KR100343398B1 - 탈황효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈 - Google Patents

탈황효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈 Download PDF

Info

Publication number
KR100343398B1
KR100343398B1 KR1019990001350A KR19990001350A KR100343398B1 KR 100343398 B1 KR100343398 B1 KR 100343398B1 KR 1019990001350 A KR1019990001350 A KR 1019990001350A KR 19990001350 A KR19990001350 A KR 19990001350A KR 100343398 B1 KR100343398 B1 KR 100343398B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
recombinant
seq
desulfurization
sequence
Prior art date
Application number
KR1019990001350A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20000051096A (ko
Inventor
이상엽
장용근
박시재
Original Assignee
윤덕용
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 윤덕용, 한국과학기술원 filed Critical 윤덕용
Priority to KR1019990001350A priority Critical patent/KR100343398B1/ko
Publication of KR20000051096A publication Critical patent/KR20000051096A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100343398B1 publication Critical patent/KR100343398B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 탈황능력을 가진 고도나 종 CYKS1 균주(KCTC 0431BP)로부터 분리된 탈황관련 유전자인dszABC유전자, 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈황방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 대장균을 이용하면, 고도나 종 CYKS1 균주의 탈황관련 효소를 대량 발현할 수 있으며, 전기 재조합 대장균을 유기황 화합물을 포함하는 물질이 함유된 배지에 접종하고 배양함으로써, 종래의 화학적 탈황방법에 비하여 장치비와 운전비 등을 절감하면서 화학적 탈황방법으로는 제거가 어려운 디벤조티오펜(DBT) 등의 유기황 화합물로부터 용이하게 탈황이 가능하다.

Description

탈황효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈황방법{Recombinant E. coli Expressing Desulfurizing Enzymes and Biodesulfurization Method Therewith}
본 발명은 탈황세균으로부터 유래된 탈황관련 효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈황방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 탈황능력을 가진 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주(KCTC 0431BP)로부터 분리되었으며 탈황관련 효소를 코딩하는dszABC유전자, 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈황방법에 관한 것이다.
원유 속에 포함되어 있는 대표적인 이물질인 황은 원유정제에 사용되는 촉매의 중독(poisoning)을 유발하거나 장치의 부식 등을 초래하여, 원유 정제공정시 많은 문제를 일으킨다. 또한, 석탄, 석유에 포함되어 있는 황은 연소될 때 산성비를 유발시키는 이산화황(SO2)의 형태로 발산되는데, 산성비는 공기, 토양 및 수질오염의 주원인으로 영구히 지속적으로 환경에 나쁜 영향을 미친다. 최근에 엄격해진 환경규제 때문에, 화석연료의 황 함량을 근본적으로 감소시키기 위하여 석탄, 석유와 같은 화석연료 속에 포함된 황의 전처리 및 후처리는 필수적인 공정이 되었으며, 이에 대한 많은 연구가 행해지고 있다.
현재 원유 탈황에 이용되고 있는 공정은 수소첨가탈황 공정(hydrodesulfurization, HDS)으로서, 고온·고압의 조건에서 화학적인 촉매를이용하여 황을 환원시켜 H2S로 전환함으로써 황을 제거한다. HDS 공정으로 대부분의 무기황 성분은 제거가 가능하나, 유기황 제거의 어려움, 고온·고압을 견디는 장치의 필요, 반응산물인 H2S의 후처리 등의 문제로 인하여, 이의 대체방법으로서 미생물을 이용한 탈황공정(biodesulfurization, BDS)이 연구되기 시작하였다. BDS 공정은 상온·상압에서 이루어지기 때문에 장치비, 운전비가 적게 들고, HDS로 제거하기 어려운 유기황의 제거에 유리하며, 기존의 HDS 공정에 부가적으로 추가하여 상호보완할 수 있다는 장점이 있다.
