1, X52927.1, M61684.1, AB026691.1, AJ306711.1, AJ314865.1, AM709724.1, Z46423.1, GQ153290.1, EU239784.1), M.szulgai(X52926.1, AY299141.1, AY299173.1, AF547878.1, AB026704.1, X99220.1), M.terrae(NR_029168.1, AY299142.1, AY550211.1, HM584725.1, Z46427.1), M.chelonae(AM884324.1, AJ419969.1, AF144327.1, AY458082.1, AY299148.1), M.kansasii(M29575.1, X15916.1, AB026695.1, AB232369.1, AM709725.1), M. gordonae(GU142923.1,AB026692.1, AJ315574.1, AY604571.1), M.marinum(AF456238.1, AY513243.1, AB026701.1, GU827996.1, Y14185.1), M.simiae(GQ153280.1,AB026694.1, Y14186.1, Z46426.1), M.ulcerans(Z13990.1,X99217.1), M. septicum(AY457070.1, AM902922.1), M.smegmatis(NR_025311.1, Y08453.1), M.scrofulaceum(GQ153271.1, AB026702.1, L15622.1), M. haemophilum(V06638.1, AY579398.1, AY579399.1, DQ235664.1), M.celatum(L08169.1, AF375990.1, FJ754638.1), M.peregrinum(AY457069.1, AM396454.1, AM421288.1), M.mucogenicum(AF480585.1, AM902932.1, AY504951.1, DQ235663.1), M. shimoidei(X82459.1, AJ005005.1, X99219.1)
M. gastri (GU142918.1, AF547836.1, AY299182.1, Y14182.1), M.xenopi (AJ536033.1, AY082373.1, AF547891.1, AJ243481.1, L15624.1, Y14192.1), M.fortuitum (AY458072.1, AY299168.1, AY299167.1, AY457066.1, AF480580.1, GU142933.1, AF144326.1, AM709726.1), M.abscessus (AJ419970.1, AJ416940.1, AJ536038 ,AM709728.1, AF163815.1, FM955485.1, FM955486.1, AY458075.1, EF486338.1), M.avium (NR_025584.1, AJ536037.1, EF521892.1, GU362530.1, HM056131.1, AB0266901.1, AF410479.1, L15620.1, X74054.1, Z46421.1), M.intracellulare (AY652958.1, AJ536036.1, X52927.1, M61684.1, AB026691.1, AJ306711.1, AJ314865 .1, AM709724.1, Z46423.1, GQ153290.1, EU239784.1), M.szulgai (X52926.1, AY299141.1, AY299173.1, AF547878.1, AB026704.1, X99220.1), M .terrae (NR_029168.1, AY299142.1, AY550211.1, HM584725.1, Z46427.1), M.chelonae (AM884324.1, AJ419969.1, AF144327.1, AY458082.1, AY299148.1), M .kansasii (M29575.1, X15916.1, AB026695.1, AB232369.1, AM709725.1), M. gordonae (GU142923.1, AB026692.1, AJ315574.1, AY604571.1), M.marinum (AF456238.1, AY513243.1, AB026701.1, GU827996.1, Y14185.1), M.simiae (GQ153280.1,AB026694.1, Y14186.1, Z46426.1), M.ulcerans (Z13990.1) ,X99217.1), M. septicum (AY457070.1, AM902922.1), M.smegmatis (NR_025311.1, Y08453.1), M.scrofulaceum (GQ153271.1, AB026702.1, L15622.1), M . haemophilum (V06638.1, AY579398.1, AY579399.1 , DQ235664.1), M.celatum (L08169.1, AF375990.1, FJ754638.1), M.peregrinum (AY457069.1, AM396454.1, AM421288 .1), M.mucogenicum (AF480585.1, AM902932.1, AY504951.1, DQ235663.1), M. shimoidei (X82459.1, AJ005005.1, X99219.1)

나. I. 프라이머primer

1) M. gastri 11) M. gastri 1

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gggcttgtcttggactcgt-3′ (서열번호 1)Forward primer: 5′-gggcttgtcttggactcgt-3′ (SEQ ID NO: 1)

역방향프라이머 : 5′-tggtgggacaacactcttgg-3′ (서열번호 2)Reverse primer: 5′-tggtgggacaacactcttgg-3′ (SEQ ID NO: 2)

증폭산물 크기 : 39bpAmplification product size: 39bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 75.06℃
Amplification product melting temperature (Tm): 75.06℃

2) M. gastri 22) M. gastri 2

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gcaacactcgggcttgtctt-3′ (서열번호 3)Forward primer: 5′-gcaacactcgggcttgtctt-3′ (SEQ ID NO: 3)

역방향프라이머 : 5′-atggtgggacaacactcttgg-3′ (서열번호 4)Reverse primer: 5′-atggtgggacaacactcttgg-3′ (SEQ ID NO: 4)

증폭산물 크기 : 49bpAmplification product size: 49bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 78.10℃
Amplification product melting temperature (Tm): 78.10℃

3) M. xenopi 3) M. xenopi

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gttgggcagcaggcagta-3′ (서열번호 5)Forward primer: 5′-gttgggcagcaggcagta-3′ (SEQ ID NO: 5)

역방향프라이머 : 5′-gttgcctcaaaacccaacag-3′ (서열번호 6)Reverse primer: 5′-gttgcctcaaaacccaacag-3′ (SEQ ID NO: 6)

증폭산물 크기 : 50bpAmplification product size: 50bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 80.86℃
Amplification product melting temperature (Tm): 80.86℃

4) M. fortuitum 14) M. fortuitum 1

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-cccgagccgtgaggaac-3′ (서열번호 7)Forward primer: 5′-cccgagccgtgaggaac-3′ (SEQ ID NO: 7)

역방향프라이머 : 5′-caatagtgtgtctggcagtcaaaa-3′ (서열번호 8)Reverse primer: 5′-caatagtgtgtctggcagtcaaaa-3′ (SEQ ID NO: 8)

증폭산물 크기 : 82bpAmplification product size: 82bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 81.70℃
Amplification product melting temperature (Tm): 81.70℃

5) M. fortuitum 25) M. fortuitum 2

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-cccgagccgtgaggaac-3′ (서열번호 7)Forward primer: 5′-cccgagccgtgaggaac-3′ (SEQ ID NO: 7)

역방향프라이머 : 5′-cgacacccgcaacaggat-3′ (서열번호 9)Reverse primer: 5′-cgacacccgcaacaggat-3′ (SEQ ID NO: 9)

증폭산물 크기 : 141bpAmplification product size: 141bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 85.50℃
Amplification product melting temperature (Tm): 85.50℃

6) M. tuberculosis complex(결핵균)6) M. tuberculosis complex

검출대상 유전자 : IS6110Gene to be detected: IS6110

정방향프라이머 : 5′-cgaactcaaggagcacatcag-3′ (서열번호 10)Forward primer: 5′-cgaactcaaggagcacatcag-3′ (SEQ ID NO: 10)

역방향프라이머 : 5′-cagggttagccacactttgc-3′ (서열번호 11)Reverse primer: 5′-cagggttagccacactttgc-3′ (SEQ ID NO: 11)

증폭산물 크기 : 79bpAmplification product size: 79bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 84.16℃
Amplification product melting temperature (Tm): 84.16℃

7) Nontuberculous mycobacteria(항산성비결핵균)7) Nontuberculous mycobacteria

검출대상 유전자 : 16S rRNAGene to be detected: 16S rRNA

정방향프라이머 : 5′-tktggtggaaagcttttgc-3′ (서열번호 12)Forward primer: 5′-tktggtggaaagcttttgc-3′ (SEQ ID NO: 12)

역방향프라이머 : 5′-cgtaggagtctgggccgta-3′ (서열번호 13)Reverse primer: 5′-cgtaggagtctgggccgta-3′ (SEQ ID NO: 13)

증폭산물 크기 : 146bpAmplification product size: 146bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 87.54℃
Amplification product melting temperature (Tm): 87.54℃

8) M. abscessus 18) M. abscessus 1

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-atgaactagggaacataaagtatgca-3′ (서열번호 14)Forward primer: 5′-atgaactagggaacataaagtatgca-3′ (SEQ ID NO: 14)

역방향프라이머 : 5′-aggatttacaaaacatattcaccaagt-3′ (서열번호 15)Reverse primer: 5′-aggatttacaaaacatattcaccaagt-3′ (SEQ ID NO: 15)

증폭산물 크기 : 69bpAmplification product size: 69bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 71.70℃
Amplification product melting temperature (Tm): 71.70℃

9) M. abscessus 29) M. abscessus 2

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-tcgaatgaactagggaacataaagta-3′ (서열번호 16)Forward primer: 5′-tcgaatgaactagggaacataaagta-3′ (SEQ ID NO: 16)

역방향프라이머 : 5′-gatttacaaaacatattcaccaagtaga-3′ (서열번호 17)Reverse primer: 5′-gatttacaaaacatattcaccaagtaga-3′ (SEQ ID NO: 17)

증폭산물 크기 : 71bpAmplification product size: 71bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 72.10℃
Amplification product melting temperature (Tm): 72.10℃

10) M. intracellulare 10) M. intracellulare

검출대상 유전자 : 16S rRNAGene to be detected: 16S rRNA

정방향프라이머 : 5′-ggtctaataccgrataggaccttta-3′ (서열번호 18)Forward primer: 5′-ggtctaataccgrataggaccttta-3′ (SEQ ID NO: 18)

역방향프라이머 : 5′-cgcaaaagctttccaccwa-3′ (서열번호 19)Reverse primer: 5′-cgcaaaagctttccaccwa-3′ (SEQ ID NO: 19)

증폭산물 크기 : 56bpAmplification product size: 56bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 75.40℃ 혹은 76.90℃
Amplification product melting temperature (Tm): 75.40℃ or 76.90℃

11) M. szulgai 11) M. szulgai

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-ggtcctgaggcaacactca-3′ (서열번호 20)Forward primer: 5′-ggtcctgaggcaacactca-3′ (SEQ ID NO: 20)

역방향프라이머 : 5′-ccaagatggtgggacaacag-3′ (서열번호 21)Reverse primer: 5′-ccaagatggtgggacaacag-3′ (SEQ ID NO: 21)

증폭산물 크기 : 52bpAmplification product size: 52bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 79.66℃
Amplification product melting temperature (Tm): 79.66℃

