KR100309856B1 - Non-toxic immunogens derived from retroviral regulatory proteins, antibodies, methods for their preparation, and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따른 비독성 면역원성 화합물은 인체에 투여될 수 있고, 알데히드와 같은 커플링제를 사용하는 화학 처리에 의해 HIV-1, HIV-2, HTLV-1 또는 HTLV-2바이러스 조절 단백질로부터 또는 알데히드를 사용하는 전처리에 의해 활성화된 운반 단백질로부터 유래됨으로써, 상기 조절 단백질에 대한 항체에 의해 인지될 수 있고, 천연 단백질의 독성 생물학적 특성의 50% 이상을 상실하면서 상기 천연 단백질을 중화시키거나 또는 차단하는 항체를 생산하기에 충분한 면역원성을 유지할 수 있다.The non-toxic immunogenic compounds according to the present invention can be administered to the human body and can be administered orally or parenterally from HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 viral regulatory proteins by chemical treatment using a coupling agent such as aldehyde, , Which can be recognized by antibodies to the regulatory protein and which neutralizes or blocks the natural protein while losing more than 50% of the toxic biological properties of the natural protein Sufficient immunogenicity to produce an antibody can be maintained.
Description
본 발명은 그의 면역원성은 유지 또는 증가되게 본질적인 생물학적 특성을 사전에 불활성화시킨, 레트로바이러스의 조절 단백질을 사용하는 새로운 레트로바이러스 면역원, 그의 제조 방법 및 그를 함유한 제약 조성물에 관한 것이다. 이러한 새로운 "불활성화된" 면역원을 사용하여, 면역원을 생산하는 천연 단백질의 생산을 도울 수 있는 조절 해제 작용을 예방 또는 조절할 수 있는, 인체에서의 자동 면역화를 유도할 수 있다.The present invention relates to a novel retroviral immunogen using a regulatory protein of a retrovirus, a method for its preparation and a pharmaceutical composition containing the same, wherein the immunogenicity is maintained or increased so that the inherent biological properties are inactivated in advance. Using these new " deactivated " immunogens, it is possible to induce autoimmunity in the human body, which can prevent or control the deregulation action that can assist in the production of natural proteins that produce immunogens.
본 발명은 또한 이러한 "불활성화된" 면역원을 사용함으로써 얻어지는 새로운 항체, 그의 제조 방법 및 그를 함유한 수동 면역화용 제약 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a novel antibody obtained by using such an " inactivated " immunogen, a process for its preparation and a pharmaceutical composition for passive immunization containing it.
Tat 분자는 바이러스 입자에서 발견되지는 않지만 HIV-1 게놈에 의해 코딩되는 HIV 조절 단백질이다. 감염된 세포 내부에서, 프로바이러스 DNA에 의해 코딩되는 이 단백질은 바이러스 또는 세포 유전자에 대해 트랜스활성화 역할을 한다. 그러나, 이 유전자 조절 단백질은 또한 천연 또는 단편화된 상태의 죽은 세포의 파쇄물내에 또는 분비 과정에 의해 분비된, 세포외 순환 매질 중에 세포 외부에서 발견될 수도 있다. 순환 매질 중의 그의 존재는 몇몇의 혈청 반응 양성 대상에서 검출가능한 항-Tat 항체의 존재를 설명한다. Tat는 이러한 세포외 환경에서는, 세포 표면의 인테그린에 의해 인식되는 RGD 잔기를 갖는 말단 C 세그먼트 및 분자의 기본 영역(잔기 45-70)을 통해 박테리아 독소처럼 여러 조직의 비감염 세포에 대해 작용할 수 있게 된다. 이렇듯, 진정한 바이러스 독소와 같이 작용하는 순환 Tat 단백질은 내피 세포에 대해 유해한 작용을 할 수 있고, 성장 인자 BFGF와 함께 AIDS 질환의 특징이 되는 카포시 육종의 신생 혈관 형성을 일으킬 수 있다. 순환 Tat 단백질은 또한 T 세포에 대한 직접적인 면역억제 작용에 의해 또는 APC(대식세포 또는 수지상 돌기 세포)로 불리우는 항원 제공 세포에 의한 인터페론-α 생성의 조절 해제를 도움으로써 AIDS와 함께 점차 확고해져가는 면역억제를 악화시킬 수도 있다.The Tat molecule is an HIV regulatory protein that is not found in viral particles but is encoded by the HIV-1 genome. Within the infected cells, this protein, which is encoded by the proviral DNA, acts as a transactivator for the virus or cellular gene. However, this gene regulatory protein may also be found extracellularly in the extracellular circulating medium secreted by a secretion process or in the disruption of dead cells in a natural or fragmented state. His presence in the circulating media accounts for the presence of detectable anti-TAT antibodies in some serum response positive subjects. Tat is capable of acting on non-infected cells of various tissues, such as a bacterial toxin, through the terminal C segment with the RGD residue recognized by the integrins of the cell surface and the basic domain of the molecule (residues 45-70) in these extracellular environments . Thus, the circulating Tat protein, which acts like a true viral toxin, can have deleterious effects on endothelial cells and can cause neovascularization of Kaposi 's sarcoma, which is characteristic of AIDS disease with growth factor BFGF. Circulating Tat protein is also an immune system that is becoming increasingly established with AIDS by helping to regulate the production of interferon-α by antigen-presenting cells, called direct immunosuppressive actions on T cells or by APCs (macrophages or dendritic cells) The inhibition may be exacerbated.
후천성 면역결핍증(AIDS)은 면역억제로 인한 기회성 질병에 의해 또는 카포시 육종에 의해 임상학적으로 정의된다. HIV 감염 경과 중에 점차 확고해지는 후천성 면역억제는 처음에는 기억 항원에 의한, 그 다음에는 동종 항원에 의한, 마지막으로 유사분열 촉진 물질(PHA)에 의한 자극 후에, T 세포의 면역학적 반응성의 손실에 의해 생물학적으로 스스로 징후가 나타난다(세포성색전 및 IL2 생성의 감소). 이런 면역억제는 인터페론-α 및 -γ의 과도한 생성과 관련이 있다.Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) is defined clinically by opportunistic disease due to immunosuppression or by Kaposi's sarcoma. Acquired immunosuppression, which is becoming increasingly established during the course of HIV infection, is caused by loss of immunological reactivity of the T cell, first by a memory antigen, then by a homologous antigen, and finally by stimulation with a mitogen (PHA) Biologically manifesting itself (reduction of cellular embolization and IL2 production). Such immunosuppression is associated with excessive production of interferon-alpha and-gamma.
면역억제를 유도하는 세포병원성 메카터즘은 복잡하며, 면역 세포, T 림프구 및 APC에 대해 직접적으로 작용하거나 또는 시토킨계를 통해 간접적으로 작용하는 바이러스 기원의 각종 인자가 관여한다. HIV-1 입자에 의해 운반되고 그의 세포외 존재가 혈청내 바이러스 충전에 의해 평가되는 엔벨로프 단백질 gp120은 표현형 CD4의 T 세포의 활성 감퇴(anergy)를 직접적으로 유도할 수 있다. 그의 편에서는, HIV 조절 단백질, 특히 순환 바이러스 독소의 세포외 형태인 Tat는 시험관내에서기억 항원에 의해 또는 항-CD3 항체에 의해 활성화된 T 세포가 Tat 분자의 존재하에도 더 이상 증식하지 않는다는 사실에 의해 T세포의 직접적인 면역억제 또는 다른 병원성 효과를 유도하는 것으로 생각된다. 또한, 순환 Tat 단백질은, AIDS 질환에서 관찰되는 면역억제 및 세포소멸을 증폭시킬 수 있는, APC에 의한 인터페론-α, 세포증식억제성 및 세포소멸성 시토킨의 과도 생성을 촉진시키는 것으로 생각된다. 사실상, 대식세포에 의한 인터페론-α의 분비가, Tat의 존재시에 그 정상상태에서는 인터페론-α의 생성을 조절하는(불응기) 역조절(피드백)에 의해 더 이상 중단되지 않는 것으로 생각된다.The cytopathic mechatism leading to immunosuppression is complex and involves a variety of factors of viral origin that act directly on immune cells, T lymphocytes and APCs or indirectly through the cytokines. The envelope protein gpl20, which is carried by HIV-1 particles and whose extracellular presence is assessed by viral filling in serum, can directly induce the anergy of T cells of phenotype CD4. On the other hand, Tat, an extracellular form of the HIV regulatory protein, in particular the circulating viral toxin, shows that T cells activated in vitro by a memory antigen or by an anti-CD3 antibody no longer proliferate in the presence of Tat molecules Lt; RTI ID = 0.0 > T-cell < / RTI > In addition, circulating Tat protein is thought to promote the transient production of interferon-alpha, cytostatic and cytotoxic cytokines by APC, which can amplify immunosuppression and apoptosis observed in AIDS disease. In fact, it is believed that the secretion of interferon-a by macrophages is no longer interrupted by the (inadaptive) regulatory feedback (feedback) that regulates the production of interferon-a in its steady state in the presence of Tat.
카포시 육종은 내피 세포로부터 출발하여 신생 혈관 형성을 나타내는 혈관 소결절 형성이 임상학적인 징후로 나타난다. 시토킨(인터페론-γ , IL1 및 IL6)의 생성을 초래하는 염증 과정에 의해 활성화된 이들 세포는 BFGF(기본 섬유아세포 성장 인자)를 형성하며 증가한다. 시험관내에서의 활성화된 내피 세포의 증식은 Tat 단백질 매질의 존재하에 증가된다. 항-Tat 항체는 시험관내에서 Tat 단백질의 증식 효과를 차단한다. 세포 표면 상의 인테그린 패밀리로부터의 부착인자(adhesin)을 갖는 내피 세포에 대한 Tat의 작용은 이들 세포 분자에 의해 인식되는 RGD 서열의 존재에 의해 설명된다.Kaposi sarcoma is a clinical manifestation of vascular nodule formation, which starts from endothelial cells and represents neovascularization. These cells, activated by inflammatory processes that lead to the production of cytokines (interferon-γ, IL1 and IL6), increase with the formation of BFGF (primary fibroblast growth factor). Proliferation of activated endothelial cells in vitro is increased in the presence of the Tat protein medium. The anti-Tat antibody blocks the proliferative effect of Tat protein in vitro. The action of Tat on endothelial cells with adhesin from the Integrin family on the cell surface is explained by the presence of the RGD sequence recognized by these cell molecules.