원유에 포함되어 있으며 HDS 공정으로는 분해가 어려운 대표적인 유기황 성분은 디벤조티오펜(dibenzothiophene, DBT)이다. 지금까지 알려진 DBT 탈황 기능을 가진 호기성 균주는 두가지 대표적인 경로를 따른다. 첫 번째 경로는 DBT의 산화를 통해 황을 유리하는 고다마(Kodama) 경로이다. 고다마는 DBT를 산화하여 수용성인 2-히드록시-2-포밀-벤조티오펜(2-hydroxy-2-formyl-benzothiophene)으로 전환하는 고다마 경로를 보고하였다. 그러나, 고다마 경로에서 DBT 속의 황은 무기황으로 유리되지 않는다(참조: Kodama et al.,Agric. Biol. Chem., 34:1320-1324(1973)). 고다마 경로를 이용해 DBT를 분해하는 미생물은 그 이후에 많이 탐색(screening)되었으나, DBT의 C-C 결합을 파괴해 원유의 연료값을 절하시킨다는 단점이 있어 산업적으로 유리하지 않다. 두 번째 경로는 DBT의 황만 선택적으로 제거하는 4-S 경로이다. 4-S 경로를 이용하는 미생물로는 코리네박테리움 에스피. SY-1(Corynebacteriumsp. SY-1, 참조: Omori et al.,Appl. Environ. Microbiol.,58:911-915(1992)), 로도코커스 에스피. IGTS8(Rhodococcussp. IGTS8, 참조: Denome et al.,J. Bactriol.,176:6707-6716(1994)) 및, 로도코커스 에리스로폴리스 D-1(Rhodococcus erythropolisD-1, 참조: Izumi et al.,Appl. Environ. Microbiol., 60:223-226(1994)) 등이 있다. 전기 미생물들은 DBT에서 황을 선택적으로 제거하여 황은 설페이트(sulfate)의 형태로 유리하고, 최종 생성물로서 2-히드록시비페닐(2-hydroxybiphenyl, 2-HBP)을 생성한다. 이러한 4-S 분해 경로를 이용하면, 원유의 연료값을 떨어뜨리지 않고도 황을 제거할 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.
현재까지 클로닝된 DBT 탈황 유전자는 데놈(Denome) 등(참조: Denome et al.,Appl. Environ. Microbiol.,59:2837-2843(1993); Denome et al.,J. Bactriol.,176:6707-6716(1994))과 피딩톤(Piddington) 등(참조: Piddington et al.,Appl. Environ. Microbiol.,61:468-475(1995))에 의하여 독립적으로 로도코커스 종(Rhodococcussp.) IGTS8 균주로부터 클로닝된dszABC유전자가 유일하며, DBT에서 디벤조티오펜 술폰(dibenzothiophene sulfone, DBTO2)으로의 전환에는dszC유전자가, DBTO2에서 2-(2-히드록시페닐) 벤젠설피네이트(2-(2-hydroxyphenyl) benzenesulfinate, HPBS)로의 전환에는dszA유전자가, 그리고 HPBS에서 2-HBP로의 전환에는dszB유전자가 각각 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 미생물에서의 탈황기작에 대한 연구는 탈황에 관여하는 여러 인자들의 효과적인 연구를 가능하게 하며, 탈황경로에 관여하는 효소의 활성 증대, 효율적인 재조합 탈황균주의 개발등을 가능하게 한다.
한편, 최근 본 발명자들은 한국 대구 염색공단의 염색폐수로부터, DBT에서 황을 제거하여 최종생성물로 2-HBP를 생성하는, DBT 탈황능을 가진 신규한 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주(KCTC 0431BP)를 분리한 바 있다(참조: 대한민국 특허출원 제 98-7159호). 전기 CYKS1 균주는 신규한 탈황 관련 유전자를 보유하고 있을 가능성이 높았다. 자연계에 존재하는 강력한 탈황세균의 탐색 및 이들 탈황세균의 탈황관련 효소를 효율적으로 발현하는 재조합 미생물의 개발은 저에너지 소비형 유기황 탈황기술의 개발을 위하여 절실히 요구되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 자연계에서 발견되는 탈황세균으로부터 탈황관련 유전자를 클로닝하여, 탈황관련 효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈황방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 본 발명자들에 의하여 분리된 바 있는 고도나 종 CYKS1 균주(KCTC 0431BP)의 염색체 유전자로부터dszABC유전자를 분리하여 대장균 발현벡터에 클로닝하고, 전기 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 제조한 다음, 전기 재조합 대장균이 우수한 DBT 분해능을 가지고 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 첫번째 목적은 고도나 종 CYKS1 균주(KCTC 0431BP)로부터 분리된 탈황관련 유전자인dszA, B및C유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 전기dszA, B및C유전자로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 전기dszA, B및C유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균 을 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯번째 목적은 전기 재조합 대장균을 이용한 생물학적 탈황방법을 제공하는 것이다.