12) M. terrae 12) M. terrae

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gattcccccgtacctcacat-3′ (서열번호 22)Forward primer: 5′-gattcccccgtacctcacat-3′ (SEQ ID NO: 22)

역방향프라이머 : 5′-accaccgaccacccactac-3′ (서열번호 23)Reverse primer: 5′-accaccgaccacccactac-3′ (SEQ ID NO: 23)

증폭산물 크기 : 80bpAmplification product size: 80bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 82.86℃
Amplification product melting temperature (Tm): 82.86℃

13) M. avium 13) M. avium

검출대상 유전자 : 16S rRNAGene to be detected: 16S rRNA

정방향프라이머 : 5′-gacctcaagacgcatgtcttc-3′ (서열번호 24)Forward primer: 5′-gacctcaagacgcatgtcttc-3′ (SEQ ID NO: 24)

역방향프라이머 : 5′-cgcaaaagctttccaccag-3′ (서열번호 25)Reverse primer: 5′-cgcaaaagctttccaccag-3′ (SEQ ID NO: 25)

증폭산물 크기 : 39bpAmplification product size: 39bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 73.50℃
Amplification product melting temperature (Tm): 73.50℃

14) M. chelonae 14) M. chelonae

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-tgtccaccccgtggata-3′ (서열번호 26)Forward primer: 5′-tgtccaccccgtggata-3′ (SEQ ID NO: 26)

역방향프라이머 : 5′-gtgccagcgtttcaattcta-3′ (서열번호 27)Reverse primer: 5′-gtgccagcgtttcaattcta-3′ (SEQ ID NO: 27)

증폭산물 크기 : 65bpAmplification product size: 65bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 79.00℃
Amplification product melting temperature (Tm): 79.00℃

15) M. kansasii /M. gastri 115) M. kansasii / M. gastri 1

검출대상 유전자 : 16S rRNAGene to be detected: 16S rRNA

정방향프라이머 : 5′-gcaatctgccctgcacac-3′ (서열번호 28)Forward primer: 5′-gcaatctgccctgcacac-3′ (SEQ ID NO: 28)

역방향프라이머 : 5′-ccacaaggcatgctccaa-3′ (서열번호 29)Reverse primer: 5′-ccacaaggcatgctccaa-3′ (SEQ ID NO: 29)

증폭산물 크기 : 80bpAmplification product size: 80bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 81.16℃
Amplification product melting temperature (Tm): 81.16℃

16) M. kansasii /M. gastri 216) M. kansasii / M. gastri 2

검출대상 유전자 : 16S rRNAGene to be detected: 16S rRNA

정방향프라이머 : 5′-cggaaaggtctcttcggagac-3′ (서열번호 30)Forward primer: 5′-cggaaaggtctcttcggagac-3′ (SEQ ID NO: 30)

역방향프라이머 : 5′-tttcccaggcttatcctggt-3′ (서열번호 31)Reverse primer: 5′-tttcccaggcttatcctggt-3′ (SEQ ID NO: 31)

증폭산물 크기 : 88bpAmplification product size: 88bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 83.36℃
Amplification product melting temperature (Tm): 83.36℃

17) M. gordonae 117) M. gordonae 1

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-tgcaagccttgagtggtca-3′ (서열번호 32)Forward primer: 5′-tgcaagccttgagtggtca-3′ (SEQ ID NO: 32)

역방향프라이머 : 5′-ggggacagcaccagagg-3′ (서열번호 33)Reverse primer: 5′-ggggacagcaccagagg-3′ (SEQ ID NO: 33)

증폭산물 크기 : 111bpAmplification product size: 111bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 83.80℃
Amplification product melting temperature (Tm): 83.80℃

18) M. gordonae 218) M. gordonae 2

검출대상 유전자 : 16S rRNAGene to be detected: 16S rRNA

정방향프라이머 : 5′-taacacatgcaagtcgaaaggt-3′ (서열번호 34)Forward primer: 5′-taacacatgcaagtcgaaaggt-3′ (SEQ ID NO: 34)

역방향프라이머 : 5′-ctttccaccacaggacatgt-3′ (서열번호 35)Reverse primer: 5′-ctttccaccacaggacatgt-3′ (SEQ ID NO: 35)

증폭산물 크기 : 156bpAmplification product size: 156bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 83.74℃
Amplification product melting temperature (Tm): 83.74℃

19) M. marinum /M. ulcerans 119) M. marinum / M. ulcerans 1

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gggtcctgaggcaacatct-3′ (서열번호 36)Forward primer: 5′-gggtcctgaggcaacatct-3′ (SEQ ID NO: 36)

역방향프라이머 : 5′-caacatcccgaaaccaacag-3′ (서열번호 37)Reverse primer: 5′-caacatcccgaaaccaacag-3′ (SEQ ID NO: 37)

증폭산물 크기 : 39bpAmplification product size: 39bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 74.60℃
Amplification product melting temperature (Tm): 74.60℃

20) M. simiae 20) M. simiae

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-ctcggccgacttcggtt-3′ (서열번호 38)Forward primer: 5′-ctcggccgacttcggtt-3′ (SEQ ID NO: 38)

역방향프라이머 : 5′-agatggagggacaccacttca-3′ (서열번호 39)Reverse primer: 5′-agatggagggacaccacttca-3′ (SEQ ID NO: 39)

증폭산물 크기 : 37bpAmplification product size: 37bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 76.40℃
Amplification product melting temperature (Tm): 76.40℃

21) M. ulcerans 21) M. ulcerans

검출대상 유전자 : HSP65(Heat shock protein 65)Gene to be detected: HSP65 (Heat shock protein 65)

정방향프라이머 : 5′-accgagaccctgctcaaa-3′ (서열번호 40)Forward primer: 5′-accgagaccctgctcaaa-3′ (SEQ ID NO: 40)

역방향프라이머 : 5′-gctccttggtctcgacctct-3′ (서열번호 41)Reverse primer: 5′-gctccttggtctcgacctct-3′ (SEQ ID NO: 41)

증폭산물 크기 : 46bpAmplification product size: 46bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 79.10℃
Amplification product melting temperature (Tm): 79.10℃

22) M. septicum 22) M. septicum

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-atggcctcgcacctgtag-3′ (서열번호 42)Forward primer: 5′-atggcctcgcacctgtag-3′ (SEQ ID NO: 42)

역방향프라이머 : 5′-ccaatagtgtgtctggcagttcta-3′ (서열번호 43)Reverse primer: 5′-ccaatagtgtgtctggcagttcta-3′ (SEQ ID NO: 43)

증폭산물 크기 : 72bpAmplification product size: 72bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 81.70℃
Amplification product melting temperature (Tm): 81.70℃

23) M. smegmatis 123) M. smegmatis 1

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gagctggagcgctgtagtg-3′ (서열번호 44)Forward primer: 5′-gagctggagcgctgtagtg-3′ (SEQ ID NO: 44)

역방향프라이머 : 5′-gaaacagcgtttcccacac-3′ (서열번호 45)Reverse primer: 5′-gaaacagcgtttcccacac-3′ (SEQ ID NO: 45)

증폭산물 크기 : 73bpAmplification product size: 73bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 84.20℃
Amplification product melting temperature (Tm): 84.20℃

24) M. smegmatis 224) M. smegmatis 2

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gagccgtgaggagctgga-3′ (서열번호 46)Forward primer: 5′-gagccgtgaggagctgga-3′ (SEQ ID NO: 46)

역방향프라이머 : 5′-accgcatctcaacgtttgc-3′ (서열번호 47)Reverse primer: 5′-accgcatctcaacgtttgc-3′ (SEQ ID NO: 47)

증폭산물 크기 : 66bpAmplification product size: 66bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 84.36℃
Amplification product melting temperature (Tm): 84.36℃

25) M. scrofulaceum 125) M. scrofulaceum 1

검출대상 유전자 : 16S rRNAGene to be detected: 16S rRNA

정방향프라이머 : 5′-accatcgacgaaggctcac-3′ (서열번호 48)Forward primer: 5′-accatcgacgaaggctcac-3′ (SEQ ID NO: 48)

역방향프라이머 : 5′-cacctaccgtcaacccaca-3′ (서열번호 49)Reverse primer: 5′-cacctaccgtcaacccaca-3′ (SEQ ID NO: 49)

증폭산물 크기 : 40bpAmplification product size: 40bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 77.50℃
Amplification product melting temperature (Tm): 77.50℃

26) M. scrofulaceum 226) M. scrofulaceum 2

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gcaacactcggctcgttct-3′ (서열번호 50)Forward primer: 5′-gcaacactcggctcgttct-3′ (SEQ ID NO: 50)

역방향프라이머 : 5′-agatggagggacaccactca-3′ (서열번호 51)Reverse primer: 5′-agatggagggacaccactca-3′ (SEQ ID NO: 51)

증폭산물 크기 : 38bpAmplification product size: 38bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 77.50℃
Amplification product melting temperature (Tm): 77.50℃

27) M. haemophilum 27) M. haemophilum

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gcacaacagcaaatgaatcg-3′ (서열번호 52)Forward primer: 5′-gcacaacagcaaatgaatcg-3′ (SEQ ID NO: 52)

역방향프라이머 : 5′-acatgggacaagcctgagt-3′ (서열번호 53)Reverse primer: 5′-acatgggacaagcctgagt-3′ (SEQ ID NO: 53)

증폭산물 크기 : 69bpAmplification product size: 69bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 80.76℃
Amplification product melting temperature (Tm): 80.76℃

28) M. marinum /M. ulcerans 228) M. marinum / M. ulcerans 2

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gggtcctgaggcaacatc-3′ (서열번호 54)Forward primer: 5′-gggtcctgaggcaacatc-3′ (SEQ ID NO: 54)

역방향프라이머 : 5′-acagaacacgccaccaaa-3′ (서열번호 55)Reverse primer: 5′-acagaacacgccaccaaa-3′ (SEQ ID NO: 55)

증폭산물 크기 : 133bpAmplification product size: 133bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 83.56℃
Amplification product melting temperature (Tm): 83.56℃

29) M. celatum 29) M. celatum

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-cacgaaaaacactccgcatc-3′ (서열번호 56)Forward primer: 5′-cacgaaaaacactccgcatc-3′ (SEQ ID NO: 56)

역방향프라이머 : 5′-gcgatttttcccatttgttg-3′ (서열번호 57)Reverse primer: 5′-gcgatttttcccatttgttg-3′ (SEQ ID NO: 57)

