KR100279902B1

KR100279902B1 - 하고초로부터 분리된 림프구 세포 카이나아제의 에스에이치2 영역에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산 및 그 분리정제방법

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Publication number: KR100279902B1
Application number: KR1019980017741A
Authority: KR
Inventors: 허은미; 최영봉; 윤영대; 안순철; 이현선; 안종석; 정수일
Original assignee: 허영섭; 재단법인목암생명공학연구소
Priority date: 1998-05-16
Filing date: 1998-05-16
Publication date: 2001-02-01
Also published as: KR19990085366A

Abstract

본 발명은 T 림프구 세포 카이나아제(Lymphocyte cell kinase, 이하 Lck라함) 단백질의 SH2 영역(Src homology region 2)에 대한 결합을 저해하는 생리활성을 갖는 약용식물과 미생물 배양액을 탐색하여 저해활성이 가장 우수한 하고초(Prunella vulgaris)를 선정하고, 이로부터 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산을 분리정제하며, 분리된 로즈마린산에 대하여 Lck SH2 영역과 펩타이드간의 결합에 대한 저해활성이 우수함을 밝히고, 이의 인지질 순환계에 미치는 영향, 세포내 칼슘 이온 흐름 변화에 미치는 영향 및 인터루킨-2 유전자 발현 저해활성을 확인하고, 그 결과 하고초로부터 분리된 로즈마린산을 면역억제작용제로 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

하고초로부터 분리된 림프구 세포 카이나아제의 에스에이치2 영역에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산 및 그 분리정제방법

본 발명은 하고초로부터 분리된 림프구 세포 카이나아제(이하, Lck(Lymphocyte cell kinase)라 함)의 SH2 영역(Src homology region 2)에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산(rosmarinic acid) 및 그 분리정제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 약용식물과 미생물 배양액을 대상으로 T 림프구 세포의 Lck 단백질의 SH2 영역에 대한 결합을 저해하는 활성을 탐색하여 저해활성이 높은 약용식물로서 하고초(Prunella vulgaris)를 선정하고, 하고초의 메탄올 추출물로부터 로즈마린산을 분리정제하며, 분리된 로즈마린산이 Lck의 SH2 영역 결합 저해활성을 밝히는 것에 관한 것이다.

SH2 영역은 100 아미노산 정도의 단백질 부위로서, 인산화타이로신(tyrosine phosphate)을 포함하는 단백질과의 결합을 통하여 세포 내 임의의 단백질에서 다른 단백질로 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 한다.

SH2 영역을 포함하는 단백질 중 다수는 세포내 신호전달체계(signal transduction system)에 관여하고 있는 것으로 알려져 있으며, 특정 단백질의 SH2 영역과 그에 결합하는 단백질간의 결합특이성은 결합부위에 위치하는 인산화타이로신, 그 주변 아미노산의 서열 및 구조에 의해 대부분 결정된다(참조: Pawson, Nature, 373: 573-580(1995)).

Lck는 림프세포에서 특이적으로 발현하는 Src계의 타이로신 인산화 효소로서, T 림프구 세포를 활성화시키고, 증식 및 분화시키는 데 있어서 매우 중요한 역할을 한다.

SH2 영역은 SH3 영역과 더불어 Lck 조절부위의 하나로서, 효소가 불활성화된 상태에서는 Lck 단백질의 카르복시 말단 부위에 존재하는 인산화타이로신(pY505)과 분자내 결합을 이룸으로써 자가조절을 받고 있으나, 활성화된 상태에서는 SH2 영역이 노출되고 노출된 SH2 영역이 T 림프구 세포내의 다른 단백질과 결합하여 외부자극에 대한 신호를 전달한다(참조: Peri et al., Oncogene Res., 8: 2765-2772(1993)).