생체내에서의 카포시 육종의 기초가 되는 신생 혈관 형성은 RGD 서열을 함유하는 그의 C 말단 단편으로 인해 내피 세포의 인테그린에 의해 인식될 수 있는 그의 세포외 형태의 Tat 조절 단백질에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있다. 또한, Tat는 잔기 K 및 R이 풍부한 그의 기본 영역에 의해 작용할 수 있고, 그 결과로서세포외 매트릭스의 헤파린 설페이트에 결합할 수 있어 성장 인자 BFGF를 농축시킨다. 성장 인자에 의해 유도된 내피 세포의 증식은 Tat의 존재에 의해 증가되며 신생 혈관 형성을 유발한다. 내피 세포의 성장에 대한 이러한 효과는 시험관내에서 항-Tat 항체의 작용에 의해 감소된다.Neovascularization that is the basis of Kaposi sarcoma in vivo is known to be facilitated by its extracellular form of Tat regulatory protein, which can be recognized by the integrins of endothelial cells due to its C-terminal fragment containing the RGD sequence . In addition, Tat can act by its basal region rich in residues K and R, and as a result it can bind heparin sulfate in the extracellular matrix to concentrate the growth factor BFGF. Growth factor - induced endothelial cell proliferation is increased by the presence of Tat and induces angiogenesis. This effect on the growth of endothelial cells is reduced by the action of anti-Tat antibodies in vitro.
따라서, 레트로바이러스 조절 단백질, 특히 진정한 바이러스 독소인, 세포외 매질(혈액, 림프액, 간질성 매질...)에서 순환하는 Tat의 유해 활성을 차단하는 것이 바람직하다.It is therefore desirable to block the detoxifying activity of the circulating Tat in the extracellular medium (blood, lymph, interstitial media, etc.), a retroviral regulatory protein, in particular a true viral toxin.
HIV 바이러스에 관해서 말하면, 백신 접종에 관한 현재 까지의 시도는 이러한 바이러스의 구조 단백질 또는 구조 단백질의 단편을 이용하여 이루어졌지만, 이러한 바이러스의 조절 단백질 또는 조절 단백질의 단편을 이용하여 이루어진 적은 없었다.As far as the HIV virus is concerned, attempts to date on vaccination have been made using structural proteins or fragments of structural proteins of these viruses, but none have been made using the control proteins or fragments of regulatory proteins of these viruses.
따라서, 놀랍게도 독성 활성이 특정 항체에 의해 중화되는 박테리아 독소(파상풍성, 디프테리아성 또는 보툴리누스 독소)와 같이, 조절 바이러스 단백질, 특히 그의 세포외 형태로 HIV의 진정한 독소인 Tat의 유해 효과 (상기 유해 효과는 T 세포의 면역억제에 의해, APC에 의한 인터페론-α 생성의 조절 해제에 의해, 또는 카포시 육종의 기초가 되는 신생 혈관 생성에 의해 발휘된다)는 하기 실험부에서 알수 있는 바와 같이 특정 항-Tat 항체의 존재하에 제거된다.Thus, surprisingly, the harmful effects of controlled viral proteins, particularly Tat, which is the true toxin of HIV, in its extracellular form, such as the bacterial toxins (tetanus, diphtheria or botulinum toxin) whose toxic activity is neutralized by a particular antibody Is exerted by immunosuppression of T cells, by deregulation of interferon-alpha production by APC, or by neovascularization that is the basis of Kaposi ' s sarcoma) Is removed in the presence of the antibody.
동일하게 HIV-1, HIV-2, HTLV-1 또는 HTLV-2와 같은 바이러스의 다른 조절 단백질에도 적용된다. 따라서, 인체에 투여되어 항체를 생산할 수 있는 이용가능한 면역원을 얻는 것, 그리고 치료용 및 예방용 항체를 얻는 것이 바람직하다. 사실상, 면역원으로서 사용된 선행 기술의 화합물, 특히 기본 영역을 함유하는 것은 인체에 독성일 수 있다(WO-A-9118454호 참조). 이들은 본 발명과는 대조적으로 이러한 단백질 또는 단백질 단편의 불활성화의 기초가 되는, Tat, Nef 또는 Rev의 비변형된 천연 단편이다.It is equally applicable to other regulatory proteins of viruses such as HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2. Thus, it is desirable to obtain an available immunogen that can be administered to the human body to produce an antibody, and to obtain therapeutic and prophylactic antibodies. In fact, prior art compounds used as immunogens, especially those containing the basal region, may be toxic to humans (see WO-A-9118454). These are unmodified natural fragments of Tat, Nef or Rev that are the basis for the inactivation of such proteins or protein fragments as opposed to the present invention.
따라서, 본 발명은 알데히드와 같은 커플링제를 사용하는 화학 처리에 의해 HIV-1, HIV-2, HTLV-1 또는 HTLV-2 바이러스 조절 단백질로부터 또는 알데히드, 바람직하게는 포름알데히드 또는 글루타르알데히드를 사용하는 전처리에 의해 활성화된 담체 단백질로부터 유래됨으로써, 상기 조절 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있게 되며, 천연 단백질의 독성 생물학적 특성의 50% 이상, 바람직하게는 80%이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상을 상실하는 한편 상기 천연 단백질을 중화시키거나 또는 차단하는 항체를 생산하기에 충분한 면역원성을 유지할 수 있도록 하는 것이 특징인, 인체에 투여될 수 있는 비독성 면역원성 화합물에 관한 것이다.Accordingly, the present invention provides a method of using an HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 viral regulatory protein or an aldehyde, preferably formaldehyde or glutaraldehyde, by chemical treatment using a coupling agent such as aldehyde , More preferably at least 80%, more preferably at least 95%, of the toxic biological properties of the native protein, which is derived from the carrier protein activated by the pretreatment of the natural protein, Toxic immunogenic compound which is capable of being administered to the human body, characterized in that it is capable of maintaining sufficient immunogenicity to produce an antibody that neutralizes or blocks said natural protein whilst losing more than that of said natural protein.
이 화합물은 파상풍 톡소이드와 같은 박테리아 톡소이드와 유사하게 이하에 "톡소이드"로 간주될 것이다.This compound will be hereinafter referred to as " toxoid ", similar to bacterial toxoids such as tetanus toxoid.
사실상, 이 화합물들은 통상의 박테리아 톡소이드와 마찬가지로 특유의 독성은 없지만, 그럼에도 불구하고 대상에게 투여됨으로써 면역화를 일으킬 수 있다.In fact, these compounds, as well as conventional bacterial toxoids, have no specific toxicity, but can nevertheless cause immunization by administration to the subject.
이하의 화학 처리는 본 발명에 따른 면역원성 화합물의 잔류 독성을 감소시킬 목적으로, 예를 들면 조사, 및 특히 UV 조사와 같은 물리적 처리에 의해 보충될 수 있다.The following chemical treatments may be supplemented by physical treatments, for example irradiation, and in particular UV irradiation, for the purpose of reducing the residual toxicity of the immunogenic compounds according to the invention.
상기 톡소이드는 예를 들면 Tat와 같은 조절 단백질의 펩티드 서열과 동일하거나 또는 유사한 서열을 갖는 펩티드로부터 제조될 수 있고, 또한 예를 들면 수지상에서의 통상의 펩티드 합성에 의해 또는 유전자 공학에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 모든 과정은 선행 기술에 잘 공지되어 있다.The toxoid may be prepared from a peptide having the same or similar sequence as the peptide sequence of a regulatory protein such as, for example, Tat, and may be obtained, for example, by conventional peptide synthesis in a resinous form or by genetic engineering have. All of these processes are well known in the prior art.
본 발명에 따른 변형된 조절 단백질 또는 그의 변형된 단편이 상기 천연 조절 단백질에 대한 항체에 의해 쉽게 인식되는 지를 확인하기 위해, 하기 실험부에서 알 수 있는 바와 같이, 예를 들면 특정 항체의 존재하에 ELISA에 의해 항원-항체 복합체의 형성을 면역학적으로 확인할 수 있다.In order to confirm that the modified regulatory protein or modified fragment thereof according to the present invention is easily recognized by an antibody to the natural regulatory protein, as can be seen in the following experimental part, for example, an ELISA , The formation of an antigen-antibody complex can be immunologically confirmed.
조절 단백질의 면역원성이 상기 천연 단백질을 중화시키는 항체를 형성하기에 충분하게 유지되었는지를 결정하기 위해, 하기 실험부에서 알 수 있는 바와 같이 예를 들면 포유 동물(토끼, 쥐, 마우스)을 본 발명에 따른 면역원성 화합물을 이용하여 면역화시킬 수 있고 생성된 항체가 조절 단백질의 독성 활성을 중화시키는지를 확인할 수 있다.In order to determine whether the immunogenicity of the regulatory protein is maintained sufficient to form antibodies neutralizing the natural protein, for example, mammals (rabbits, rats, mice) may be used in the present invention Can be immunized with an immunogenic compound according to < RTI ID = 0.0 > SEQ ID < / RTI > to confirm whether the resulting antibody neutralizes the toxic activity of the regulatory protein.
변형된 조절 단백질이 그의 독성 생물학적 특성을 50% 이상 상실하는지를 결정하기 위해, 하기 실험부에서 알 수 있는 바와 같이, 예를 들면 T 세포의 면역억제에 대한 또는 말초 혈액의 활성화된 단핵 세포에 의한 인터페론-α 생성에 대한, 또는 조절 단백질에 의해 유도된 신생 혈관 생성에 대한 불활성화 Tat와 같은 조절 단백질의 영향을 연구할 수 있다.In order to determine if the modified regulatory protein has lost more than 50% of its toxic biological properties, it has been shown, for example, that immunosuppression of T cells or of interferon by activated mononuclear cells of peripheral blood, The effect of regulatory proteins such as inactivated Tat on angiogenesis, or on neovascularization induced by regulatory proteins can be studied.
Tat 조절 단백질의 불활성화는 예를 들면 복제가 천연 Tat의 외생 공급에 좌우되는 세포주 HLM-1에서 배양된 Tat-결여 비감염성 HIV 돌연변이체를 이용하는 "Tat 보호 분석"에 의해 확인될 수 있다.Inactivation of Tat-regulated proteins can be confirmed, for example, by "Tat protection assay" using Tat-deficient noninfectious HIV mutants cultured in cell line HLM-1, where replication is dependent on the exogenous supply of natural Tat.
면역원성 화합물은 HIV-1, HIV-2, HTLV-1 또는 HTLV-2 바이러스 조절 단백질 중 어느 것, 특히 HIV-1 및 HIV-2 바이러스의 Vif, Rev, Nef 및 Tat로부터 유래될 수 있고, 바람직하게는 Rev, Nef 및 Tat, 더욱 바람직하게는 Rev 및 Tat, 가장 바람직하게는 Tat가 사용된다.The immunogenic compounds may be derived from any of the HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 viral regulatory proteins, particularly Vif, Rev, Nef and Tat of the HIV-1 and HIV-2 virus, , Rev, Nef and Tat, more preferably Rev and Tat, and most preferably Tat.