도 1은 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주(KCTC 0431BP)의dszABC염색체 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pBlueS1ExABC의 유전자 지도이다.
도 2a 내지 도 2d는 전기 고도나 종 CYKS1 균주의dszABC염색체 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열이다.
도 3은 전기 고도나 종 CYKS1 균주의dszABC염색체 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pTrcS1ExABC의 유전자 지도이다.
도 4는 재조합 대장균Escherichia coliW3110/pTrcS1ExABC(KCTC 0565BP)의 디벤조티오펜 분해능을 보여주는 HPLC 분석결과이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
데놈(Denom) 등은 로도코커스 종(Rhodococcussp.) IGTS8 균주에서 원유 탈황에 관여하는dszABC유전자를 보고한 바 있는데, 이때dszAB유전자는 서로 중복되어 있으며,dszC유전자는 전기dszAB유전자와 함께 일종의 오페론을 형성하는 것으로 밝혀졌다(참조: Denome et al.,J. Bactriol.,176:6707-6716(1994); Denis-Larose et al.,Appl. Environ. Microbial., 63:2915-2919(1997)). 이에, 본 발명자들은 원유 탈황능을 가진 것으로 알려진 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주(KCTC 0431BP)의dszABC유전자를 클로닝하고자, 전기 CYKS1 균주로부터 염색체 유전자를 분리한 다음, 종래의 로도코커스 종 IGTS8 균주의dszABC유전자 서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 CYKS1의dszAB유전자 및dszC유전자를 증폭시켰다. 그 결과, 약 2.5kb 크기의dszAB유전자는 증폭되었으나,dszC유전자는 증폭되지 않아, CYKS1의dszC유전자가 IGTS8의dszC유전자와는 서열이 많이 다름을 제시하였다. 따라서, 전기 증폭된 CYKS1dszAB유전자의 3' 말단서열에 근거하여 새로운 프라이머를 합성한 다음, 이를 이용하여 PCR을 재수행하여dszC유전자를 증폭하는데 성공하였다. 이와 같이 증폭된 고도나 CYKS1의dszAB유전자와dszC유전자를 pBluescript SK(-)의HindIII/XbaI 인식부위에 차례로 삽입하여, 6.8kb 크기의 재조합 플라스미드 pBlueS1ExABC를 제조하였다. 자동 염기서열 분석기를 이용하여dszABC유전자의 염기서열을 분석한 결과,dszA유전자의 크기는 1425bp(474 아미노산),dszB유전자의 크기는 1098bp(365 아미노산), 그리고dszC유전자의 크기는 1251bp(416 아미노산)인 것으로 확인되었다. 특히,dszA유전자의 3' 말단 서열과dszB유전자의 5' 말단 서열 간에는 약 67bp의 중첩이 있었으며,dszB유전자의 종지코돈과dszC유전자의 시작코돈 사이에는 10bp의 간격이 있었다. 고도나 종 CYKS1 균주의dszABC유전자와 종래의 로도코커스 종 IGTS8 균주의dszABC유전자와의 전체적인 서열상동성은 89%이었다. 아미노산 서열상동성은 DszA의 경우 86%, DszB의 경우 86%, 그리고 DszC의 경우 90%이었다.
고도나 종 CYKS1 균주의dszABC유전자를 대장균에서 발현시키고자, 약 3.7kb 크기의dszABC유전자 절편을 전기 pBlueS1ExABC로부터 절단한 다음, pTrc99A 플라스미드의NcoI/XbaI 인식부위에 다시 삽입하여, 8.0kb 크기의 재조합발현벡터 pTrcS1ExABC를 제조하였다. 이어서, 전기충격법에 의하여 전기 pTrcS1ExABC 벡터로 대장균 W3110을 형질전환시켜 Dsz A, B 및 C를 발현하는 재조합 대장균을 제조한 다음, 전기 재조합 대장균을 'Escherichia coliW3110/pTrcS1ExABC'라 명명하고, 이를 1999년 1월 8일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자 은행(KCTC, 대전광역시 유성구 어은동 52)에 기탁번호 KCTC 0565BP로 기탁하였다.