T 림프구 세포의 활성화에 있어서 Lck의 SH2 영역의 중요성에 대해서는 SH2 영역과 인산화타이로신 간의 결합을 하지 못하는 돌연변이 Lck를 이용한 여러 가지 실험을 통해 보고되었다.

이 돌연변이 Lck를 가진 세포는 T 림프구 세포 활성화 신호에 의해 유도되는 세포 내 칼슘 신호전달, T 림프구 세포 증식에 필요한 인터류킨-2(Interleukin-2, 이하 IL-2라 함) 합성 및 분비신호 전달 등이 저해되는 것으로 확인되었다(참조: Xu and Littman, Cell 74: 633-643(1993); Straus et al., J. Biol. Chem., 271: 9976-9981(1996); Lewis et al., J. Immunol., 159: 2292-2300(1997)).

이러한 Lck의 SH2 영역에 대한 중요성은 이 영역의 인산화타이로신을 함유하는 단백질과의 결합을 저해하는 물질이 면역억제제로서 작용할 가능성을 시사한다고 보여진다.

본 발명의 목적은 Lck의 SH2 영역 결합 저해활성을 갖는 신규한 물질을 제공하는 데 있다.

또 다른 본 발명의 목적은 상기와 같은 신규한 물질을 하고초로부터 분리 정제하는 방법을 제공하는 데 있다.

그 밖에 본 발명의 목적은 상기와 같은 신규한 물질의 면역억제제로서의 용도를 개발하는 데 있다.

제1도는 본 발명에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산의 농도에 따른 Lck의 SH2 영역과 바이오틴-SGSGEEPQpYEEIPI 펩타이드 간의 결합 저해활성 변화를 나타내는 그래프이고,

제2도는 본 발명에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산의 처리 농도에 따른 쥬르카트(Jurkat) T 림프구 세포에서 CD3와 CD4 항체에 의한 세포내 칼슘 양의 증가를 측정한 그래프이며,

제3도는 본 발명에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산을 비롯한 기 면역억제제를 처리한 쥬르카트(Jurkat) T 림프구 세포에서 CD3와 CD4 항체에 의한 인터루킨-2 프로모터 부위의 활성도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 하고초로부터 분리된 림프구 세포 카이나아제의 SH2 영역에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 로즈마린산의 분리정제방법은 하고초 600g을 메탄올 10∼20ℓ에 침지시켜 3∼5 일간 방치하여 활성물질을 추출하는 단계, 메탄올 추출물을 감압건조하고 증류수 1∼2ℓ에 현탁하고 동량의 에틸아세테이트로 3회 용매추출하여 활성분획을 얻는 단계, 감압농축된 활성분획을 클로로포름과 메탄올 20:1의 혼합용매로 실리카 겔 크 로마토그라피법을 통해 비활성분획을 용출, 제거하는 단계, 클로로포름, 메탄올 및 증류수 20:10:1∼10:5:1의 혼합용매로 활성물질을 용출하는 단계, 용출된 활성분획을 메탄올을 전개용매로 하여 세파덱트 LH-20 크로마토그라피법을 통해 활성분획을 모으는 단계, 20% 메탄올과 1% 인산의 혼합용매를 전개용매로 하여 역상저압 크로마토그라피법을 통해 활성분획을 모으는 단계 및 45% 메탄올과 0.5% 인산의 혼합용매를 전개용매로 하여 고압액상 크로마토그라피법을 통해 로즈마린산을 얻는 단계로 이루어진 것을 그 특징으로 한다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 다수의 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해제 후보물질을 탐색하기 위하여 다음과 같은 방법을 사용한다.

96-공(well) 미세적정 판(microtiter plate)에 Lck의 SH2 부위의 단백질을 흡착시킨 다음, Lck의 SH2 영역과 높은 친화도로 결합한다고 보고된 바 있는 바이오틴(biotin)이 표지된 인산화타이로신을 포함하는 펩타이드와 반응시킨다.

