KR100304005B1

KR100304005B1 - 3,4-디히드록시벤조산을 포함한 미생물 생육 저해 기능을 갖는치자 황색소 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR100304005B1
Application number: KR1019990024378A
Authority: KR
Inventors: 박근형; 임철근; 정순택
Original assignee: 박근형
Priority date: 1999-06-22
Filing date: 1999-06-22
Publication date: 2001-09-24
Also published as: KR20010003889A

Abstract

본 발명은 3,4-디히드록시벤조산을 포함한 미생물 생육 저해 기능을 갖는 치자 열매 황색소 추출물의 제조에 관한 것으로, 치자 열매를 마쇄한 후 용매로 추출한 다음 여과하여 얻어진 황색소 추출물은 미생물에 생육 저해 기능을 가진 천연 색소로, 추출물에 함유된 활성물질은 HPLC 등으로 분리하여 MS, NMR 등으로 분석한 결과 3,4-디히드록시벤조산으로 동정된 물질을 포함하며, 이 추출물은 미생물 생육 저해 기능을 갖는 치자 열매 황색소 추출물로 식품 첨가제, 공예품의 염료, 의복의 착색제 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

3,4-디히드록시벤조산을 포함한 미생물 생육 저해 기능을 갖는 치자 황색소 추출물의 제조 방법{Method of processing for extracts of yellow pigment having inhibition growth of microorganisms containing 3,4-dihydroxybenzoicacid from Gardenia jasminoides Ellis Fruits.}

본 발명은 3,4-디히드록시벤조산을 포함한 미생물 생육 저해 기능을 갖는 치자 황색소 추출물의 제조에 관한 것이다.

종래 기술로는 치자 황색소의 제조 방법에 관한 것이었고, 3,4-디히드록시벤조산을 포함한 미생물 생육 저해 기능을 갖는 치자 황색소 추출물에 관해서는 특허 출원된 바 없다.

치자는 오랫동안 단무지, 녹두전, 쌀떡 등에 첨가하여 색소로 사용되었고, 한방에서는 해열(解熱), 이담(利膽), 지혈(止血), 소염(消炎) 등의 약물 효과가 있다고 알려져 왔으며(김재길, 원색천연약물대사전, 남산당 p.121 (1984)), 치자 색소 추출물은 식용으로도 안전하다고 알려져있다(부산대 김희구 교수, 식품음료신문, 1998년 5월 18일). 그러나 치자 열매로부터 황색소가 포함된 추출물에 3,4-디히드록시벤조산을 포함한 미생물 생육 저해 기능에 관한 사실은 알려진 바 없다.

지금까지 치자 색소는 물, 알코올 등의 용매로 추출하여 식품, 염료 등의 착색제로 이용되어 왔으나, 이들 색소 추출물에 항미생물 활성을 갖는 3,4-디히드록시벤조산이 포함된 미생물 생육 저해 효과에 대해서는 알려진 바 없었다.

본 발명은 치자 열매의 물, 에탄올, 메탄올 추출물에는 치자 황색소의 존재 뿐만이 아니라 미생물 생육 저해 효과가 있슴을 발견하였으며, 이 효과의 원인 물질로 3,4-디히드록시벤조산을 포함한다는 사실을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 3,4--디히드록시벤조산을 포함한 미생물 생육 저해 기능을 갖는 치자 황색소 추출물의 제조로, 스타필로코커스 아우레우스와 에스테리치아 코리를 포함한 미생물에 대한 생육 저해 기능을 갖는 천연 색소 추출물을 제조하는 방법임을 특징으로 한다.

도 1은 치자 열매로부터 황색소 추출물의 제조 과정

도 2는 치자 열매의 물, 에탄올, 메탄올 추출물의 가시영역에서의 흡수 스펙트럼 양상

도 3은 치자 황색소 추출물로부터 3,4-디히드록시벤조산을 분리·동정하는 과정

도 4는 치자 황색소 추출물로부터 분리되어 3,4-디히드록시벤조산으로 동정된 Mass 스펙트럼

도 5는 치자 황색소 추출물로부터 분리되어 3,4-디히드록시벤조산으로 동정된¹H-¹³C NMR 스펙트럼

1) 치자 황색소 추출물의 색소 성질

본 발명의 방법에 의해 제조된 치자 추출물의 색소의 성질을 파악하기 위해 분광광도계(V-550, jasco사)를 이용하여 가시영역의 흡수 스펙트럼을 측정한 결과, 도 2에서 제시한 바와 같이, 치자 황색소의 특징인 전형적 흡수 스펙트럼인 434 nm에서 흡수 극대(λ _max)와 460 nm에서 흡수 극대를 갖는 특징적인 스펙트럼을 보여 알려진 치자 황색소 스펙트럼과 일치하였다. 따라서, 본 발명의 방법으로 제조한 치자 추출물은 치자 황색소를 포함하고 있다.