본 발명에 의하여 제공되는 재조합 대장균Escherichia coliW3110/pTrcS1ExABC는 후술하는 실시예에서 대표적인 유기황 화합물로 도입된 디벤조티오펜(dibenzothiophene, DBT)에서 황만을 선택적으로 제거하여, 최종적으로 2-하이드록시비페닐(2-hydroxybiphenyl)로 전환시키는 것이 확인되었다. 전기 재조합 대장균은 석유와 같은 화석연료 내의 다른 성분 또는 유기황 화합물 내의 탄소결합에는 영향을 미치지 않고, 유기황 화합물 내의 황만을 제거하게 된다.
한편, 본 발명의 재조합 대장균을 이용한 생물학적 유기황 탈황은 유기황 화합물을 포함하는 물질이 첨가된 대장균 배양배지에Escherichia coliW3110/pTrcS1ExABC(KCTC 0565BP)를 접종하고, 호기적 조건하에서 배양하여 실행된다.
전기 본 발명의 생물학적 유기황 탈황방법에서, 대장균 배양배지는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 0.01%(w/v) 카사미노 산(casamino acid)과 0.2%(v/v) 글리세롤이 첨가된 BSM배지(NaH2PO4H2O 4g/L, K2HPO43H2O 4g/L, NH4Cl 2g/L, MgCl26H2O 0.2g/L, CaCl22H2O 0.001g/L 및 FeCl36H2O 0.001g/L)를 사용한다.
본 발명의 탈황방법에 의하여 탈황될 수 있는 유기황 화합물로서는, 메틸설파이드, 티오펜, 티아졸, 2-메틸티오펜, 3-메틸티오펜, 4,5-다이메틸티아졸, 티아나프텐, 페닐설파이드, 디벤조티오펜, 2-메틸-β-나프티오티아졸, 벤질설파이드, p-톨릴다이설파이드, 벤질설파이드 및 디벤조티오펜설폰 등을 포함하며, 이들 유기황 화합물을 포함하는 물질로서는 원유, 석유 또는 디젤유 등의 화석연료를 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주의 염색체 유전자 분리
고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주의 염색체 유전자를 스토커(Stoecker) 등의 방법에 따라 분리 정제하였다(참조: Stoecker et al., Inter. J. Sys. Bacteriol., 44:106-110(1994)): 고도나 종 CYKS1 균주(KCTC 0431BP)를 500mL의 NB배지(8g/L nutrient broth)에서 하룻밤 정도 배양하였다. 균주들이 초기 대수성장기에 있을 때 원심분리에 의하여 균체를 회수한 다음, 10mg/mL의 리소자임(lysozyme)이 포함되어 있는 TE 용액(10mM Tris, 1mM EDTA; pH 7.6) 50mL에 현탁시켰다. 전기 균주 현탁액을 약 24시간 동안 서서히 교반하면서 상온에서 배양하였다. 배양이 완료된 다음, 균주의 파쇄와 단백질 제거를 위하여, 전기 배양액에 10% 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액 16mL과 20mg/mL의 프로티네이즈 K(Proteinase K) 570㎕를 첨가하고, 1시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 이어서, 5M 염화나트륨 용액 14mL과 0.7M 염화나트륨 용액에 용해되어 있는 10 % 세틸트리메틸암모니움브로마이드(cetyltrimethylammoniumbromide, CTAB) 10.66mL을 첨가한 다음, 65℃에서 10분간 반응시켰다. 그런 다음, 전기 반응액과 같은 부피의 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform:isoamylalcohol = 24:1)을 가하고, 상온에서 2시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 전기 혼합액을 6,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 비이커에 옮겨담고, 두 배 부피의 냉각된 에탄올을 천천히 가하여 염색체 유전자를 침전시킨 후, 유리봉으로 유전자를 말아서 감아올렸다. 전기 유리봉을 자연 건조시켜 에탄올을 제거하고, 1mL TE 용액(10mM Tris, 1mM EDTA; pH 8.0)에 유전자를 용해시켰다. 전기 유전자 용액에 RNase를 최종농도 50㎕/mL이 되도록 가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 다음, 다시 전기 반응액과 같은 부피의 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform:isoamylalcohol = 24:1)을 가하고, 상온에서 2시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 전기 혼합액을 6,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 비이커에 옮겨담고, 두 배 부피의 냉각된 에탄올을 천천히 가하여 염색체 유전자를 침전시킨 후, 유리봉으로 유전자를 말아서 감아올렸다. 전기 유리봉을 자연 건조시켜 에탄올을 제거하고, 최종적으로 1mL TE 용액(10mM Tris, 1mM EDTA; pH 8.0)에 정제된 CYKS1의 염색체 유전자를 용해시켰다.