이때, 과산화 효소가 부착된 스트렙트아비딘(Streptavidin, Horse radish peroxidase congate) 및 과산화 효소의 기질을 첨가하여 야기된 발색반응의 정도를 측정한다.

상기의 방법을 통해 각종 약용식물의 메탄올 추출물과 전국의 토양으로부터 분리한 방선균 및 곰팡이 배양액을 대상으로 T 림프구 세포의 Lck SH2 영역에 대한 결합을 저해하는 생리활성을 탐색한다.

이 과정에서 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해활성이 가장 높고 저해활성의 재현성이 있는 하고초를 선정하고, 하고초의 메탄올 추출물로부터 여러 가지 크로마토그래피 기술을 이용하여 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해물질을 분리, 정제한다.

일련의 과정을 통해 순수 분리된 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해물질의 자외선 분광광도 스펙트럼, 적외선 분광광도 스펙트럼, 고속원자폭격 질량분석 스펙트럼,¹H-핵자기공명 스펙트럼 및¹³C-핵자기공명 스펙트럼 등을 참고로 고찰한 결과, 로즈마린산(rosmarinic acid)과 동일함이 밝혀졌다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[Lck SH2 결합저해 물질의 탐색]

정제된 1μM 농도의 글루타치온-S-전이효소(Glutathione-S-trasferase : 이하, GST라 함)-Lck SH2 부위의 단백질을 상온에서 2시간 반응시켜 96-공 미세적정판(96-well microtiter plate)에 부착시켰다.

여기에, 1μM의 바이오틴-SGSGEEPQpYEEIPI 펩타이드 및 각종 천연물 추출액 시료를 한가지씩 혼합하여 반응시키고, 시료가 펩타이드와 GST-Lck SH2와의 결합을 경쟁적으로 저해할 수 있도록 상온에서 다시 2시간 방치하였다.

그런 다음, 과산화효소가 부착된 스트렙트아비딘(Streptavidin, Pierce사 제품, 미국)을 첨가하여 반응시킨 후 세척하고, 바이오틴-펩타이드와 결합하여 남아있는 과산화효소의 활성을 발색반응을 이용하여 측정하였다.

다시말해, 3,3,5,5-테트라메틸 벤지딘(3,3,5,5-tetramethyl benzidine)을 기질로 첨가하고 30분간 반응시킨 다음, 0.8N 황산으로 효소활성을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정함으로써, SH2영역과 인산화타이로신을 포함하는 펩타이드의 결합을 정량하였다.

발색반응이 저해된 시료 중에서 각 천연물 추출액 내의 저해물질의 존재를 탐색한 결과, 가장 저해활성이 높고 재현성을 보이는 하고초 추출액을 선정하였다.

[실시예 2]

[하고초로부터 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해활성 물질(로즈마린산)의 순수분리]

시중의 약재상으로부터 건조된 하고초 600g을 구입하여 메탄올 10∼20ℓ에 침지시킨 뒤, 상온에서 3∼5일간 방치하여 활성물질을 추출하였다.

메탄올 추출물을 감압건조하여 증류수에 현탁한 뒤, 에틸아세테이트로 용매 추출하여 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해활성이 가장 높은 에틸아세테이트 분획을 얻었다.

얻어진 에틸아세테이트 분획을 감압농축한 뒤, 클로로포름과 메탄올 20:1 혼합액 소량에 녹여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 클로로포름과 메탄올의 20:1 혼합액으로 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해활성이 없는 부분을 용출 제거한 다음, 클로로포름, 메탄올 및 증류수의 20:10:1∼10:5:1 혼합액을 전개용매로 사용하여 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해물질을 용출하였다.

얻어진 활성분획을 감압농축하여 소량의 메탄올에 녹인 뒤, 메탄올을 전개용매로 하여 세파덱스(Sephadex) LH-20(시그마사 제품) 칼럼 크로마토그라피를 실시하였다.