2) 치자 열매 추출물에 대한 미생물 생육 저해 효과

본 발명에 의해 제조된 치자의 황색소 추출물은 표 1에 제시한 바와 같이, 그람 양성 세균인 스타필로코커스 아우레우스와 그람 음성 세균인 에스테리치아 코리 미생물에 대한 생육 저해 효과가 나타나, 제조된 치자 열매의 추출물은 황색소 뿐만이 아니라 미생물 생육 저해 효과가 있슴을 발견하였다.

[표 1] 치자 황색소의 물, 에탄올, 메탄올 추출물에 대한 미생물 생육 저해 효과

또한, 치자 메탄올의 황색소 추출물을 용매분획 방법으로 정제하여 얻어진 산성 획분은 표 2에 제시한 바와 같이, 그람 양성 세균인 스타필로코커스 아우레우스를 비롯한 세균, 효모, 젖산균 등 다양한 미생물에 대한 생육 저해 효과가 나타났다.

[표 2] 치자 황색소의 메탄올 추출물로부터 용매 분획하여 얻어진 확분에 대한 미생물 생육 저해 효과

3) 미생물 생육 저해 원인 물질의 규명

물, 에탄올, 메탄올 추출물 모두 미생물 생육 저해 효과가 있었으나, 치자 황색소의 메탄올 추출물이 미생물 생육 저해 효과가 가장 높아, 이 추출물에 포함된 미생물 생육 저해 원인 물질의 규명을 위해 도 3에 제시된 바와 같이, 여러 단계의 분리·정제 과정을 거쳐 미생물 생육 저해 원인 물질로 3,4-디히드록시벤조산을 분리·동정하였다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 I : 치자 황색소 추출물의 제조 방법

본 발명은 도 1에 제시된 바와 같이, 치자 열매 100 g을 실온에서 건조하여 마쇄한 다음 불순물과 지용성 성분을 제거하고자, 상온에서 헥산 용매 1ℓ에 24 시간 침지시켜 세척하고 남은 잔사를 각각의 물, 에탄올, 메탄올 용매 1ℓ에 24 시간 침지 시킨 후, 여과(G3 유리여과기)하여 물 추출물 19 g, 에탄올 추출물 18 g, 메탄올 추출물 20 g을 얻었다. 상기에서 얻어진 각각의 추출물은 세파덱스 LH-20(25∼100 메쉬, Pharmacia사)를 물, 혹은 에탄올, 혹은 메탄올 용매계로 하루밤 팽윤시킨 후, 컬럼에 충진하고 동 용매계로 용출 분획하여, 총 컬럼 부피에 대한 용출 부피의 비(Ve/Vt)가 0.8∼1.2의 용출 획분을 모아 치자 황색소 추출물을 정제·제조한다. 이 추출물을 동결 건조 혹은 감압농축에 의해 용매가 제거된 분말 형태의 물 추출물 7g, 에탄올 추출물 6 g, 메탄올 추출물 9 g이 각각 얻어진다. 또한, 용도에따라 고도의 정제가 필요하지 않는 경우는 상기의 세파덱스 LH-20 컬럼 정제 과정을 생략 할 수 있다.

실시예 Ⅱ : 치자 황색소 추출물의 색소 성질

상기의 방법으로 얻어진 치자 황색소의 추출물은 각각의 물, 에탄올, 메탄올 용매계로 용해하여 분광 광도계(V-550, jasco사)를 이용하여 가시영역 흡수 스펙트럼을 측정한 결과,도 2에 제시된 바와 같이 치자 황색소의 특징인 전형적 흡수 스펙트럼인 434 nm에서 흡수 극대(λ _max)와 460 nm에서 흡수 극대를 갖는 특징적인 스펙트럼을 보여 알려진 치자 황색소 스펙트럼과 일치하였다. 따라서, 본 발명의 방법으로 제조한 치자 추출물은 치자 황색소를 포함하고 있다.

실시예 Ⅲ : 치자 열매 추출물에 대한 미생물 생육 저해 효과

본 발명에 의해 제조된 치자의 황색소 추출물은 표 1에 제시한 바와 같이, 그람 양성 세균인 스타필로코커스 아우레우스와 에스테리치아 코리 미생물에 대한 생육 저해 효과가 나타났다.

또한, 치자 메탄올의 황색소 추출물을 하기의 실시예 Ⅳ-1에서 설명한 방법으로 용매 분획하여 얻어진 산성 획분은 표 2에 제시한 바와 같이, 그람 양성 세균인 스타필로코커스 아우레우스를 비롯한 세균, 효모, 젖산균 등 다양한 미생물에 대한 생육 저해 효과가 나타났다.

