KR100317081B1

KR100317081B1 - 생물학적활성을지닌인간안지오제닌을발현하는재조합미생물및그를이용한인간안지오제닌의제조방법

Info

Publication number: KR100317081B1
Application number: KR1019980063713A
Authority: KR
Inventors: 윤종명; 한승희; 권오병; 김승호; 구태영; 박승국; 유영효; 박명환
Original assignee: 주식회사대웅제약
Priority date: 1998-12-31
Filing date: 1998-12-31
Publication date: 2002-10-12
Also published as: KR20000046971A

Abstract

본 발명은 강력한 혈관신생 유도 단백질인 인간 안지오제닌을 코딩하는 안지오제닌 유전자를 tac 프로모터의 조절하에서 대장균의 Omp A 분비 신호서열에 융합시켜 생물학적 활성이 유지된 상태로 발현시키는 재조합 발현벡터, 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 전기 재조합 미생물을 이용한 인간 안지오제닌의 대량 제조방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 인간 안지오제닌 유전자를 강력한 tac 프로모터 조절하에 있는 대장균의 Omp A 분비 신호서열을 포함하는 벡터에 삽입하여, 대장균의 Omp A 분비 신호서열과 인간 안지오제닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 구축하였다. 그런 다음, 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균의 배양액으로부터 재조합 단백질을 수득하고 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 안지오제닌 단백질이 세포외로 효율적으로 분비되며 생물학적 활성을 유지하고 있음을 확인하였다. 본 발명에 의하면, 생물학적 활성을 유지하고 있는 안지오제닌을 간편하고 신속하게 대량 발현하여, 종래의 생산 방법에서 제기되어 왔던 낮은 수율과 저하된 생물학적 활성의 문제점을 극복함으로써, 안지오제닌의 생리학적 기능 연구에 이바지 할 수 있으며, 혈관생성유도제로 안지오제닌을 약리학적으로 이용할 수 있을 것이다.

Description

생물학적 활성을 지닌 인간 안지오제닌을 발현하는 재조합 미생물 및 그를 이용한 인간 안지오제닌의 제조방법

본 발명은 생물학적 활성을 지닌 인간 안지오제닌을 발현하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 인간 안지오제닌의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 강력한 혈관신생 유도 단백질인 인간 안지오제닌을 코딩하는 안지오제닌 유전자를 tac 프로모터의 조절하에서 대장균의 Omp A 분비 신호서열에 융합시켜 생물학적 활성이 유지된 상태로 발현시키는 재조합 발현벡터, 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 전기 재조합 미생물을 이용한 인간 안지오제닌의 대량 제조방법에 관한 것이다.

인간 안지오제닌은 123개의 아미노산으로 구성된 분자량 14.2kDa의 단백질로서, 주로 암세포에서 대량 생성된다. 인간 안지오제닌은 3개의 디설파이드 결합을 가지며, 혈관신생을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 인간 안지오제닌은 구조적으로 리보핵산분해효소 계통 단백질과 매우 유사하며, 일반적인 리보핵산분해효소에 비해서는 낮은 활성을 보이나, 표적세포 표면의 수용체에 결합되어 내재화(internalization)된 다음, 리보좀 RNA를 분해하여 세포를 사멸시킨다. 인간 안지오제닌은 혈관 내피세포, 평활근세포 등과 같은 정상세포에서도 발현되며, 미생물을 이용하여 리보핵산분해효소 활성 및 혈관신생 유도 기능을 가지는 재조합 인간 안지오제닌을 생산한 예가 보고된 바 있다.

한편, 당업계에서는 안지오제닌 단백질을 재조합 대장균의 배양액으로부터 수득하고자, 대장균에서 유래한 분비 신호서열(secretion signal sequence)을 이용하여 왔으나, 이 경우 안지오제닌이 봉입체(inclusion body)의 형태로 발현된다는 단점이 있다(참조: Bird, R.E., et al., Science, 242:423-426, 1988; Chaudhary, V.K., et al., Nature, 339:394-397, 1989; Tai, M.S., et al., Biochemistry, 29:8024-8030, 1990). 봉입체의 형태로 발현된 재조합 단백질은 높은 수율과 생물학적 활성을 위하여 필수적으로 재접힘(refolding)과 복원(renaturation)의 과정을거치는데, 이 과정은 실행이 복잡할 뿐 아니라 단백질의 활성을 저하시킨다는 문제점을 가지고 있다. 특히, 인간 안지오제닌은 다수의 디설파이드 결합을 가지고 있기 때문에, 재접힘 과정 등을 거칠 경우 단백질 활성이 인간혈청에서 정제된 경우보다 저하되는 것으로 보고되어 있다(참조: Lapidus, A. L., et al., Biomed. Sci., 1(6)597-604, 1990).

