KR100331807B1 - Method for fabricating dna chip - Google Patents
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Abstract
DNA 칩 제조방법에 관한 것으로, 이종의 올리고 핵산들이 결합된 원판 DNA 칩과, 올리고 핵산과 상보적 결합을 할 수 있는 DNA 조각들이 혼합된 용액을 준비하고, DNA 조각들이 대응되는 올리고 핵산에 각각 상보적 결합되도록 원판 DNA 칩을 용액 속에 담근 후, 대응되는 올리고 핵산에 각각 상보적 결합된 DNA 조각들 위에 복제할 기판을 위치시킨다. 그리고, DNA 조각들의 상보적 결합을 끊어주고, 상보적 결합이 끊어진 DNA 조각들을 복제할 기판에 결합시켜 복제된 DNA 칩을 제작한다. 이와 같은 방법을 사용하는 본 발명은 하나의 DNA 칩으로 여러 장의 DNA 칩을 복제할 수 있으므로 대량 생산에 유리하며, 제조 공정이 간단하여 고가의 장비가 필요치 않으므로 제조 비용이 저렴한 장점이 있다.The present invention relates to a method for preparing a DNA chip, comprising: preparing a DNA DNA chip having heterologous oligonucleotides bound together with a solution containing DNA fragments capable of complementary binding to oligonucleotides, and complementing the respective oligonucleotides with corresponding oligonucleotides. The original DNA chip is immersed in solution for proper binding, and then the substrate to be replicated is placed on each of the DNA fragments complementary to the corresponding oligo nucleic acid. Then, the complementary binding of the DNA fragments is broken, and the DNA fragments that are complementary to each other are bonded to the substrate to be replicated to produce a cloned DNA chip. The present invention using such a method is advantageous in mass production because a plurality of DNA chips can be replicated with a single DNA chip, and the manufacturing process is simple, so that expensive equipment is not required, and thus manufacturing cost is low.
Description
본 발명은 DNA 칩 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a DNA chip manufacturing method.
일반적으로 DNA 칩(chip)은 좁은 표면 위에 매우 다양한 염기서열을 가지는 DNA 조각이 고밀도로 배열되어 고정된 DNA와 미지의 DNA 시료와의 결합(hybridization)을 통하여 미지시료내의 DNA에 대한 정보를 알아내는데 사용된다.Generally, a DNA chip finds information on DNA in an unknown sample through hybridization of a fixed DNA with an unknown DNA sample by densely arranged DNA fragments having a wide variety of sequences on a narrow surface. Used.
여기서, 결합(hybridization)이란 DNA 염기를 구성하는 아데닌(adenine)-티민(thymine), 구아닌(quanine)-시토신(cytosine)간의 수소결합에 의해 상보적인 염기서열을 갖는 유전자 부위(subsequence)가 서로 결합하여 더블-스트랜디드(double-stranded) DNA를 형성하는 것을 의미한다.Here, the term 'hybridization' refers to a gene sequence having complementary base sequences linked to each other by hydrogen bonding between adenine-thymine and guanine-cytosine constituting DNA bases. By means of forming double-stranded DNA.
따라서, 미지의 DNA 시료가 기판에 고정된 DNA 탐침과 상보적 결합을 하게 되면 기판 표면에 놓이게 되는데, 이때 DNA 탐침이나 DNA 시료 또는 결합(hybridization) 후에 더블-스트랜디드(double-stranded) DNA를 적당히 라벨(label)을 하면 시료내의 DNA 염기서열에 대한 정보를 알 수 있다.Thus, when an unknown DNA sample complementarily binds to a DNA probe immobilized on a substrate, it is placed on the surface of the substrate, where the double-stranded DNA is removed after the DNA probe or DNA sample or hybridization. Proper labeling provides information about DNA sequences in the sample.
DNA 칩 제조는 기판상에서 직접 올리고핵산을 합성하여 탐침(probe)을 만드는 합성법과 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)나 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid : PNA), cDNA(complementary DNA) 등을 미리 합성하여 칩상에 올리는 방법으로 크게 두 가지로 나눌 수 있다.DNA chip manufacturing is a method of synthesizing oligonucleic acid directly on a substrate to make a probe and a method of synthesizing oligonucleotides, peptide nucleic acids (PNA), cDNA (complementary DNA), and placing them on a chip in advance. Can be divided into two.