증폭산물 크기 : 100bpAmplification product size: 100bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 85.84℃
Amplification product melting temperature (Tm): 85.84℃

30) M. abscessus 330) M. abscessus 3

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-catttcccagtcgaatgaacta-3′ (서열번호 58)Forward primer: 5′-catttcccagtcgaatgaacta-3′ (SEQ ID NO: 58)

역방향프라이머 : 5′-ggatttacaaaacatattcaccaagtagatac-3′ (서열번호 59)Reverse primer: 5′-ggatttacaaaacatattcaccaagtagatac-3′ (SEQ ID NO: 59)

증폭산물 크기 : 80bpAmplification product size: 80bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 75.10℃
Amplification product melting temperature (Tm): 75.10℃

31) M. abscessus /M. chelonae 31) M. abscessus / M. chelonae

검출대상 유전자 : 16S rRNAGene to be detected: 16S rRNA

정방향프라이머 : 5′-ctaataccggataggaccacaca-3′ (서열번호 60)Forward primer: 5′-ctaataccggataggaccacaca-3′ (SEQ ID NO: 60)

역방향프라이머 : 5′-gcaaaagctttgcaccact-3′ (서열번호 61)Reverse primer: 5′-gcaaaagctttgcaccact-3′ (SEQ ID NO: 61)

증폭산물 크기 : 52bpAmplification product size: 52bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 76.40℃
Amplification product melting temperature (Tm): 76.40℃

32) M. peregrinum 32) M. peregrinum

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-attcgttggatggcctcac-3′ (서열번호 62)Forward primer: 5′-attcgttggatggcctcac-3′ (SEQ ID NO: 62)

역방향프라이머 : 5′-ccacgccaagtttgttgag-3′ (서열번호 63)Reverse primer: 5′-ccacgccaagtttgttgag-3′ (SEQ ID NO: 63)

증폭산물 크기 : 65bpAmplification product size: 65bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 81.70℃
Amplification product melting temperature (Tm): 81.70℃

33) M. mucogenicum 33) M. mucogenicum

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-catttacatgccctgatcca-3′ (서열번호 64)Forward primer: 5′-catttacatgccctgatcca-3′ (SEQ ID NO: 64)

역방향프라이머 : 5′-cgacgacaatcccaacca-3′ (서열번호 65)Reverse primer: 5′-cgacgacaatcccaacca-3′ (SEQ ID NO: 65)

증폭산물 크기 : 76bpAmplification product size: 76bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 83.50℃
Amplification product melting temperature (Tm): 83.50℃

34) M. shimoidei 34) M. shimoidei

검출대상 유전자 : ITS(Internal transcribed spacer)Gene to be detected: ITS (Internal transcribed spacer)

정방향프라이머 : 5′-gaagtcgagccgtgagga-3′ (서열번호 66)Forward primer: 5′-gaagtcgagccgtgagga-3′ (SEQ ID NO: 66)

역방향프라이머 : 5′-accaccaaagatgaggcaac-3′ (서열번호 67)Reverse primer: 5′-accaccaaagatgaggcaac-3′ (SEQ ID NO: 67)

증폭산물 크기 : 142bpAmplification product size: 142bp

증폭산물 융해온도(Tm) : 86.96℃
Amplification product melting temperature (Tm): 86.96℃

2. 실시간 2. Real time 중합효소연쇄반응Polymerase chain reaction 및 융해곡선 분석 And melting curve analysis

가. end. DNADNA 의 분리Separation of

임상검체에서 분리된 항산성비결핵균 100주, 마이코박테리아 표준 균주 68주를 사용하였다. 사용된 표준균주는 M. abscessus ATCC 19977, M. acapulcensis KCTC 9501, M. africanum ATCC 25420, M. agri KCTC 9502, M. alvei KCTC 19709, M. asiaticum KCTC 9503, M. aurum KCTC 19457, M. austroafricanum KCTC 9504, M. avium ATCC 25291, M. bolletii KCTC 19281, M. botniense KCTC 19646, M. bovis ATCC 19210, M. brumae KCTC 19711, M. celatum ATCC 51131, M. chelonae subsp chelonae KCTC 9505, M. chlorophenolicum KCTC 19089, M. chubuense KCTC 19712, M. diernhoferi KCTC 9506, M. fallax KCTC 9508, M. flavescens ATCC 14474, M. fortuitum ATCC 6841, M. frederiksbergense KCTC 19100, M. gadium ATCC 27726, M. gastri ATCC 15754, M. gilvum KCTC 19423, M. goodii ATCC BAA-955, M. gordonae KCTC 9513, M. haemophilum ATCC 29548, M. hassiacum ATCC 700660, M. interjectum ATCC 51457, M. intermedium ATCC 51848, M. intracellulare ATCC 13950, M. intracellulare KCTC 9514, M. kansasii ATCC 12478, M. lentiflavum KMRC 70087, M. malmoense ATCC 29571, M. mantobense KCTC 9977, M. marinum ATCC 927, M. massiliense KCTC 19086, M. microti ATCC 19422, M. moriokaense KCTC 9516, M. mucogenicum KCTC 19088, M. neoaurum KCTC 19096, M. nonchromogenicum ATCC 19530, M. obuense KCTC 19097, M. parascrofulaceum KCTC 9979, M. peregrinum KCTC 9615, KMRC 75002, M. phlei KCTC 9689, M. porcinum KCTC 9517, M. pulveris KCTC 9518, M. scrofulaceum ATCC 19981, M. septicum ATCC 700731, M. simiae ATCC 25275, M. shimoidei ATCC 27962, M. smegmatis KCTC 9108, M. szulgai KCTC 9520, KMRC 31125, M. terrae KCTC 9614, M. triplex ATCC 700071, M. triviale KMRC 70093, M. tuberculosis ATCC 25177, ATCC 27294, M. ulcerans ATCC 19423, M. vaccae KCTC 19087, M. vanbaalenii KCTC 9966, M. wolinskyi ATCC 700010, M. xenopi KMRC 42001이었다.
100 strains of anti-acid non-tuberculous bacteria isolated from clinical specimens and 68 strains of mycobacteria standard strain were used. The standard strains used were M. abscessus ATCC 19977 , M. acapulcensis KCTC 9501, M. africanum ATCC 25420, M. agri KCTC 9502, M. alvei KCTC 19709, M. asiaticum KCTC 9503, M. aurum KCTC 19457, M. austroafricanum KCTC 9504, M. avium ATCC 25291, M. bolletii KCTC 19281, M. botniense KCTC 19646, M. bovis ATCC 19210, M. brumae KCTC 19711, M. celatum ATCC 51131, M. chelonae subsp chelonae KCTC 9505, M. chlorophenolicum KCTC 19089, M. chubuense KCTC 19712, M. diernhoferi KCTC 9506, M. fallax KCTC 9508, M. flavescens ATCC 14474, M. fortuitum ATCC 6841, M. frederiksbergense KCTC 19100, M. gadium gadium ATCC 27726, M. gastri ATCC 15754, M. gilvum KCTC 19423, M. goodii ATCC BAA-955, M. gordonae KCTC 9513, M. haemophilum ATCC 29548, M. hassiacum ATCC 700660, M. interjectum ATCC 51457, M. intermedium ATCC 51848, M. intracellulare ATCC 13950, M. intracellulare KCTC 9514, M. kansasii ATCC 12478, M. lentiflavum KMRC 70087, M. malmoense ATCC 29571 , M. mantobense KCTC 9977, M. marinum ATCC 927, M. massiliense KCTC 19086, M. microti ATCC 19422, M. moriokaense KCTC 9516, M. mucogenicum KCTC 19088, M. neoaurum KCTC 19096, M. nonchromogenicum ATCC 19530, M. obuense KCTC 19097, M. parascrofulaceum KCTC 9979, M. peregrinum KCTC 9615 , KMRC 75002, M. phlei KCTC 9689 , M. porcinum KCTC 9517, M. pulveris KCTC 9518, M. scrofulaceum ATCC 19981, M. septicum ATCC 700731, M. simiae ATCC 25275, M. shimoidei ATCC 27962, M. smegmatis KCTC 9108, M. szulgai KCTC 9520 , KMRC 31125, M. terrae KCTC 9614, M. triplex ATCC 700071, M. triviale KMRC 70093, M. tuberculosis ATCC 25177, ATCC 27294, M. ulcerans ATCC 19423, M. vaccae KCTC 19087, M. vanbaalenii KCTC 9966, M . wolinskyi ATCC 700010, M. was xenopi KMRC 42001.

임상검체에서 분리된 항산성비결핵균 100주는 액체배지(MGIT 마이코박테리아 배지)나 고체(Ogawa배지)배지에서 배양하여 검출한 균주이었다. ATCC, KCTC 균주는 액체배지에서 배양하여 사용하였고, KMRC 균주는 고체배지에서 배양하여 사용하였다.100 anti-acid non-Tuberculosis bacteria isolated from clinical specimens were strains detected by culturing in liquid medium (MGIT mycobacteria medium) or solid (Ogawa medium) medium. ATCC and KCTC strains were cultured and used in a liquid medium, and KMRC strains were cultured and used in a solid medium.

액체배지에서 자란 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 균이 배양된 MGIT 마이코박테리아 배양튜브를 잘 섞은 후에 액체 배지 500㎕를 취해 1.5㎖ 튜브에 넣고 14,000 rpm로 5분간 원심분리 시켰다. 원심분리 후 상층액은 버리고 남은 침사부분에 멸균증류수 300㎕ 넣고 끓는 물에 10분간 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14,000 rpm로 5분간 원심분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.The DNA of mycobacteria grown in liquid medium was extracted as follows. After the MGIT mycobacteria culture tube in which the bacteria were cultured was well mixed, 500 µl of the liquid medium was taken, put into a 1.5 ml tube, and centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded, and 300 µl of sterile distilled water was added to the remaining saliva portion and heated in a boiling water for 10 minutes in a bath. After heating in a bath, centrifugation was performed at 14,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was used as a template DNA for polymerase chain reaction.

고체배지에서 자란 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 1.5㎖튜브에 멸균증류수 500㎕ 넣고 고체배지에서 1 백금이를 취해 멸균증류수에 풀었다. 이 튜브를 끓는 물에 10분간 중탕 가열한 후 14,000 rpm에서 5분간 원심 분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
DNA of mycobacteria grown in solid medium was extracted as follows. 500 µl of sterile distilled water was placed in a 1.5 ml tube, and 1 platinum was taken from the solid medium and dissolved in sterile distilled water. The tube was heated in boiling water for 10 minutes and then centrifuged for 5 minutes at 14,000 rpm, and the supernatant was used as a template DNA for the polymerase chain reaction.