따라서, 생물학적으로 비활성형인 봉입체의 문제점을 해결하기 위하여, 재조합 단백질을 생물학적 활성형 상태로 세포 외로 발현, 분비시키고자 하는 연구가 있었으나, 이 경우에도 안지오제닌과 같은 염기성 단백질은 세포막에 결합하는 성향이 있어 성공하지 못하고 있다.

이와 같이, 아직까지 생물학적 활성이 유지된 안지오제닌을 대량으로 제조하는 방법이 개발되지 못하고 있어, 안지오제닌의 생리적 작용에 대한 연구 및 약리적인 이용이 활발히 진행되지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 생물학적 활성을 가지는 안지오제닌을 대량으로 제조하는 방법의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 생물학적 활성이 유지된 상태로 인간 안지오제닌을 대량으로 제조하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 대장균의 Omp A 분비 신호서열과 인간 안지오제닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 제조하고, 전기 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균의 배양액으로부터 재조합 안지오제닌 단백질을 분리 정제하여, 전기 재조합 안지오제닌이 우수한 생물학적 활성을 가지고 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 대장균의 Omp A 분비 신호서열과 인간 안지오제닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 활성을 지닌 안지오제닌 단백질을 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 인간 안지오제닌을 대장균에서 발현시키는 재조합 발현벡터 pTA를 구축하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 2a는 재조합 인간 안지오제닌을 발현하는 재조합 대장균의 배양액 상등액을 CM-세파로즈 컬럼 크로마토그라피로 정제한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 2b는 전기 배양액 상등액을 CM-세파로즈 컬럼으로 정제하여 수득한 분획을 헤파린-세파로즈 컬럼 크로마토그라피로 정제한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 3은 안지오제닌 재조합 단백질을 정제하는 과정의 각 단계에서 얻어진 분획을 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏(Western blot)으로 분석한 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명자들은 인간 안지오제닌 유전자를 강력한 tac 프로모터 조절하에 있는 대장균의 Omp A 분비 신호서열을 포함하는 벡터에 삽입하여, 대장균의 Omp A 분비 신호서열과 인간 안지오제닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 구축하였다. 그런 다음, 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균의 배양액으로부터 재조합 단백질을 수득하고 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 안지오제닌 단백질이 세포외로 효율적으로 분비되며 생물학적 활성을 유지하고 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명자들은 123개의 아미노산으로 구성된 인간 안지오제닌을 코딩하는 유전자를 중합효소연쇄반응으로 수득하여, 강력한 tac 프로모터 조절하에 있는 대장균의 Omp A 분비 신호서열을 포함하는 공지의 벡터 pTED(KFCC-10925)에 삽입하여, 대장균의 Omp A 분비 신호서열과 인간 안지오제닌의 융합단백질을 발현하는 재조합 발현벡터 pTA를 구축하였다. 이어서, 전기 pTA 벡터로 대장균(E. coli)JM101(Invitrogen, USA)을 형질전환시켜 재조합 대장균E. coliJM101/pTA를 제조한 다음, 이를 1998년 12월 10일자로 사단법인 한국종균협회(KFCC, 대한민국 서울시 서대문구 신촌동 134 소재)에 기탁번호 KFCC-11072로 기탁하였다.