이러한 일들은 현재 미국에서 가장 활발하게 진행되고 있으며 많은 결과와 실질적인 제작 기술들이 상용화되고 있다.This is currently the most active in the United States, with many results and practical production techniques commercially available.
그 중에서 반도체 공정에 많이 사용되는 포토리소그래피(photolithography) 방식을 이용하여 폴리펩타이드를 실리콘 기판상에서 인-시투(in-situ) 합성하는 방법이 있다(미국 특허 5,143,854).Among them, there is a method of in-situ synthesis of a polypeptide on a silicon substrate by using photolithography, which is widely used in semiconductor processes (US Pat. No. 5,143,854).
이 방법은 미리 기판상에 개개의 염기가 합성될 수 있는 작용기를 도입하고 작용기 말단에는 빛에 민감한(photolabile) 화학물질에 의해 보호된 상태로 만든다.This method introduces functional groups capable of synthesizing individual bases on a substrate in advance and leaves them protected by photolabile chemicals at the functional group ends.
그리고, 포토마스크(photomask)를 이용하여 특정한 일정 부위에만 빛을 쬐어주게 되면 빛에 민감한 화학물질이 제거되고 염기와 반응할 수 있는 작용기만 노출이 된다.When the light is exposed to only a certain part using a photomask, light-sensitive chemicals are removed and only functional groups that can react with the base are exposed.
이때, 반응에 참여하는 각각의 염기들도 그 말단 부위에 빛에 민감한 화학물질이 붙어 있기 때문에 빛이 쪼여져 작용기가 활성화된 부위에만 염기가 한 개씩 합성될 수 있게 된다.At this time, each base participating in the reaction also has light-sensitive chemicals attached to its terminal sites, so that light is split so that only one base can be synthesized at the site where the functional group is activated.
이어, 반응이 안된 염기들을 제거해준 다음, 다시 반복해서 다른 패턴을 갖는 포토마스크를 이용하여 특정부위에 특정 염기를 선택적으로 합성하는 작업을 계속하게 되면, 결과적으로 일정한 면적의 각 스팟(spot)상에 15 ∼ 25 mer 의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있다.Subsequently, after removing the unreacted bases and repeating the process of selectively synthesizing a specific base at a specific site using a photomask having a different pattern, the result is that each spot of a certain area has a constant area. Oligonucleotides having a nucleotide sequence of 15 to 25 mer can be synthesized.
이렇게 빛의 투사와 도입되는 염기의 순서에 따라 올리고뉴클레오타이드들이 기판위에 형성되는데, 이러한 포토리소그래피(photolithography)에 의한 DNA 칩 제조는 고체상 합성에서 올리고핵산 탐침(probe)을 합성할 수 있는 길이(약 30 베이스(base))의 제한 때문에 긴 유전자나 반복 배열이 많은 유전자를 구분하는 데는 불리하며, 미리 고안된 배열만 읽을 수 있기 때문에 탐침을 만들기 전에 찾고자 하는 구조를 알아내야만 한다.The oligonucleotides are formed on the substrate according to the light projection and the order of the introduced bases. The production of DNA chips by photolithography allows the synthesis of oligonucleotide probes in solid phase synthesis (about 30). Due to the limitation of base), it is disadvantageous to distinguish long genes or genes with many repeat sequences, and since only pre-designed sequences can be read, you must find out the structure you are looking for before making a probe.
그러나, 가장 큰 문제점은 DNA 칩 제조시마다 각각의 패턴을 갖는 마스크가 필요하다는 점이다.However, the biggest problem is that a mask having each pattern is required every time a DNA chip is manufactured.
예를 들면, 25 베이스(base) 길이의 올리고핵산 탐침을 제작할 경우, 1개의 베이스 층을 형성하는데 마스크가 각각 4 장씩, 총 100장의 마스크가 필요하게 되며, 공정 또한 약 100 싸이클(cycle)이 소요되므로 DNA 칩 제조 및 양산시 복잡한 공정과 가격면에서 큰 부담이 되는 문제가 있다.For example, when manufacturing a 25 base long oligonucleic acid probe, a total of 100 masks are required to form one base layer, 4 masks each, and the process also requires about 100 cycles. Therefore, when manufacturing and mass-producing a DNA chip, there is a problem that becomes a big burden in terms of complex process and price.