상기의 미생물 생육저해 효과에 대한 표 1과 표 2의 결과는 하기 실시예 Ⅲ-1과 실시예 Ⅲ-2에서 상세히 설명한다.

실시예 Ⅲ-1 : 접종균으로 이용한 미생물에 대한 생육배지와 배양온도

접종균으로 이용한 미생물은 표 1과 표 2에 제시한 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스를 포함한 다양한 미생물을 사용하여, 젖산균의 경우 MRS 배지, 비브리오 불니피쿠스는 LB 배지, 스트렙토코커스 뮤탄스는 BHI 배지, 효모는 YM 배지, 그외 세균은 Nutrient 등의 배지에 다양한 미생물을 생육시켰으며, 배양 온도는 효모의 경우 30 ℃에서, 그람 양성균, 그람 음성균, 젖산균의 경우 37 ℃와 30 ℃에서, 각각 24 시간 3회 반복하여 전배양을 한 후 접종균으로 사용하였다.

실시예 Ⅲ-2 : 미생물 생육저해 효과의 측정방법

본 발명의 방법에 의해 제조된 치자 황색소의 메탄올 추출물에서 치자열매 0.1 g에 상당하는 양을 취하여 용매 제거한 후, 페이퍼 디스크 위에 올리고 0.85 %의 식염수 65 ㎕로 확산시키는 자이카의 페이퍼 디스크 방법(Zaika, L., Spices and herbs, Their antimicrobial activity and it's determination,, J. Food Safety, 9, 97(1988))을 이용하여, 페이퍼 디스크 주위에 나타나는 생육 저해환의 크기로 미생물 생육 저해 효과의 정도를 측정한 결과, 표 1에 제시한 바와 같이 모든 치자 황색소 추출물은 미생물 생육 저해 효과를 가지고 있으며, 또한 치자 황색소를 포함하고 있다. 따라서, 제조된 치자 열매의 추출물은 황색소 뿐만이 아니라 미생물 생육 저해 효과가 있슴을 발견하였다.

또한, 치자 황색소의 메탄올 추출물을 용매 분획하여 얻어진 EtOAc 가용 산성 획분에서, 치자 열매 2 g에 싱당하는 양을 취하여 상기와 같은 자이카의 페이퍼 디스크 방법을 이용하여, 페이퍼 디스크 주위에 나타나는 생육 저해환의 크기로 미생물 생육 저해 효과의 정도를 측정한 결과, 표 2에 제시한 바와 같이, 산성 획분은 그람 양성 세균인 스타필로코커스 아우레우스를 비롯한 세균, 효모, 젖산균 등 다양한 미생물에 대한 생육 저해 효과가 나타났다.

또한, 치자 황색소의 메탄올 추출물의 미생물 생육 저해 원인 물질의 규명을 위해, 하기 실시예 Ⅳ와 같은 방법으로 3,4-디히드록시벤조산을 분리·동정하였다.

실시예 Ⅳ : 치자 황색소의 메탄올 추출물로부터 3,4-디히드록시벤조산을 분리·동정하는 과정

실시예 Ⅳ-1 : 본 발명에 의해 제조된 메탄올 황색소의 추출물은 도 1에 제시된 제조 방법에 의해, 치자 열매 1.8 kg로부터 분말 형태의 메탄올 추출물 64 g을 얻었다. 상기에서 얻어진 메탄올 추출물 64 g을 에틸 아세테이트와 pH 8의 인산 완충용액(0.2 M Na₂HPO₄-0.2 M NaH₂PO₄)을 이용하여 용매 분획한 후, 얻어진 수상 획분을 1 M의 HCl을 가하여 pH 3으로 조절한 다음, 분획시켜 에틸 아세테이트 가용 산성획분 1.8 g의 활성획분을 얻었다. 얻어진 에틸 아세테이트 가용 산성획분 및 중성획분, 그리고 수상획분에 대한 미생물 생육 저해 효과를 표 2에 제시한다. 즉, 치자 추출물의 항균효과는 대부분 에틸 아세테이트 가용 산성획분에서 발현되며, 생육 저해 미생물의 스펙트라는 그람 양성 세균인 스타필로코커스 아우레우스를 비롯한 세균 및 효모, 젖산균 등을 포함하고 있다.

실시예 IV-2 : 실리카겔 컬럼 크로마토그래피

상기 에틸 아세테이트 가용 산성 획분의 활성물질을 농축하여 용매 제거 시킨 후, 시료의 약 10배량에 상당하는 실리카겔(20 g, 70-230 메쉬, 컬럼 크로마토그래피용, Merck사)을 에틸 아세테이트로 슬러리를 만들어 컬럼에 충진시킨 후, 메탄올 : 에틸아세테이트 용매계로 메탄올 농도를 0, 5, 10, 15, 100 %(농도별로 80 ㎖씩)까지 단계적으로 증가시키는 스텝와이즈(step-wise) 용출방법으로 분획하여 활성을 검정한 결과, 100 % 메탄올의 용출획분에서 활성이 나타났고, 활성획분으로 702 mg을 얻었다.