나. I. 프라이머primer 믹스( Mix( PrimersPrimers mixmix ))

6 종류의 프라이머 믹스 튜브를 제조하였다. 각각의 프라이머 믹스 튜브에는 해당 마이코박테리아에 특이한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 동일한 량으로 들어 있다.
Six types of primer mix tubes were prepared. Each primer mix tube contains the same amount of forward and reverse primers specific to the mycobacteria.

1) 튜브Ⅰ1) TubeⅠ

a. 튜브Ⅰ-A a. Tube I-A

M. gastri 1 프라이머 10pmole/㎕ M. gastri 1 primer 10pmole/µl

M. xenopi 프라이머 9pmole/㎕ M. xenopi primer 9pmole/µl

M. fortuitum 1 프라이머 6pmole/㎕ M. fortuitum 1 primer 6pmole/µl

M. tuberculosis complex 프라이머 14pmole/㎕ M. tuberculosis complex primer 14pmole/µl

Nontuberculous mycobacteria 프라이머 8pmole/㎕
Nontuberculous mycobacteria primer 8pmole/µl

b. 튜브Ⅰ-B b. Tube I-B

M. gastri 2 프라이머 8pmole/㎕ M. gastri 2 primer 8pmole/µl

M. xenopi 프라이머 9pmole/㎕ M. xenopi primer 9pmole/µl

M. fortuitum 1 프라이머 6pmole/㎕ M. fortuitum 1 primer 6pmole/µl

M. tuberculosis complex 프라이머 14pmole/㎕ M. tuberculosis complex primer 14pmole/µl

Nontuberculous mycobacteria 프라이머 8pmole/㎕
Nontuberculous mycobacteria primer 8pmole/µl

c. 튜브Ⅰ-C c. Tube I-C

M. xenopi 프라이머 9pmole/㎕ M. xenopi primer 9pmole/µl

M. peregrinum 프라이머 12pmole/㎕ M. peregrinum primer 12pmole/µl

M. tuberculosis complex 프라이머 14pmole/㎕ M. tuberculosis complex primer 14pmole/µl

Nontuberculous mycobacteria 프라이머 8pmole/㎕
Nontuberculous mycobacteria primer 8pmole/µl

2) 튜브Ⅱ2) TubeⅡ

a. 튜브Ⅱ-A a. Tube II-A

M. abscessus 1 프라이머 10pmole/㎕ M. abscessus 1 primer 10pmole/µl

M. intracellulare 프라이머 10pmole/㎕ M. intracellulare primer 10pmole/µl

M. szulgai 프라이머 10pmole/㎕ M. szulgai primer 10pmole/µl

M. terrae 프라이머 10pmole/㎕
M. terrae primer 10pmole/µl

b. 튜브Ⅱ-B b. TubeⅡ-B

M. abscessus 2 프라이머 12pmole/㎕ M. abscessus 2 primer 12pmole/µl

M. intracellulare 프라이머 10pmole/㎕ M. intracellulare primer 10pmole/µl

M. szulgai 프라이머 10pmole/㎕ M. szulgai primer 10pmole/µl

M. terrae 프라이머 10pmole/㎕
M. terrae primer 10pmole/µl

3) 튜브Ⅲ3) TubeⅢ

a. 튜브Ⅲ-A a. TubeⅢ-A

M. avium 프라이머 10pmole/㎕ M. avium primer 10pmole/µl

M. chelonae 프라이머 14pmole/㎕ M. chelonae primer 14pmole/µl

M. kansasii /M. gastri 1 프라이머 8pmole/㎕ M. kansasii / M. gastri 1 primer 8pmole/µl

M. gordonae 1 프라이머 10pmole/㎕
M. gordonae 1 primer 10pmole/µl

b. 튜브Ⅲ-B b. TubeⅢ-B

M. avium 프라이머 10pmole/㎕ M. avium primer 10pmole/µl

M. chelonae 프라이머 14pmole/㎕ M. chelonae primer 14pmole/µl

M. kansasii /M. gastri 2 프라이머 8pmole/㎕ M. kansasii / M. gastri 2 primer 8pmole/µl

M. fortuitum 2 프라이머 10pmole/㎕
M. fortuitum 2 primer 10pmole/µl

4) 튜브Ⅳ4) Tube IV

a. 튜브Ⅳ-A a. Tube IV-A

M. marinum /M. ulcerans 1 프라이머 10pmole/㎕ M. marinum / M. ulcerans 1 primer 10pmole/µl

M. simiae 프라이머 10pmole/㎕ M. simiae primer 10pmole/µl

M. ulcerans 프라이머 12pmole/㎕12pmole/µl of M. ulcerans primer

M. septicum 프라이머 10pmole/㎕ M. septicum primer 10pmole/µl

M. smegmatis 1 프라이머 8pmole/㎕
M. smegmatis 1 primer 8pmole/µl

b. 튜브Ⅳ-B b. Tube IV-B

M. simiae 프라이머 10pmole/㎕ M. simiae primer 10pmole/µl

M. ulcerans 프라이머 12pmole/㎕12pmole/µl of M. ulcerans primer

M. septicum 프라이머 10pmole/㎕ M. septicum primer 10pmole/µl

M. smegmatis 1 프라이머 8pmole/㎕
M. smegmatis 1 primer 8pmole/µl

c. 튜브Ⅳ-C c. Tube IV-C

M. simiae 프라이머 10pmole/㎕ M. simiae primer 10pmole/µl

M. ulcerans 프라이머 12pmole/㎕12pmole/µl of M. ulcerans primer

M. septicum 프라이머 10pmole/㎕ M. septicum primer 10pmole/µl

M. gordonae 2 프라이머 10pmole/㎕
M. gordonae 2 primer 10pmole/µl

5) 튜브Ⅴ5) Tube V

a. 튜브Ⅴ-A a. Tube V-A

M. scrofulaceum 1 프라이머 12pmole/㎕ M. scrofulaceum 1 primer 12pmole/µl

M. scrofulaceum 2 프라이머 12pmole/㎕ M. scrofulaceum 2 primer 12pmole/µl

M. haemophilum 프라이머 10pmole/㎕ M. haemophilum primer 10pmole/µl

M. celatum 프라이머 8pmole/㎕
M. celatum primer 8pmole/µl

b. 튜브Ⅴ-B b. Tube V-B

M. scrofulaceum 1 프라이머 12pmole/㎕ M. scrofulaceum 1 primer 12pmole/µl

M. haemophilum 프라이머 10pmole/㎕ M. haemophilum primer 10pmole/µl

M. marinum /M. ulcerans 2 프라이머 10pmole/㎕ M. marinum / M. ulcerans 2 primer 10pmole/µl

M. celatum 프라이머 8pmole/㎕
M. celatum primer 8pmole/µl

c. 튜브Ⅴ-C c. Tube V-C

M. scrofulaceum 1 프라이머 12pmole/㎕ M. scrofulaceum 1 primer 12pmole/µl

M. marinum /M. ulcerans 2 프라이머 10pmole/㎕ M. marinum / M. ulcerans 2 primer 10pmole/µl

M. smegmatis 2 프라이머 10pmole/㎕
M. smegmatis 2 primer 10pmole/µl

6) 튜브Ⅵ6) Tube VI

a. 튜브Ⅵ-A a. Tube VI-A

M. abscessus 3 프라이머 10pmole/㎕ M. abscessus 3 primer 10pmole/µl

M. peregrinum 프라이머 10pmole/㎕ M. peregrinum primer 10pmole/µl

M. mucogenicum 프라이머 10pmole/㎕ M. mucogenicum primer 10pmole/µl

M. shimoidei 프라이머 4pmole/㎕
M. shimoidei primer 4pmole/µl

b. 튜브Ⅵ-B b. Tube VI-B

M. abscessus /M. chelonae 프라이머 10pmole/㎕ M. abscessus / M. chelonae primer 10pmole/µl

M. peregrinum 프라이머 10pmole/㎕ M. peregrinum primer 10pmole/µl

M. mucogenicum 프라이머 10pmole/㎕ M. mucogenicum primer 10pmole/µl

M. shimoidei 프라이머 4pmole/㎕
M. shimoidei primer 4pmole/µl

c. 튜브Ⅵ-C c. Tube VI-C

M. gastri 2 프라이머 10pmole/㎕ M. gastri 2 primer 10pmole/µl

M. mucogenicum 프라이머 10pmole/㎕ M. mucogenicum primer 10pmole/µl

M. celatum 프라이머 8pmole/㎕
M. celatum primer 8pmole/µl

다. 이중 실시간 All. Double real time 중합효소연쇄반응법Polymerase chain reaction method 및 융해곡선분석 And melting curve analysis

Type-it HRM PCR 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 상기 Type-it HRM PCR 키트에는 형광 색소로서 EvaGreen이 들어 있다. 실시간 중합효소연쇄반응은 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 이용하였다. 약 95℃에서 약 5분간 변성 공정을 1 사이클(cycle), 약 95℃에서 약 10초 간 변성, 약 60℃에서 약 15초 간 어닐링 및 연장 공정을 1 싸이클로 하여, 40 싸이클을 수행하였다. 마지막 중합효소연쇄반응이 끝난 후, 약 68℃에서 약 93℃까지 초당 약 0.2℃ 속도로 온도를 증가시키면서 510nm의 형광파장을 측정하여 융해곡선분석을 하였다. 이 때, 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 조성은 하기 표 1과 같다.Real-time polymerase chain reaction was performed using a Type-it HRM PCR kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA). The Type-it HRM PCR kit contains EvaGreen as a fluorescent dye. Real-time polymerase chain reaction was performed using Rotor-Gene Q (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA). 40 cycles were performed by performing a denaturation process at about 95°C for about 5 minutes, 1 cycle, denaturation at about 95°C for about 10 seconds, annealing and extension processes at about 60°C for about 15 seconds in 1 cycle. After the final polymerase chain reaction was completed, the melting curve was analyzed by measuring the fluorescence wavelength of 510 nm while increasing the temperature at a rate of about 0.2° C. per second from about 68° C. to about 93° C. At this time, the composition of the reactants for performing the double real-time polymerase chain reaction are shown in Table 1 below.