HTLV-1 또는 HTLV-2의 Tax 단백질도 또한 사용될 수 있다.Tax proteins of HTLV-1 or HTLV-2 may also be used.
Tat 및 Rev의 기본 영역의 외부 영역, 즉 Tat의 외부 영역 49 내지 57 및 Rev의 35 내지 50, 또는 4개 이하의 아미노산, 바람직하게는 2개 이하의 아미노산에 의해 이들 영역과의 중첩 영역, 특히 펩티드 HQVSLSKQPTSQPRGD가 사용될 수도 있다.Tat and Rev in the outer region of the basic region, i.e., the outer region 49-57 of Tat, and 35-50, or no more than 4 amino acids, preferably 2 or fewer amino acids of Rev, The peptide HQVSLSKQPTSQPRGD may be used.
HIV-1, HIV-2, HTLV-1, 또는 HTLV-2 바이러스 조절 단백질"로부터 유래된" 또는 "유래하는"이란 면역원성 화합물이 조절 단백질 모두 또는 소정의 단편으로 이루어질 수 있고, 이 단백질 또는 단편의 아미노산의 1가지 이상의 변형, 예를 들면 결실, 치환, 추가 또는 아미노산의 아실화와 같은 관능화를, 이들 변형이 상기 특정된 상태(독성 부재, 면역학적 특성)로 유지되는 정도로 포함할 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 일반적으로 이소로이신 잔기에 의한 로이신 잔기의 대체는 상기 특성을 변형시키지 않으며, 일반적으로 8개 이상의 아미노산, 특히 12개 이상의 아미노산의 조절 단백질의 상동 세그먼트에 대해 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 특히 바람직하게는 10% 미만의 아미노산에 대해 일어나는 것이여야 한다. 단편은 8 내지 60개의 아미노산, 바람직하게는 12 내지 40개의 아미노산, 특히 바람직하게는 25 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. HIV-1의 Tat의C 말단내의 잔기 65-80이 그 예가 될 수 있다.Quot; or " derived from " HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 viral regulatory proteins may consist of all or a part of the regulatory protein, , Such as deletion, substitution, addition or acylation of an amino acid, to the extent that these modifications are maintained in the specified state (toxicity, immunological properties) As used herein. For example, substitution of a leucine residue by an isoleucine residue in general does not alter this property, and is generally less than 30%, preferably less than 30%, for a homologous segment of a regulatory protein of 8 or more amino acids, , Preferably less than 20%, particularly preferably less than 10%. The fragment may comprise 8 to 60 amino acids, preferably 12 to 40 amino acids, particularly preferably 25 to 40 amino acids. An example is the residue 65-80 within the C-terminus of Tat of HIV-1.
선택적인 조건하에서, 본 발명의 면역원성 화합물은 총 조절 단백질을 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상 함유하며, 가장 바람직하게는 모두 또는 거의 모두 상기 단백질로 이루어진다.Under selective conditions, the immunogenic compounds of the present invention contain at least 50%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 90% of the total regulatory protein, and most preferably all or nearly all of the proteins.
일반적으로, 변형된 면역원 및 천연 단백질 또는 천연 단백질의 일부 간의 변형, 상동성 또는 유사성, 및 본 발명에 따른 면역원성 화합물의 범위 및 면역원성 화합물의 파상풍 톡소이드와 같은 면역원성 단백질로의 사용 또는 커플링 방법에 관해서는, 본 명세서에 참고로 인용한 국제 공개 특허 제86/06 414호 또는 유럽 특허 공개 제0 220 273호 또는 PCT/US86/00831호를 참고로 하면 된다.In general, the modification, homology or similarity between a modified immunogen and a portion of a native protein or a native protein, and the range of immunogenic compounds according to the invention and the use or coupling of the immunogenic compound with an immunogenic protein such as a tetanus toxoid As regards the method, reference may be made to WO 86/06 414 or EP 0 220 273 or PCT / US86 / 00831, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
본 발명에 따른 면역원성 화합물은 다음과 같이 사용될 수 있다.The immunogenic compounds according to the invention can be used as follows.
본 발명에 따른 면역원성 화합물을 치료를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량으로 피하 또는 근육내로 투여한다. 투여량은 변화될 수 있는데, 예를 들면 3개월 동안 1개월에 한번씩, 이어서 유도된 혈청 항체의 농도에 따라 주기적으로, 예를 들면 2 내지 6개월 마다 피하로 100 내지 1,000 μg을 투여할 수 있다.The immunogenic compound according to the invention is administered subcutaneously or intramuscularly in a therapeutically effective amount to a patient in need of such treatment. The dosage can vary, for example, from 100 to 1,000 μg subcutaneously every three months for one month, and periodically, for example every 2 to 6 months, depending on the concentration of the induced serum antibody .
본 발명에 따른 조성물은 백신 접종 분야에 통상적인 경로, 특히 피하, 근육내, 정맥내 또는 경구로 투여될 수 있다. 투여는 단일 투여법으로 또는 일정 시간 간격 후에 1회 또는 수회의 반복법으로 행할 수 있다.The compositions according to the present invention may be administered by conventional routes, particularly subcutaneous, intramuscular, intravenous or oral, in the field of vaccination. The administration can be carried out by a single administration method or once or repeatedly after a certain time interval.
본 발명은 또한 상기 면역원성 화합물을 활성 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 치료 또는 예방용 제약 조성물에 관한 것이다. 면역원성 화합물은 그 자체로 제형화되거나 또는 제약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면 보조제와 함께 혼합될 수 있다.The present invention also relates to a pharmaceutical composition for the treatment or prevention, characterized by containing said immunogenic compound as an active ingredient. The immunogenic compound may be formulated per se or may be mixed with pharmaceutically acceptable excipients such as adjuvants.
본 발명은 또한 인간 또는 동물의 치료 방법에 사용하기 위한, 상기 정의한 면역원성 화합물, 즉 상기 면역원성 화합물을 함유하는 의약, 및 상기 조절 단백질, 특히 Tat의 유해 효과를 치료 또는 예방하기 위한 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 상기 면역원성 화합물의 용도에 관한 것이다. 사실상, 본 발명에 따른 화합물은 하기 실험부에서 알 수 있는 바와 같이, 그들의 독성 특성을 상실하였으며, 따라서 인간에게 투여될 수 있다.The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising an immunogenic compound as defined above, i.e. a medicament containing said immunogenic compound, and a therapeutic or prophylactic agent for the treatment or prevention of the harmful effects of said regulatory protein, in particular Tat, To the use of such immunogenic compounds in the manufacture of medicaments. In fact, the compounds according to the invention have lost their toxic properties and can therefore be administered to humans, as can be seen in the experimental part below.
본 발명에 따른 면역원성 화합물의 투여는 자동 면역요법에 해당한다. 또한, 수동 면역요법을 수행하는 것, 즉 HIV-1, HIV-2, HTLV-1 또는 HTLV-2 바이러스 조절 단백질의 유해 효과를 중화시키는 것을 필요로 하는 환자에게 항체를 직접 제공하는 것이 유리할 수도 있다.Administration of the immunogenic compounds according to the invention corresponds to an autoimmune therapy. It may also be advantageous to provide antibodies directly to patients in need of performing passive immunotherapy, i.e. neutralizing the deleterious effects of HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 viral regulatory proteins .
이러한 항-조절 단백질 항체는 통상적으로, 예를 들면 상기 정의한 면역원성 화합물을 이용하여 포유 동물, 인간 또는 동물을 면역화시킨 후에, 엡스타인-바르(Epstein Barr) 바이러스에 의해 형질전환된 인간 B 림프구를 클로닝시키고, 그후에 상기 형질전환된 B 림프구에 의해 분비된 필요한 항체를 수집하여, 또는 파아지의 라이브러리로부터 유전자 재조합에 의해 얻어질 수 있다.Such an anti-regulatory protein antibody will typically be obtained by, for example, immunizing a mammal, human or animal using the immunogenic compound as defined above, and then cloning a human B lymphocyte transformed by Epstein Barr virus And then collecting the necessary antibodies secreted by the transfected B lymphocytes, or obtained by recombinant DNA from a phage library.
본 발명은 또한 항-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 또는 -HTLV-2 바이러스 조절 단백질 항체, 특히 항-Tat 톡소이드 항체의 제조 방법, 특히 포유 동물을 상기 정의한 면역원성 화합물을 이용하여 면역화시키는 것을 특징으로 하는, 상기 항체의 제조 방법에 관한 것이다.The invention also relates to methods for the preparation of anti-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 or -HTLV-2 viral regulatory protein antibodies, in particular anti-Tat toxoid antibodies, And then immunizing the antibody.
본 발명은 또한 항-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 또는 -HTLV-2 바이러스 조절 단백질 항체, 특히 상기 방법을 수행함으로써 면역화된 인간 또는 포유 동물 대상으로부터 얻어진 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 관한 것이다.The present invention also relates to the use of an anti-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 or -HTLV-2 viral regulatory protein antibody, particularly a polyclonal or monoclonal antibody obtained from a human or mammalian subject immunized by performing the method It is about antibodies.
이러한 특정 항체는 다음과 같이 형성될 수 있다.This specific antibody can be formed as follows.
1. 생물학적으로 불활성화되었지만 면역원성인 조절 단백질, 특히 Tat에 의한 능동 면역화(백신 접종)에 의해 유도된 항체는 대상 그 자체로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, Tat인 경우의 면역원성 화합물은 박테리아 톡소이드에서 유추하여 Tat-톡소이드로 불리운다.1. Controlled proteins that are biologically inactivated but immunogenic, in particular antibodies induced by active immunization (vaccination) with Tat can be formed from the subject itself. For example, an immunogenic compound in the case of Tat is analogous to a bacterial toxoid and is referred to as Tat-toxoid.
2. 수동 면역화(혈청 요법)에 의해 대상에게 투여시킨 항체는 다른 동종- 또는 이종 생물체로부터 형성될 수 있다. 동종 항체(인간)는 본 발명에 따른 면역원성 단백질 또는 그의 유도체, 특히 Tat(본 발명에 따른 Tat-톡소이드 또는 Tat의 펩티드 단편)로 능동 면역화(백신 접종)시킨 후에 비감염된 대상에서 형성될 수 있다. 상기와 같이 수동적으로 투여된 항체는 동종(인간) 또는 이종(동물)이든 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 그 항체의 단편 F(ab')2 또는 Fab일 수 있다.2. Antibodies administered to a subject by passive immunization (serotherapy) may be formed from other homologous or heterologous organisms. The homologous antibody (human) can be formed in an uninfected subject after active immunization (vaccination) with an immunogenic protein according to the present invention or a derivative thereof, especially Tat (a Tat-toxoid according to the invention or a peptide fragment of Tat) . The manually administered antibody as described above may be monoclonal or polyclonal antibody or fragment F (ab ') 2 or Fab of the same (human) or heterologous (animal).