이어서, 상기의 100 % 메탄올 활성획분를 용매계 달리한 헥산 : 에틸 아세테이트 : 메탄올 8:6:1, 6:8:1, 4:10:1(v:v:v, 농도비 별로 180㎖씩)까지 단계적으로 증가시키는 스텝와이즈 용출방법으로 분획하여 활성을 검정한 결과, 헥산 : 에틸 아세테이트 : 메탄올 용매계인 8:6:1의 용출획분에서 활성이 나타났고, 활성획분으로 183 mg을 얻었다.

실시예 IV-3 : 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피

상기에서 얻은 8:6:1의 용출 활성획분은 세파덱스 LH-20(25∼100 메쉬, Pharmacia사)을 이용하여 메탄올 : 클로로포름 4:1(v/v) 용매계로 하루밤 팽윤시킨 후, 컬럼에 충진하고 메탄올 : 클로로포름 4:1 용매계로 용출·분획하여 활성을 검정한 결과, 총 컬럼 부피에 대한 용출 부피의 비(Ve/Vt)가 1.07∼1.12 용출획분에서 활성이 나타났고, 활성획분으로 50 mg을 얻었다.

실시예 Ⅳ-4 : ODS 컬럼 크로마토그래피

상기에서 얻어진 1.07∼1.12 획분의 활성물질은 시료의 약 200 배량에 상당하는 ODS(Octadecylsilane, 25 g, 70-230 메쉬, YMC사)를 메탄올로 슬러리를 만들어 컬럼에 충진시킨 후, 메탄올 : 물 용매계로 메탄올 농도를 30, 40, 50, 60, 70, 100 %(농도별로 40 ㎖씩)까지 단계적으로 증가시키는 스텝와이즈 용출방법으로 분획하여 활성을 검정한 결과, 메탄올 : 물 용매계의 30 : 70(v/v) 획분에서 활성이 나타났고, 활성획분으로 12 mg을 얻었다.

실시예 Ⅳ-5 : 고속 액체 컬럼 크로마토그래피(HPLC)

상기에서 얻어진 메탄올:물 30 : 70(v/v) 획분의 활성물질은 30 % 메탄올 용매계를 이동상으로 μ-Bonda Pak 컬럼을 장착한 HPLC(Waters 486 UV detector)로 용출시켜 활성을 검정한 결과, 3.28 분의 Retention time을 갖는 단일 Peak로 활성물질이 단리되었으며, 활성본체는 4 mg이 얻어졌다.

실시예 Ⅳ-6 : MS, NMR 분석

상기 HPLC에서 분리·정제되어 얻어진 최종 활성물질은 직접 주입장치를 장착한 질량 분석계(Thermabeam^TMMass detector, Waters)를 사용하여 직접 도입 방식의 EI 질량 분석(Direct-EI-MS)을 실시한 결과, 도 4에 제시한 바와 같이 분자 이온이 m/z 154에 베이스 피크로 나타났으며 특징적인 파편 이온이 m/z 137, 109, 63에서 관측되어 3,4-디히드록시벤조산으로 동정되었다.

이 활성물질을 CD₃OD를 용매로 하여 배리언 유니티 플러스-300(Varian Unity Plus-300, (300 MHz)) FT-NMR 분광계로¹H-¹³C NMR 분석한 결과, 도 5에 제시한 바와 같이 3,4-디히드록시벤조산의 구조를 나타냈다. 따라서, 상기 실시예 Ⅳ의 결과는 치자 열매에 포함되는 미생물 생육 저해 원인 물질로 3,4-디히드록시벤조산을 함유하고 있슴이 확인 되었다.

그런데, 3,4-디히드록시벤조산은 마(마승진외, 두릅수피에서 항미생물 활성을 갖는 3,4-디히드록시벤조산의 분리, 한국식품과학회지, 27권, 807-812P., 1995)등에 의해, 그람 양성 및 음성 세균, 효모, 젖산균 등 다양한 미생물에 대한 생육 저해 효과가 있슴이 보고된 바 있다.

본 방법에 의해 제조된 치자 황색소 추출물은 치자 고유의 황색소를 유지하면서 3,4-디히드록시벤조산을 포함하여, 그람 양성 세균, 그람 음성 세균 등 미생물에 대한 생육 저해 효과를 동시에 갖는 치자 황색소 추출물을 제공하며, 이 추출물은 식품 첨가제, 공예품의 염료, 의복 착색제 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

3,4-디히드록시벤조산을 포함한 미생물 생육 저해 기능을 갖는 치자 황색소 추출물의 제조 방법