본 발명의 pTA 벡터는 tac 프로모터를 도입하여 손쉽게 단백질의 발현을 조절할 수 있으며, 프로모터 하류에 연속적인 두 개의 리보좀 결합 부위를 가지므로, 단백질의 해독 개시가 효율적으로 이루어진다. 또한, pTA 벡터는 trpA 전사 종결서열, 보편적(universal) 해독종결 서열 및 인위적으로 합성된 OmpA 분비 신호서열 등을 포함하므로, 인간 안지오제닌 단백질이 정확하게 발현되고 효율적으로 세포 외로 분비된다. 이외에도, 형질전환된 대장균의 선별마커로서 암피실린 저항성 유전자 외에도 테트라사이클린 유전자를 사용함으로써, 계대배양을 계속적으로 반복하여도 pTA에 의하여 형질전환된 대장균만 선별적으로 배양되어 목적 단백질을 고수율로 얻을 수 있다. 아울러, 테트라사이클린 유전자의 사용은 암피실린 저항성 유전자를 사용하는 경우와는 달리 β-락탐 분해효소와 같은 항생제 분해효소를 세포외로 분비시키지 않으므로, 단백질 분비시 얻고자 하는 외래 단백질과 β-락탐 분해효소의 경쟁에 의하여 야기되는 단백질 분비효율의 감소를 방지할 수 있다. 또한, 본 발명의 pTA 벡터는 형질전환된 대장균의 세포분열시 플라스미드가 두 개의 자세포에 골고루 분배될 수 있도록, 플라스미드 분배서열(par region, 참조: Primose S. B., et al., In Bioactive Microbiol Products 2: Development and Production, Nisbet L. J. & Windtanley D. J., pp63-77, Academic Press, London; Skogman G., et al., Gene, 23:105-115(1983))을 포함시켜, 배양액 중의 모든 대장균이 재조합 벡터를 가지도록 함으로써 결과적으로 단백질 발현수율의 향상을 꾀하였다. 이렇게 제조된 pTA 벡터는 전체적인 크기가 매우 작아 숙주 세포내에서 안정하고 외래 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있다.

전기 재조합 대장균E. coliJM101/pTA를 YCP 배지에서 배양하여 배양액의 상등액에서 예상된 분자량(14 kDa)의 안지오제닌 단백질이 분비되는 것을 확인하고, 이를 수득하여 CM-세파로즈 컬럼과 헤파린-세파로즈 컬럼을 통과시켜 재조합 안지오제닌을 정제하였다. 본 발명의 재조합 대장균을 배양하면 인간 안지오제닌을 배양액 1L 당 50mg의 수율로 발현할 수 있다.

이어서, 안지오제닌은 리보핵산분해효소로서 작용하여 토끼 적혈구 무세포 해독 시스템(rabbit reticulocyte cell-free translation system)의 단백질 해독능력을 강력하게 억제한다고 알려져 있는 바, 본 발명에서 제조된 안지오제닌 단백질의 생물학적 활성을 확인하기 위하여, 정제된 재조합 안지오제닌을 실험실 조건의 단백질 해독 시스템(in vitro translation system)을 이용하여 단백질 해독억제 정도를 조사한 결과, 전기 재조합 안지오제닌은 생물학적 활성의 중요한 부분인 효소로서의 활성을 유지하고 있음을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재조합 발현벡터 및 재조합 대장균의 제조

인간 안지오제닌 cDNA를 클로닝하기 위하여, 5'과 3' 말단의 공지된 염기서열(참조: Kurachi, K., et al., Biochemistry, 24:5494-5499, 1985)에서 유래한 하기와 같은 염기서열을 가지는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 D(서열번호: 1)와 P(서열번호: 2)를 이용하여, 재조합 벡터 pRSang(참조: 대한민국 특허출원 제 97-57603호)를 주형으로 DNA 중합효소연쇄반응을 수행하였다:

프라이머 D: 5'-AACCGTGGCGCAGGCCCAGGATAACTCCAGGTA-3' (서열번호: 1)

DsaI

프라이머 P: 5'-GCCTGCAGTTACGGGCGACGGAAAATTGAC-3' (서열번호: 2)

PstI

4 유닛의 PFU 중합효소, 각각 2mM의 디옥시뉴클레오티드(Stratagene, USA), 100ng의 pRSang 및 각각 100 pmole의 전기 프라이머 D와 프라이머 P를 포함하는 반응혼합물에 증류수를 가하여 반응부피를 100㎕로 조정하고 잘 혼합하였다. 그런 다음, 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 70초 및 94℃에서 30초로 이루어진 반응주기를 32회 반복하고, 최종 단계에서는 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다. 증폭된 DNA 산물을 1% 아가로오스 젤에서 전기영동하여 분리하고 정제한 다음, 제한효소인 DsaI과 PstI으로 절단하여 재분리, 정제하였다.