"항-조절 단백질 항체"란 이들 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 그 항체의 단편 F(ab')2 또는 Fab, 또는 파아지의 라이브러리로부터 유전자 작제에 의해 얻어진 항-조절 단백질 항체를 의미하는 것으로 이해된다.By "anti-regulatory protein antibody" is meant an anti-regulatory protein antibody obtained by genetic construction from a library of these monoclonal or polyclonal antibodies or fragment F (ab ') 2 or Fab, or phage thereof I understand.
인간 기원의 동종 항체는 다음과 같은 것이 있다.Homogeneous antibodies of human origin include the following.
- 본 발명에 따른 면역원성 화합물, 특히 Tat-톡소이드 또는 Tat의 펩티드 단편으로 면역화시킨 혈청반응 음성 대상에서 얻어질 수 있는 폴리클로날 항체, 또는A polyclonal antibody obtainable in a serum-reacting negative subject immunized with an immunogenic compound according to the invention, in particular a Tat-toxide or a peptide fragment of Tat, or
- 이들 면역화된 개체의 EBV 바이러스에 의해 형질전환된 B 세포의 특정 클론(EBV-특정 B 세포주)으로부터 얻은 모노클로날 항체.- monoclonal antibodies obtained from specific clones of EBV-infected B cells (EBV-specific B cell lines) of these immunized individuals.
이종 항체는 본 발명에 따른 면역원성 화합물, 특히 Tat 또는 그의 유도체(본 발명에 따른 Tat-톡소이드, Tat의 무독화된 펩티드 단편)로 과면역화된 동물로부터 형성되며, 다음과 같은 것이 있다.The heterologous antibody is formed from an animal immunized with an immunogenic compound according to the present invention, in particular Tat or a derivative thereof (Tat-toxoid according to the invention, a detoxified peptide fragment of Tat), which is as follows.
- 과면역화된 동물로부터 형성된 폴리클로날 항체, 또는A polyclonal antibody formed from an overexpressed animal, or
- 골수종 주, 타입 x63, 특히 x63AG3과 비장 세포 및 선세포의 콜러 및 밀스타인(Kohler and Milstein) 기술에 따른 혼성화 후에 얻어진 모노클로날 항체. 이 경우에, 말 또는 토끼 항체가 바람직하다.- monoclonal antibodies obtained after hybridization according to the Kohler and Milstein technique of myeloma, type x63, particularly x63AG3, and spleen cells and lineage cells. In this case, a horse or rabbit antibody is preferred.
본 발명은 또한 포유 동물, 인간 또는 동물을 상기 정의한 면역원성 화합물을 이용하여 면역화시키는 것을 특징으로 하는, 항-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 또는 -HTLV-2 바이러스 조절 단백질 항체의 제조 방법에 관한 것이다.The invention also relates to the use of an anti-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 or -HTLV-2 viral regulatory protein antibody, characterized in that a mammal, human or animal is immunized with an immunogenic compound as defined above And a method for producing the same.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 면역원성 화합물에 의해 면역화된 개체로부터 유래되며, EBV 바이러스에 의해 형질전환되고 특정 항-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 또는 -HTLV-2 바이러스 조절 단백질 항체를 생성하는 B 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 또는 -HTLV-2 바이러스 조절 단백질 항체의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for the treatment and / or prophylaxis of certain anti-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 or -HTLV-2 viruses, which are derived from an individual immunized with an immunogenic compound according to the invention, -HIV-2, -HTLV-1 or -HTLV-2 virus control protein antibodies, characterized in that B cells that produce a protein antibody are used in the preparation of a monoclonal anti-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 or -HTLV-2 virus control protein antibody.
상기 EBV+ 세포를 배양하여 필요한 항체를 생산할 수 있다. 이들 세포는 상기한 바와 같이, 특히 천연 조절 단백질, 또는 본 발명에 따른 면역원성 화합물로면역화된 환자로부터 유래된다.The EBV + cells may be cultured to produce the required antibodies. These cells are derived, as mentioned above, especially from patients who are immunized with a natural regulatory protein, or an immunogenic compound according to the invention.
본 발명은 또한 하이브리도마를 포유 동물, 특히 마우스로부터, 특히 천연 조절 단백질 또는 본 발명에 따른 면역원성 화합물로 면역화시킨 마우스의 비세포 또는 선세포, 및 골수종 세포주, 바람직하게는 x63으로부터 당업계에 공지된 방법(Kohler and Milstein)에 의해 제조하는 것을 특징으로 하는, 불활성화된 또는 비-불활성화된 HIV-1, HIV-2, HTLV-1 또는 HTLV-2 바이러스 조절 단백질에 대한 본 발명에 따른 모노클로날 항체의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method of treating a hybridoma in a mammal, particularly a mouse, particularly a non-cell or lineage cell of a mouse immunized with a natural control protein or an immunogenic compound according to the invention, and a myeloma cell line, 1 < / RTI > or HTLV-2 viral regulatory proteins of the invention, characterized in that the monoclonal antibody is produced by the method of the invention (Kohler and Milstein) And a method for producing the same.
본 발명은 또한 상기 정의한 면역원성 화합물을 면역원으로서 사용하는 것을 특징으로 하는, 유전자 재조합 기술에 의한 항-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 또는 -HTLV-2 바이러스 조절 단백질 항체의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to the preparation of anti-HIV-1, -HIV-2, -HTLV-1 or -HTLV-2 viral regulatory protein antibodies by recombinant techniques, characterized in that the above defined immunogenic compounds are used as immunogens ≪ / RTI >
본 발명은 또한 예를 들면, 효소적 분해에 의해 얻을 수 있는, 상기 항체의 단편 F(ab')2 또는 Fab에 관한 것이다.The invention also relates to fragments F (ab ') 2 or Fab of said antibody, which can be obtained, for example, by enzymatic degradation.
본 발명은 또한 세포외 형태인 특정 항-HIV 바이러스 증식-조절 단백질의 유해 효과를 중화 또는 차단시키며, 상기한 바와 같이 제조되는 특정 항-HIV 바이러스 증식-조절 단백질 항체, 특히 항-Taf 항체, 또는 이 항체의 단편 F(ab')2 또는 F(ab)를 사용하여 HIV 바이러스로 감염된 대상을 수동 면역화하는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to the use of certain anti-HIV virus proliferation-regulating protein antibodies, in particular anti-Taf antibodies, which neutralize or block the deleterious effects of certain anti-HIV virus proliferation- To a method of passively immunizing a subject infected with HIV virus using the fragment F (ab ') 2 or F (ab) of this antibody.
본 발명은 또한 HIV 바이러스의 구성 (또는 구조) 단백질, 특히 엔벨로프 당단백질 gp 120 또는 gp 160 또는 그의 변형 또는 비변형된 펩티드 단편과, 또는 불활성화된 HIV 바이러스와, 또는 예를 들면 알칼리 가수분해에 의해 그의 게놈 RNA가 소모된 HIV 바이러스와 배합된 상기 정의한 면역원성 화합물을 사용하는 항-HIV 또는 -AIDS 능동 면역화 방법에 관한 것이다.The invention also relates to a composition (or structure) protein of HIV virus, in particular an envelope glycoprotein gp 120 or gp 160, or a modified or unmodified peptide fragment thereof, or an inactivated HIV virus, HIV or -AIDS active immunization using an immunogenic compound as defined above in combination with an HIV virus whose genomic RNA has been consumed.
본 발명은 또한 불활성화된 시토킨, 특히 인터페론-α, TGF-β 또는 TNF를 기초로 한 1가지 이상의 면역원과 배합된 상기 정의한 면역원성 화합물을 사용하는 항-HIV 또는 -AIDS 능동 면역화 방법에 관한 것이다. 사실상, 하기 실험부에서 알수 있는 바와 같이, 조절 단백질에 대한 본 발명에 따른 항체, 및 항-인터페론-α 항체 효과의 배합은 HIV에 의해 유도된 면역억제를 완전히 회복시킨다.The present invention also relates to an anti-HIV or -AIDS active immunization method using an immunogenic compound as defined above in combination with an inactivated cytokine, especially one or more immunogens based on interferon-alpha, TGF-beta or TNF will be. In fact, as can be seen in the experimental section below, the combination of the antibody according to the invention and the anti-interferon-alpha antibody effect on the regulatory protein completely restores HIV-induced immunosuppression.
본 발명은 또한 2가지의 면역원성 화합물, 즉 상기 정의한 면역원성 화합물 및 시토킨, 예를 들면 인터페론-α 또는 TNF-β에 대한 항체를 유도할 수 있는 면역원성 화합물(예를 들면, WO-A-9118454호에 기재되어 있음)로 이루어진 조성물, 및 시토킨, 특히 인터페론-α에 대한 항체, 및 조절 단백질에 대한 상기 항체로 이루어진 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to two immunogenic compounds, namely immunogenic compounds as defined above and immunogenic compounds capable of inducing antibodies to cytokines, such as interferon-alpha or TNF-beta (for example WO-A -9118454), and compositions comprising said antibodies to cytokines, especially antibodies to interferon-alpha, and regulatory proteins.
본 발명은 또한 무기, 유성 또는 합성 면역성 보조제와 배합된 상기 정의한 면역원성 화합물, 또는 그의 면역원성을 증가시키는 단백질과 커플링되거나 또는 배합된 상기 정의한 면역원성 화합물을 면역원으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 능동 면역화 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to the use of an immunogenic compound as defined above coupled or combined with an immunogenic compound as defined above combined with an inorganic, oily or synthetic immunosuppressive adjuvant, or an immunogenic compound thereof, Lt; / RTI >
이러한 면역화는 치료 및 예방을 모두 실현할 수 있다.Such immunization can achieve both treatment and prevention.
Tat 단백질의 유도체는 바람직하게는 상기 및 하기 방법 모두에 있어서 면역원으로서 사용된다.Derivatives of the Tat protein are preferably used as immunogens in both of the above and below methods.
본 발명은 또한 상기 정의한 면역원을, 정제된 특정 항체 또는 그의 단편F(ab')2 또는 F(ab)의 투여에 의한 수동 혈청요법에 사용될 수 있는 과면역성 인간 혈청 생산에 사용하는 것을 특징으로 하는, HIV-1, HIV-2, HTLV-1 또는 HTLV-2 혈청반응 음성 또는 혈청반응 양성 대상의 과면역화 방법에 관한 것이다.The invention also relates to the use of an immunogen as defined above for the production of an immunogenic human serum which can be used for manual serum therapy by administration of a specific antibody purified or a fragment thereof F (ab ') 2 or F (ab) , HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 serum-negative or serum-reactive positive subjects.