또한, 각각의 공정마다 세척(washing)과 마스크 얼라인(mask align)과정 및 제조시 고가의 장비가 필요하다는 등의 단점이 있었다.In addition, there are disadvantages such as washing and mask alignment processes and expensive equipment required for each process.
상기 방법 이외에도 잉크젯 프린터와 같이 압전 인쇄(piezoelectric printing) 방식으로 4가지 베이스(base) 중 어느 하나를 전기적으로 방출시킴으로써, 칩 표면 위에 올리고핵산을 형성하는 방법이 있다(미국 특허 5,474,796).In addition to the above method, there is a method of forming oligonucleic acid on a chip surface by electrically releasing any one of four bases by piezoelectric printing such as an inkjet printer (US Pat. No. 5,474,796).
그러나, 이 방법은 40 ∼ 50 베이스의 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 형성할 수는 있지만, 배열(aligning) 공정이 쉽지 않으며, 패턴의 최소 크기가 약 100 ㎛ 정도이므로 집적화에는 한계가 있다.However, this method can form oligonucleotides of 40 to 50 bases, but the alignment process is not easy, and since the minimum size of the pattern is about 100 μm, integration is limited.
또한, 시료주입과 분사장치의 동작시, 번짐 현상 등이 나타나는 단점이 있다.In addition, when the sample injection and the injection device is operated, there is a disadvantage that appears bleeding phenomenon.
그리고, 고전적인 방법이라 할 수 있는 마이크로피펫팅(micropipetting) 방식과 cDNA의 스폿팅(spotting) 방식이 있다(Science 270 : 467 ∼ 470, 1995).In addition, there are a micropipetting method and a spotting method of cDNA, which are classic methods (Science 270: 467-470, 1995).
이 방법들은 모두 고밀도로 DNA 칩을 제조할 수 없다는 단점과 대량생산에 제약이 되는 단점이 있어 연구용 목적의 DNA 칩 제작에만 응용되고 있는 실정이다.All of these methods have the disadvantage of not being able to manufacture DNA chips at high density and are constrained in mass production, so they are only applied to the production of DNA chips for research purposes.
본 발명의 목적은 종래의 문제들을 해결하기 위한 것으로, 낮은 가격으로 DNA 칩을 대량 생산할 수 있는 DNA 칩 제조방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to solve the conventional problems, to provide a DNA chip manufacturing method that can mass-produce a DNA chip at a low price.
도 1a 내지 도 1e는 본 발명에 제 1 실시예에 따른 DNA 칩 제조 공정을 보여주는 도면1A to 1E are diagrams illustrating a DNA chip manufacturing process according to a first embodiment of the present invention.
도 2a 내지 도 2d는 본 발명 제 2 실시예에 따른 DNA 칩 제조 공정을 보여주는 도면2A to 2D are diagrams illustrating a DNA chip manufacturing process according to a second embodiment of the present invention.
도 3a 내지 도 3b는 전기장을 이용한 본 발명의 DNA 칩 제조 공정을 보여주는 도면3a to 3b is a view showing a DNA chip manufacturing process of the present invention using an electric field
본 발명에 따른 DNA 칩 제조방법은 이종의 올리고 핵산들이 결합된소스(source) 기판과, 올리고 핵산과 상보적 결합을 할 수 있는 DNA 조각들이 혼합된 용액을 준비하는 제 1 단계와, DNA 조각들이 대응되는 올리고 핵산에 각각 상보적 결합되도록 소스 기판을 상기 용액 속에 담그는 제 2 단계와, 대응되는 올리고 핵산에 각각 상보적 결합된 DNA 조각들 위에 타겟(target) 기판을 위치시키는 제 3 단계와, DNA 조각들의 상보적 결합을 끊어주고, 상보적 결합이 끊어진 DNA 조각들을 타겟 기판에 결합시키는 제 4 단계와, 제 2, 제 3, 제 4 단계를 순차적으로 반복하는 제 5 단계로 이루어진다.The DNA chip manufacturing method according to the present invention comprises a first step of preparing a source substrate in which heterologous oligonucleotides are bound, a solution in which DNA fragments capable of complementary binding with oligonucleotides are prepared, and DNA fragments A second step of immersing a source substrate in the solution so as to be complementary to each corresponding oligo nucleic acid, and a third step of placing a target substrate on DNA fragments each complementarily bound to the corresponding oligo nucleic acid; Breaking the complementary binding of the fragments, and the fourth step of binding the DNA fragments with the complementary binding to the target substrate, and a fifth step of sequentially repeating the second, third, and fourth steps.