실시예 2: 고도나 종 CYKS1 균주의dszAB및dszC유전자의 클로닝
전기 실시예 1로부터 수득한 고도나 종 CYKS1 균주의 염색체 유전자로부터 탈황관련 유전자를 클로닝하기 위하여, 로도코커스 종(Rhodococcussp.) IGTS8 균주의dszABC유전자 서열에 기초하여(참조: Denome et al.,J. Bactriol.,176:6707-6716(1994); Denis-Larose et al.,Appl. Environ. Microbial., 63:2915-2919(1997)), 다음과 같은 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
dszAB프라이머: 5'-CCCAAGCTTCGCGATGACTCAACAACGAC-3' (서열번호: 1)
HindIIII
5'-CCCAAGCTTCTATCGGTGGCGATTGAGGC-3' (서열번호: 2)
HindIIII
dszC프라이머: 5'-GGGAATTCCATATGACACTGTCACCTGAAAA-3' (서열번호: 3)
NdeI
5'-TGCTCTAGATCAGGAGGTGAAGCCGGG-3' (서열번호: 4)
XbaI
전기 실시예 1로부터 수득한 고도나 종 CYKS1 균주의 염색체 유전자를 주형으로 하고 전기 프라이머(서열번호: 1, 2, 3 및 4)를 사용하여, DNA 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 이 때 반응조건은 94℃에서 50 초간 변성(denaturation), 52℃에서 50 초간 서냉복원(annealing), 72℃에서 2분간 신장(extention)을 한 주기로 하여, 총 30 주기를 반복하였다. PCR 반응산물을 아가로오스 젤 전기영동으로 확인한 결과,dszAB유전자로부터 증폭된 약 2.5 kb 크기의 유전자 절편은 뚜렷하게 확인되었으나,dszC에 해당하는 약 1.3 kb 크기의 유전자 절편은 증폭되지 않은 것으로 확인되었다.
전기dszAB유전자 절편을 플라스미드 pUC19(New England Biolabs, Inc., USA)의HindIII 인식부위에 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결시켰다. 전기 연결반응으로부터 수득한dszAB유전자 절편이 삽입된 재조합 pUC19 플라스미드로 전기충격법(electroporation)에 의하여 대장균 XL1-Blue(Stratagene, USA)를 형질전환시켰다(참조: Sambrook et al., 1989, Vol 1, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). 이어서, 전기 재조합 pUC19에 삽입되어 있는dszAB유전자의 염기서열을 자동 염기서열 분석기(ABI PrismTM377 DNA sequencer, Perkin Elmer Co., USA)로 분석하고, 이로부터 밝혀진CYKS1dszB유전자의 3' 말단서열에 근거하여, 다시 다음과 같은 염기서열을 가지는 PCR 프라이머를 제작하였다:
dszC프라이머-1: 5'-CCCAAGCTTCTGCAGGAGCCCGTCGCC-3' (서열번호: 5)
HindIII
5'-TGCTCTAGATCAGGAGGTGAAGCCGGG-3' (서열번호: 6)
XbaI
전기 프라이머(서열번호: 5 및 6)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행한 결과, 약 1.4kb 크기의 유전자 절편을 수득할 수 있었다. 전기 1.4kb 유전자 절편은 약 1.3kb 크기의dszC유전자 이외에, 5' 말단에 약 100bp의dszB유전자 서열을 추가로 포함하고 있었다. 전기dszC유전자를 포함하는 1.4kb절편을 역시 플라스미드 pUC19의HindIII/XbaI 인식부위에 삽입하고, 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켰다. 