본 발명은 또한 상기 정의한 또는 상기 방법에 의해 얻어진 1종 이상의 항-바이러스 조절 단백질 항체를 치료 또는 예방용 활성 성분으로서 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient for the treatment or prophylaxis, one or more anti-viral regulatory protein antibodies as defined above or obtained by said method.
마지막으로, 본 발명은 HIV-1, HIV-2, HTLV-1 또는 HTLV-2 바이러스 조절 단백질의 유해 효과 치료용 의약의 제조를 위한 면역원성 화합물 또는 또는 상기 항체에 관한 것이다.Finally, the present invention relates to an immunogenic compound or an antibody for the manufacture of a medicament for the treatment of the deleterious effects of HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 virus control proteins.
요약해서 말하면, 본 발명은 혈청반응 양성 대상 또는 ARC/AIDS 환자에 대한 HIV-1, HIV-2, HTLV-1 또는 HTLV-2 바이러스 조절 단백질, 특히 순환 Tat의 유해 작용을 차단하는 특정 항체의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다. 이러한 특정 항체는, 1. 생물학적으로 불활성화되었지만 면역원성인 Tat(박테리아 톡소이드에서 유추하여 Tat-톡소이드로 불리움)에 의한 능동 면역화(백신 접종)에 의해 유도되어 대상 그 자체로부터, 또는 2. 수동 면역화(혈청 요법)에 의해 대상에게 투여되어 다른 동종- 또는 이종 생물체로부터 형성될 수 있다. 동종 항체(인간)는 조절 단백질, 예를 들면 Tat 또는 그의 유도체(본 발명에 따른 Tat-톡소이드 또는 Tat의 펩티드 단편)로 능동 면역화(백신 접종)시킨 후에 비감염된 대상에서 형성될 수 있다. 이러한 수동으로 투여된 항체는 동종(인간) 또는 이종(동물)이든 완전한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 그 항체의 단편 F(ab')2 또는 Fab일 수 있다.In summary, the present invention relates to the use of HIV-1, HIV-2, HTLV-1 or HTLV-2 viral regulatory proteins for ARC / AIDS subjects or seropositive subjects, in particular for the prevention Or therapeutic use. This particular antibody may be derived from the subject itself, or by active immunization (vaccination) with a biologically inactivated but immunogenic Tat (analogous to a bacterial toxoid, called Tat-toxoid) ≪ / RTI > serum therapy) to be formed from other homologous or heterologous organisms. Homologous antibodies (humans) can be formed in non-infected subjects after active immunization (vaccination) with regulatory proteins, such as Tat or its derivatives (Tat-toxoid according to the invention or peptide fragment of Tat). Such manually administered antibody may be a homologous (human) or heterologous (animal) complete monoclonal or polyclonal antibody or fragment F (ab ') 2 or Fab thereof.
상기한 Tat-톡소이드란 화학 약품으로 처리된 Tat 단백질 또는 펩티드를 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 화학 처리는 순환 Tat의 독성 생물학적 특성(T세포의 면역억제; 인터페론을 생성하는 세포에 의한 인터페론-α 생성의 유도; 내피 세포의 신생 혈관 생성; 대식세포에 대한 인터페론의 항바이러스 효과의 차단)의 상실을 야기시키지만, 보조제의 존재 또는 부재하에 집합되거나 또는 집합되지 않는 "담체"에 커플링되거나 또는 커플링되지 않는 적절한 방법으로 제공되고 제조될 때, 항체의 형성을 유도할 수 있는 특성은 유지하도록 한다.The above-mentioned Tat-toxoid is understood to mean a Tat protein or a peptide treated with a chemical agent. These chemical treatments include the toxic biological properties of circulating Tat (immunosuppression of T cells, induction of interferon-α production by interferon-producing cells, neovascularization of endothelial cells, blocking of the antiviral effect of interferon on macrophages) Quot; carrier " that is aggregated or not aggregated in the presence or absence of adjuvants, but which is capable of inducing the formation of antibodies, .
Tat-톡소이드의 개념은 Tat의 면역원성 펩티드 단편, 즉 보조제의 존재 또는 부재하에 "담체"에 커플링되거나 또는 커플링되지 않는 적절한 방법으로 제공되고 제조될 때, 항-Tat 항체의 형성을 유도할 수 있는 Tat의 펩티드 서열로 확대된다.The concept of Tat-to-toxoids is that of inducing the formation of anti-Tat antibodies when provided and prepared in an appropriate manner that is coupled to or not coupled to a " carrier " in the presence or absence of an immunogenic peptide fragment of Tat, Lt; RTI ID = 0.0 > Tat. ≪ / RTI >
본 발명은 또한 제약 조성물에 관한 것이다.The invention also relates to pharmaceutical compositions.
a) 본 발명에 따른, 조절 단백질, 특히 Tat의 바이러스 톡소이드 또는 단편 또는 유사체를 예방 또는 치료 제제로서 함유하는 제약 조성물.a) A pharmaceutical composition according to the present invention, which comprises a control protein, in particular a virus toxoid or fragment or analogue of Tat, as a prophylactic or therapeutic agent.
b) 본 발명에 따른 상기 단백질 또는 그의 단편 F(ab')2 또는 Fab에 대해 면역화된 생물체로부터 생성된 항-Tat 항체를 예방 또는 치료 제제로서 함유하는 제약 조성물.b) a pharmaceutical composition comprising an anti-Tat antibody produced from an organism immunized against said protein or its fragment F (ab ') 2 or Fab according to the present invention as a prophylactic or therapeutic agent.
본 발명은 또한 활성 성분(Tat-톡소이드 또는 그의 유도체 또는 항-Tat 항체) 이외에 보조제 및(또는) 항-레트로바이러스 특성을 갖는 다른 면역원을 함유할 수 있는 백신 제약 조성물로 이루어진 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit comprising a vaccine pharmaceutical composition that may contain adjuvants and / or other immunogens with anti-retroviral properties in addition to the active ingredient (Tat-toxoid or derivative thereof or anti-Tat antibody).
마지막으로, 본 발명은 통상의 생약 형태의 제약 조성물을 제공한다. 특히,본 발명에 따른 활성 성분은 효과적인 치료를 하기에 충분한 양으로 제약학상 허용되는 희석제 또는 담체와 혼합된다.Finally, the present invention provides pharmaceutical compositions in conventional herbal form. In particular, the active ingredient according to the invention is mixed with a pharmaceutically acceptable diluent or carrier in an amount sufficient to effect effective treatment.
<실험예 1: 순환 Tat 단백질의 병원성 효과>EXPERIMENTAL EXAMPLE 1: Pathogenic Effect of Circulating Tat Protein [
Tat의 존재하의 T 세포의 면역억제.Immunosuppression of T cells in the presence of Tat.
말초 혈액의 활성화된 T 림프구에 대한 Tat의 효과를 연구하였다. 면역자기에 의해 분리된 단핵 세포(PMBC) 및 T 림프구(HLA 35 DR-)를 Tat 분자의 존재 또는 부재하에 항-CD3항체에 의해 활성화시켰다. 5일 동안 배양한 후에, H3-티미딘을 포함시켜 세포 증식을 측정하였다. 그 결과는 Tat가 HLA DR- T 세포의 증식을 억제하였다는 것을 나타내었다(ml 당 1.5 μg의 농도에서 85% 억제). 이 억제 효과는 특정 항-Tat 항체(Intracel, U.K.)의 존재하에 없어졌다.The effects of Tat on activated T lymphocytes of peripheral blood were studied. Wherein the mononuclear cells (PMBC) and T lymphocytes (HLA 35 DR-) isolated by immune magnetic in the presence or absence of the Tat molecule was activated by -CD 3 antibody. After incubation for 5 days, H 3 - was measured by a cell proliferation comprises a thymidine. The results indicated that Tat inhibited the proliferation of HLA DR-T cells (85% inhibition at a concentration of 1.5 μg per ml). This inhibitory effect disappeared in the presence of certain anti-Tat antibodies (Intracel, UK).
<실험예 2: 순환 Tat 단백질의 병원성 효과><Experimental Example 2: Pathogenic effect of circulating Tat protein>
Tat의 존재하의 대식세포에 대한 인터페론 효과의 억제:Inhibition of Interferon Effect on Macrophages in the Presence of Tat:
인터페론-α의 항바이러스 작용에 대한 Tat의 효과를 MDBK 세포에 대한 VSV바이러스의 세포병원성능의 측정법을 이용하는 통상의 생물학적 시험에 의해 측정하였다.The effect of Tat on the antiviral action of interferon-a was determined by conventional biological tests using the assay of cell viability of VSV virus against MDBK cells.
외생 인터페론에 대한 Tat의 효과Effect of Tat on exogenous interferon
Tat의 투여량 증가는 외생 인터페론의 항-바이러스 성능이 1 내지 20 μg/㎖의 Tat의 농도에 대한 투여량/효과 곡선에 따라 저농도로부터 억제될 수 있도록 하였다. 대표적인 실험에서, 희석 배수 1/4,800(150 I.U.에 해당)까지 명백한 인터페론-α의 보호 효과는 10 μg/㎖의 Tat의 농도에 대해 희석 배수 1/300으로 감소하였다. 10 μg/㎖의 Tat의 농도에서, 외생 인터페론의 4,800의 희석시에 VSV의 역가는 103.8(Tat 부재하의 인터페론 시료)에서 105.5(Tat 존재하의 인터페론 시료)로 증가하였다. 이 실험에서, Tat 분자에 의한 인터페론-α의 항-바이러스 효과의 억제는 특정 항-Tat 항체(Intracel, U.K.)의 존재하에 또한 본 발명자가 제조한 말 항체(하기 실시예 참조)에 의해 제어되었다.The increase in Tat dose allowed the anti-viral performance of exogenous interferon to be inhibited from low concentrations according to the dose / effect curves for concentrations of 1 to 20 μg / ml of Tat. In a representative experiment, the protective effect of the apparent interferon-alpha up to a dilution factor of 1/4 800 (corresponding to 150 IU) was reduced to a dilution factor of 1/300 for a concentration of 10 μg / ml Tat. At a concentration of 10 μg / ml Tat, the VSV reversal at 4,800 dilutions of exogenous interferon was increased from 10 3.8 (interferon in the absence of Tat) to 10 5.5 (interferon in the presence of Tat). In this experiment, the inhibition of the anti-viral effect of interferon-alpha by the Tat molecule was also controlled by the inventive horse antibody (see Examples below) in the presence of a specific anti-Tat antibody (Intracel, UK) .