여기서, 올리고 핵산은 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acids) 중 어느 하나를 포함하고, 올리고 핵산의 5', 3' 중 어느 한 위치가 소스 기판에 공유 결합으로 고정된다.Here, the oligonucleotide includes any one of DNA, RNA, and PNA (Peptide Nucleic Acids), and any position of 5 'or 3' of the oligonucleotide is fixed covalently to the source substrate.
그리고, DNA 조각은 DNA, RNA, PNA 중 어느 하나인 올리고 핵산이고, DNA 조각의 5', 3' 중 어느 한 위치에는 소스 기판에 공유 결합할 수 있는 작용기가 있다.The DNA fragment is an oligonucleotide that is any one of DNA, RNA, and PNA, and at any one of 5 'and 3' of the DNA fragment, there is a functional group capable of covalently binding to the source substrate.
또한, 소스 기판은 다수개의 비어홀이 형성하여 각 비어홀의 내벽에 각기 다른 올리고 핵산이 결합되도록 제작할 수도 있다.In addition, the source substrate may be fabricated so that a plurality of via holes are formed to bind different oligonucleotides to the inner wall of each via hole.
그리고, 소스 기판 및 타겟 기판은 유리, 실리콘 등과 같은 무기물이거나 또는 아크릴계, PET(Polyethylene terephtalate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리스틸렌(polystylene), 폴리프로필렌(polypropylene) 등과 같은 고분자 물질로 이루어진다.The source substrate and the target substrate may be inorganic materials such as glass, silicon, or the like, or may be made of a polymer material such as acrylic, polyethylene terephtalate (PET), polycarbonate, polystylene, polypropylene, and the like.
여기서, 타겟 기판은 그 표면 위에 금, 알루미늄과 같은 금속 박막만이 형성되거나, 나일론, 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 등과 같은 고분자 맴브레인만이 형성되거나, 상기 금속 박막 위에 덱스트란(dextran)과 같은 고분자 물질이 적층되어 형성될 수도 있다.Here, the target substrate may be formed of only a metal thin film such as gold or aluminum on the surface thereof, only a polymer membrane such as nylon or nitrocellulose may be formed, or a polymer material such as dextran may be formed on the metal thin film. It may be formed by laminating.
그리고, 본 발명에서는 DNA 조각들의 상보적 결합을 끊어주기 위한 방법으로 기계적 에너지, 광 에너지, 열 에너지 중 어느 하나를 이용할 수 있고, 상보적 결합이 끊어진 DNA 조각들을 타겟 기판으로 빠르게 이동시키기 위한 방법으로 전기장을 이용할 수 있다.In the present invention, any one of mechanical energy, light energy, and thermal energy may be used as a method for breaking the complementary bonds of DNA fragments, and a method for rapidly moving the DNA fragments that have been broken with complementary bonds to a target substrate. Electric fields can be used.
이와 같은 방법을 사용하는 본 발명은 하나의 DNA 칩으로 여러 장의 DNA 칩을 복제할 수 있으므로 대량 생산에 유리하며, 제조 공정이 간단하여 고가의 장비가 필요치 않으므로 제조 비용이 저렴한 장점이 있다.The present invention using such a method is advantageous in mass production because a plurality of DNA chips can be replicated with a single DNA chip, and the manufacturing process is simple, so that expensive equipment is not required, and thus manufacturing cost is low.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 잇점들은 첨부한 도면을 참조한 실시예들의 상세한 설명을 통해 명백해질 것이다.Other objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description of embodiments taken in conjunction with the accompanying drawings.
상기와 같은 특징을 갖는 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 설명하면 다음과 같다.Referring to the accompanying drawings, preferred embodiments of the present invention having the features as described above are as follows.
본 발명에 따른 DNA 칩의 제작원리는 DNA 스트랜드(strand) 사이의 상보적 수소결합을 기본으로 한다.The manufacturing principle of the DNA chip according to the present invention is based on complementary hydrogen bonds between DNA strands.