여기서 얻어진 SH2 영역에 대한 결합 저해활성을 나타내는 분획은 20% 메탄올과 1% 인산 혼합액을 전개용매로 하여 역상 저압(Lobar, 머크사 제품) 크로마토그라피하고, 얻어진 활성분획을 모아 다이아이온(Diaion) HP-20에 흡착시켜 100% 메탄올로 활성물질을 용출하였다.

용출된 활성분획을 45% 메탄올:0.5% 인산 혼합액을 전개용매로 하고, 칼럼으로 YMC-Pack C18(내경 2cm×외경 15cm)를 사용하여 유속 4mℓ/분, UV 254nm의 분리 조건에서 고압액상 크로마토그라피(HPLC)하여 결합 저해활성을 나타내는 용출시간 22분의 피크만을 모으고, 모아진 활성분획을 다이아이온 HP-20에 흡착시켜 100% 메탄올로 용출하여 Lck의 SH2 영역 결합 저해물질을 50mg 얻었다.

얻어진 물질의 물리화학적 특성은 다음과 같다;

1) 외관 : 연한 초록색 액상

2) 자외선(UV)-분광광도 스펙트럼, λ_max(nm) : 210, 220, 230(s), 250(s), 285, 340(중성 및 산성 메탄올), 208, 225, 250-260, 300-310, 370(염기성 메탄올)

3) 적외선(IR)-분광광도 스펙트럼, υ_max(cm^-1, KBr) : 3300(하이드록실), 1700(카보닐), 1600, 1500, 1450(방향족)

4) 고속원자폭격 질량분석 스펙트럼 : m/z 361[M+H]

5)¹H-핵자기공명 스펙트럼(300MHz, DMSO), δ(ppm) : 7.5(1H, d, J=15.8Hz, H-8), 7.03(1H, d, J=2.3Hz, H-2) 6.92(1H, dd, J=2.3, 8.3Hz, H-6), 6.76(1H, d, J=8.3Hz, H-5), 6.77(1H, d, J=2.3Hz, H-2′), 6.67(1H, d, J=8.3Hz, H-5′), 6.62(1H, dd, J=2.3, 8.3Hz, H-6′), 6.25(1H, d, J=15.8Hz, H-7), 6.62(1H, dd, J=3, 9.8Hz, H-8′), 3.10(1H, dd, J=3, 14.3Hz, H-7α), 2.93(1H, dd, J=9.8, 14.3Hz, H-7β)

6)¹³C-핵자기공명스펙트럼(75MHz, DMSO), δ(ppm) : 127.9(C-1), 115.6(C-2), 149.4(C-3), 146.7(C-4), 116.5(C-5), 122.9(C-6), 146.7(C-7), 115.6(C-8), 169.1(C-9), 131.1(C-1′), 117.5(C-2′), 145.9(C-3′), 144.8(C-4′), 116.2(C-5′), 121.8(C-6′), 38.79(C-7′), 77.6(C-8′), 177.9(C-9′).

[화학식]

결과적으로 확인된 순수 분리정제 물질은 로즈마린산임을 알 수 있었다.

[실시예 3]

[로즈마린산의 Lck SH2 영역에 대한 결합 저해활성 조사]

상기 실시예 2에서와 같은 방법을 통해 하고초로부터 분리된 로즈마린산을 0.03∼300 ㎍/mℓ 농도 범위에서 상기 실시예 1의 방법에 따라 Lck의 SH2 영역과 바이오틴-펩타이드와의 결합에 대한 저해활성을 측정하였으며, 그 결과는 제1도에 나타낸 바와 같다.

제1도의 결과로부터 본 발명의 하고초로부터 분리된 로즈마린산을 처리함으로써 Lck의 SH2 영역과 바이오틴-펩타이드와의 결합이 농도의존적으로 저해되었으며, 50% 저해농도는 3㎍/mℓ임을 알 수 있다.