전기 정제된 DNA 절편을 DsaI/PstI으로 처리된 플라스미드 벡터 pTED(KFCC-10925)와 잘 혼합한 다음, T4 DNA 리가아제를 첨가하고 16℃에서 18시간 동안 반응시켜, 전기 PCR로부터 수득한 인간 안지오제닌 cDNA가 pTED 벡터의 DsaI/PstI 위치에 삽입된 재조합 발현벡터 pTA를 제조하였다(참조: 도 1). 그런 다음, 전기 pTA벡터를 제한효소 DsaI, PstI, BstEII, SmaI 및 AlwNI으로 절단하여 인간 안지오제닌 cDNA의 삽입여부를 확인하였다. 도 1에서, ANG는 인간 안지오제닌 cDNA; P_Tac은 tac 프로모터; omp A는 Omp A 분비 신호서열; Term은trp A전사종결 서열;Par는 분리서열(partition sequence);ColE1ori는 ColE1 복제원점(replication origin)을 각각 나타낸다. 이어서, 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 전기 pTA 벡터를 대장균(E. coli) JM101(Invitrogen, USA)에 형질전환시켜 재조합 대장균을 제조한 다음, 이를E. coliJM101/pTA라 명명하고, 1998년 12월 10일자로 사단법인 한국종균협회(KFCC, 대한민국 서울시 서대문구 신촌동 134 소재)에 기탁번호 KFCC-11072로 기탁하였다.

실시예 2: 재조합 대장균을 이용한 안지오제닌의 발현 및 분비

전기 실시예 1로부터 수득한 재조합 대장균E. coliJM101/pTA로부터 안지오제닌이 효율적으로 발현 분비되는가를 확인하기 위하여, 전기 JM101/pTA를 YCP 배지(1 리터 당 20g 효모 추출물, 10g 카사미노산(Casamino acid), 3g KH₂PO₄, 2g Na₂HPO₄, 2.5g (NH₄)₂HPO₄, 0.24g MgSO_4·7H₂O, 0.01 g CaCl_2·2H₂O 및 5g 글루코스를 포함)에서 30^oC에서 72 시간동안 배양하고, 원심분리하여 상등액을 회수한 다음, 회수된 상등액의 일부를 14 % SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 전기영동된 단백질을 PVDF 막(membrane)으로 옮겨 토우빈(Towbin)의 방법(참조: Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 76:4350-4354, 1979)에 따라, 1차 항체로는 염소의 항-안지오제닌 항체를, 2차 항체로는 알칼리성 탈인산화제(alkaline phosphatase)에 결합된 토끼의 항-염소 면역글로불린 항체를 각각 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 수행한 결과, 안지오제닌 단백질로 예상되는 크기(약 14 kDa)의 밴드가 관찰되어, 안지오제닌이 본 발명의 재조합 대장균에 의하여 성공적으로 발현, 분비됨을 확인하였다(참조: 도 3, 레인 1).

실시예 3: 안지오제닌의 정제와 분석

전기 재조합 대장균E. coliJM101/pTA를 실시예 2에서와 동일한 조건으로 30^oC에서 560 nm에서의 흡광도가 2에 도달할 때까지 배양한 다음, 최종농도가 1mM이 되도록 이소프로필 베타-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하고 3일을 더 배양하였다. 이 때, 안지오제닌 단백질의 수율은 50 mg/리터이었으며, 배양 시간이 길어질수록 더욱 증가함을 확인할 수 있었다. 전기 배양액을 원심분리하여 상등액을 회수하고, 5N의 염산을 첨가하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 안지오제닌 단백질의 분리, 정제를 위하여, 페트(Fett) 등이 종양에서 유래한 안지오제닌 단백질이 CM-52 양이온 교환 수지에 흡착되고 1M 염화나트륨 용액에서_용출된다고 보고한 바에 따라(참조: Fett, J.W., et al., Biochemistry, 24:5480-5486, 1985), 전기 상등액을 CM-세파로즈 수지에 흡착시키고, 0 내지 1.5M의 염화나트륨 농도구배로_용출시시켰(참조: 도 2a). 이어서, 0.5 내지 0.75M의 염화나트륨 용액에서_용출된 분획을 합쳐 적절히 희석한 후, 헤파린-세파로즈 컬럼(heparin-sepharose column, Pharmacia Biotech., Upsala, Sweden)을 통과시키고 0.15 내지 1.0M의 염화나트륨 농도구배로_용출, 정제하였으며(참조: 도 2b), 최종적으로 크기배제 HPLC(size-exclusion HPLC)를 수행하여 단일 피크의 정제된 안지오제닌을 수득하였다. 각 정제 과정에서 분리된 단백질은 SDS-PAGE 분석법과 염소의 항-안지오제닌 항체를 이용한 웨스턴 블랏(Western blot) 분석법으로 안지오제닌 단백질임을 확인하였다(참조: 도 3). 도 3에서, 왼쪽 사진은 SDS-PAGE, 오른쪽 사진은 웨스턴 블랏의 사진이고; M열은 분자량 마커(molecular weight marker); 1열은 배양 상등액; 2열은 CM-세파로즈 컬럼으로부터 수득한 분획; 3열은 헤파린-세파로즈 컬럼으로부터 수득한 분획; 및, 4열은 크기배제 HPLC로 정제된 안지오제닌 단백질을 각각 나타낸다.