즉, 아데닌(adenine)-티민(thymine), 구아닌(guanine)-시토신(cytosine)간의 수소결합에 의한 상보적 결합은 높은 선택성을 가지는데, 본 발명은 이런 DNA 간의 높은 선택성을 가진 상보적 결합을 이용하여 한 장의 원판 DNA 칩을 사용하여 빠르고 손쉽게 여러 장의 복제(replica) DNA 칩을 만드는 방법이다.That is, complementary binding by hydrogen bonding between adenine-thymine and guanine-cytosine has high selectivity, and the present invention provides complementary binding with high selectivity between such DNAs. Using a single DNA chip, you can quickly and easily create multiple copies of a DNA chip.
도 1a 내지 도 1e는 본 발명에 제 1 실시예에 따른 DNA 칩 제조 공정을 보여주는 도면으로서, 먼저 도 1a에 도시된 바와 같이, 상보적 결합을 하는 염기서열의 올리고 핵산을 고정시킨 원판 DNA 칩을 제작한다.1A to 1E are diagrams illustrating a DNA chip manufacturing process according to a first embodiment of the present invention. First, as shown in FIG. 1A, an original DNA chip to which oligonucleotides of a nucleotide sequence having complementary binding is immobilized is provided. To make.
여기서, 원판 DNA 칩은 유리, 실리콘 등과 같은 무기물로 이루어지거나, 아크릴계, PET(Polyethylene terephtalate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리스틸렌(polystylene), 폴리프로필렌(polypropylene) 등과 같은 고분자 물질로 이루어진 기판 표면에 각기 다른 올리고 핵산들이 고정되어 셀(cell) 형태로 나란히 배열되는데, 포토리소그래피(photolithography), 잉크젯, 마이크로스폿팅(microspotting), 마이크로인젝션(microinjection) 등의 DNA 칩 제조방법을 사용하여 제작된다.Here, the original DNA chip is made of inorganic materials such as glass, silicon, or the like, or on the surface of a substrate made of a polymer material such as acrylic, polyethylene terephtalate (PET), polycarbonate, polystyrene, polypropylene, etc. Other oligonucleotides are immobilized and arranged side by side in the form of cells, which are fabricated using DNA chip manufacturing methods such as photolithography, inkjet, microspotting, and microinjection.
그리고, 원판 DNA 칩에 배열된 올리고 핵산들은 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acids) 등을 포함하고, 이 올리고 핵산들의 5' 또는 3' 위치가 원판 DNA 칩에 공유 결합으로 고정되어 있다.The oligonucleotides arranged on the original DNA chip include DNA, RNA, PNA (Peptide Nucleic Acids), and the 5 'or 3' positions of the oligonucleotides are covalently fixed to the original DNA chip.
원판 DNA 칩에 고정된 각각의 올리고 핵산은 후공정에서 사용될 DNA의 혼합 용액에서 한 종의 DNA에만 선택적으로 결합할 수 있도록 디자인되어 있다.Each oligo nucleic acid immobilized on the original DNA chip is designed to selectively bind to only one type of DNA in a mixed solution of DNA to be used in a later process.
이어, 도 1b에 도시된 바와 같이 다수의 올리고 핵산들이 결합된 원판 DNA 칩을 모든 염기서열을 가진 DNA 조각들이 혼합된 용액 속에 담근다.Subsequently, as shown in FIG. 1B, the original DNA chip to which the plurality of oligonucleotides are bound is immersed in the mixed solution of DNA fragments having all sequences.
이때, 용액 내의 각 DNA 조각들은 원판 DNA 칩의 올리고 핵산에 선택적으로 대응되어 상보적 결합을 한다.At this time, the respective DNA fragments in the solution selectively correspond to the oligonucleotides of the original DNA chip to complementary binding.
즉, 도 1c에 도시된 바와 같이 용액 내의 DNA 조각은 DNA의 선택성에 의해원하는 위치로 원판 DNA 칩 위에 배열되게 된다.That is, as shown in FIG. 1C, the DNA fragments in the solution are arranged on the disc DNA chip in a desired position by the selectivity of the DNA.
여기서, DNA 조각은 DNA, RNA, PNA 등의 올리고 핵산으로서, DNA 조각의 5' 또는 3' 위치에는 복제 기판에 공유 결합할 수 있는 작용기가 있다.Here, the DNA fragment is an oligonucleic acid such as DNA, RNA, PNA, etc., and at the 5 'or 3' position of the DNA fragment, there is a functional group capable of covalently binding to a replication substrate.