로즈마린산의 생물학적 활성은 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.

[실시예 4]

[로르마린산의 인지질 순환계에 미치는 영향]

상기 실시예 2에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산의 Lck SH2 영역에 대한 결합 저해활동이 T 림프구 세포 내에서의 인지질 순환계에 미치는 영향에 대하여 살펴보았다.

인지질 순환계에 대한 영향을 측정하기 위하여, 로즈마린산이 처리된 쥬르카트(Jurkat) 세포 배양액에 CD3와 CD4 항체를 처리하여 세포내의 인지질 순환계를 증폭시킨 다음, 5% HClO₄로 세포를 용해시키고 그 상등액을 Dowex AG 1×6(시그마사제품)에 흡착시켜 2 M 암모늄 포메이트로 이노시톨포스페이트류를 용출하여 저해되는 정도를 측정하였다.

그 결과는 다음 표 1에 나타난 바와 같으며, 이로부터 25㎍/mℓ의 로즈마린산을 처리한 경우 CD3와 CD4 항체에 의해 증폭된 쥬르카트(Jurkat) 세포내의 인지질 순환계에 전혀 영향이 없었다.

[실시예 5]

[Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해에 따른 세포내 칼슘 이온 흐름 변화 측정]

상기 실시예 2에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산의 Lck SH2 영역에 대한 결합 저해활성이 세포내의 칼슘 이온 흐름에 대해 미치는 영향을 알아보았다.

T 림프구 세포의 표면항원(sIg)인 CD3와 CD4에 대한 항체를 처리하면 활성화 자극으로 작용하여 T 림프구 세포가 활성화되고, 이때 세포내 칼슘 이온의 증가가 일어남이 알려져 있다. 또한, 이같은 일련의 과정 중에 Lck가 관련되어 있음이 알려져 있으므로, 본 발명에 따라 하고초로부터 분리된 Lck의 SH2 영역에 대한 결합저해제인 로즈마린산이 T 림프구 세포 활성화에 따른 세포내 칼슘 이온량의 증가를 저해하는지를 알아보았다.

세포내 칼슘 이온과 결합하여 형광을 내는 물질인 Fura-2/AM을 처리한 쥬르카트(Jurkat) 세포에 상기 실시예 2에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산을 10분 처리한 후, 여기에 CD3와 CD4 항체를 처리하면서 세포내 칼슘 이온의 증가를 방출된 형광의 양으로 탐지하였다.

이때, 로즈마린산을 처리하지 않는 것을 대조구로 하고, 로즈마리산의 처리농도를 각각 0.5㎍, 1㎍, 10㎍, 50㎍으로 하여 세포내 칼슘 이온의 증가를 측정하였으며, 그 결과는 제2도에 나타낸 바와 같다.

제2도로부터 본 발명에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산을 처리한 경우 농도의존적으로 세포내의 칼슘 이온의 흐름에 대한 저해활성을 나타냄을 알 수 있다.

[실시예 6]

[로즈마린산에 의한 T 림프구 세포의 인터루킨-2(interleukin-2) 유전자 발현 저해활성 조사]

로즈마린산의 Lck SH2 영역에 대한 결합 저해활성이 인터루킨-2의 유전자 발현에 미치는 영향을 알아 보았다.

T 림프구 세포가 활성화되면 인터루킨-2를 분비하는 데, 이때 분비되는 인터루킨-2-는 T 림프구 세포의 성장과 증식에 중요한 인자로서, T 림프구 세포 활성화를 탐지할 수 있는 하나의 지표이다. 또한, T 림프구 세포 항원수용체(TCR: T cell receptor)를 통한 활성화 자극을 주면, 인터루킨-2 유전자가 발현되는 데, 이 과정에 Lck가 관여함이 잘 알려져 있다.