성분ingredient 부피(㎕)Volume (µl) 농도density 2X HRM PCR Master Mix2X HRM PCR Master Mix 55 1X1X 프라이어 믹스Fryer mix 0.50.5 표 2 참조See Table 2 뉴클레아제가 제거된 물(Nuclease free water)Nuclease free water 3.53.5 -- DNA 주형(DNA template)DNA template 1One -- 전체 all 1010

프라이머 량(pmole/㎕) Primer amount (pmole/µl) 반응액내 농도(μM)Concentration in reaction solution (μM) 44 0.20.2 66 0.30.3 88 0.40.4 99 0.450.45 1010 0.50.5 1212 0.60.6 1414 0.70.7

<< 실시예Example 1> 1>

상기 튜브 Ⅰ-A, 튜브 Ⅱ-A, 튜브 Ⅲ-A, 튜브 Ⅳ-A, 튜브 Ⅴ-A 및 튜브 Ⅵ-A의 프라이머 믹스를 이용하는 마이코박테리아의 동정 방법이다. 상술한 실시간 중합효소연쇄반응 및 융해곡선 분석에 따라서 마이코박테리아를 동정하였다.
This is a method for identifying mycobacteria using the primer mix of Tube I-A, Tube II-A, Tube III-A, Tube IV-A, Tube V-A, and Tube VI-A. Mycobacteria were identified according to the above-described real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis.

<< 실시예Example 2> 2>

상기 튜브 Ⅰ-B, 튜브 Ⅱ-B, 튜브 Ⅲ-A, 튜브 Ⅳ-B, 튜브 Ⅴ-B 및 튜브 Ⅵ-B의 프라이머 믹스를 이용하는 프라이머 믹스를 이용하는 마이코박테리아의 동정 방법이다. 상술한 실시간 중합효소연쇄반응 및 융해곡선 분석에 따라서 마이코박테리아를 동정하였다.
This is a method for identifying mycobacteria using a primer mix using the primer mixes of Tube I-B, Tube II-B, Tube III-A, Tube IV-B, Tube V-B, and Tube VI-B. Mycobacteria were identified according to the above-described real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis.

<< 실시예Example 3> 3>

상기 튜브 Ⅰ-C, 튜브 Ⅱ-B, 튜브 Ⅲ-B, 튜브 Ⅳ-C, 튜브 Ⅴ-C 및 튜브 Ⅵ-C의 프라이머 믹스를 이용하는 마이코박테리아의 동정 방법이다. 상술한 실시간 중합효소연쇄반응 및 융해곡선 분석에 따라서 마이코박테리아를 동정하였다.
This is a method for identifying mycobacteria using a primer mix of Tube I-C, Tube II-B, Tube III-B, Tube IV-C, Tube V-C, and Tube VI-C. Mycobacteria were identified according to the above-described real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis.

라. 실시간 la. real time 중합효소연쇄반응법Polymerase chain reaction method 및 융해곡선분석 결과 And melting curve analysis results

<< 실시예Example 1> 1>

도 1 내지 도 5는 각각 튜브 Ⅰ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. fortuitum, M.gastri, Nontuberculous mycobacteria, M. tuberculosis complex 및 M. xenopi의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.1 to 5 are an amplification product obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. fortuitum , M.gastri , Nontuberculous mycobacteria, M. tuberculosis complex, and M. xenopi using the primer mix of Tube I-A, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis.

도 6 내지 도 9는 각각 튜브 Ⅱ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. abscessus, M.intracellulare, M. szulgaiM. terrae의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.6 to 9 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reactions of M. abscessus , M.intracellulare , M. szulgai and M. terrae using the primer mix of Tube II-A, respectively. The analysis result is shown.

도 10 내지 도 13은 각각 튜브 Ⅲ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. avium, M.chelonae, M. gordonaeM. kansasii의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.10 to 13 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. avium , M.chelonae , M. gordonae and M. kansasii using the primer mix of Tube III-A, respectively. The analysis result is shown.

도 14 내지 도 18은 각각 튜브 Ⅳ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. marinum, M.septicum, M. simiae, M. smegmatisM. ulcerans의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.14 to 18 are amplification products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. marinum , M.septicum , M. simiae , M. smegmatis and M. ulcerans using the primer mix of Tube IV-A, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis.

도 19 내지 도 21은 각각 튜브 Ⅴ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. celatum, M.haemophilumM. scrofulaceum의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.19 to 21 show the results of melting curve analysis of the amplified products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. celatum , M. haemophilum and M. scrofulaceum using the primer mix of Tube V-A, respectively. .

도 22 내지 도 25는 각각 튜브 Ⅵ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M.abscessus, M. mucogenicum, M. peregrinumM. shimoidei의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.22 to 25 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reactions of M.abscessus , M. mucogenicum , M. peregrinum and M. shimoidei using the primer mix of Tube VI-A, respectively. The analysis result is shown.

도 1 내지 도 25를 통하여, 각각의 마이코박테리아 균주에 따라 디자인한 프라이머에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm)에 해당하는 피크를 나타냄을 확인할 수 있었다.1 to 25, it was confirmed that the peak corresponding to the melting temperature (Tm) of the amplification product corresponding to the primer designed according to each mycobacterial strain was shown.

도 1 및 도 2를 참조하면, 튜브 Ⅰ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 때문에, 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)에 해당하는 피크(약 87.54℃)와 함께 각각 M. fortuitum(약 81.70℃) 및 M.gastri(약 75.06℃)에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크가 나타났다. 다만, M.xenopi의 경우, 항산성비결핵균에 해당하지만 M. xenopi에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 80.86℃)만이 나타났다(도 5 참조).1 and 2, since real-time polymerase chain reaction is performed using the primer mix of Tube I-A, M. The amplification product melting temperature (Tm) peaks corresponding to fortuitum (about 81.70°C) and M.gastri (about 75.06°C) appeared. However, for M.xenopi, for the M. tuberculosis but wherein the acid rain were only amplified product melting temperature (Tm) peak (about 80.86 ℃), corresponding to M. xenopi (see Fig. 5).

도 18을 참조하면, 튜브 Ⅳ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 때문에, M. ulcerans 의 균주의 경우, M. marinum /M. ulcerans 1에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 74.60℃)와 함께 M. ulcerans에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 79.10℃)가 나타났다.Referring to Figure 18, because by using a primer mix of the tube-A Ⅳ perform real-time polymerase chain reaction, in the case of a strain of M. ulcerans, M. marinum / M. ulcerans amplification product melting temperature for the 1 ( Tm) peak (about 74.60 °C) and the amplification product melting temperature (Tm) peak (about 79.10 °C) corresponding to M. ulcerans appeared.

도 21을 참조하면, 튜브 Ⅴ-A의 프라이머 믹스(M. scrofulaceum 1 및 M.scrofulaceum 2의 프라이머 세트 포함)를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 때문에, M. scrofulaceum 의 균주의 경우 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 77.50℃)가 나타나며, M. scrofulaceum 1 및 M. scrofulaceum 2의 프라이머 세트에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크가 모두 약 77.50℃에 해당하기 때문에 피크가 하나로 나타났다. Referring to FIG. 21, because by using a primer mix of the tube Ⅴ-A (including the primer set of the M. scrofulaceum M.scrofulaceum 1 and 2) to perform a real-time polymerase chain reaction, in the case of a strain of M. scrofulaceum amplification product The melting temperature (Tm) peak (about 77.50°C) appeared, and the amplification product melting temperature (Tm) peak corresponding to the primer sets of M. scrofulaceum 1 and M. scrofulaceum 2 all corresponded to about 77.50° C., so the peak was one. .

상기 실시예 1에서 튜브 Ⅱ-A(M. abscessus 1)와 튜브 Ⅵ-A(M. abscessus 3)에 M.abscessus를 검출하여 구별할 수 있는 프라이머 세트를 구비하도록 하여, 임상검체에서 효과적으로 M. abscessus를 동정할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 튜브 Ⅴ-A에 M. scrofulaceum 1 및 M. scrofulaceum 2를 구비하여, 임상검체에서 M.scrofulaceum를 동정할 수 있음을 확인할 수 있었다. Tube in Example 1 Ⅱ-A (M. abscessus 1 ) and the tube Ⅵ-A (M. abscessus 3) to be equipped with a primer set that can be distinguished by detecting the M.abscessus, M. effective in clinical specimens It was confirmed that abscessus could be identified. In addition, with a M. scrofulaceum M. scrofulaceum 1 and 2 the tube Ⅴ-A, it was confirmed that it is possible to identify the M.scrofulaceum from clinical specimens.

실시예 1을 통하여, 결핵균인지 항산성비결핵균인지, 항산성비결핵균 중에서는 M. gastri , M. xenopi, M. fortuitum, M. abscessus, M. avium, M. intracellulare, M.szulgai, M. terrae, M. chelonae, M. kansasii, M. gordonae, M. marinum, M. simiae, M.ulcerans, M. septicum, M. smegmatis, M. scrofulaceum, M. haemophilum, M.celatum, M. peregrinum, M. mucogenicum M. shimoidei 중 어떤 균주 인지 효과적으로 동정할 수 있음을 확인할 수 있었다.
Through Example 1, whether Mycobacterium tuberculosis or mycobacterium tuberculosis, among the Mycobacterium tuberculosis, M. gastri , M. xenopi , M. fortuitum , M. abscessus , M. avium , M. intracellulare , M.szulgai , M. terrae , M. chelonae , M. kansasii , M. gordonae , M. marinum , M. simiae , M.ulcerans , M. septicum , M. smegmatis , M. scrofulaceum , M. haemophilum , M.celatum , M. peregrinum , M. mucogenicum And M. shimoidei .

<< 실시예Example 2> 2>

도 26 내지 도 30은 각각 튜브 Ⅰ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.fortuitum, M. gastri, Nontuberculous mycobacteria, M. tuberculosis complex 및 M.xenopi의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.26 to 30 show an amplification product obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.fortuitum , M. gastri , Nontuberculous mycobacteria, M. tuberculosis complex and M.xenopi using the primer mix of Tube I-B, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis.

도 31 내지 도 34는 각각 튜브 Ⅱ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.abscessus, M. intracellulare, M. szulgaiM. terrae의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.31 to 34 show the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reactions of M.abscessus , M. intracellulare , M. szulgai and M. terrae using the primer mix of Tube II-B, respectively. The analysis result is shown.