그리고, 도 1d에 도시된 바와 같이 DNA 조각들이 상보적 결합된 원판 DNA 칩을 세척하여 비선택적으로 결합된 DNA 조각을 씻어주고, 복제하고자 하는 복제 기판 위에 원판 DNA 칩을 올려놓은 뒤, 선택적으로 결합되어 있는 DNA 조각을 복제 기판으로 옮긴다.Then, as shown in FIG. 1D, the DNA fragments having the DNA fragments complementarily bound are washed to wash non-selectively bound DNA fragments, and the original DNA chips are placed on the replication substrate to be replicated, and then selectively bound. Transfer the DNA fragment to the replica substrate.
이때, DNA 조각은 복제 기판에 결합을 할 수 있도록 반응기를 가지고 있으므로, 이 과정에서 적당한 반응조건을 사용하면 복제 기판 표면에 DNA 조각을 고정시킬 수 있다.At this time, since the DNA fragment has a reactor to bind to the replica substrate, using the appropriate reaction conditions in this process can fix the DNA fragment on the surface of the replica substrate.
여기서, DNA 조각을 복제 기판으로 옮기기 위해서는 먼저, DNA 조각과 올리고 핵산과의 상보적 결합을 끊어주어야 한다.Here, in order to transfer the DNA fragment to the replica substrate, first, the complementary bond between the DNA fragment and the oligonucleotide must be broken.
본 발명에서는 DNA 조각들의 상보적 결합을 끊어주기 위한 방법으로 기계적 에너지, 광 에너지, 열 에너지 중 어느 하나를 이용하였다.In the present invention, any one of mechanical energy, light energy, and thermal energy was used as a method for breaking the complementary binding of DNA fragments.
즉, 기계적 에너지를 이용하는 방법은 상보적 결합된 DNA 조각에 기계적으로 충격을 주어 상보적 결합을 끊는 방법이고, 광 에너지를 이용하는 방법은 DNA 조각에 소정 파장의 광을 주사하여 상보적 결합을 끊는 방법이며, 열 에너지를 이용하는 방법은 DNA 조각에 소정 온도로 열을 인가하여 상보적 결합을 끊는 방법이다.In other words, the method of using mechanical energy is a method of mechanically impacting complementary bound DNA fragments to break the complementary bond, and the method of using optical energy is a method of breaking complementary bonds by scanning light of a predetermined wavelength onto the DNA fragment. The method of using thermal energy is a method of breaking complementary bonds by applying heat to a DNA fragment at a predetermined temperature.
이어, 도 1e에 도시된 바와 같이 원판 DNA 칩과 DNA가 고정된 복제 기판을 분리하면 복제된 DNA 칩이 제조된다.Subsequently, as shown in FIG. 1E, when the original DNA chip and the DNA-fixed replication substrate are separated, a cloned DNA chip is manufactured.
그리고, 다시 원판 DNA 칩을 사용하여 상기 도 1b 및 도 1e의 과정을 반복하면 다수의 복제 DNA 칩을 제작할 수 있다.And, by repeating the process of Figures 1b and 1e again using the original DNA chip can be produced a number of replicate DNA chips.
여기서, 원판 DNA 칩 대신해 복제 DNA 칩을 사용하여도 처음에 제작한 원판 DNA 칩과 동일한 염기서열의 복제 DNA 칩들을 제작할 수 있다.Here, even if a replica DNA chip is used in place of the original DNA chip, replica DNA chips having the same base sequence as the original DNA chip can be produced.
지금까지는 편평한 표면을 갖는 원판 DNA 칩을 사용하였지만, 다수개의 비어홀(via hole)이 뚫려 있는 원판 DNA 칩을 사용할 수도 있다.Until now, a disc DNA chip having a flat surface has been used, but a disc DNA chip having a plurality of via holes can be used.
도 2a 내지 도 2d는 본 발명 제 2 실시예에 따른 DNA 칩 제조 공정을 보여주는 도면으로서, 본 발명 제 2 실시예는 본 발명 제 1 실시예와 거의 비슷한 제조 공정을 거치므로 상세한 설명은 생략하도록 한다.Figure 2a to 2d is a view showing a DNA chip manufacturing process according to a second embodiment of the present invention, since the second embodiment of the present invention passes through a manufacturing process similar to the first embodiment of the present invention, detailed description thereof will be omitted. .