자동 염기서열 분석기를 이용한dszC유전자의 염기서열 분석결과, 고도나 종 CYKS-1 균주의dszC유전자 서열은 전기 실시예 1에서 로도코커스 종 IGTS8 균주의dszC유전자 서열을 바탕으로 제작하였던 프라이머(서열번호: 3 및 4)와는 유전자 서열이 많이 다름을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 고도나 종 CYKS1 균주의 유전자 서열을 바탕으로 새롭게 제작된 프라이머를 이용한dszABC유전자의 클로닝
전기 실시예 2에서 확인된 고도나 종 CYKS1 균주의dszAB및dszC유전자 서열을 바탕으로, 다음과 같은 염기서열을 가지는 새로운 PCR 프라이머를 제작하였다:
newdszAB프라이머:
5'-CCCAAGCT T CATGACTCAACAACGACAACTGCATCTGGCC-3'(서열번호:7)HindIIIBspHI
5'-CCCAAGCTTTCCTATCGGTGACGGTTGAGGCTG-3' (서열번호:8)
HindIII
newdszC프라이머:
5'-CCCAAGCTTGCATGACTCTGTCCGTTGAAAAGC-3' (서열번호: 9)
HindIII
5'-TGCTCTAGATCATCATCAGGAGGTGAAGCCGGG-3' (서열번호: 10)XbaI
newdszC프라이머의 경우, 효과적인 전사의 종결을 위하여 종지코돈을 두 개 연속으로 넣어주었고,dszB유전자와dszC유전자 사이의 6bp는 클로닝을 용이하게 하기 위하여HindIII 인식서열로 바꾸어 주었다. PCR 반응은 전기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다. 증폭된dszAB유전자 절편은 플라스미드 pACYC184(NewEngland Biolabs, Inc., USA)의HindIII 지역에, 그리고dszC유전자 절편은 pBluescript SK(-)(New England Biolabs, Inc., USA)의HindIII/XbaI 지역에 각각 삽입하고, 이와 같이 제조된 재조합 플라스미드들로 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켰다. 이어서, 전기 재조합 pACYC184에 삽입되어 있는dszAB유전자를dszC유전자가 들어있는 재조합 pBluescript SK(-)의HindIII 인식부위에 삽입시켜,dszABC탈황유전자가 하나의 오페론(operon)으로 작용할 수 있는 6.8kb 크기의 재조합 플라스미드를 작제하고, 전기 플라스미드를 'pBlueS1ExABC'이라 명명하였다(참조: 도 1).
실시예 4: 고도나 종 CYKS1 균주의dszABC오페론의 염기서열 분석
자동 염기서열 분석기(ABI PrismTM377 DNA sequencer, Perkin Elmer Co., USA)를 이용하여, 전기 실시예 3에서 클로닝한dszABC오페론의 염기서열을 분석한 결과,dszA유전자(서열번호: 11)의 크기는 1425bp(474 아미노산, 서열번호: 12),dszB유전자(서열번호: 13)의 크기는 1098bp(365 아미노산, 서열번호: 14), 그리고dszC유전자(서열번호: 15)의 크기는 1251bp(416 아미노산, 서열번호: 16)인 것으로 확인되었다(참조: 도 2a 내지 도 2d). 특히,dszA유전자의 3' 말단 서열과dszB유전자의 5' 말단 서열 간에는 약 67bp의 중첩이 있었으며,dszB유전자의 종지코돈과dszC유전자의 시작코돈 사이에는 10bp의 간격이 있었다(참조: 도 2a 내지 도 2d). 고도나 종 CYKS1 균주의dszABC유전자와 종래의 로도코커스 종 IGTS8 균주의dszABC유전자와의 전체적인 서열상동성은 89%이었다. 아미노산 서열상동성은 DszA의 경우 86%, DszB의 경우 86%, 그리고 DszC의 경우 90%이었다.