<실험예 3: HIV-1에 의해 감염된 대상에서의 세포외 형태의 Tat 단백질의 측정>Experimental Example 3: Measurement of extracellular Tat protein in a subject infected with HIV-1 [
혈청반응 양성 환자의 혈청 중의 항-Tat 항체의 존재:The presence of anti-Tat antibodies in the sera of seronegative patients:
a) 천연 Tat 분자를 항원으로서 사용하는 혈청 항-Tat 항체의 ELISA 연구를 50 혈청반응 양성 대상 및 15 혈청반응 음성 대상에 대해 수행하였다. 혈청반응 음성 대상의 혈청 모두 및 혈청반응 양성 대상의 혈청 20가지는 역치점(컷오프) 미만의 광학 밀도(OD=0.250)를 갖는 항-Tat 항체의 존재를 나타내지 않았다. 한계치를 넘는 HIV로 감염된 대상의 30가지 혈청 중에서, 6가지는 0.500을 초과하는 OD를 가졌다. 항-Tat 항체의 존재와 임상학적 조건 및 혈액 mm3당 CD4 세포 수 사이에는 명백한 상관 관계가 없었다.a) ELISA studies of serum anti-Tat antibodies using natural Tat molecules as antigens were performed on 50 serum-reactive and 15 seronegative negative subjects. All of the sera from the seronegative subjects and the sera from the serum seronegative subjects did not show the presence of anti-Tat antibodies with an optical density (OD = 0.250) below the threshold (cutoff). Of the 30 sera of HIV-infected subjects over the limit, six had an OD of greater than 0.500. There was no clear correlation between the presence of anti-TAT antibody and clinical conditions and the number of CD4 cells per mm 3 of blood.
b) Tat의 각종 펩티드를 항원으로서 사용하는 혈청 항-Tat 항체의 ELISA 연구를 그들의 HIV 감염 진전의 각종 단계에서 혈청반응 양성 대상에 대해 수행하였다; 징후가 없는 대상, 전-AIDS 임상학적 징후군(ARC)을 나타내는 환자 및 AIDS를 앓는 환자. 이 연구 결과를 다음과 같이 나타내었다:b) ELISA studies of serum anti-Tat antibodies using various peptides of Tat as antigens were performed on seropositive subjects at various stages of their HIV infection progression; Patients with no signs, patients with pre-AIDS clinical signs (ARC), and patients with AIDS. The results of this study are as follows:
1) Tat의 펩티드 서열1) Peptide sequence of Tat
MEPVDPRLEPWKHPG (N 말단에서의 잔기 1-15)MEPVDPRLEPWKHPG (residues 1-15 at the N-terminus)
HQVSLSKQPTSQPRGD (C말단에서의 잔기 65-80)HQVSLSKQPTSQPRGD (residues 65-80 at the C terminus)
은 혈청반응 양성 대상의 혈청의 대부분에 의해 인식되었으며 혈청반응 음성 대상(대조군)의 혈청에 의해서는 인식되지 않았다. 반응은 매우 양성이었지만, HIV 감염의 진전 및 대상에서의 CD4 수에 대해서 상관 관계가 입증되지는 않았다.Was recognized by most of the serum seropositive subjects and was not recognized by the sera from the seropositive subjects (control group). The response was very positive, but no correlation was evidenced with the progress of HIV infection and the number of CD4 in the subject.
2) 연구된 다른 서열은 혈청반응 양성 개체 또는 대조군으로부터 얻은 혈청에 의해 평가가능한 방법으로 인식되지 않았다(표 1 참조). 각 서열에 대한 몇가지의 혈청 만이 역치점을 초과하는 광학 밀도(대조군 혈청 평균의 2배)를 나타내었다.2) Other sequences studied were not recognized in a manner that is measurable by sera obtained from serum-reactive individuals or controls (see Table 1). Only some of the sera for each sequence showed an optical density exceeding the threshold value (twice the mean of the control serum).
[표 1][Table 1]
3) 대부분의 반응성 서열(AA 65-80)은 인테그린에 의해 인식되는 RGD 잔기를 함유하는 것임을 주목할 수 있다.3) It can be noted that most reactive sequences (AA 65-80) contain RGD residues recognized by integrins.
<실시예 1: 면역원성 Tat 단백질(Tat-톡소이드)의 제조>≪ Example 1: Preparation of immunogenic Tat protein (Tat-toxide) >
포름알데히드의 존재하의 Tat 단백질의 불활성화Inactivation of Tat protein in the presence of formaldehyde
포름알데히드를 70 mM 인산 이나트륨(pH 8.0) 중의 Tat의 용액(1 mg/ml)에 최종 농도가 33 mM이 되도록 첨가하였다.Formaldehyde was added to a solution of Tat (1 mg / ml) in 70 mM disodium phosphate (pH 8.0) to a final concentration of 33 mM.
혼합물을 37 ℃에서 1, 3, 5, 7 및 9일 동안 배양하였다. 각 배양 주기의 말기에, 시료를 취하고 최종 농도가 100 mM이 되도록 글리신을 첨가하여 포름알데히드와의 반응을 차단하였다.The mixture was incubated at 37 DEG C for 1, 3, 5, 7 and 9 days. At the end of each incubation period, samples were taken and the reaction with formaldehyde was blocked by adding glycine to a final concentration of 100 mM.
각 시료를 그의 용적 100배 PBS(인산염 완충된 염수)에 대하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 투석하였다.Each sample was dialyzed overnight at 4 ° C against 100 times its volume of PBS (phosphate buffered saline).
<실시예 2: 면역원성 Tat 단백질(Tat-톡소이드)의 제조>Example 2: Preparation of immunogenic Tat protein (Tat-toxoid)
글루타르알데히드의 존재하의 Tat 단백질의 불활성화Inactivation of Tat protein in the presence of glutaraldehyde
글루타르알데히드를 70 mM 인산 이나트륨(pH 8.2) 중의 Tat의 용액(1 mg/ml)에 최종 농도가 0.026 M 또는 0.0026 M이 되도록 첨가하였다. 글루타르알데히드와의 반응을 1분에서 3시간 까지의 여러 시간 동안 계속되도록 하였다. 선택된 반응시간 후에, 실험실 온도에서 최종 농도가 100 mM이 되도록 글리신을 첨가하여 반응을 차단하였다. 각종 시료를 그의 용적 100배의 PBS에 대하여 4 ℃에서 16시간 동안 투석하였다.Glutaraldehyde was added to a solution of Tat (1 mg / ml) in 70 mM disodium phosphate, pH 8.2, to a final concentration of 0.026 M or 0.0026 M. The reaction with glutaraldehyde was allowed to continue for several hours, ranging from 1 minute to 3 hours. After the selected reaction time, the reaction was blocked by the addition of glycine to a final concentration of 100 mM at the laboratory temperature. Various samples were dialyzed against 100 times their volume of PBS at 4 DEG C for 16 hours.
<실시예 3: 면역원성 Tat 단백질(Tat-톡소이드)의 제조>Example 3: Preparation of immunogenic Tat protein (Tat-toxoid)
Tat의 불활성화 및 파상풍 독소로의 동시 커플링Inactivation of Tat and simultaneous coupling to tetanus toxin
글루타르알데히드를 70 mM - 100 mM 인산염 완충액 (pH 6.8 내지 8.2) 중의 파상풍 독소 및 Tat의 혼합물(몰비: 1 내지 15)에 최종 농도가 0.0026 M 내지0.026 M이 되도록 첨가하고, 불활성화 및 커플링 반응이 실험실 온도에서 여러 시간(3-15분) 동안 일어나도록 하였다. 최종 농도가 100 mM이 되도록 글리신을 첨가하여 반응을 차단하고, 각종 시료를 그의 용적 100배 PBS에 대하여 4 ℃에서 16시간 동안 투석하였다.Glutaraldehyde was added to a mixture of tetanus toxin and Tat (molar ratio: 1 to 15) in 70 mM to 100 mM phosphate buffer (pH 6.8 to 8.2) to a final concentration of 0.0026 M to 0.026 M, and deactivation and coupling The reaction was allowed to take place for several hours (3-15 minutes) at the laboratory temperature. The reaction was blocked by adding glycine to a final concentration of 100 mM, and the various samples were dialyzed against PBS at a volume of 100 times at 4 DEG C for 16 hours.
<실시예 4: Tat-톡소이드의 면역원성 효능 및 항원성>≪ Example 4: Immunogenic efficacy and antigenicity of Tat-toxoid >
마우스에서의 면역원성 Tat-톡소이드: ELISA에 의한 항체 측정Immunogenicity in mice Tat-toxoid: Antibody assay by ELISA
포름알데히드에 의해(Tat-톡소이드), 또는 글루타르알데히드에 의해(Tat-폴란), 또는 파상풍 독소에 커플링시킨 후에(콘쥬게이트된 Tat-파상풍 독소), 불활성화된 각종 Tat 제제, 즉 실시예 1 내지 3의 면역원성 화합물의 면역원성 효능을 마우스에서 측정하였다.(Tat-tetanus toxin conjugated) after coupling with formaldehyde (Tat-toxide), or glutaraldehyde (Tat-Polan), or tetanus toxin, various inactivated Tat agents, The immunogenic efficacy of immunogenic compounds of 1 to 3 was measured in mice.
체중 18-20 g의 스위스 마우스를 프로인트 완전 보조액의 존재하에 실시예 1, 2 및 3의 면역원을 2회 피하 주사하여 면역화시켰으며, 두번째 주사는 프로인트 불완전 보조액의 존재하에 에멀젼 중의 제제 20 μg으로 첫번째 주사한지 3주 후에 실시하였다.Swiss mice weighing 18-20 g were immunized by subcutaneous injection of the immunizations of Examples 1, 2 and 3 in the presence of Freund's complete adjuvant, and a second injection was performed in the presence of Freund's incomplete adjuvant with 20 ug of the formulation in emulsion , And three weeks after the first injection.
반복 주사한지 15일 후에, 혈액 시료를 심장내에서 취하였다. 혈청 중의 항-Tat 항체를 ELISA에 의해 확인하였다. 광학 밀도는 490 nm에서 측정되었다.After 15 days of repeated injections, blood samples were taken in the heart. Anti -Tat antibodies in serum were confirmed by ELISA. Optical density was measured at 490 nm.