도 35 내지 도 38은 각각 튜브 Ⅲ-A의 프라이머 믹스를 이용하여 M. avium, M.chelonae, M. gordonaeM. kansasii의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.35 to 38 show melting curves of an amplicon obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. avium , M.chelonae , M. gordonae and M. kansasii using the primer mix of Tube III-A, respectively. The analysis result is shown.

도 39 내지 도 42는 각각 튜브 Ⅳ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.septicum, M. simiae, M. smegmatisM. ulcerans의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.39 to 42 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.septicum , M. simiae , M. smegmatis and M. ulcerans using the primer mix of Tube IV-B, respectively. The analysis result is shown.

도 43 내지 도 47은 각각 튜브 Ⅴ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M. celatum, M.haemophilum, M. scrofulaceum, M. marinumM. ulcerans의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.43 to 47 show amplification products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. celatum , M.haemophilum , M. scrofulaceum , M. marinum, and M. ulcerans using the primer mix of Tube V-B, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis.

도 48 내지 도 52는 각각 튜브 Ⅵ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M. abscessus, M. chelonae, M. mucogenicum, M. peregrinumM. shimoidei의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.48 to 52 show amplification products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. abscessus , M. chelonae , M. mucogenicum , M. peregrinum and M. shimoidei using the primer mix of tube VI-B, respectively. ) Shows the results of melting curve analysis.

도 26 내지 도 52를 통하여, 각각의 마이코박테리아 균주에 따라 디자인한 프라이머에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm)에 해당하는 피크를 나타냄을 확인할 수 있었다.26 to 52, it was confirmed that the peak corresponding to the melting temperature (Tm) of the amplification product corresponding to the primer designed according to each mycobacterial strain was shown.

도 26 및 도 27을 참조하면, 튜브 Ⅰ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 때문에, 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)에 해당하는 피크(약 87.54℃)와 함께 각각 M. fortuitum(약 81.70℃) 및 M. gastri(약 78.10℃)에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크가 나타났다. 다만, M. xenopi의 경우, 항산성비결핵균에 해당하지만 M. xenopi에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 80.86℃)만이 나타났다(도 30 참조).Referring to Figures 26 and 27, since real-time polymerase chain reaction is performed using the primer mix of Tube I-B, M. The amplification product melting temperature (Tm) peaks corresponding to fortuitum (about 81.70°C) and M. gastri (about 78.10°C) appeared. However, in the case of M. xenopi, Mycobacterium tuberculosis, but that the anti-acid rain were only amplified product melting temperature (Tm) peak (about 80.86 ℃), corresponding to M. xenopi (see Fig. 30).

도 46 및 도 47을 참조하면, 튜브 Ⅴ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하고, M. marinum /M. ulcerans 2에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 83.56℃)에 해당하여 M. marinum 또는 M. ulcerans는 모두 약 83.56℃에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크를 나타냈다. 이 경우, 튜브 Ⅵ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하고, 융해곡선 분석을 수행한 결과를 비교하여 볼 때, M. ulcerans에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 79.10℃)가 나타날 경우 M. ulcerans으로 균주를 동정할 수 있고, 상기 피크가 안 나타날 경우 M. marinum로 균주를 동정할 수 있다. 또한, 튜브 Ⅴ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 M. marinum /M. ulcerans 2에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 83.56℃)가 나타나고, 튜브 Ⅵ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하고, 융해곡선 분석을 수행하여 M.ulcerans에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 79.10℃)가 나타날 경우, 검체 내에 M. marinumM. ulcerans이 있는 것으로 동정할 수 있다.46 and 47, real-time polymerase chain reaction was performed using the primer mix of Tube V-B, and the amplification product melting temperature (Tm) peak (about 83.56) corresponding to M. marinum / M. ulcerans 2 °C), M. marinum or M. ulcerans all exhibited a melting temperature (Tm) peak corresponding to about 83.56 °C. In this case, when compared to the results of using a primer mix of the tube Ⅵ-B perform the polymerase chain reaction (PCR), and performing a melting curve analysis, amplified product melting temperature (Tm) peak corresponding to M. ulcerans (about 79.10℃) , the strain can be identified as M. ulcerans , and if the peak does not appear, the strain can be identified as M. marinum. In addition, by performing real-time polymerase chain reaction using the primer mix of Tube V-B, the amplification product melting temperature (Tm) peak (about 83.56°C) corresponding to M. marinum / M. ulcerans 2 appears, and tube VI- If the amplification product melting temperature (Tm) peak (about 79.10°C) corresponding to M.ulcerans appears by performing a polymerase chain reaction using the primer mix of B, and performing a melting curve analysis, M. marinum and M. marinum in the sample. It can be identified as having M. ulcerans.

상기 실시예 2에서 튜브 Ⅱ-B(M. abscessus 2)와 튜브 Ⅲ-A(M. chelonae)에 각각 M. abscessus, M. chelonae를 검출하여 구별할 수 있는 프라이머 세트를 구비하면서, 튜브 Ⅵ-B에 M. abscessusM. chelonae를 구별할 수는 없지만 M. abscessus 또는 M. chelonae에 대한 특이성 높은 M. abscessus /M. chelonae를 구비하여, 임상검체에서 효과적으로 M. abscessus 또는 M. chelonae를 동정할 수 있음을 확인할 수 있었다.In Example 2, tube II-B ( M. abscessus 2) and tube III-A ( M. chelonae ) were provided with primer sets capable of detecting and distinguishing M. abscessus and M. chelonae, respectively, and tube VI- to B can not distinguish M. abscessus and M. chelonae, but provided with a high specificity M. abscessus / M. chelonae for M. abscessus or M. chelonae, M. chelonae effectively identify M. abscessus or from clinical specimens I was able to confirm that I could do it.

실시예 2를 통하여, 결핵균인지 항산성비결핵균인지, 항산성비결핵균 중에서는 M. gastri , M. xenopi, M. fortuitum, M. abscessus, M. avium, M. intracellulare, M.szulgai, M. terrae, M. chelonae, M. kansasii, M. gordonae, M. marinum, M. simiae, M.ulcerans, M. septicum, M. smegmatis, M. scrofulaceum, M. haemophilum, M.celatum, M. peregrinum, M. mucogenicumM. shimoidei 중 어떤 균주 인지 효과적으로 동정할 수 있음을 확인할 수 있었다.
Through Example 2, whether Mycobacterium tuberculosis or mycobacterium tuberculosis, among the Mycobacterium tuberculosis, M. gastri , M. xenopi , M. fortuitum , M. abscessus , M. avium , M. intracellulare , M.szulgai , M. terrae , M. chelonae , M. kansasii , M. gordonae , M. marinum , M. simiae , M.ulcerans , M. septicum , M. smegmatis , M. scrofulaceum , M. haemophilum , M.celatum , M. peregrinum , M. It was confirmed that any strain of mucogenicum and M. shimoidei could be effectively identified.

<< 실시예Example 3> 3>

도 53 내지 도 56은 각각 튜브 Ⅰ-C의 프라이머 믹스를 이용하여 M. xenopi, M.peregrinum, Nontuberculous mycobacteria 및 M. tuberculosis complex의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.53 to 56 are melting curves of the amplification products obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. xenopi , M. peregrinum, Nontuberculous mycobacteria and M. tuberculosis complex using the primer mix of Tube I-C, respectively The analysis result is shown.

도 57 내지 도 60은 각각 튜브 Ⅱ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.abscessus, M. intracellulare, M. szulgaiM. terrae의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.57 to 60 show the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.abscessus , M. intracellulare , M. szulgai and M. terrae using the primer mix of Tube II-B, respectively. The analysis result is shown.

도 61 내지 도 64는 각각 튜브 Ⅲ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M. avium, M.chelonae, M. fortuitumM. kansasii의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.61 to 64 show the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. avium , M.chelonae , M. fortuitum and M. kansasii using the primer mix of Tube III-B, respectively. The analysis result is shown.

도 65 내지 도 68은 각각 튜브 Ⅳ-C의 프라이머 믹스를 이용하여 M.septicum, M. simiae, M. gordonaeM. ulcerans의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.Figures 65 to 68 are the melting curves of the amplicons obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.septicum , M. simiae , M. gordonae and M. ulcerans using the primer mix of Tube IV-C, respectively. The analysis result is shown.

도 69 내지 도 71은 각각 튜브 Ⅴ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M.scrofulaceum, M. marinumM. smegmatis의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.69 to 71 show the results of melting curve analysis of an amplicon obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M.scrofulaceum , M. marinum, and M. smegmatis using the primer mix of Tube V-B, respectively. .

도 72 내지 도 74는 각각 튜브 Ⅵ-B의 프라이머 믹스를 이용하여 M. gastri, M. mucogenicumM. celatum의 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석 결과를 나타낸다.72 to 74 show the results of melting curve analysis of an amplicon obtained by performing real-time polymerase chain reaction of M. gastri , M. mucogenicum and M. celatum using the primer mix of Tube VI-B, respectively. .

도 53 내지 도 74를 통하여, 각각의 마이코박테리아 균주에 따라 디자인한 프라이머에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm)에 해당하는 피크를 나타냄을 확인할 수 있었다.53 to 74, it was confirmed that the peak corresponding to the melting temperature (Tm) of the amplification product corresponding to the primer designed according to each mycobacterial strain was shown.

도 54를 참조하면, 튜브 Ⅰ-C의 프라이머 믹스를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 때문에, 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)에 해당하는 피크(약 87.54℃)와 M. peregrinum(약 81.70℃)에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크가 나타났다. 다만, M. xenopi의 경우, 항산성비결핵균에 해당하지만 M.xenopi에 해당하는 증폭산물 융해온도(Tm) 피크(약 80.86℃)만이 나타났다(도 53 참조).Referring to FIG. 54, since the polymerase chain reaction is performed in real time using the primer mix of Tube I-C, the peak corresponding to Nontuberculous mycobacteria (about 87.54° C.) and M. peregrinum (about 81.70° C.) The amplification product melting temperature (Tm) peak corresponding to) appeared. However, in the case of M. xenopi , the amplification product melting temperature (Tm) peak (approximately 80.86°C) corresponding to M.xenopi, although corresponding to the acidic non-tuberculous bacteria, appeared (see FIG. 53).