먼저, 도 2a에 도시된 바와 같이 다수개의 비어홀(via hole)이 뚫려 있는 원판 DNA 칩을 제작한다.First, as shown in FIG. 2A, a disc DNA chip having a plurality of via holes is manufactured.
여기서, 비어홀은 유리, 실리콘 등의 무기물이나 폴리스틸렌(polystylene), 폴리프로필렌(polypropylene), PET(polyethylene terephtalate), PMMA(polymethylmethacrylate) 등의 고분자 물질로 이루어진 기판에 레이저로 일정한 간격으로 구멍을 뚫어 제작하거나 기판이 고분자 물질인 경우 사출성형 등의 방법으로 제작된다.Here, the via hole is made by punching holes at regular intervals with a laser on a substrate made of inorganic materials such as glass and silicon, or polymer materials such as polystyrene, polypropylene, polyethylene terephtalate (PET), and polymethylmethacrylate (PMMA). When the substrate is a polymer material, it is manufactured by injection molding or the like.
그리고, 각기 다른 염기 서열을 갖는 올리고 핵산들을 마이크로피펫(micropipette)이나 모세관 등으로 주입시키거나 합성하여 각 비어홀의 내벽에 고정시킨다.In addition, oligonucleotides having different nucleotide sequences are injected or synthesized into a micropipette, a capillary, or the like, and fixed to the inner wall of each via hole.
이어, 도 2b에 도시된 바와 같이 올리고 핵산이 고정된 원판 DNA 칩을 다종의 DNA 조각들을 섞은 용액 속에 담가 용액 내의 DNA 조각이 비어홀의 내벽에 고정된 올리고 핵산과 선택적으로 상보적 결합이 되도록 한다.Subsequently, as shown in FIG. 2B, the original DNA chip to which the oligonucleotide is immobilized is immersed in a solution mixed with a plurality of DNA fragments so that the DNA fragment in the solution is selectively complementary to the oligonucleotide immobilized on the inner wall of the via hole.
그리고, 도 2c에 도시된 바와 같이 원판 DNA 칩을 세척하여 비선택적으로 결합된 DNA 조각을 씻어주고, 원판 DNA 칩을 복제 기판 위에 올려놓는다.Then, as shown in FIG. 2C, the original DNA chip is washed to wash non-selectively bound DNA fragments, and the original DNA chip is placed on a replica substrate.
이어, 원판 DNA 칩에 적당한 압력 가하여 비어홀 내의 용액이 복제 기판과 비어홀이 접한 면 이외의 영역으로 확산되는 것을 막아주고, 원판 DNA 칩의 온도를 높여 DNA 조각의 상보적 결합을 끊어 비어홀 내의 용액으로 확산되도록 한다.Appropriate pressure is then applied to the disc DNA chip to prevent the solution in the via hole from diffusing to areas other than the surface where the replica substrate and the via hole are in contact.The temperature of the disc DNA chip is increased to break the complementary bonds of the DNA fragments to diffuse into the solution in the via hole. Be sure to
그리고, 상보적 결합이 끊어진 DNA 조각들은 비어홀의 용액과 접한 복제 기판면에 고정된다.DNA fragments that are broken complementarily are fixed to the surface of the replica substrate in contact with the via hole solution.
여기서, 비어홀 내의 용액이 복제 기판과 비어홀이 접한 면 이외의 영역으로 확산되는 것을 확실히 막아주기 위해, 원판 DNA 칩이나 또는 재생 기판의 표면 위에 엘라스토머(elastomer)를 형성할 수도 있다.Here, an elastomer may be formed on the surface of the original DNA chip or the regenerated substrate in order to reliably prevent the solution in the via hole from diffusing to a region other than the contact surface of the replica substrate and the via hole.
즉, 탄성이 있는 엘라스토머는 인접하는 서로 다른 올리고 핵산들 또는 인접하는 서로 다른 DNA 조각들이 분리되도록 그들 사이에 위치된다.That is, elastic elastomers are positioned between them to separate adjacent different oligonucleotides or adjacent different DNA fragments.
이어, 도 2d에 도시된 바와 같이 원판 DNA 칩과 DNA가 고정된 복제 기판을 분리하면 복제된 DNA 칩이 제조된다.Subsequently, as shown in FIG. 2D, when the original DNA chip and the replication substrate on which DNA is fixed are separated, a cloned DNA chip is manufactured.