표 2에 요약된 결과는, 독성인 것으로 판명되어 24시간 내에 마우스를 죽인, 단시간 (3분) 동안 글루타르알데히드로 처리한 콘쥬게이트 Tat-TT를 제외하고는, 모든 Tat 제제의 면역원성이 다양한 정도로 나타난다(TT내지 약하게 불활성화됨). 비면역화된 마우스의 혈청은 Tat-톡소이드에 반응하는 것과 동일하게 천연 Tat에0.200(OD) 보다 낮은 반응을 나타낸다는 것에 주목해야 한다. 또한, 이 결과는 천연 Tat가 톡소이드와 동일하게 항체에 의해 인식되는 것을 나타내며, 이것은 그들의 동등한 항원성을 확인시켜 주는 것이며 또한 면역화를 위한 Tat-톡소이드의 용도를 증명하는 것이다.The results summarized in Table 2 show that the immunogenicity of all of the Tat preparations was varied, with the exception of the conjugate Tat-TT, which was found to be toxic and treated with glutaraldehyde for a short period of time (3 minutes) (TT to weakly inactivated). It should be noted that the serum of unimmunized mice exhibits a response lower than 0.200 (OD) to natural Tat as well as to Tat-toxide. In addition, this result indicates that the natural Tat is recognized by the same antibody as the toxoid, which confirms their equivalent antigenicity and also demonstrates the use of Tat-toxoid for immunization.
[표 2][Table 2]
<실시예 5: 급성 독성>≪ Example 5: Acute toxicity >
Tat-톡소이드 및 Tat-폴란 제제의 독성을 체중이 18-20 g인 스위스 마우스에게 피하 주사하여 측정하였다. Tat-톡소이드(7일) 및 Tat-폴란(15분, 0.026 M)의 제제를 마우스 당 100 μg의 투여량으로 투여하였다. 동물들을 7일 동안 관찰하였다.The toxicity of Tat-toxoid and Tat-Polan preparations was determined by subcutaneous injection into swiss mice weighing 18-20 g. Tat-toxoid (7 days) and Tat-Pollan (15 min, 0.026 M) were administered at a dose of 100 μg per mouse. Animals were observed for 7 days.
독성의 명백한 징후는 관찰되지 않았다. 동물의 체중은 계속 증가하였다. 부검하여 육안으로 기관을 검사한 결과 이상이 없는 것으로 밝혀졌다.No obvious signs of toxicity were observed. The animals' body weight continued to increase. An autopsy and visual inspection of the organ revealed no abnormality.
<실시예 6: 항-Tat 항체>Example 6 Anti-Tat Antibody < RTI ID = 0.0 >
항-Tat 항체를 다음과 같이 제조하였다: Tat-폴란으로 면역화된 마우스의 혈청으로부터 G 단백질의 칼럼 상에서 IgG 분획물을 분리하였다. 또한, 펩신 분해에의해 분리된 IgG 분획물로부터 단편 F(ab')2를 제조하였다. 이 분획물의 면역학적 반응성을 ELISA에 의해 검사하였다.Anti-Tat antibodies were prepared as follows: IgG fractions were separated on a column of G proteins from the sera of mice immunized with Tat-polan. Also, fragment F (ab ') 2 was prepared from the IgG fraction isolated by pepsin digestion. The immunological reactivity of this fraction was examined by ELISA.
<실시예 7: Tat-톡소이드의 생물학적 불활성>Example 7: Biological inactivation of Tat-toxoid < RTI ID = 0.0 >
실시예 1에서 제조된, 1, 3, 5 및 9일 동안 불활성화된 각종 Tat-톡소이드를 HIV-1의 "긴 말단 반복"(LTR)의 유전자 리포터 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 의존물의 발현 활성의 시험으로 시험하였다.The various Tat-toxoids inactivated for 1, 3, 5 and 9 days, prepared in Example 1, were incubated with the expression activity of the gene reporter chloramphenicol acetyltransferase (CAT) -independent of the "long terminal repeat" (LTR) .
이 시험 원리는 다음과 같다: HIV의 LTR의 조절하에 CAT 유전자를 함유하는 HeLa 세포주를 6시간 동안 천연 Tat 또는 톡소이드와 접촉하도록 한다. 24시간 동안 배양시킨 후에, 세포를 용해하고 생성된 CAT의 양은 클로람페니콜에 부착된 아세틸-CoA의 비율을 측정하는 CAT 활성에 대한 시험으로 측정한다. Tat 분자가 활성이라면, 아세틸화된 클로람페니콜의 비율이 높을 것이고, 그렇지 않다면 비율은 낮을 것이다. 이러한 유착 세포의 배양을 RPMI, 10% FCS 배지 중에서 표준 방법으로 수행한다. 효과/투여량을 제공하기 위해 첨가된 Tat의 농도 범위는 상징액 ml 당 1 μg 내지 10 μg이다.This test principle is as follows: A HeLa cell line containing the CAT gene under the control of LTR of HIV is allowed to contact natural Tat or toxoid for 6 hours. After incubation for 24 hours, the cells are lysed and the amount of CAT produced is determined by testing for CAT activity measuring the ratio of acetyl-CoA attached to chloramphenicol. If the Tat molecule is active, the proportion of acetylated chloramphenicol will be high, otherwise the rate will be low. The culture of these adherent cells is performed by standard methods in RPMI, 10% FCS medium. The concentration range of Tat added to provide the effect / dose is 1 μg to 10 μg per ml of supernatant.
여기에 나타낸 결과는 Tat-톡소이드가 1일째에 낮은 잔류 활성을 나타내면서 3일 후에 완전히 불활성화되는 것을 입증하는 것이다.The results shown here demonstrate that Tat-toxoid is completely inactivated after 3 days with low residual activity on day 1.
<실시예 8: Tat-톡소이드의 병원성 효과의 부재>≪ Example 8: Absence of pathogenic effect of Tat-toxoid >
a) Tat-톡소이드 존재하의 T 세포의 면역억제의 결여 (실험예 1 및 2와 대조적임)a) lack of immunosuppression of T cells in the presence of Tat-toxoid (as opposed to Experimental Examples 1 and 2)
말초 혈액의 활성화된 T 림프구에 대한 Tat-톡소이드(5일)의 효과를 연구하였다. 면역자기에 의해 분리된 단핵 세포(PMBC) 및 T 림프구(HLA 35 DR-)를 실시예 1의 면역원성 화합물의 존재 또는 부재하에 항-CD3항체에 의해 활성화시켰다. 5일 동안 배양시킨 후에, H3-티미딘을 포함시켜 세포 증식을 측정하였다. 이 결과는 천연 Tat와 대조적으로 Tat-톡소이드가 HLA DR- T세포의 증식을 억제하지 않았음을 나타내었다. 따라서, Tat-톡소이드의 존재하에 배양물 중의 5 μg/㎖의 투여량에서 세포 증식은 대조군의 것과 동일하였다.The effect of Tat-toxoid (5 days) on activated T lymphocytes of peripheral blood was studied. Wherein the mononuclear cells (PMBC) and T lymphocytes (HLA 35 DR-) isolated by immune magnetic in the presence or absence of the immunogenic compound of Example 1 was activated by -CD 3 antibody. After 5 days of culture, cell proliferation was measured by incubation with H 3 -thymidine. These results indicate that Tat-toxoid did not inhibit HLA DR-T cell proliferation in contrast to natural Tat. Thus, cell proliferation at the dose of 5 μg / ml in culture in the presence of Tat-toxoid was the same as that of the control.
b) Tat-톡소이드 존재하에 대식 세포에 대한 인터페론-α의 효과 억제의 결여b) Lack of inhibition of the effect of interferon-alpha on macrophages in the presence of Tat-toxoid
인터페론-α의 항바이러스 작용에 대한 Tat-톡소이드의 효과를 MDBK 세포에 대한 VSV 바이러스의 세포병원성능의 측정법을 이용하는 통상의 생물학적 시험에 의해 측정하였다.The effect of Tat-toxoid on the antiviral action of interferon-alpha was determined by conventional biological tests using the assay of cell viability of VSV virus against MDBK cells.
외생 인터페론에 대한 Tat-톡소이드의 효과Effect of Tat-toxoid on exogenous interferon
천연 Tat와 대조적으로, 실시예 1의 Tat-톡소이드의 등가 투여량은 외생 인터페론의 항바이러스 성능이 억제되도록 할 수 없었다. 대표적인 실험에서, 희석 배수 1/4,800(150 I.U. 에 해당)까지 명백한 인터페론-α의 보호 효과는 50 μg의Tat-톡소이드 존재하에 유지되는 반면, 천연 Tat에 의해서는 1/300로 감소하였다. 외생 인터페론의 4,800배의 희석시에 VSV의 역가는 103.8(Tat-톡소이드 존재하의 인터페론 시료)에서 대조군의 농도에서 유지되고, 그것은 105.5(Tat 존재하의 인터페론 시료)로 증가하였다.In contrast to the natural Tat, an equivalent dose of the Tat-toxoid of Example 1 could not be inhibited by the antiviral performance of exogenous interferon. In a representative experiment, the protective effect of apparent interferon-alpha up to a dilution factor of 1/4,800 (corresponding to 150 IU) was maintained in the presence of 50 μg of Tat-toschoid, whereas it decreased to 1/300 by natural Tat. At 4,800-fold dilution of exogenous interferon, the VSV potency was maintained at a concentration of 10 3.8 (interferon in the presence of Tat-toxoid) at the concentration of the control, which increased to 10 5.5 (interferon sample in the presence of Tat).
<실시예 9: 천연 Tat의 효과에 관한 항-Tat-톡소이드 항체의 보호 역할>Example 9: Protective role of anti-Tat-to-toxoid antibody on the effect of natural Tat
실험예 1의 Tat-톡소이드에 대한 항체(포름알데히드로 3일 동안 처리)를 과면역화된 말에서 제조하였다. 또한, 이 항체로부터 단편 F(ab')2를 실시예 6에 기재된 절차에 따라서 제조하였다.Antibodies to the Tat-toxoid of Experimental Example 1 (treated with formaldehyde for 3 days) were prepared in over-inverted horses. In addition, fragment F (ab ') 2 was prepared from this antibody according to the procedure described in Example 6.
항체는 단편 F(ab')2와 같이, 항체는 각종 시험에서 천연 Tat의 각종 생물학적 활성, 즉, HIV의 LTR의 트랜스활성화(CAT 시험)(실시예 7 참조), 면역억제(실험예 1 참조), 배양물에 대한 외생 인터페론-α의 효과 억제(실험예 2 참조)를 억제하였다. 실험예 1 및 2 및 실시예 7은 천연 Tat 1 μg 당 40 μg의 항체 투여량으로 천연 Tat를 항체 또는 단편 F(ab')2와 함께 37 ℃에서 1시간 동안 예비배양을 하거나 또는 하지 않고 천연 Tat를 사용하여 반복하였다. 이 결과는 항체가 천연 Tat 의 작용을 억제한다는 것을 나타내었다.Antibodies, like fragment F (ab ') 2, have been shown in various assays for various biological activities of natural Tat, namely transactivation of HIV LTR (CAT test) (see Example 7), immunosuppression ), Inhibiting the effect of exogenous interferon-? On the culture (see Experimental Example 2). Experimental Examples 1 and 2 and Example 7 show that natural Tat is incubated with antibody or fragment F (ab ') 2 at 37 [deg.] C for 1 hour at an antibody dose of 40 [ Repeated using Tat. This result indicated that the antibody inhibited the action of natural Tat.