실시예 5: 고도나 종 CYKS1 균주의dszABC오페론을 포함하는 재조합 발현벡터 및 이로 형질전환된 재조합 대장균의 제조
고도나 종 CYKS1 균주의dszABC오페론을 대장균에서 발현시키고자, 먼저 전기 실시예 3으로부터 수득한 pBlueS1ExABC 플라스미드로부터BspHI/XbaI 처리에 의하여dszABC오페론을 분리하고, pTrc99A 플라스미드(Pharmacia Biotech, Sweden)의NcoI/XbaI 인식부위에 삽입하여, 8.0kb 크기의 재조합 발현벡터 pTrcS1ExABC를 제조하였다(참조: 도 3). 이어서, 전기충격법에 의하여 전기 pTrcS1ExABC 벡터로 대장균 W3110을 형질전환시켜 DszABC를 발현하는 재조합 대장균을 제조한 다음, 전기 재조합 대장균을 'Escherichia coliW3110/pTrcS1ExABC'라 명명하고, 이를 1999년 1월 8일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자 은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52)에 기탁번호 KCTC 0565BP로 기탁하였다.
실시예 6: 재조합 대장균의 DBT 분해능 측정
본 발명의 재조합 대장균(Escherichia coliW3110/pTrcS1ExABC, KCTC 0565BP)의 DBT 분해능을 확인하고자, 전기 재조합 대장균을 LB 배지에서 0.5mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)로 단백질 발현을 유도하면서 하룻 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 균체를 6,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 0.01%(w/v) 카사미노 산(casamino acid)과 0.2%(v/v) 글리세롤이 첨가된 BSM 배지(NaH2PO4H2O 4g/L, K2HPO43H2O 4g/L, NH4Cl 2g/L, MgCl26H2O 0.2g/L, CaCl22H2O 0.001g/L 및 FeCl36H2O 0.001g/L)로 두 번 세척한 다음, 0.2M DBT를 포함하는 BSM 배지에 현탁도가 600nm에서 0.1이 되도록 접종하였다. 60 시간의 배양 후에, 배양액의 pH를 5N HCl을 사용해 2.0 까지 감소시키고, 같은 부피의 에틸아세테이트로 추출하였다. 추출 후, 10㎕의 에틸 아세테이트 층을 280nm로 고정된 UV-VIS 검출기(Model L-6200, Hitachi, Japan)가 장착된 HPLC로 분석하였다. 이때, HPLC 컬럼으로는 Nova-Pak C18 컬럼(3.9 x 150 mm)을 사용하고, 유동층(mobile phase)으로는 100%(v/v) 메탄올을 사용하였으며, 흐름속도(flow rate)는 0.6 mL/min을 유지하였다. HPLC 분석결과, 약 15%의 DBT가 2-HBP로 전환되었음을 확인하였다(참조: 도 4). 도 4에서, 2-HBP 표준 용액과 DBT 표준 용액의 체류시간(retention time)은 각각 1.89분과 2. 62분이었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 탈황능력을 가진 고도나종 CYKS1 균주(KCTC 0431BP)로부터 분리된 탈황관련 유전자인dszABC유전자, 전기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈황방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 대장균을 이용하면, 고도나 종 CYKS1 균주의 탈황관련 효소를 대량 발현할 수 있으며, 전기 재조합 대장균을 유기황 화합물을 포함하는 물질이 함유된 배지에 접종하고 배양함으로써, 종래의 화학적 탈황방법에 비하여 장치비와 운전비 등을 절감하면서 화학적 탈황방법으로는 제거가 어려운 디벤조티오펜(DBT) 등의 유기황 화합물로부터 용이하게 탈황이 가능하다.

Claims (10)

  1. 서열번호 11의 유전자 서열을 가지는 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주의dszA유전자.
  2. 서열번호 13의 유전자 서열을 가지는 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주의dszB유전자.
  3. 서열번호 15의 유전자 서열을 가지는 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주의dszC유전자.
  4. 제 1항의 유전자 서열로부터 유추된 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주의 DszA 단백질.
  5. 제 2항의 유전자 서열로부터 유추된 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주의 DszB 단백질.
  6. 제 3항의 유전자 서열로부터 유추된 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 고도나 종(Gordonasp.) CYKS1 균주의 DszC 단백질.
  7. 서열번호 11, 13 및 15의 유전자 서열을 포함하며 다음과 같은 유전자 지도를 가지는 재조합 발현벡터 pTrcS1ExABC:
  8. 제 7항의 재조합 발현벡터 pTrcS1ExABC로 형질전환된 재조합 대장균 W3110/pTrcS1ExABC(Escherichia coliW3110/pTrcS1ExABC)(KCTC 0565BP).