실시예 3을 통하여, 결핵균인지 항산성비결핵균인지, 항산성비결핵균 중에서는 M. gastri , M. xenopi, M. fortuitum, M. abscessus, M. avium, M. intracellulare, M.szulgai, M. terrae, M. chelonae, M. kansasii, M. gordonae, M. marinum, M. simiae, M.ulcerans, M. septicum, M. smegmatis, M. scrofulaceum, M. celatum, M. peregrinumM. mucogenicum 중 어떤 균주 인지 효과적으로 동정할 수 있음을 확인할 수 있었다.Through Example 3, whether Mycobacterium tuberculosis or mycobacterium tuberculosis, among mycobacterium tuberculosis, M. gastri , M. xenopi , M. fortuitum , M. abscessus , M. avium , M. intracellulare , M.szulgai , M. terrae , Any of M. chelonae , M. kansasii , M. gordonae , M. marinum , M. simiae , M.ulcerans , M. septicum , M. smegmatis , M. scrofulaceum , M. celatum , M. peregrinum and M. mucogenicum It was confirmed that it can be recognized effectively.

실시예 3의 경우, 실시예 1 및 실시예 2와 달리 M. haemophilumM.shimoidei에 대해서는 동정할 수 있는 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트를 구비하지 않는 구성을 가진다. 상기 M. haemophilumM. shimoidei의 경우, 한국에서는 임상검체에서 잘 나타나지 않으므로, 상기 균주를 동정하기 위한 프라이머 세트를 포함할 때 프라이머 세트들 간의 상호 작용 등에 의한 동정 효율 등의 감소 등을 고려하여 포함하지 않는 구성으로 설계한 것이다.
In the case of Example 3, unlike Examples 1 and 2, M. haemophilum and M. shimoidei were not provided with a primer set for identification of mycobacteria capable of identification. In the case of M. haemophilum and M. shimoidei , it does not appear well in clinical specimens in Korea, so when including a primer set for identifying the strain, it is included in consideration of reduction in identification efficiency due to interactions between primer sets, etc. It is designed in a configuration that does not.

상기 실시 예들에 따라 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 수행할 경우, 간편하고 정확하며 빠르고, 적은 비용으로 효율적으로 임상 검체에서 마이코박테리아를 높은 신뢰성을 가지고 특정 균주로 동정할 수 있음을 확인할 수 있었다.When performing the real-time polymerase chain reaction method and melting curve analysis according to the above embodiments, it can be confirmed that the mycobacteria can be identified as a specific strain with high reliability in a clinical sample efficiently, conveniently, accurately, quickly, and at low cost. there was.

<110> UNIVERSITY OF ULSAN FOUNDATION FOR INDUSTRY COOPERATION <120> METHODS FOR IDENTIFICATION AND DETECTION OF MYCOBACTERIUM USING REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION AND MELTING CURVE ANALYSIS <130> ADP-2013-0125 <160> 73 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.gastri <400> 1 gggcttgtct tggactcgt 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.gastri <400> 2 tggtgggaca acactcttgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.gastri <400> 3 gcaacactcg ggcttgtctt 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.gastri <400> 4 atggtgggac aacactcttg g 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.xenopi <400> 5 gttgggcagc aggcagta 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.xenopi <400> 6 gttgcctcaa aacccaacag 20 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.fortuitum <400> 7 cccgagccgt gaggaac 17 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.fortuitum <400> 8 caatagtgtg tctggcagtc aaaa 24 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.fortuitum <400> 9 cgacacccgc aacaggat 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of IS6110 gene in M.tuberculosis complex <400> 10 cgaactcaag gagcacatca g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of IS6110 gene in M.tuberculosis complex <400> 11 cagggttagc cacactttgc 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in Nontuberculous mycobacteria <400> 12 tktggtggaa agcttttgc 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in Nontuberculous mycobacteria <400> 13 cgtaggagtc tgggccgta 19 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.abscessus <400> 14 atgaactagg gaacataaag tatgca 26 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.abscessus <400> 15 aggatttaca aaacatattc accaagt 27 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.abscessus <400> 16 tcgaatgaac tagggaacat aaagta 26 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.abscessus <400> 17 gatttacaaa acatattcac caagtaga 28 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 18 ggtctaatac cgrataggac cttta 25 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 19 cgcaaaagct ttccaccwa 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.szulgai <400> 20 ggtcctgagg caacactca 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.szulgai <400> 21 ccaagatggt gggacaacag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.terrae <400> 22 gattcccccg tacctcacat 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.terrae <400> 23 accaccgacc acccactac 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.avium <400> 24 gacctcaaga cgcatgtctt c 21 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.avium <400> 25 cgcaaaagct ttccaccag 19 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.chelonae <400> 26 tgtccacccc gtggata 17 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.chelonae <400> 27 gtgccagcgt ttcaattcta 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.kansasii or M.gastri <400> 28 gcaatctgcc ctgcacac 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.kansasii or M.gastri <400> 29 ccacaaggca tgctccaa 18 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.kansasii or M.gastri <400> 30 cggaaaggtc tcttcggaga c 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.kansasii or M.gastri <400> 31 tttcccaggc ttatcctggt 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.gordonae <400> 32 tgcaagcctt gagtggtca 19 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.gordonae <400> 33 ggggacagca ccagagg 17 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.gordonae <400> 34 taacacatgc aagtcgaaag gt 22 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.gordonae <400> 35 ctttccacca caggacatgt 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.marinum or M.ulcerans <400> 36 gggtcctgag gcaacatct 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.marinum or M.ulcerans <400> 37 caacatcccg aaaccaacag 20 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.simiae <400> 38 ctcggccgac ttcggtt 17 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.simiae <400> 39 agatggaggg acaccacttc a 21 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of HSP65(Heat shock protein 65) gene in M.ulcerans <400> 40 accgagaccc tgctcaaa 18 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of HSP65(Heat shock protein 65) gene in M.ulcerans <400> 41 gctccttggt ctcgacctct 20 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.septicum <400> 42 atggcctcgc acctgtag 18 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.septicum <400> 43 ccaatagtgt gtctggcagt tcta 24 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.smegmatis <400> 44 gagctggagc gctgtagtg 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.smegmatis <400> 45 gaaacagcgt ttcccacac 19 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.smegmatis <400> 46 gagccgtgag gagctgga 18 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.smegmatis <400> 47 accgcatctc aacgtttgc 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.scrofulaceum <400> 48 accatcgacg aaggctcac 19 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.scrofulaceum <400> 49 cacctaccgt caacccaca 19 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.scrofulaceum <400> 50 gcaacactcg gctcgttct 19 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.scrofulaceum <400> 51 agatggaggg acaccactca 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.haemophilum <400> 52 gcacaacagc aaatgaatcg 20 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.haemophilum <400> 53 acatgggaca agcctgagt 19 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.marinum or M.ulcerans <400> 54 gggtcctgag gcaacatc 18 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.marinum or M.ulcerans <400> 55 acagaacacg ccaccaaa 18 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.celatum <400> 56 cacgaaaaac actccgcatc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.celatum <400> 57 gcgatttttc ccatttgttg 20 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.abscessus <400> 58 catttcccag tcgaatgaac ta 22 <210> 59 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.abscessus <400> 59 ggatttacaa aacatattca ccaagtagat ac 32 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.abscessus or M.chelonae <400> 60 ctaataccgg ataggaccac aca 23 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.abscessus or M.chelonae <400> 61 gcaaaagctt tgcaccact 19 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.peregrinum <400> 62 attcgttgga tggcctcac 19 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.peregrinum <400> 63 ccacgccaag tttgttgag 19 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.mucogenicum <400> 64 catttacatg ccctgatcca 20 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.mucogenicum <400> 65 cgacgacaat cccaacca 18 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.shimoidei <400> 66 gaagtcgagc cgtgagga 18 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of ITS(Internal transcribed spacer) gene in M.shimoidei <400> 67 accaccaaag atgaggcaac 20 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in Nontuberculous mycobacteria <400> 68 tgtggtggaa agcttttgc 19 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in Nontuberculous mycobacteria <400> 69 tttggtggaa agcttttgc 19 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 70 ggtctaatac cggataggac cttta 25 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 71 ggtctaatac cgaataggac cttta 25 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 72 cgcaaaagct ttccaccaa 19 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 73 cgcaaaagct ttccaccta 19 <110> UNIVERSITY OF ULSAN FOUNDATION FOR INDUSTRY COOPERATION <120> METHODS FOR IDENTIFICATION AND DETECTION OF MYCOBACTERIUM USING REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION AND MELTING CURVE ANALYSIS <130> ADP-2013-0125 <160> 73 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.gastri <400> 1 gggcttgtct tggactcgt 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.gastri <400> 2 tggtgggaca acactcttgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.gastri <400> 3 gcaacactcg ggcttgtctt 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.gastri <400> 4 atggtgggac aacactcttg g 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.xenopi <400> 5 gttgggcagc aggcagta 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.xenopi <400> 6 gttgcctcaa aacccaacag 20 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.fortuitum <400> 7 cccgagccgt gaggaac 17 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.fortuitum <400> 8 caatagtgtg tctggcagtc aaaa 24 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.fortuitum <400> 9 cgacacccgc aacaggat 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of IS6110 gene in M.tuberculosis complex <400> 10 cgaactcaag gagcacatca g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of IS6110 gene in M.tuberculosis complex <400> 11 cagggttagc cacactttgc 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in Nontuberculous mycobacteria <400> 12 tktggtggaa agcttttgc 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in Nontuberculous mycobacteria <400> 13 cgtaggagtc tgggccgta 19 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.abscessus <400> 14 atgaactagg gaacataaag tatgca 26 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.abscessus <400> 15 aggatttaca aaacatattc accaagt 27 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.abscessus <400> 16 tcgaatgaac tagggaacat aaagta 26 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.abscessus <400> 17 gatttacaaa acatattcac caagtaga 28 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 18 ggtctaatac cgrataggac cttta 25 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 19 cgcaaaagct ttccaccwa 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.szulgai <400> 20 ggtcctgagg caacactca 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.szulgai <400> 21 ccaagatggt gggacaacag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.terrae <400> 22 gattcccccg tacctcacat 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.terrae <400> 23 accaccgacc acccactac 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.avium <400> 24 gacctcaaga cgcatgtctt c 21 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.avium <400> 25 cgcaaaagct ttccaccag 19 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.chelonae <400> 26 tgtccacccc gtggata 17 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.chelonae <400> 27 gtgccagcgt ttcaattcta 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.kansasii or M.gastri <400> 28 gcaatctgcc ctgcacac 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.kansasii or M.gastri <400> 29 ccacaaggca tgctccaa 18 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.kansasii or M.gastri <400> 30 cggaaaggtc tcttcggaga c 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.kansasii or M.gastri <400> 31 tttcccaggc ttatcctggt 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.gordonae <400> 32 tgcaagcctt gagtggtca 19 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.gordonae <400> 33 ggggacagca ccagagg 17 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.gordonae <400> 34 taacacatgc aagtcgaaag gt 22 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.gordonae <400> 35 ctttccacca caggacatgt 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.marinum or M.ulcerans <400> 36 gggtcctgag gcaacatct 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.marinum or M.ulcerans <400> 37 caacatcccg aaaccaacag 20 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.simiae <400> 38 ctcggccgac ttcggtt 17 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.simiae <400> 39 agatggaggg acaccacttc a 21 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of HSP65(Heat shock protein 65) gene in M.ulcerans <400> 40 accgagaccc tgctcaaa 18 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of HSP65(Heat shock protein 65) gene in M.ulcerans <400> 41 gctccttggt ctcgacctct 20 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.septicum <400> 42 atggcctcgc acctgtag 18 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.septicum <400> 43 ccaatagtgt gtctggcagt tcta 24 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.smegmatis <400> 44 gagctggagc gctgtagtg 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.smegmatis <400> 45 gaaacagcgt ttcccacac 19 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.smegmatis <400> 46 gagccgtgag gagctgga 18 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.smegmatis <400> 47 accgcatctc aacgtttgc 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.scrofulaceum <400> 48 accatcgacg aaggctcac 19 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.scrofulaceum <400> 49 cacctaccgt caacccaca 19 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.scrofulaceum <400> 50 gcaacactcg gctcgttct 19 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.scrofulaceum <400> 51 agatggaggg acaccactca 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.haemophilum <400> 52 gcacaacagc aaatgaatcg 20 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.haemophilum <400> 53 acatgggaca agcctgagt 19 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.marinum or M.ulcerans <400> 54 gggtcctgag gcaacatc 18 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.marinum or M.ulcerans <400> 55 acagaacacg ccaccaaa 18 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.celatum <400> 56 cacgaaaaac actccgcatc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.celatum <400> 57 gcgatttttc ccatttgttg 20 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.abscessus <400> 58 catttcccag tcgaatgaac ta 22 <210> 59 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.abscessus <400> 59 ggatttacaa aacatattca ccaagtagat ac 32 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.abscessus or M.chelonae <400> 60 ctaataccgg ataggaccac aca 23 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.abscessus or M.chelonae <400> 61 gcaaaagctt tgcaccact 19 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.peregrinum <400> 62 attcgttgga tggcctcac 19 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.peregrinum <400> 63 ccacgccaag tttgttgag 19 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.mucogenicum <400> 64 catttacatg ccctgatcca 20 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.mucogenicum <400> 65 cgacgacaat cccaacca 18 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.shimoidei <400> 66 gaagtcgagc cgtgagga 18 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of Internal transcribed spacer (ITS) gene in M.shimoidei <400> 67 accaccaaag atgaggcaac 20 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in Nontuberculous mycobacteria <400> 68 tgtggtggaa agcttttgc 19 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in Nontuberculous mycobacteria <400> 69 tttggtggaa agcttttgc 19 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 70 ggtctaatac cggataggac cttta 25 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 71 ggtctaatac cgaataggac cttta 25 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 72 cgcaaaagct ttccaccaa 19 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments of 16S rRNA gene in M.intracellulare <400> 73 cgcaaaagct ttccaccta 19