<실시예 10: 항-Tat 항체 및 항-인터페론-α 항체의 배합으로 인한 세포 증식의 전신적 회복: 항-Tat 및 항-인터페론-α 항체의 상승 작용>Example 10: Systemic recovery of cell proliferation due to combination of anti-Tat antibody and anti-interferon-a antibody: Synergistic action of anti-Tat and anti-interferon-
시험관내에서 HIV-l로 감염시키고 6일 동안 배양한 건강한 대상의 PBLs(말초 혈액의 단핵 세포)이 면역억제 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.It has been found that PBLs (peripheral blood mononuclear cells) of healthy subjects infected with HIV-1 in vitro and cultured for 6 days have immunosuppressive activity.
사실상, 6일 동안 감염되고 (또는 비감염되고) 조사된 그러한 세포를 단백질 스타필로코커스(Staphylococcus) 엔테로톡신 B(SEB)에 의해 활성화된 자기이식 세포에 1 내지 5의 비율로 첨가한다면, 4일 후에 자기이식 세포의 증식이 대조군(비감염된 세포)에 비해 80% 감소됨이 발견되었다.In fact, if such cells infected (or uninfected) for 6 days were added to the autologous grafted cells activated by protein staphylococcus enterotoxin B (SEB) at a ratio of 1 to 5, It was found that the proliferation of autologous graft cells was reduced by 80% compared to the control (uninfected cells).
이 모델에서, 항-인터페론-α 항체를 시험관내에서 감염된 세포 배양물에 첨가한다면, 이들 세포는 대상의 50%에서 그들의 억제 효과를 상실한다. 그 경우의 20%에서는, 억제 세포가 그들의 억제 효과의 60%를 상실하고, 30%에서는 억제 효과가 상당히 유지된다.In this model, if an anti-interferon-α antibody is added to an infected cell culture in vitro, these cells lose their inhibitory effect in 50% of subjects. In 20% of the cases, the inhibitory cells lose 60% of their inhibitory effect, while at 30% the inhibitory effect is significantly maintained.
항-Tat 항체(실험예 1에 기재된 모노클로날, 또는 실시예 9의 말로부터 얻은 폴리글로날)를 항-인터페론-a 항체에 첨가한다면, 시험관내에서 감염된 세포는 그 경우의 100%에서 그들의 억제 효과를 상실한다.If an anti-TAT antibody (monoclonal as described in Experimental Example 1, or polygonal obtained from Example 9) is added to the anti-interferon-a antibody, the infected cells in vitro can be detected at 100% They lose their inhibitory effect.
이 실험은 HIV1에 의해 유도된 면역억제에서의 Tat 및 인터페론-α의 혼합된 독성 역할을 입증하며, 항-인터페론 및 항-Tat 항체의 혼합이 정상 면역성을 회복한다는 것을 입증한다.This experiment demonstrates the mixed toxic role of Tat and interferon-alpha in HIV1-induced immunosuppression and demonstrates that the combination of anti-interferon and anti-TAT antibody restores normal immunity.
<실시예 12: 면역원성 Nef 단백질(Nef 톡소이드)의 제조>Example 12: Preparation of immunogenic Nef protein (Nef toxide)
포름알데히드 존재하의 Nef 단백질의 불활성화Inactivation of Nef protein in the presence of formaldehyde
포름알데히드를 70 mM 인산 이나트륨(pH 8.0) 중의 Nef 단백질의 용액(1 g/ml)에 최종 농도가 33 mM이 되도록 첨가하였다.Formaldehyde was added to a solution of Nef protein (1 g / ml) in 70 mM disodium phosphate, pH 8.0, to a final concentration of 33 mM.
혼합물을 37 ℃에서 1, 3, 5, 7 및 9일 동안 배양하였다. 각 배양 주기의 말기에, 시료를 취하고 최종 농도가 100 mM이 되도록 글리신을 첨가하여 포름알데히드와의 반응을 차단하였다.The mixture was incubated at 37 DEG C for 1, 3, 5, 7 and 9 days. At the end of each incubation period, samples were taken and the reaction with formaldehyde was blocked by adding glycine to a final concentration of 100 mM.
각 시료를 그의 용적 100배 PBS(인산염 완충된 염수)에 대하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 투석하고, Nef-톡소이드를 분리하였다.Each sample was dialyzed overnight at 4 ° C against 100 times its volume of PBS (phosphate buffered saline) and the Nef-toxide was isolated.
<실시예 13: 면역원성 Nef 단백질(Nef-폴란)의 제조>Example 13: Preparation of immunogenic Nef protein (Nef-Polan)
글루타르알데히드 존재하의 Nef 단백질의 불활성화Inactivation of Nef protein in the presence of glutaraldehyde
글루타르알데히드를 70 mM 인산 이나트륨(pH 8.2) 중의 Nef의 용액(1 mg/ml)에 최종 농도가 0.026 M 또는 0.0026 M이 되도록 첨가하였다. 글루타르알데히드와의 반응을 1분에서 3시간 까지의 여러 시간 동안 계속되도록 하였다. 선택된 반응시간 후에, 실험실 온도에서 최종 농도가 100 mM이 되도록 글리신을 첨가하여 반응을 차단하였다. 각종 시료를 그의 용적 100배 PBS에 대하여 4 ℃에서 16시간 동안 투석하고, Nef-폴란을 분리하였다.Glutaraldehyde was added to a solution (1 mg / ml) of Nef in 70 mM disodium phosphate (pH 8.2) to a final concentration of 0.026 M or 0.0026 M. The reaction with glutaraldehyde was allowed to continue for several hours, ranging from 1 minute to 3 hours. After the selected reaction time, the reaction was blocked by the addition of glycine to a final concentration of 100 mM at the laboratory temperature. Various samples were dialyzed for 16 hours at 4 ° C against 100 times their volume of PBS, and Nef-polan was isolated.
<실시예 14: Nef-톡소이드의 면역원성 효능 및 항원성>≪ Example 14: Immunogenic efficacy and antigenicity of Nef-toxoid >
마우스에서의 면역원성 Nef-톡소이드: ELISA에 의한 항체 측정Immunogenicity in mice Nef-toxoid: Antibody assay by ELISA
포름알데히드에 의해(Nef-톡소이드), 또는 글루타르알데히드에 의해(Nef-폴란) 불활성화된 각종 Nef 제제, 즉 실시예 12 및 13의 면역원성 화합물의 면역원성 효능을 마우스에서 측정하였다.The immunogenic efficacy of the various Nef agents, i.e., the immunogenic compounds of Examples 12 and 13, inactivated by formaldehyde (Nef-toxide) or glutaraldehyde (Nef-Pollan) was determined in mice.
체중 18-20 g의 스위스 마우스를 프로인트 보조액의 존재하에 실시예 12 및 13의 면역원을 2회 피하 주사하여 면역화시켰으며, 두번째 주사는 프로인트 불완전 보조액의 존재하에 에멀젼 중의 제제 20 μg으로 첫번째 주사한지 3주 후에 실시하였다.Swiss mice weighing 18-20 g were immunized by subcutaneous injection of the immunogen of Examples 12 and 13 in the presence of Freund's adjuvant twice and injected in the presence of Freund's incomplete adjuvant with the first injection Three weeks after the first injection.
반복 주사한지 15일 후에, 혈액 시료를 심장내에서 취하였다. 혈청 중의 항-Nef 항체를 ELISA에 의해 측정하였다. 광학 밀도는 490 nm에서 측정되었다.After 15 days of repeated injections, blood samples were taken in the heart. Anti-Ne antibodies in serum were measured by ELISA. Optical density was measured at 490 nm.
하기 표에 요약된 결과는, 모든 Nef 제제가 다양한 정도의 면역원성을 지정을 나타낸다. 비면역화된 마우스의 혈청은 이 ELISA 시험에서 0.2 (OD) 보다 더 낮은 반응 정도를 제공하는 것에 주목해야 한다.The results summarized in the table below indicate that all Nef agents designate varying degrees of immunogenicity. It should be noted that the serum of unimmunized mice provides a lower degree of response than this 0.2 (OD) in this ELISA test.
이 결과는 천연 Nef 단백질이 톡소이드와 동일하게 항체에 의해 인식되는 것을 나타내며, 이것은 그들의 동등한 항원성을 확인시켜 주는 것이며 또한 면역화를 위한 Nef-톡소이드의 용도를 증명하는 것이다.This result indicates that the native Nef protein is recognized by the same antibody as the toxoid, which confirms their equivalent antigenicity and also demonstrates the use of Nef-toxoid for immunization.
<서열표><Sequence Table>
(1) 일반적 정보 :(1) General information:
(i) 출원인(i) the applicant
(A) 명칭: 네오박스(A) Name: NeoBox
(B) 거리: 휘 비에르 뒤 땅쁠 117(B) Distance: Fauvier du Mouton 117
(C) 도시: 빠리(C) City: Paris
(E) 국가: 프랑스(E) Country: France
(F) 우편번호: 75003(F) Postal Code: 75003
(ii) 발명의 명칭: 새로운 면역원, 새로운 항체, 그들의 제조 방법 및 그들을 함유한 제약 조성물(ii) Title of the invention: New immunogens, new antibodies, methods for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
(iii) 서열수: 1(iii) Number of sequences: 1
(iv) 컴퓨터 판독 형태(iv) computer readable form
(A) 매체 유형: 플로피 디스켓(A) Media type: floppy diskette
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성(B) Computer: IBM PC Compatibility
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS(C) Operating system: PC-DOS / MS-DOS
(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25(EPO)(D) Software: Patterned Release # 1.0, Version # 1.25 (EPO)
(2) 서열 1에 대한 정보:(2) Information on sequence 1:
(i) 서열 특징:(i) Sequence characteristics:
(A) 길이: 16 아미노산(A) Length: 16 amino acids
(B) 유형: 아미노산(B) Type: Amino acid
(C) 가닥수: 단일(C) Number of strands: Single
(D) 토폴로지: 선형(D) Topology: Linear
(ii) 분자 형태: 펩티드(ii) Molecular form: Peptide
(xi) 서열 설명: 서열 1:(xi) Sequence description: Sequence 1:
[서열 1][SEQ ID NO: 1]
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