이같은 사실을 고려하여 상기 실시예 2에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산에 의해 T 림프구 세포의 인터루킨-2 유전자 발현이 억제되는지를 조사하기 위해 인터루킨-2 유전자의 프로모터(promoter) 부위와 이를 탐지할 수 있는 수용체 유전자인 루시퍼라아제(luciferase)의 재조합 플라스미드를 사용하였다.

이같은 플라스미드를 도입시킨 쥬르카트(Jurkat) T 세포에 실시예 2에 따라 분리된 로즈마린산 1μM을 10분간 처리한 후, 여기에 CD3와 CD4 항체를 처리하여 활성화 자극을 주었다. 그리고, 인터루킨-2 프로모터가 활성화되는지를 루시퍼라아제의 효소 활성을 측정하는 방법으로 조사하였다.

루시퍼라아제의 효소활성도 결과는 제3도에 나타낸 바와 같으며, 이로부터 양성 대조군에 비하여 로즈마린산을 미리 처리한 세포에서는 인터루킨-2 유전자의 발현이 감소됨을 알 수 있었다.

한편, 로즈마린산은 이미 사용되고 있는 면역억제제인 사이클로스포린 A나, 역시 면역억제효능이 알려져 있는 FK506 보다 더 우월한 저해활성을 보였으며, 이로부터 로즈마린산이 T 림프구 세포에 특이적으로 발현하는 Lck에 작용하므로써 보다 효과적인 면역억제활성을 갖고 있음을 나타낸다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 하고초로부터 분리된 로즈마린산은 Lck의 SH2 영역에 대한 결합 저해활성이 우수하며, 이의 인지질 순환계에의 영향, 세포내 칼슘 이온 흐름 변화에의 영향, T 림프구 세포의 인터루킨-2 유전자 발현의 저해활성 결과로부터 면역억제작용제로 적용할 수 있는 등의 효과가 있음을 알 수 있다.

Claims

하고초를 메탄올에 침지시킨 후 방치하여 활성물질을 추출하는 단계, 상기 메탄올 추출물을 감압건조하고 에틸아세테이트로 용매추출하여 활성분획을 얻는 단계; 상기 감압농축된 활성분획을 클로로포름과 메탄올을 제 1 혼합용매로 사용하여 크로마토그라피법을 통해 비활성분획을 용출제거하는 단계; 클로로포름, 메탄올 및 증류수를 혼합한 제 2 혼합용매로 활성물질을 용출하는 단계; 용출된 활성분획을 메탄올을 전개용매로 하여 크로마토그라피법을 통해 활성분획을 모으는 단계; 메탄올과 인산의 혼합용매를 제 3 혼합용매로 사용하여 역상저압 크로마토그라피법을 통해 활성분획을 모으는 단계; 및 메탄올과 인산의 제 4 혼합용매를 사용하여 고압액상 크로마토그라피법을 통해 로즈마린산을 얻는 단계를 포함하는 하고초로부터 림프구 세포 카이나아제(Lck)의 SH2 영역(Src homonology region 2)에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산을 분리정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제 1 혼합용매로는 클로로포름과 메탄올을 20:1 부피비로 혼합한 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 하고초로부터 림프구 세포 카이나아제(Lck)의 SH2 영역(Src homology region 2)에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산을 분리정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제 2 혼합용매로는 클로로포름, 메탄올 및 증류수를 20:10:1∼10:5:1 부피비로 혼합한 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 하고초로부터 림프구 세포 카이나아제(Lck)의 SH2 영역(Src homology region 2)에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산을 분리정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제 3 혼합용매로는 20% 메탄올과 1% 인산의 혼합용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 하고초로부터 림프구 세포 카이나아제(Lck)의 SH2 영역(Src homology region 2)에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산을 분리정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제 4 혼합용매로는 45% 메탄올과 0.5% 인산의 혼합용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 하고초로부터 림프구 세포 카이나아제(Lck)의 SH2 영역(Src homology region 2)에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산을 분리정제하는 방법.