Claims (4)

서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 M.gastri의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 M. xenopi의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및, 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 M. fortuitum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제1 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트;
서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머를 포함하는 M. intracellulare의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 20의 정방향 프라이머 및 서열번호 21의 역방향 프라이머를 포함하는 M. szulgai의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 및 서열번호 22의 정방향 프라이머 및 서열번호 23의 역방향 프라이머를 포함하는 M. terrae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제2 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트;
서열번호 24의 정방향 프라이머 및 서열번호 25의 역방향 프라이머를 포함하는 M. avium의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 26의 정방향 프라이머 및 서열번호 27의 역방향 프라이머를 포함하는 M. chelonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 28의 정방향 프라이머 및 서열번호 29의 역방향 프라이머의 세트를 포함하는 M. kansasii 또는 M. gastri의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 32의 정방향 프라이머 및 서열번호 33의 역방향 프라이머를 포함하는 M. gordonae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제3 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트;
서열번호 38의 정방향 프라이머 및 서열번호 39의 역방향 프라이머를 포함하는 M. simiae의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 40의 정방향 프라이머 및 서열번호 41의 역방향 프라이머를 포함하는 M. ulcerans의 HSP65에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 42의 정방향 프라이머 및 서열번호 43의 역방향 프라이머를 포함하는 M. septicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 44의 정방향 프라이머 및 서열번호 45의 역방향 프라이머를 포함하는 M. smegmatis의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제4 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트;
서열번호 48의 정방향 프라이머 및 서열번호 49의 역방향 프라이머를 포함하는 M. scrofulaceum의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 52의 정방향 프라이머 및 서열번호 53의 역방향 프라이머를 포함하는 M. haemophilum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 54의 정방향 프라이머 및 서열번호 55의 역방향 프라이머를 포함하는 M. marinum 또는 M. ulcerans의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 56의 정방향 프라이머 및 서열번호 57의 역방향 프라이머를 포함하는 M. celatum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제5 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트; 및
서열번호 60의 정방향 프라이머 및 서열번호 61의 역방향 프라이머를 포함하는 M. abscessus 또는 M. chelonae의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 62의 정방향 프라이머 및 서열번호 63의 역방향 프라이머를 포함하는 M.peregrinum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 64의 정방향 프라이머 및 서열번호 65의 역방향 프라이머를 포함하는 M. mucogenicum의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 66의 정방향 프라이머 및 서열번호 67의 역방향 프라이머를 포함하는 M. shimoidei의 ITS 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 제6 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트로 이루어진 것을 특징으로 하는 마이코박테리아 동정용 키트.
A primer set specific for the ITS gene of M.gastri including the forward primer of SEQ ID NO: 3 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 5, and an ITS gene of M. xenopi including the reverse primer of SEQ ID NO: A first primer set for identifying a first mycobacteria comprising a primer set specific for the ITS gene of M. fortuitum comprising a forward primer of SEQ ID NO: 7 and an inverted primer of SEQ ID NO: 8;
A primer set specific for the ITS gene of M. abscessus comprising the forward primer of SEQ ID NO: 16 and the reverse primer of SEQ ID NO: 17, a forward primer of SEQ ID NO: 18, and a reverse primer of SEQ ID NO: 19, 16S rRNA of M. intracellulare A primer set specific for the gene, a forward primer of SEQ ID NO: 20 and a reverse primer of SEQ ID NO: 21, a primer set specific for the ITS gene of M. szulgai , and a forward primer of SEQ ID NO: 22 and a reverse primer of SEQ ID NO: A set of primers for identification of a second mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. terrae ;
A primer set specific for the 16S rRNA gene of M. avium comprising the forward primer of SEQ ID NO: 24 and the reverse primer of SEQ ID NO: 25, a forward primer of SEQ ID NO: 26, and an ITS of M. chelonae comprising the reverse primer of SEQ ID NO: A primer set specific for the 16S rRNA gene of M. kansasii or M. gastri comprising a set of primers specific to the gene, a forward primer of SEQ ID NO: 28 and a reverse primer of SEQ ID NO: 29, a forward primer and sequence of SEQ ID NO: A set of primers for identifying a third mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. gordonae comprising the reverse primer of SEQ ID NO: 33;
A primer set specific for the ITS gene of M. simiae comprising the forward primer of SEQ ID NO: 38 and the reverse primer of SEQ ID NO: 39, the forward primer of SEQ ID NO: 40, and the HSP65 of M. ulcerans containing the reverse primer of SEQ ID NO: M including the specific primers, SEQ ID NO: 42 of the forward primer and the specific primer set and the forward primer of SEQ ID NO: 44 and a reverse primer of SEQ ID NO: 45 to the ITS gene of M. septicum comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 43 the fourth mycobacteria identifying primer set comprising a set of primers specific to the gene of the ITS smegmatis;
A primer set specific for the 16S rRNA gene of M. scrofulaceum comprising the forward primer of SEQ ID NO: 48 and the reverse primer of SEQ ID NO: 49, the forward primer of SEQ ID NO: 52 and the reverse primer of SEQ ID NO: 53, and the ITS of M. haemophilum A primer set specific for the gene, a forward primer of SEQ ID NO: 54 and a reverse primer of SEQ ID NO: 55, a primer set specific for the ITS gene of M. marinum or M. ulcerans , a forward primer of SEQ ID NO: 56 and a primer set of SEQ ID NO: 57 A set of primers for identification of a fifth mycobacteria comprising a primer set specific to the ITS gene of M. celatum including a reverse primer; And
Specific primer sets on M. abscessus or 16S rRNA gene of M. chelonae comprising a forward primer SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 61 of the reverse primer, M comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 62 and a reverse primer of SEQ ID NO: 63 a primer set specific for the ITS gene of P. ceregrinum , a forward primer of SEQ ID NO: 64 and a reverse primer of SEQ ID NO: 65, a primer set specific for the ITS gene of M. mucogenicum , a forward primer of SEQ ID NO: 66, Characterized in that it comprises a primer set for identification of a sixth mycobacteria comprising a primer set specific to an ITS gene of M. shimoidei including a reverse primer.
삭제delete 청구항 제1항에 있어서, 상기 제1 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트 내지 제6 마이코박테리아 동정용 프라이머 세트는 별도의 보관수단에 의해 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 마이코박테리아 동정용 키트.The kit for identification of mycobacteria according to claim 1, wherein the primer set for identifying the first mycobacteria to the sixth mycobacteria is separated by a separate storage means. 분리된 시료로부터 DNA를 얻는 단계;
청구항 제1항에 의한 마이코박테리아 동정용 키트를 이용하여 상기 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계;
온도를 변화시키면서 상기 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 마이코박테리아 동정 방법.
Obtaining DNA from the separated sample;
Subjecting the DNA to a real-time polymerase chain reaction using the kit for identifying mycobacteria according to claim 1;
Melting the amplification product amplified by the real-time PCR reaction while changing the temperature to obtain a melting curve; And
And confirming the melting temperature of the melting curve.
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