  9. 제 8항의 재조합 대장균 W3110/pTrcS1ExABC(Escherichia coliW3110/pTrcS1ExABC)(KCTC 0565BP)을 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)로 단백질 발현을 유도하며 배양하는 단계; 및, 전기 배양된 균체를 메틸설파이드, 티오펜, 티아졸, 2-메틸티오펜, 3-메틸티오펜, 4,5-다이메틸티아졸, 티아나프텐, 페닐설파이드, 디벤조티오펜, 2-메틸-β-나프티오티아졸, 벤질설파이드, p-톨릴다이설파이드, 벤질설파이드 및 디벤조티오펜설폰으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 포함하는 배지에 접종하고, 호기적 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 생물학적 유기황 탈황방법.
  10. 삭제
KR1019990001350A 1999-01-19 1999-01-19 탈황효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈 KR100343398B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019990001350A KR100343398B1 (ko) 1999-01-19 1999-01-19 탈황효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019990001350A KR100343398B1 (ko) 1999-01-19 1999-01-19 탈황효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20000051096A KR20000051096A (ko) 2000-08-16
KR100343398B1 true KR100343398B1 (ko) 2002-07-11

Family

ID=19571653

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019990001350A KR100343398B1 (ko) 1999-01-19 1999-01-19 탈황효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100343398B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019038789A1 (en) * 2017-08-25 2019-02-28 Indian Institute Of Technology, Delhi RECOMBINANT VECTOR COMPRISING FUSION DNA FOR CELL SURFACE DISPLAY AND USES THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
KR20000051096A (ko) 2000-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2979178B2 (ja) 脱硫用生物触媒をコードする組換えｄｎａ
CN110573605B (zh) 一种慢生根瘤菌单加氧酶及其在制备手性亚砜中的应用
Sohrabi et al. Bacterial desulfurization of organic sulfur compounds exist in fossil fuels
Pan et al. Enhancement of desulfurization activity by enzymes of the Rhodococcus dsz operon through coexpression of a high sulfur peptide and directed evolution
Matsui et al. Recombinant Rhodococcus sp. strain T09 can desulfurize DBT in the presence of inorganic sulfate
CN113957084A (zh) 一种完全降解2,4-二硝基甲苯的大肠杆菌工程菌的构建及其应用
Wu et al. RecET recombination system driving chromosomal target gene replacement in Zymomonas mobilis
KR100343398B1 (ko) 탈황효소를 발현하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 생물학적 탈
US5952208A (en) Dsz gene expression in pseudomonas hosts
WO1998045447A9 (en) Dsz gene expression in pseudomonas hosts
WO2007072003A1 (en) Hydrogen production by means of a cell expression system
US6235519B1 (en) Gene involved in thiophene biotransformation from nocardia asteroides KGB1
Gou et al. Isolation and identification of nondestructive desulfurization bacterium
KR100613691B1 (ko) 토양 메타게놈 유래 신규 리파제 및 이를 이용하여 라세믹에틸 2-브로모프로피오네이트를 선택적으로 분할하는 방법
CN109486837B (zh) 一组高温生物脱硫基因与应用
US5846813A (en) DszD utilization in desulfurization of DBT by rhodococcus sp. IGTS8
EP0695359A1 (en) PROCESS FOR INCREASING THE PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE RECOMBINANT PROTEINS
US6133016A (en) Sphingomonas biodesulfurization catalyst
CN111117980A (zh) 一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因和应用
Gou et al. Desulfurization metabolite of Rhodococcus erythropolis LSSE8-1 and its related desulfurizational gene fragments
US5804433A (en) Rhodococcus flavin reductase complementing DszA and DszC activity
JP2004283120A (ja) 脱硫関連酸化還元酵素をコードする遺伝子および取得方法
CN112280768B (zh) 碱性蛋白酶低温突变体及其在污泥处理中的应用
JP4129493B2 (ja) 組換え脱硫菌
KR20060080202A (ko) 플라스미드 카피 수가 변화된 광 숙주 범위 ｐＢＢＲ1-기초플라스미드 돌연변이 유도체

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20081209

Year of fee payment: 8

LAPS Lapse due to unpaid annual fee