그리고, 다시 원판 DNA 칩을 사용하여 상기 도 2b 및 도 2d의 과정을 반복하면 다수의 복제 DNA 칩을 제작할 수 있다.In addition, by repeating the process of FIGS. 2b and 2d using the original DNA chip, a plurality of replica DNA chips can be produced.
한편, 본 발명은 전기장을 이용하여 상보적 결합이 끊어진 DNA 조각들을 복제 기판으로 빠르게 이동시킬 수도 있다.On the other hand, the present invention can also be used to quickly move the DNA fragments that are complementary to the replication substrate by using an electric field.
도 3a 내지 도 3b는 전기장을 이용한 본 발명의 DNA 칩 제조 공정을 보여주는 도면으로서, 도 3a에 도시된 바와 같이 올리고 핵산과 DNA 조각이 상보적 결합된 원판 DNA 칩의 상/하부 중 어느 한 곳에 전극이 코팅된 기판을 위치시키고, 다른 한 곳에 복제할 기판을 위치시킨다.3A to 3B are diagrams illustrating a process for manufacturing a DNA chip of the present invention using an electric field. As shown in FIG. 3A, an electrode is positioned at an upper / lower portion of an original DNA chip having a oligonucleotide and a DNA fragment complementarily coupled thereto. This coated substrate is placed and the substrate to be duplicated in another place.
이어, 도 3b에 도시된 바와 같이 전극이 코팅된 기판과 복제 기판에 전류를 인가하면 음전하를 띤 DNA 조각이 빠른 속도로 복제 기판의 표면으로 이동된다.Subsequently, as shown in FIG. 3B, when current is applied to the electrode-coated substrate and the replica substrate, the negatively charged DNA fragment is rapidly moved to the surface of the replica substrate.
이때, 복제 기판은 전도성이 있는 물질로 이루어지거나 또는 기판 표면 위에 금속 박막이 형성되어 있어야 한다.In this case, the replica substrate should be made of a conductive material or a metal thin film formed on the substrate surface.
그러므로, 본 발명에서 사용되는 복제 기판은 복제 기판 표면 위에 금이나 알루미늄과 같은 금속 박막만이 형성될 수도 있고, 나일론, 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 등과 같은 고분자 멤브레인(membrane)만이 형성될 수도 있으며, 상기의 금속 박막 위에 덱스트란(dextran)과 같은 고분자 물질을 적층하여 형성될 수도 있다.Therefore, in the replica substrate used in the present invention, only a metal thin film such as gold or aluminum may be formed on the replica substrate surface, and only a polymer membrane such as nylon, nitrocellulose, or the like may be formed. It may be formed by laminating a polymer material such as dextran on a metal thin film.
이와 같이, 본 발명의 DNA 칩 제조방법은 DNA 간의 높은 선택성을 가진 상보적 결합을 이용하기 때문에 한 장의 원판 DNA 칩만으로 빠르고 손쉽게 여러 장의 복제(replica) DNA 칩을 만들 수 있어 향후 대량 생산에 매우 유리하다.As described above, since the DNA chip manufacturing method of the present invention uses complementary binding having high selectivity between DNAs, it is possible to quickly and easily make several copies of a replica DNA chip using only one original DNA chip, which is very advantageous for mass production in the future. Do.
본 발명에 따른 DNA 칩 제조방법은 다음과 같은 효과가 있다.DNA chip manufacturing method according to the present invention has the following effects.
하나의 DNA 칩으로 여러 장의 DNA 칩을 복제할 수 있으므로 대량 생산에 유리하며, 제조 공정이 간단하여 고가의 장비가 필요치 않으므로 제조 비용이 저렴한장점이 있다.Since multiple DNA chips can be duplicated with a single DNA chip, it is advantageous for mass production, and the manufacturing process is simple, so that expensive equipment is not required.
이상 설명한 내용을 통해 당업자라면 본 발명의 기술사상을 일탈하지 아니하는 범위에서 다양한 변경 및 수정이 가능함을 알 수 있을 것이다.Those skilled in the art will appreciate that various changes and modifications can be made without departing from the technical spirit of the present invention.
따라서, 본 발명의 기술적 범위는 실시예에 기재된 내용으로 한정되는 것이 아니라 특허 청구의 범위에 의하여 정해져야 한다.Therefore, the technical scope of the present invention should not be limited to the contents described in the embodiments, but should be defined by the claims.
Claims (15)
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