실시예 4: 안지오제닌 단백질의 생물학적 활성

본 발명에서 제조된 재조합 안지오제닌의 생물학적 활성은 실험실 조건하의 단백질 해독 시스템(in vitro translation system, Boheringer Mannheim Biochemica, Germany)을 이용하여 측정하였다. 전기 단백질 해독 시스템을 이용하면, 토끼 적혈구 용출액(lysate)에 [³H]류신(leucine)을 첨가하고, 산에 침전가능한 단백질(acid-precipitable protein)에 편입된 [³H]류신의 양을 측정하여 단백질 해독억제 정도를 조사함으로써, 재조합 안지오제닌의 리보핵산분해효소 활성을 알 수 있다: 10㎕의 토끼 적혈구 용해질(lysate), 1㎕의 mRNA, 2㎕의 [³H]류신 및 2㎕의 19가지 아미노산(각 1mM)을 포함하는 반응혼합물에 하기 표 1에 주어진 농도의 전기 정제된 안지오제닌 단백질을 첨가하고, 최종 반응부피를 25㎕가 되도록 조절한다음, 15분간 30^oC에서 반응시켰다. 안지오제닌의 작용을 동일 몰라(molar) 농도의 태반 리보핵산분해효소 억제제(placental ribonuclease inhibitor, PRI)를 첨가하여 중지시키고, 산(10% 트리클로르 아세트산(trichloracetic acid))에 침전가능한 단백질에 편입된 [³H]류신의 양을 정량하여 단백질 해독억제 정도를 조사하였다. 그 결과, 하기 표 1에서 보듯이, 첨가된 안지오제닌 단백질의 양이 증가할수록 단백질에 편입된 [³H]류신의 양이 감소하며, 토끼 적혈구 용해질의 단백질 해독능에 대한 억제 율도 증가함을 확인하였다(참조: 표 1).

재조합 안지오제닌의 토끼 적혈구 단백질 해독억제 효과

안지오제닌, nM	[³H] 류이신이 편입된 정도
안지오제닌, nM	% cpm	억제율 (%)
0	100	0
40	56	44
60	14	86

이와 같은 결과는 본 발명에 의하여 제조된 재조합 안지오제닌이 생물학적 활성의 중요한 부분인 리보핵산분해효소로서의 활성을 유지하고 있음을 제시하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 인간 안지오제닌을 암호화하는 유전자를 tac 프로모터 하에서 대장균의 Omp A 분비 신호서열에 융합시킨 재조합 발현벡터, 전기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 전기 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 활성을 지닌 인간 안지오제닌 단백질을 대량 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 생물학적 활성을 유지하고 있는 안지오제닌을 간편하고 신속하게 대량 발현하여, 종래의 생산 방법에서 제기되어 왔던 낮은 수율과 저하된 생물학적 활성의 문제점을 극복함으로써, 안지오제닌의 생리학적 기능 연구에 이바지 할 수 있으며, 혈관생성유도제로 안지오제닌을 약리학적으로 이용할 수 있을 것이다.

(서열목록)

서열번호: 1

서열의 길이: 33

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: 기타 핵산(합성 DNA)

서열의 특징

기타 정보: 프라이머

서열의 기재방법:

AACCGTGGCGCAGGCCCAGGATAACTCCAGGTA

서열번호 : 2

서열의 길이: 26